TP Pharmacologie
publicité
TP Pharmacologie TP : Etude pharmacologique des récepteurs du muscle dorsal de sangsue I. Introduction Le but de ce TP est de caractériser le fonctionnement de la jonction neuromusculaire du muscle dorsal de sangsue. Pour cela, l’étude repose sur des mesures de contraction induites par divers agents connus pour agir directement sur cette synapse. Les sangsues sont des animaux parasites qui se nourrissent de sang. Leur nom scientifique est Hirudo medicinalis. Elles sont utilisées dans la médecine (d’où leur nom), du fait de l’utilisation des propriétés anticoagulantes et anti-inflammatoires de leur salive. Par exemple, on trouve une crème appelée Hirucreme qui utilise ces composants. Elles peuvent aussi être utilisées pour faciliter certaines greffes, ou pour favoriser la formation de capillaires sanguins. Elles possèdent 2 ventouses, l’une antérieure (bouche) et l’autre postérieure. La ventouse antérieure possède 3 mâchoires portant chacune 60 à 100 dents leur permettant ainsi de creuser la peau des animaux pour en aspirer le sang. Elles se déplacent par ondulations, et sont capables d’une contraction et d’une extension importante. Nous allons prélever un lambeau musculaire sur la partie dorsale de l’animal qui est très pigmentée, et possède une dépression longitudinale-médiane. Pour cela, nous avons découpé la partie ventrale de l’animal, cette partie est peu pigmentée et possède 2 dépressions longitudinales-latérales. Nous avons ensuite installé notre lambeau musculaire dans une cuve à organes isolés, à l’aide de deux fils à chaque extrémité. II. Manipulation A. Etude de l’effet de l’acétylcholine On obtient une courbe, en injectant dans la préparation de l’acétylcholine, qui mesure la force de contraction du muscle. Cette courbe est la courbe acétylcholine de l’annexe 1. Elle est de la forme suivante : On a injecté dans la cuve 10 µL d’une solution de chlorure d’acétylcholine à 10 -1 M. La cuve fait 50 mL. Or C1xV1 = C2xV2. Ici C1 = 0,1 M ; V1 = 1.10-5 L ; V2 = 5.10-2 L (50010 µL, on ne considère que 50 mL, ce qui ne change quasiment rien aux calculs). Donc C2 = C1xV1/V2 = 0,1x1.10-5/5.10-2 = 10-6/5.10-2 = 2.10-5 M On remarque donc qu’après injection de l’acétylcholine, le muscle a une augmentation d’activité, bien que celle-ci ne reste à un bas niveau. On peut donc conclure pour le moment que l’acétylcholine permet dans le muscle dorsal de la sangsue d’effectuer des contractions. Il existe donc dans le muscle des récepteurs acétylcholinergiques qui entrainent la contraction du muscle. B. Etude de l’effet de l’acétylcholine en présence de prostigmine® On a maintenant injecté 25 µL de prostigmine à 0,5 M que l’on a laissé incorporer par le muscle pendant 10 minutes. Ensuite, nous avons refait l’expérience précédente. Cette fois, nous avons pu noter une forte différence sur l’annexe 1 : La contraction a été plus forte en présence de prostigmine. En effet, l’amplitude de la contraction sans prostigmine est de 143,04 mV. En présence de prostigmine, elle est de 489,69 mV. Cette nette augmentation nous permet donc de dire que la prostigmine augmente l’effet de l’acétylcholine, en effet, c’est un anticholinestérasique qui inhibe la dégradation de l'acétylcholine par la choline-estérase. Ceci permet à l’acétylcholine de ne pas être dégradée, et donc de rester dans le milieu pour agir plus longtemps. C. Etude de l’effet du triéthiodure de gallamine La nouvelle expérience consiste à injecter 25 µL d’une solution de triéthiodure de gallamine à 1 M dans un volume de 50 mL. De la même façon que dans la partie A, nous calculons une concentration finale à 5.10-4 M. Après avoir laissé le milieu 10 minutes, nous avons de nouveau injecté 10 µL d’acétylcholine. On considère cependant que la prostigmine est toujours dans le muscle, et donc que l’acétylcholine a une action favorisée par une élimination plus lente. Nous obtenons avec l’annexe 2 les résultats suivants : La contraction a été plus faible en présence de gallamine qu’en absence. On peut donc conclure que la gallamine empêche l’action de l’acétylcholine. C’est donc que la gallamine est un antagoniste compétitif de l’acétylcholine, puisque apparemment, il se fixe sur les mêmes récepteurs et qu’il empêche l’action de l’acétylcholine. Le fait que l’action de contraction ait diminué vient de là, l’amplitude étant passée de 489,69 mV à 324,89 mV. On sait que l’acétylcholine se fixe sur les récepteurs muscariniques et nicotiniques. Or la gallamine est un curarisant, un antagoniste des récepteurs nicotiniques. C’est donc sur ces récepteurs que la gallamine fait son travail d’antagoniste, en empêchant l’acétylcholine de se fixer sur les récepteurs nicotiniques. D. Etude de