TP DE MICROBIOLOGIE - ANNEE 2014-2015 Licence Sciences, Technologies, Santé mention Biologie UE 5.5 b : Bactériologie Générale UE optionnelle du groupe B du semestre 5 - niveau L3 biologie MATERIEL et Hygiène-Sécurité : Blouse propre en coton obligatoire Cheveux longs attachés Pas de coiffure non facilement retirable Pas de coiffure en matière inflammable Signaler toute coupure aux doigts Travail en binôme Etuve : groupe du matin, étage du haut groupe de l’après midi, étage du bas Pipetage uniquement avec poires Pour le CR par binôme et les séances respecter les consignes de la dernière page PROGRAMME DU TP : LE COURS ET LES TD DOIVENT ETRE COMPRIS Travail stérile Identification de 3 souches Identification présomptive de souches d’un mélange - Techniques de base : - Travail stérile - Etat frais et Coloration de Gram - Ensemencement - Isolement sur milieux gélosés sélectifs et non sélectifs Identification bactérienne par l’étude des caractères métaboliques et antigéniques I - TRAVAIL STERILE (J1, J2) 1) J1 A partir d’un bouillon Trypticase Soja (TS) de 10 mL (tube à essai), transvaser stérilement ≈ 2 mL dans 5 tubes à hémolyse à l’aide d’une pipette Pasteur. - 2 bouillons serviront au test de stérilité : les incuber 24h à 37°C. - les 3 autres bouillons serviront pour l’identification des 3 souches (voir II). 2) J2 Les 2 bouillons non ensemencés sont-ils limpides ? Conclusion. II - IDENTIFICATION DE 3 SOUCHES (J1, J2, J3) Chaque binôme reçoit 3 souches isolées sur gélose TS en vue d’une identification. 1) J1 - Caractères morphologiques. Pour chacune des 3 souches, réaliser séparément : - Gram (objectif x 100 à l’immersion). Dessiner la forme exacte (allongée, ovale, ronde, incurvée, …). Préciser le groupement. - Etude de la mobilité - ensemencement d’un milieu semi-solide mannitol-mobilité : piqûre centrale avec 1 colonie. - ensemencement d’un bouillon TS de ˜ 2 mL avec 1 colonie. - Réisolement - Isoler à partir du bouillon TS ensemencé par 1 colonie chaque souche sur une gélose TS bien séchée par la méthode des quadrants. Flamber entre chaque quadrant. TP L3 UE 5.5b Page 1 2) J2 Etudier sur les 3 souches : - Caractères morphologiques. - étude de la mobilité : - lecture du milieu mannitol-mobilité. - état frais entre lame et lamelle à partir du bouillon TS (objectif x 40 à sec). Comparer le groupement avec celui de J1 à partir du Gram. Notez-vous une différence ? Si oui, pourquoi ? Quel est le groupement le plus valide ? - étude macroscopique des colonies - Métabolisme énergétique - TESTS à REALISER SUR LA MEME LAME - catalase : Déposer 1 goutte de H2O2 puis les colonies avec 1 pipette Pasteur. - oxydase : Déposer 1 papier buvard avec 1 goutte de TMPD. Déposer les colonies avec une pipette Pasteur à la limite de la goutte et du buvard sec. Le test est + si c’est la colonie qui vire au rouge. Etudier selon l’identification présomptive de la famille ou du genre : - Caractères métaboliques - pour bacilles Gram Lecture de la fermentation du mannitol sur le milieu mannitol-mobilité ensemencé en J1. Ensemencement d’une galerie d’identification simplifiée en tubes (voir fiches techniques) : - milieu de Kligler-Hajna - milieu de Clark et Lubs (pour réaction de RM et