identification de mecanismes moleculaires augmentant le

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Université Lille1 Sciences et Technologies
Année 2014 N° d’ordre 41570
THESE
Présentée pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L UNIVERSITE LILLE1 SCIENCES ET TECHNOLOGIES
Discipline : Aspects moléculaires et cellulaires de la Biologie
IDENTIFICATION DE MECANISMES
MOLECULAIRES AUGMENTANT LE POTENTIEL
THERAPEUTIQUE DES CANAUX CALCIQUES ORAI
ET DES POMPES SERCA
Thèse dirigée par le Docteur Fabien Vanden Abeele
Présentée et soutenue publiquement par
Charlotte Dubois
Le jeudi 4 décembre 2014
Rapporteurs :
Dr Thierry Capiod, Chargé de recherche INSERM, Université Paris V, FR
Dr Geert Bultynck, Professeur Associé, Université KU Leuven, BEL
Membres du Jury :
Pr Natalia Prevarskaya, Professeur des Universités, Lille, FR
Pr Robert Alain Toillon, Professeur des Universités, Lille, FR
Pr Jesper Vuust Moller, Professeur émérite, Université d’Aarhus, Aarhus, DK
Pr Bertrand Tombal, Professeur des Universités, Praticien Hospitalier (PU-PH), Louvain,
BEL
Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014
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Résumé
Le développement tumoral requiert des « caractéristiques » moléculaires bien identifiées. En
ce qui concerne le cancer de la prostate, il est bien connu qu’il se caractérise par une grande
hétérogénéité avec en particulier un nombre important de cellules en quiescence ce qui se traduit
notamment par une prolifération certes aberrante mais très lente (Denmeade et al., 2003). Ce cancer
peut se développer pendant plusieurs décennies avant de provoquer des symptômes chez les patients.
Ainsi, de nombreux traitements anti-cancéreux qui ciblent spécifiquement les cellules en prolifération
s’avèrent peu efficaces et aujourd’hui les formes avancées de ce cancer sont donc incurables. Cette
inefficacité des traitements chimiothérapeutiques est aussi une conséquence d’un phénomène de
résistance à l’apoptose dont l’origine s’explique encore une fois en partie grâce à l’hétérogénéité de ce
cancer. En conséquence, une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires à l’origine du
phénomène de résistance à l’apoptose et de la dérégulation de la prolifération est nécessaire. En outre,
l’identification de thérapeutiques permettant de cibler l’hétérogénéité tumorale est également une
priorité.
Dans ce contexte, nous avons mis en évidence le rôle déterminant des protéines ORAI1 et
ORAI3 dans un remodelage de l’homéostasie calcique qui participe à l’émergence d’un phénotype
cancéreux plus agressif. Nous avons découvert le mécanisme à l’origine de la formation d’un canal
constitué des protéines ORAI1 et ORAI3 permis par : (1) la surexpression de la protéine ORAI3 et (2)
des perturbations du microenvironnement tumoral au cours de la progression tumorale. Ce canal
calcique hétéromérique ORAI1/ORAI3 est activé par l’acide arachidonique et la formation
préférentielle de ces hétéromères au cours de la cancérogenèse se fait au détriment des canaux
homomériques ORAI1 connus pour jouer un rôle crucial dans l’induction de la mort cellulaire des
cellules cancéreuses. Ces résultats mettent en lumière un nouveau rôle du métabolisme perturbé de
l’acide arachidonique connus depuis longtemps pour participer à la progression tumorale et le
remodelage de l’homéostasie calcique via les protéines ORAI avec la formation des complexes
hétéromérique pro-prolifératifs ORAI1/ORAI3 au détriment des canaux homomériques pro-
apoptotiques ORAI1.
En parallèle nous avons étudié les mécanismes d’action d’une nouvelle pro-drogue très
prometteuse en cours d’évaluation clinique, le G-202® (Genspera, USA), et qui permet de cibler
l’hétérogénéité tumorale. Le G-202® est capable d’induire un stress calcique réticulaire et la mort par
apoptose des cellules cancéreuses quiescentes ou prolifératives. La molécule active de cette pro-
drogue est un analogue de la Thapsigargine (TG), un inhibiteur des pompes SERCA du réticulum
endoplasmique, dont la forte action cytotoxique est connue depuis longtemps. Nous avons découvert
un nouveau mécanisme d’action de la TG que son analogue le G-202® ne possède plus. Cette
découverte nous a permis premièrement d’augmenter considérablement l’efficacité du G-202® utilisé
seul in vitro et in vivo sur des modèles murins (Brevet en cours de dépôt) et deuxièmement d’élaborer
un nouveau type de thérapies combinées et ciblées augmentant considérablement l’efficacité de
nombreux traitements chimiothérapeutiques actuels sur des cellules résistantes. Enfin, d’un point de
vue fondamental, le G-202® nous a permis de remettre en question les mécanismes de la signalisation
calcique intracellulaire impliqués dans l’induction de l’apoptose.
En conclusion, grâce à ces études nous avons identifié de nouveaux mécanismes moléculaires
permettant d’augmenter le potentiel thérapeutique des canaux calciques ORAI et des pompes SERCA
du réticulum endoplasmique.
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ABSTRACT
Tumor development requires clearly identified molecular "features". With regard to prostate
cancer, it is well known that it is characterized by its heterogeneity with a large number of cells in
quiescence whom results are aberrant but certainly very slow proliferation (Denmeade et al. 2003).
