TP DE MICROBIOLOGIE - ANNEE 2014

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TP DE MICROBIOLOGIE - ANNEE 2014-2015
Licence Sciences, Technologies, Santé mention Biologie
UE 5.5 b : Bactériologie Générale
UE optionnelle du groupe B du semestre 5 - niveau L3 biologie
MATERIEL et Hygiène-Sécurité :
Blouse propre en coton obligatoire
Cheveux longs attachés
Pas de coiffure non facilement retirable
Pas de coiffure en matière inflammable
Signaler toute coupure aux doigts
Travail en binôme
Etuve : groupe du matin, étage du haut
groupe de l’après midi, étage du bas
Pipetage uniquement avec poires
Pour le CR par binôme et les séances respecter les consignes de la dernière page
PROGRAMME DU TP :
LE COURS ET LES TD DOIVENT ETRE COMPRIS
Travail stérile
Identification de 3 souches
Identification présomptive de souches d’un mélange
- Techniques de base :
- Travail stérile
- Etat frais et Coloration de Gram
- Ensemencement
- Isolement sur milieux gélosés sélectifs et non sélectifs
Identification bactérienne par l’étude des caractères métaboliques et antigéniques
I - TRAVAIL STERILE (J1, J2)
1) J1
A partir d’un bouillon Trypticase Soja (TS) de 10 mL (tube à essai), transvaser stérilement ≈
2 mL dans 5 tubes à hémolyse à l’aide d’une pipette Pasteur.
- 2 bouillons serviront au test de stérilité : les incuber 24h à 37°C.
- les 3 autres bouillons serviront pour l’identification des 3 souches (voir II).
2) J2
Les 2 bouillons non ensemencés sont-ils limpides ? Conclusion.
II - IDENTIFICATION DE 3 SOUCHES (J1, J2, J3)
Chaque binôme reçoit 3 souches isolées sur gélose TS en vue d’une identification.
1) J1
- Caractères morphologiques.
Pour chacune des 3 souches, réaliser séparément :
- Gram (objectif x 100 à l’immersion). Dessiner la forme exacte (allongée, ovale,
ronde, incurvée, …). Préciser le groupement.
- Etude de la mobilité
- ensemencement d’un milieu semi-solide mannitol-mobilité : piqûre centrale avec 1 colonie.
- ensemencement d’un bouillon TS de ˜ 2 mL avec 1 colonie.
- Réisolement - Isoler à partir du bouillon TS ensemencé par 1 colonie chaque souche
sur une gélose TS bien séchée par la méthode des quadrants. Flamber entre chaque quadrant.
TP L3 UE 5.5b
Page 1
2) J2
Etudier sur les 3 souches :
- Caractères morphologiques.
- étude de la mobilité :
- lecture du milieu mannitol-mobilité.
- état frais entre lame et lamelle à partir du bouillon TS (objectif x 40 à sec).
Comparer le groupement avec celui de J1 à partir du Gram. Notez-vous une différence ? Si
oui, pourquoi ? Quel est le groupement le plus valide ?
- étude macroscopique des colonies
- Métabolisme énergétique
- TESTS à REALISER SUR LA MEME LAME - catalase : Déposer 1 goutte de H2O2 puis les colonies avec 1 pipette Pasteur.
- oxydase : Déposer 1 papier buvard avec 1 goutte de TMPD. Déposer les colonies
avec une pipette Pasteur à la limite de la goutte et du buvard sec. Le test est + si c’est la
colonie qui vire au rouge.
Etudier selon l’identification présomptive de la famille ou du genre :
- Caractères métaboliques
- pour bacilles Gram Lecture de la fermentation du mannitol sur le milieu mannitol-mobilité ensemencé en J1.
Ensemencement d’une galerie d’identification simplifiée en tubes (voir fiches techniques) :
- milieu de Kligler-Hajna
- milieu de Clark et Lubs (pour réaction de RM et VP)
- milieu urée-indole de Ferguson
- recherche de la nitrate réductase sur mannitol-mobilité.
Ensemencement d’une galerie API 10S.
- pour staphylocoques (coques Gram +, catalase +)
Lecture de la fermentation du mannitol (cf. ci-dessus).
Recherche d’une DNAse : ensemencer une gélose à l’ADN.