VP) - milieu urée-indole de Ferguson - recherche de la nitrate réductase sur mannitol-mobilité. Ensemencement d’une galerie API 10S. - pour staphylocoques (coques Gram +, catalase +) Lecture de la fermentation du mannitol (cf. ci-dessus). Recherche d’une DNAse : ensemencer une gélose à l’ADN. Recherche d’une coagulase : agglutination de particules de latex sensibilisées par du fibrinogène. - pour streptocoques (coques Gram +, catalase -) Lecture de la fermentation du mannitol (cf. ci-dessus). Etude des caractères antigéniques (à faire éventuellement J3) : 1- réaction d’agglutination de particules de latex sensibilisées par des anticorps spécifiques de chaque polyoside C de groupe A, B, C et D. 3) J3 - pour bacilles Gram Révélation et lecture de la galerie d’identification en tubes. Test ONPG : uniquement si la bactérie est lactose - (voir milieu de Kligler-Hajna). Révélation et lecture de la galerie API 10E. Comparaison des résultats obtenus par les 2 méthodes. - pour les staphylocoques Révélation de la DNAse. TP UE L3 5.5b Page 2 III - ETUDE D’UN MELANGE DE GERMES (J1, J2, J3) Chaque binôme reçoit un bouillon TS renfermant un mélange de germes. 1) J1 - Etude morphologique - Gram : mettre 2 gouttes de pipette Pasteur sur une lame. - présomption : types de germes présents (forme, groupement, Gram) - choix de milieux de culture sélectifs ou non pour l’isolement de ces bactéries - Isolement sur milieux solides : Sur des géloses séchées isoler le mélange - sur milieu non sélectif (gélose TS) pour permettre la croissance de toutes les bactéries - sur milieu(x) sélectif(s) si nécessaire pour inhiber certaines bactéries : - milieu de Chapman sélectif pour staphylocoques et microcoques - milieu de Drigalski sélectif pour bacilles Gram- courants (entérobactéries, Pseudomonas, Vibrion). 2) J2 - Voir la qualité des isolements. - Lecture des milieux Chapman et Drigalski. - Identification présomptive de chaque germe : - Gram - oxydase - catalase - type respiratoire : Lecture des géloses Viande Foie (VF). VOIR clichés fournis essaie de faire tenir sur une ligne sinon mettre à la ligne Les géloses VF ont été ainsi préparées. Les VF sont préalablement régénérées 20 min. au bain-marie bouillant et ramenées à ˜ 55°C. Elles sont ensemencées avec une colonie sur toute la hauteur du tube puis solidifiées immédiatement en passant le tube sous l’eau froide. Les VF sont incubées 24h à 37°C. Le bouchon est légèrement dévissé pour laisser l’air pénétrer. AUCUN AUTRE TEST à faire 3) J3 Finir les lectures des tests. COMPTE RENDU par binôme : à rendre impérativement en J3 à la fin de la séance : NB : - Utiliser les fiches de CR qui vous seront distribuées en J1 - Venir impérativement en J1 avec une note sur : - principe et mode de lecture des milieux TS, Chapman et Drigalski. - principe et mode de lecture des milieux Kligler, Clark et Lubs, urée-indole et du test de la recherche de la nitrate réductase. - définition des entérobactéries. - L’absence de ces notes en J1 sera sanctionnée - Inclure ces notes au CR - Ne pas oublier le n° des 3 souches étudiées et la lettre du mélange. TP UE L3 5.5b Page 3 FICHES TECHNIQUES de L3 - UE 5.5b de BACTERIOLOGIE GENERALE COLORATION DE GRAM : à partir