l’effet de l’atropine Pour finir, on recommence nos expériences avec de l’atropine plutôt que de la gallamine. On a cette fois ajouté 50 µL d’une solution de sulfate d’atropine 1 M dans 50 mL de milieu Ringer. La concentration en atropine est donc (calculé comme précédemment) de 1.10-3 M. Une nouvelle fois, après avoir laissé ce milieu 10 minutes, nous avons injecté 10 µL d’acétylcholine. Nous n’avons pas obtenu les résultats attendus (annexe 3), bien que nous ayons noté une forte baisse. Nous utilisons donc les résultats fournis par le professeur (annexe 4). Les résultats attendus sont les suivants : On peut alors se rendre compte qu’après l’injection de l’atropine, l’acétylcholine n’a plus aucun effet, puisque la contraction ne se fait plus du tout. Avec la forte concentration, l’atropine a bien fonctionné, et on peut conclure que l’atropine a la même action que la gallamine, elle est un antagoniste de l’acétylcholine. Cependant, la différence vient du fait que l’atropine est un antagoniste des récepteurs muscariniques. C’est donc sur ces récepteurs que se fait son action, en empêchant l’acétylcholine de se fixer. L’amplitude a baissé de 525,3 mV à 230,5 mV. III. Conclusion On peut conclure que l’acétylcholine contracte les muscles grâce aux récepteurs nicotiniques, que la prostigmine favorise cette action alors que la gallamine et l’atropine la défavorisent, voir même l’inhibent. Cependant, les deux inhibiteurs n’agissent pas sur le même système, les mêmes récepteurs, et donc n’ont pas les mêmes actions. Les récepteurs Récepteur : Transduction nécessite une étape de couplage du ligand avec le récepteur, nécessite la production d’un second messager, molécule diffusible qui va être véhiculée au niveau intra cellulaire pour déclencher un effet biologique. On les appelle second messagers car le premier est le ligand. En réalité, ce schéma simple est beaucoup plus complexe. La première possibilité est le fait qu’un même récepteur peut être couplé à 2 systèmes de couplages différents. PLC : phospholipase C PLA2 : Phospholipase A2 AC : Adénylate cyclase I. Etude des récepteurs de la cellule pigmentaire de poisson La plupart des poissons téléostéens (qui présentent une arrête centrale) présentent des écailles sur leur face externes, qui correspondent au prolongement du derme. Ce sont des structures inertes que l’on pourrait qualifier de plaques cornées, disposées sur les poissons pour les protéger, et dans certains poissons comme le gardon (Gardonus rutilus), la disposition des écailles est de type élasmoïde, c'est-à-dire que les écailles sont disposées en rangées qui se chevauchent, le bord libre d’une écaille recouvre la partie derme de l’écaille suivante. On constate que sur l’écaille il y a un certain nombre de stries. Par exemple, les stries radiaires sont disposées en rayons, et les stries concentriques sont disposées en parallèle les unes par rapport aux autres. Elles apparaissent avec l’âge du poisson. Plus un poisson vieillit, plus les stries s’accroissent. Au niveau de ces écailles on trouve un certain nombre de cellules pigmentées, les Chromatophores, de différents types : Xantophores : cellules pigmentaires de couleur jaune Erythrophores : cellules pigmentaires de couleur rouge Guanophores : aspect irisée, prend toutes les couleurs de l’arc en ciel Mélanophores (mélanocytes) : aspect étoilé, disposés sur les stries radiaires ou sur les stries concentriques, de couleur noire due à la mélanine, pigment noir La mélanine est condensée en granules pigmentaires appelés mélanosomes, ce sont des grains de mélanine. Ces mélanosomes ne sont observables qu’en microscopie électronique. Les mélanosomes se déplacent sur le cytosquelette, sur un réseau de fibres, appelés microtubules. Ils prennent naissance dans le centrosome, structure à proximité du noyau. Extrémité + : lieu de la polymérisation, formation du microtubule Extrémité - : là où le microtubule se dissocie, à proximité du noyau Cela n’a rien à voir avec des charges électriques. Le mélanosome se déplace sur le microtubule, il n’est pas fixé directement dessus, il est relié au réseau de microtubule par des molécules de liaison appelées molécules de kinésine. Le mélanosome se déplace vers le noyau ou vers la périphérie, suivant comment se font les ponts de liaison. Ils se font en fonction du niveau de phosphorylation des kinésines, déterminé par la protéine kinase A, qui va phosphoryler les kinésines en fonction du taux d’AMPc intracellulaire. II. La dispersion ou la concentration Les mélanosomes peuvent se disperser vers la périphérie, alors que la concentration correspond à un regroupement des mélanosomes vers le centre de la cellule. A. Cas de l’adrénaline L’adrénaline est une