Recherche d’une coagulase : agglutination de particules de latex sensibilisées par du
fibrinogène.
- pour streptocoques (coques Gram +, catalase -)
Lecture de la fermentation du mannitol (cf. ci-dessus).
Etude des caractères antigéniques (à faire éventuellement J3) :
1- réaction d’agglutination de particules de latex
sensibilisées par des anticorps spécifiques de chaque polyoside C de groupe A, B, C et D.
3) J3
- pour bacilles Gram Révélation et lecture de la galerie d’identification en tubes.
Test ONPG : uniquement si la bactérie est lactose - (voir milieu de Kligler-Hajna).
Révélation et lecture de la galerie API 10E.
Comparaison des résultats obtenus par les 2 méthodes.
- pour les staphylocoques
Révélation de la DNAse.
TP UE L3 5.5b
Page 2
III - ETUDE D’UN MELANGE DE GERMES (J1, J2, J3)
Chaque binôme reçoit un bouillon TS renfermant un mélange de germes.
1) J1
- Etude morphologique
- Gram : mettre 2 gouttes de pipette Pasteur sur une lame.
- présomption : types de germes présents (forme, groupement, Gram)
- choix de milieux de culture sélectifs ou non pour l’isolement de ces bactéries
- Isolement sur milieux solides :
Sur des géloses séchées isoler le mélange
- sur milieu non sélectif (gélose TS) pour permettre la croissance de toutes les
bactéries
- sur milieu(x) sélectif(s) si nécessaire pour inhiber certaines bactéries :
- milieu de Chapman sélectif pour staphylocoques et microcoques
- milieu de Drigalski sélectif pour bacilles Gram- courants (entérobactéries,
Pseudomonas, Vibrion).
2) J2
- Voir la qualité des isolements.
- Lecture des milieux Chapman et Drigalski.
- Identification présomptive de chaque germe :
- Gram
- oxydase
- catalase
- type respiratoire : Lecture des géloses Viande Foie (VF).
VOIR clichés fournis essaie de faire tenir sur une ligne sinon mettre à la ligne
Les géloses VF ont été ainsi préparées. Les VF sont préalablement régénérées 20 min. au
bain-marie bouillant et ramenées à ˜ 55°C. Elles sont ensemencées avec une colonie sur toute
la hauteur du tube puis solidifiées immédiatement en passant le tube sous l’eau froide. Les VF
sont incubées 24h à 37°C. Le bouchon est légèrement dévissé pour laisser l’air pénétrer.
AUCUN AUTRE TEST à faire
3) J3 Finir les lectures des tests.
COMPTE RENDU par binôme : à rendre impérativement en J3 à la fin de la séance :
NB :
- Utiliser les fiches de CR qui vous seront distribuées en J1
- Venir impérativement en J1 avec une note sur :
- principe et mode de lecture des milieux TS, Chapman et Drigalski.
- principe et mode de lecture des milieux Kligler, Clark et Lubs, urée-indole
et du test de la recherche de la nitrate réductase.
- définition des entérobactéries.
- L’absence de ces notes en J1 sera sanctionnée
- Inclure ces notes au CR
- Ne pas oublier le n° des 3 souches étudiées et la lettre du mélange.
TP UE L3 5.5b
Page 3
FICHES TECHNIQUES de L3 - UE 5.5b de BACTERIOLOGIE GENERALE
COLORATION DE GRAM : à partir d’une colonie dissociée dans une très petite goutte d’eau
COLORATION DE GRAM : à partir d’un bouillon : Déposer 1 goutte de bouillon non dilué
Réaliser un frottis sur une lame :
Sécher lentement. Flamber à l’alcool 100° (1 ou 2 gouttes).
Recouvrir la lame de violet de gentiane (1 min.). Vider.
Recouvrir la lame de lugol (1 min.). Vider. Rincer à l’eau.
Décolorer à l’alcool 100° : recouvrir la lame 15 s. d’alcool 100°. Rincer immédiatement à l’eau.
Recommencer cette décoloration si la lame n’est pas transparente.
Recouvrir la lame d’eau. Ajouter 4 gouttes de fuchsine (1 min.). Rincer à l’eau.