d’une colonie dissociée dans une très petite goutte d’eau COLORATION DE GRAM : à partir d’un bouillon : Déposer 1 goutte de bouillon non dilué Réaliser un frottis sur une lame : Sécher lentement. Flamber à l’alcool 100° (1 ou 2 gouttes). Recouvrir la lame de violet de gentiane (1 min.). Vider. Recouvrir la lame de lugol (1 min.). Vider. Rincer à l’eau. Décolorer à l’alcool 100° : recouvrir la lame 15 s. d’alcool 100°. Rincer immédiatement à l’eau. Recommencer cette décoloration si la lame n’est pas transparente. Recouvrir la lame d’eau. Ajouter 4 gouttes de fuchsine (1 min.). Rincer à l’eau. Sécher en tamponnant délicatement la lame avec un papier absorbant. Marquer la lame. EMPLOI DU MICROSCOPE Nettoyer objectifs et oculaires au papier Joseph avant et après chaque utilisation. Ne pas coller les yeux sur les oculaires. L’objectif x 40 ne doit jamais recevoir d’huile. - Lames colorées Les bactéries sont tuées, fixées sur la lame et colorées. Condensateur monté jusqu’à la lame si le microscope le permet. Diaphragme ouvert. Objectif x 100 à immersion (avec huile). Pour la mise au point, l’objectif trempe dans la goutte d’huile. Nettoyer au papier Joseph après utilisation de l’objectif. - Etat frais Les bactéries sont vivantes en bouillon. Déposer une anse de bouillon entre lame et lamelle. Observer l’abondance, (la forme), le groupement et la mobilité des bactéries. Condensateur baissé si le microscope le permet. Diaphragme fermé. Objectif x 40 à sec (sans huile). Pour la mise au point, l’objectif est à environ 1 mm au-dessus de la lamelle. PENSER à RESPECTER les REGLES d’Hygiène et Sécurité : lavage des mains, désinfection, tri des déchets, bec bunsen, … PENSER à RANGER votre paillasse en fin de TP TP UE L3 5.5b FICHE TECHNIQUE Page 4 TECHNIQUES D’ENSEMENCEMENT DES DIFFERENTS MILIEUX DE CULTURE - Milieux liquides Pour tous les milieux liquides, dissocier dans le liquide une colonie prélevée avec l’anse métallique. ex : - bouillon trypticase-soja (TS) - milieu de RM/VP (Clark et Lubs) - milieu urée-indole de Ferguson - Milieux solides - en boîtes de Petri. --> Isolement en quadrant. - gélose TS (peptones, NaCl 5%, agar) - milieu de Drigalski (peptone, lactose, bleu de bromothymol, cristal violet, sels biliaires, agar) - milieu de Chapman (peptone, mannitol, rouge de phénol, NaCl 75 g/L, agar) --> Faire une strie. - gélose à l’ADN ( peptone, ADN, NaCl 5%, agar). - en tube. Milieu Ensemencement mannitol-mobilité viande-foie Kliger-Hajna Bouchon Piqûre Piqûre strie sur la pente + piqûre du culot fermé entrouvert entrouvert REVELATION ET LECTURE DES MILIEUX D’IDENTIFICATION Milieu Chapman et Drigalski : lire le métabolisme des sucres Autres milieux : Lecture Milieu Test Réactif à ajouter test positif Urée-indole uréase indole TDA 0 Kovacs FeCl3 Clark et Lubs RM VP rouge de méthyle rouge jaune 10 gouttes NaOH puis rose en 10’- tube jaune, beige incliné 10 gouttes α Naphtol Gélose à l’ADN DNAse HC1 MannitolMobilité Mannitol 0 Gazogène 0 Mobilité 0 TP UE L3 5.5b rouge anneau rose brun foncé test négatif orange jaune, beige brun clair halo clair jaune rouge bulle épaisseur de la épaisseur de la gélose trouble gélose limpide FICHE TECHNIQUE Page 5 TP UE L3 5.5b FICHE