This cancer can grow for decades before causing symptoms in patients. So many anti-cancer
treatments that specifically target proliferating cells are not very effective; it’s why advanced forms of
prostate cancer are incurable. The ineffectiveness of chemotherapy treatments is also a consequence of
the phenomenon of resistance to apoptosis whose origin is partly due to the heterogeneity of this
cancer. Accordingly, a better understanding of the molecular mechanisms underlying resistance to the
phenomenon of apoptosis and deregulation of proliferation is needed. Furthermore, the identification
of therapeutic target for tumor heterogeneity is also a priority.
In this context, we have highlighted the key role of protein ORAI1 and ORAI3 in remodeling
of calcium homeostasis involved in the emergence of a more aggressive cancer phenotype. We have
discovered the mechanism behind the formation of a channel consisting of proteins ORAI1 and
ORAI3 permit by (1) the overexpression of ORAI3 protein and (2) perturbation of the tumor
microenvironment during tumor progression. This heteromeric calcium channel ORAI1/ORAI3 is
activated by arachidonic acid and the preferential formation of these heteromeric channels during
carcinogenesis disfavoring ORAI1 homomeric channels known to play a crucial role in the induction
of cell death in cells cancer. These results highlight a new role of disturbed arachidonic acid
metabolism known to participate in tumor progression and remodeling of calcium homeostasis via
ORAI proteins with the formation of pro-proliferative heteromeric complexes ORAI1/ORAI3 to
expense of homomeric channels proapoptotic ORAI1.
In parallel we studied the mechanisms of action of a very promising new pro-drug undergoing
clinical evaluation, the G-202® (Genspera, USA), which allows the targeting of tumor heterogeneity.
The G-202® is capable of inducing a stress reticular calcium and apoptotic death of resting and
proliferating cancer cells. The active molecule of this prodrug is an analogue of thapsigargin (TG), an
inhibitor of the endoplasmic reticulum SERCA pumps, whose strong cytotoxic effect has long been
known. We discovered a novel mechanism of action of the TG that its analog G-202® no longer
possesses. This discovery allowed us firstly to significantly increase the efficiency of the G-202®
alone in vitro and in vivo mouse models (patent pending) and secondly to develop a new type of
combination therapies and targeted increasing considerably the efficiency of many current
chemotherapeutic treatments on resistant cells. Finally, from a fundamental point of view, the G-202®
allowed us to question the mechanisms of intracellular calcium signaling involved in the induction of
apoptosis.
In conclusion, from these studies we have identified new molecular mechanisms to increase
the therapeutic potential of calcium channels and pumps ORAI SERCA of the endoplasmic reticulum.
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GLOSSAIRE
AA (acide Arachidonique)
ADN (acide désoxyribonucléique)
AIF (apoptosis Inducing Factor)
AMPK (AMP-activated protein kinase)
ARC (Arachidonic acid Regulated calcium channels)
ARNi (acide ribonucléique interférent)
ARNm (acide ribonucléique messager)
ATF6 (activating transcription factor 6)
ATG5 (Autophagy protein 5)
ATP (adénosine-5'-triphosphate)
BCL-2 (B-cell lymphoma 2)
BH3-only (BCL-2 Homology 3 only)
CaM (calmodulin)
CaMKK-bêta (Calcium/calmodulin-dependant protein kinase kinase beta)
CD95 (cluster of differentiation 95)
CDK4 (Cyclin-dependent kinase 4)
CHOP (C/EBP protéine homologue)
CHOP (C/EBP-homologous protein)
CPA (acide indole cyclopiazonique alcaloïde)
CRAC (Ca2+ release-activated Ca2+ Channels
CREB1 (cAMP Responsive Element Binding protein 1)
DAPK (Death-Associated Protein kinase)
DFCP1 (Double FYVE-containing protein 1)
DISC (death-inducing signaling complex)
ECC (entrée capacitive de Ca2+
EDTA (Ethylène Diamine Tétra Acétique)
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eIF2α (Eukaryotic Initiation Factor 2 α)
ENCC (entrée non capacitative du calcium)
ERAD (Endoplasmic-reticulum-associated protein degradation)
FADD (Fas-associated death domain),
FAK (Focal adhesion kinase)
FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
GADD153 (Growth Arrest and DNA Damage inducible protein 153)
HEK293 (Human Embryonic Kidney 293)
HIF-1 (hypoxia inducible factor)
HSC70 (Heat Shock Cognate protein70)
HSP90 (Heat Shock Protein 90)
IGF1/2 (Insulin-like Growth Factor-1/2)
IP3 (Inositol 1,4,5 trisphosphate)
IP3R (Inositol 1,4,5 trisphosphate receptor)
IRE1 α (Inositol-requiring enzyme 1α)
LAMP-2A (Lysosome-Associated Membrane Protein type 2A)
LC3 (Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3)
LCR4 (Leucotriènes C4)
LH-RH (luteinizing hormone-releasing hormone)
LNCaP (Lymph Node Carcinoma of the Prostate)
MDR (Multi Drug Resistance)
mTOR (mammalian Target Of Rapamycin)
NFAT (Nuclear Factor of Activated T-cells)
PDGF (Platelet-derived growth factor)
PERK (protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase)
PI3K (Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase)
PKC (protein kinase C)
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