hormone synthétisée par les glandes surrénales. Ce sont des glandes situées au dessus des reins. L’adrénaline est libérée en cas de stress. Cette adrénaline est aussi libérée par les terminaisons nerveuses du système nerveux périphérique, en particulier par la branche sympathique. Chez le poisson, en cas de stress, l’adrénaline va provoquer dans le mélanocyte une concentration des cellules pigmentaires, et donc ils se regroupent au centre de la cellule. On teste les effets de l’adrénaline en présence d’un médicament, le tartrate d’Ergotamine, qui est une molécule à structure très complexe. C’est une molécule antagoniste compétitive des récepteurs α2 adrénergiques. Quand on l’applique sur le mélanoside, et que dans un second temps on applique de l’adrénaline, on constate que le phénomène de concentration des cellules pigmentaires ne s’observe plus. Le récepteur est couplé à une protéine Gi (i = inhibitrice). Elle inhibe l’adénylate cyclase, AC. Gi fait le lien entre le récepteur et l’AC. L’AC transforme l’ATP en AMPc. La concentration en AMPc intracellulaire diminue, donc il y a moins de PKA, donc un baisse de la phosphorylation des kinésines, et donc on va avoir une migration des mélanosomes vers le noyau. Ce phénomène provoque au final un éclaircissement général du poisson, ce qui permet au poisson d’échapper à ses prédateurs. Il va devenir de plus en plus transparent et se confondre dans l’environnement. B. Cas de l’α-MSH On testera aussi l’α-MSH (α mélanocyte stimulating hormon). Elle est sécrétée par les systèmes neuro-sécrétoire caudal, système situé au niveau de la queue du poisson. Ca forme une glande. Chez l’homme, elle est synthétisée au niveau de l’hypophyse postérieure, glande située à la base du cerveau, elle se trouve juste au dessus du palais. L’α-MSH a un rôle beaucoup plus important chez les poissons et les amphibiens que chez l’homme, puisqu’elle contrôle la coloration de la peau de l’animal. On prend par exemple le caméléon. Chez l’homme, elle intervient pour le bronzage, puisqu’elle entraine la migration des mélanocytes pour les ramener au niveau de la peau. C’est une hormone qui est un petit peptide de 13 acides aminé. Quand on applique de l’α-MSH sur les mélanocytes du poisson, les mélanosomes vont avoir tendance à se répartir en périphérie de la cellule. Il existe des récepteurs à l’α-MSH sur la cellule. Ces récepteurs sont couplés à la protéine Gs (stimulante) qui active l’adénylate cyclase, ce qui entraine l’élévation de la concentration intracellulaire en AMPc. Cette AMPc active la protéine kinase A (PKA), ce qui entraine une phosphorylation des kinésines. D’une manière générale, l’α-MSH entraine un assombrissement du poisson. C. Cas de l’acétylcholine L’acétylcholine est une hormone libérée par le système nerveux, par sa branche parasympathique. C’est un neurotransmetteur. L’acétylcholine entraine un léger effet de concentration sur les mélanosomes. Elle agit par l’intermédiaire d’un récepteur M2 à l’acétylcholine, c’est un récepteur muscarinique, en effet, la muscarine, substance issue de l’amanite, agit sur ces récepteurs et les active, la muscarine est un agoniste de ces récepteurs. Ces récepteurs sont couplés à une protéine Gi. Le taux d’AMPc diminue. Les mélanosomes auront tendance à migrer vers le noyau. III. L’étude d’organes isolés de mammifères Ces techniques sont courantes en pharmacologie car elles permettent de travailler dans des conditions proches de la situation in vivo, et parce qu’on peut tester facilement un grand nombre de molécules. On prend par exemple l’intestin grêle de rat. La couche la plus externe est la séreuse, c’est la couche de protection du tube digestif, elle est formée par un tissu conjonctif. Ensuite, on trouve la musculeuse ou couche musculaire, distinguée en une couche musculaire externe, avec des fibres disposées de manière longitudinale (parallèle au grand axe), et en une couche interne, où les fibres sont disposées en cercle par rapport au tube digestif. On va ensuite distinguer la sous-muqueuse, couche plus interne, elle est formée de villosités. Les cellules musculaires sont capables de se contracter de manière totalement involontaire, c’est le muscle lisse. On aura 2 types de contractions. D’une part les contractions de péristaltisme, qui se propagent à 1cm/s, et fait avancer les aliments dans l’intestin. Les autres contractions sont des contractions de segmentation. Il y a contraction dans 2 régions non adjacentes du tube digestif, ce qui a pour effet de couper les aliments en masses de plus petite taille. Ça permet de faciliter la digestion. Les cellules musculaires lisses présentent au niveau structural une organisation beaucoup moins développée que dans le cas