TECHNIQUE Page 6 TABLEAU D'INDENTIFICATION / IDENTIFICATION TABLE / PROZENTTABELLE / TABLA DE IDENTIFICACION / TABELLA DI IDENTIFICAZIONE / QUADRO DE IDENTIFICACAO % de réactions positives aprés 18-24 H à 35-37°C/ % of positive reactions after 18-24 hrs. at 35-37°C/ % der positiven Reaktionen nach 18-24 Std. bei 35-37°C/% de las reacciones positivas después de 18-24 H a 35-37°C/% di reazioni positive dopo 18-24 ore a 35-37°C/ % de reacçoes positivas apos 18-24 H a 35-37°C ONPGGLU ARA LDC ODC API 10 S V3.O 97 100 95 0 86 Citrobacter koseri/amalonaticus 51 100 99 0 99 Citrobacter braakii 98 100 99 0 100 Citrobacter farmeri 90 100 94 0 0 Citrobacter freundii 0 99 1 99 100 Edwardsiella tarda 76 95 80 98 56 Escherichia coli 1 74 99 90 0 32 Escherichia coli 2 100 99 99 15 0 Escherichia vulneris 99 99 99 98 99 Enterobacter aerogenes Enterobacter amnigenus 99 98 98 0 95 Enterobacter spp/Escherichia coli/Shigella sonnei100 100 100 0 100 99 99 99 1 93 Enterobacter cloacae 60 99 75 100 98 Hafnia alvei 99 99 96 78 2 Klebsiella oxytoca 99 99 99 72 0 Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae 2 97 1 5 96 Morganella morganii 100 100 80 0 0 Pantoea spp 1 96 100 99 0 0 Pantoea spp 2 1 96 1 1 98 Proteus mirabilis 0 100 0 0 0 Proteus penneri 0 97 1 0 1 Proteus vulgaris 1 99 1 0 0 Providencia rettgeri 1 99 2 0 0 Providencia stuartii/alcalifaciens 97 100 99 96 97 Salmonella arizonae 0 99 0 97 97 Salmonella choleraesuis 0 100 100 100 1 Salmonella gallinarum 0 100 99 0 100 Salmonella paratyphi A Salmonella pullorum 0 100 68 75 99 4 100 94 92 95 Salmonella spp 0 99 0 98 0 Salmonella typhi Serratia liquefaciens 94 100 98 70 99 Serratia marcescens 94 100 19 98 95 95 99 95 97 43 Serratia odorifera 26 99 40 0 0 Shigella spp Yersinia enterocolitica 1 41 100 98 0 74 Yersinia enterocolitica 2 85 97 0 0 58 77 98 29 0 0 Yersinia pseudotuberculosis 96 98 61 50 0 Aeromonas hydrophila Plesiomonas shigelloides 95 99 0 100 100 Vibrio alginolyticus/parahaemolyticus 0 99 19 98 75 97 98 1 82 92 Vibrio vulnificus/cholerae 0 86 75 0 0 Acinetobacter baumannii Chryseobacterium indologenes 20 0 0 0 0 Chryseobacterium meningosepticum 70 0 0 0 0 0 30 11 0 0 Pseudomonas aeruginosa/fluorescens/putida Pseudomonas spp 1 7 8 0 0 0 6 1 0 80 Shewanella putrefaciens Sphingobacterium multivorum 96 46 17 0 0 Stenotrophomonas maltophilia 60 1 0 48 0 CIT 87 75 0 75 1 1 1 0 84 56 0 94 40 90 90 2 28 68 57 1 31 70 91 50 4 0 0 0 74 0 85 97 87 0 0 0 13 50 0 61 56 54 14 20 68 54 83 30 76 H2S URE TDA 0 2 0 81 1 0 0 0 0 65 1 0 94 0 0 3 4 0 0 2 0 0 4 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 5 0 0 40 0 0 60 0 1 99 91 0 0 1 0 0 0 83 99 98 15 100 100 83 98 99 0 94 99 0 15 100 96 0 0 70 0 0 33 0 0 5 0 0 85 0 0 85 0 0 8 0 0 0 5 0 0 28 0 1 0 0 0 0 0 0 98 0 0 99 0 0 96 0 0 0 0 0 1 0 0 5 0 0 1 0 0 0 0 0 92 0 0 0 0 1 15 0 1 4 0 90 1 0 0 92 0 1 0 0 IND 92 1 100 1 99 70 50 0 0 0 0 0 0 100 0 97 0 100 2 0 94 88 98 1 0 0 0 0 3 0 0 1 99 20 49 0 0 85 99 99 99 0 70 81 0 0 0 0 0 OX 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 99 99 100 100 0 99 100 99 98 100 96 4 NO2 99 99 99 98 99 99 98 99 99 99 99 99 99 99 99 88 85 85 93 99 99 98 99 99 99 99 99 99 99 99 99 95 99 99 98 98 95 98 99 47 96 3 20 6 14 48 96 1 26