Sécher en tamponnant délicatement la lame avec un papier absorbant. Marquer la lame.
EMPLOI DU MICROSCOPE
Nettoyer objectifs et oculaires au papier Joseph avant et après chaque utilisation. Ne pas coller les
yeux sur les oculaires. L’objectif x 40 ne doit jamais recevoir d’huile.
- Lames colorées
Les bactéries sont tuées, fixées sur la lame et colorées.
Condensateur monté jusqu’à la lame si le microscope le permet. Diaphragme ouvert. Objectif x 100 à
immersion (avec huile). Pour la mise au point, l’objectif trempe dans la goutte d’huile. Nettoyer au
papier Joseph après utilisation de l’objectif.
- Etat frais
Les bactéries sont vivantes en bouillon.
Déposer une anse de bouillon entre lame et lamelle. Observer l’abondance, (la forme), le groupement
et la mobilité des bactéries.
Condensateur baissé si le microscope le permet. Diaphragme fermé. Objectif x 40 à sec (sans huile).
Pour la mise au point, l’objectif est à environ 1 mm au-dessus de la lamelle.
PENSER à RESPECTER les REGLES d’Hygiène et Sécurité : lavage des mains, désinfection, tri des
déchets, bec bunsen, …
PENSER à RANGER votre paillasse en fin de TP
TP UE L3 5.5b
FICHE TECHNIQUE
Page 4
TECHNIQUES D’ENSEMENCEMENT DES DIFFERENTS MILIEUX DE CULTURE
- Milieux liquides
Pour tous les milieux liquides, dissocier dans le liquide une colonie prélevée avec l’anse métallique.
ex :
- bouillon trypticase-soja (TS)
- milieu de RM/VP (Clark et Lubs)
- milieu urée-indole de Ferguson
- Milieux solides
- en boîtes de Petri. --> Isolement en quadrant.
- gélose TS (peptones, NaCl 5%, agar)
- milieu de Drigalski (peptone, lactose, bleu de bromothymol, cristal violet, sels biliaires, agar)
- milieu de Chapman (peptone, mannitol, rouge de phénol, NaCl 75 g/L, agar)
--> Faire une strie.
- gélose à l’ADN ( peptone, ADN, NaCl 5%, agar).
- en tube.
Milieu
Ensemencement
mannitol-mobilité
viande-foie
Kliger-Hajna
Bouchon
Piqûre
Piqûre
strie sur la pente + piqûre du culot
fermé
entrouvert
entrouvert
REVELATION ET LECTURE DES MILIEUX D’IDENTIFICATION
Milieu Chapman et Drigalski : lire le métabolisme des sucres
Autres milieux : Lecture
Milieu
Test
Réactif à ajouter
test positif
Urée-indole
uréase
indole
TDA
0
Kovacs
FeCl3
Clark et Lubs
RM
VP
rouge de méthyle
rouge
jaune
10 gouttes NaOH puis rose en 10’- tube jaune, beige
incliné
10 gouttes α Naphtol
Gélose à l’ADN
DNAse
HC1
MannitolMobilité
Mannitol 0
Gazogène 0
Mobilité 0
TP UE L3 5.5b
rouge
anneau rose
brun foncé
test négatif
orange
jaune, beige
brun clair
halo clair
jaune
rouge
bulle
épaisseur de la épaisseur de la
gélose trouble
gélose limpide
FICHE TECHNIQUE
Page 5
TP UE L3 5.5b
FICHE TECHNIQUE
Page 6
TABLEAU D'INDENTIFICATION / IDENTIFICATION TABLE / PROZENTTABELLE /
TABLA DE IDENTIFICACION / TABELLA DI IDENTIFICAZIONE / QUADRO DE IDENTIFICACAO
% de réactions positives aprés 18-24 H à 35-37°C/ % of positive reactions after 18-24 hrs. at 35-37°C/
% der positiven Reaktionen nach 18-24 Std. bei 35-37°C/% de las reacciones positivas después