des cellules musculaires striées squelettiques. L’organisation des sarcomères est moins bien construite, les contractions développées sont de faible importance. Les contractions sont lentes et d’amplitude faible. Elles durent des centaines de millisecondes. On constate que le muscle lisse développe des contractions de manière rythmique. Elles apparaissent de manière régulière dans le tube digestif, ce qui est généré par des cellules pacemaker, ou cellules automatiques, qui sont des cellules disposées en plexus nerveux, on va distinguer le plexus d’Auerbach, situé entre les couches musculaires longitudinales et circulaires, et le plexus de Meissner, situé entre la couche musculaire interne (circulaire) et la sous muqueuse. On constate que le système nerveux périphérique innerve toutefois le tissu intestinal. L’innervation s’effectue de 2 manières : Type syncitial/unitaire : on a affaire à un syncitium, des cellules qui fonctionnent de manière couplée, dans cette situation, les cellules sont innervées de manière complète et unitaire, et donc au final, on a une régulation homogène de l’ensemble de l’intestin. On le trouve aussi dans le muscle utérin. Type multi unitaire : on le trouve dans d’autres tissus musculaires lisses, on n’a pas affaire à un syncitium, l’innervation est séparée au niveau des cellules, c’est ce que l’on trouve au niveau des artères, et dans une situation qui conduit à un fonctionnement de manière séparée des cellules. Dans cette situation, les cellules musculaires lisses ne présentent pas d’activité spontanée. Le système parasympathique du système nerveux périphérique active le muscle lisse intestinal. Les récepteurs mis en jeux sont des récepteurs M2 muscariniques, tandis que le système sympathique va intervenir dans le sens d’une utilisation du fonctionnement de l’intestin, les récepteurs mis en jeux sont α2 et β2 adrénergiques. L’histamine est sécrétée par la muqueuse de l’estomac. L’arrivée des aliments dans l’estomace déclenche la sécrétion de l’histamine. Elle va se fixer sur un recepteur à l’histamine appelé RH1. Elle est couplée à un Gs, couplé à PLC, ce qui entraine la production de Diacylglycérol (DAG), et d’Inositol tri-phosphate (IP3). Il existe des récepteurs à l’IP3, quoi entrainent quand ils sont activés la libération de calcium du RE lisse, et ce calcium va provoquer la contraction du tissu intestinal. On testera en TP l’Atropine. C’est un inhibiteur compétitif des récepteurs M2 à l’acétylcholine. C’est une molécule issue d’une plante, la belladone. Quand on applique l’atropine sur les contractions intestinales, on constate que par rapport au cycle contraction relaxation, on va entrainer un blocage assez important de la contraction intestinale. Dans certains cas, la contraction est totalement bloquée. Dans d’autres cas, elle n’est bloquée que de manière partielle. Il subsiste une composante phasique ou rapide. On a donc 2 composantes phasiques (résistante à atropine, sensible au curare) ou lentes (résistante au curare, sensible à l’atropine). Le curare est un antagoniste des récepteurs cholinergiques nicotiniques. Les neurotransmetteurs régulent le fonctionnement intestinal par des réflexes nerveux courts ou longs. Ce sont des groupes de régulation à courte distance, ou à longue distance, impliquant des structures nerveuses sur longue distance, comme le nerf vague (parasympathique). Ces voies de régulation permettent une régulation nerveuse qui s’accompagne aussi d’une régulation par des hormones. En particulier, l’histamine effectue une régulation à courte ou longue distance. On parle d’effet paracrine à courte distance, et d’effet endocrine dans le cas de distance plus longue. En particulier on constate que l’estomac contrôle le fonctionnement intestinal (histamine), c’est aussi le cas de la sécrétine. Les stimuli qui entrainent la libération de ces hormones sont des stimuli mécaniques (aliments qui arrivent et distendent les parois de l’estomac), des stimuli chimiques (composition des éléments mangés, aliments acides entraine la production d’histamine). Les hormones peuvent soit exciter l’intestin, soit inhiber le fonctionnement du TD. L’effet excitateur peut être induit par des hormones telles que la Gastrine, et qui agit sur les cellules de la muqueuse intestinale pour stimuler la sécrétion des glandes gastriques. Etude pharmacologique des récepteurs du muscle dorsal de sangsue L’objectif de ce TP est d’étudier le fonctionnement du muscle dorsal de la sangsue, et en particulier la jonction neuromusculaire. Avec une cuve, on va prélever un morceau de muscle de sangsue, les cellules musculaires sont sous forme de double couche, une couche de cellules longitudinales, et une couche de circulaires.