de 18-24 H a 35-37°C/% di reazioni positive dopo 18-24 ore a 35-37°C/
% de reacçoes positivas apos 18-24 H a 35-37°C
ONPGGLU ARA LDC ODC
API 10 S
V3.O
97 100 95 0 86
Citrobacter koseri/amalonaticus
51 100 99 0 99
Citrobacter braakii
98 100 99 0 100
Citrobacter farmeri
90 100 94 0
0
Citrobacter freundii
0
99 1 99 100
Edwardsiella tarda
76 95 80 98 56
Escherichia coli 1
74 99 90 0 32
Escherichia coli 2
100 99 99 15 0
Escherichia vulneris
99 99 99 98 99
Enterobacter aerogenes
Enterobacter amnigenus
99 98 98 0 95
Enterobacter spp/Escherichia coli/Shigella sonnei100 100 100 0 100
99 99 99 1 93
Enterobacter cloacae
60 99 75 100 98
Hafnia alvei
99 99 96 78 2
Klebsiella oxytoca
99 99 99 72 0
Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae
2
97 1
5 96
Morganella morganii
100 100 80 0
0
Pantoea spp 1
96 100 99 0
0
Pantoea spp 2
1
96 1
1 98
Proteus mirabilis
0 100 0
0
0
Proteus penneri
0
97 1
0
1
Proteus vulgaris
1
99 1
0
0
Providencia rettgeri
1
99 2
0
0
Providencia stuartii/alcalifaciens
97 100 99 96 97
Salmonella arizonae
0
99 0 97 97
Salmonella choleraesuis
0 100 100 100 1
Salmonella gallinarum
0 100 99 0 100
Salmonella paratyphi A
Salmonella pullorum
0 100 68 75 99
4 100 94 92 95
Salmonella spp
0
99 0 98 0
Salmonella typhi
Serratia liquefaciens
94 100 98 70 99
Serratia marcescens
94 100 19 98 95
95 99 95 97 43
Serratia odorifera
26 99 40 0
0
Shigella spp
Yersinia enterocolitica 1
41 100 98 0 74
Yersinia enterocolitica 2
85 97 0
0 58
77 98 29 0
0
Yersinia pseudotuberculosis
96 98 61 50 0
Aeromonas hydrophila
Plesiomonas shigelloides
95 99 0 100 100
Vibrio alginolyticus/parahaemolyticus
0
99 19 98 75
97 98 1 82 92
Vibrio vulnificus/cholerae
0
86 75 0
0
Acinetobacter baumannii
Chryseobacterium indologenes
20
0
0
0
0
Chryseobacterium meningosepticum
70
0
0
0
0
0
30 11 0
0
Pseudomonas aeruginosa/fluorescens/putida
Pseudomonas spp
1
7
8
0
0
0
6
1
0 80
Shewanella putrefaciens
Sphingobacterium multivorum
96 46 17 0
0
Stenotrophomonas maltophilia
60
1
0 48 0
CIT
87
75
0
75
1
1
1
0
84
56
0
94
40
90
90
2
28
68
57
1
31
70
91
50
4
0
0
0
74
0
85
97
87
0
0
0
13
50
0
61
56
54
14
20
68
54
83
30
76
H2S URE TDA
0
2
0
81 1
0
0
0
0
65 1
0
94 0
0
3
4
0
0
2
0
0
4
0
0
2
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
5
0
0 40 0
0 60 0
1 99 91
0
0
1
0
0
0
83 99 98
15 100 100
83 98 99
0 94 99
0 15 100
96 0
0
70 0
0
33 0
0
5
0
0
85 0
0
85 0
0
8
0
0
0
5
0
0 28 0
1
0
0
0
0
0
0 98 0
0 99 0
0 96 0
0
0
0
0
1
0
0
5
0
0
1
0
0
0
0
0 92 0
0
0
0
1 15 0
1
4
0
90 1
0
0 92 0
1
0
0
IND
92
1
100
1
99
70
50
0
0
0
0
0
0
100
0
97
0
100
2
0
94
88
98
1
0
0
0
0
3
0
0
1
99
20
49
0
0
85
99
99
99
0
70
81
0
0
0
0
0
OX
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
99
99
100
100
0
99
100
99
98
100
96
4
NO2
99
99
99
98
99
99
98
99
99
99
99
99
99
99
99
88
85
85
93
99
99
98
99
99
99
99
99
99
99
99
99
95
99
99
98
98
95
98
99
47
96
3
20
6
14
48
96
1
26
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