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Relations entre stress oxydant et résistance à l’insuline Notion de radical libre Un radical libre (RL) est une espèce chimique qui possède un électron non apparié (célibataire) sur sa couche périphérique H O H électrons de la liaison H2O H O électrons célibataire du radical hydroxyle Le radical est doté d’une réactivité particulière Afin d’apparier son électron célibataire, il peut se comporter avec d’autres atomes ou molécules comme : un oxydant un réducteur Notion de radical libre Les radicaux libres impliqués dans le stress oxydant présentent un électron célibataire sur un atome d’oxygène Ces radicaux libres peuvent être produits in vivo ou in vitro soit : Par rupture homolytique d’une liaison covalente composés conservant un électron célibataire en deux Par la perte ou le gain d’un électron chez une espèce non radicalaire In vivo ils peuvent être générés en faible quantité lors du métabolisme normal de l’oxygène (CRM) Formation des radicaux libres La CRM permet la réduction de l'oxygène moléculaire en 2 H2O Cette réduction directe : implique la présence de quatre électrons est rendue possible grâce à un système complexe de protéines et d'enzymes localisées dans la membrane interne de la mitochondrie. Les conséquences de cette activité de la CRM sont doubles et paradoxales la mitochondrie fournie 36 ATP ~0,4 à 4% de l'oxygène ne sont pas correctement convertis en eau NADH NAD+ succinate fumarate 2H+ ½ O2 4H+ 4H+ 4H+ 2H+ H2O Matrice mitochondriale C4 C3 tC C2 Cy C1 ~0,4 à 4% 2H+ EIM Stress oxydant Le stress oxydant est observé lorsque la production des espèces réactives de l’oxygène (ERO) dépasse les capacités de défense des tissus Il entraîne des altérations des composants cellulaires, dues aux réactions chimiques des ERO avec les lipides, les protéines et les acides nucléiques cellulaires. Antioxydants ERO ERO : Espèces Réactives de l’Oxygène Production des Espèces Réactives de l’Oxygène Par réduction monoélectronique, l'oxygène peut donner naissance à des Espèces Réactives de l’Oxygène (ERO) parmi lesquelles figurent l'anion • superoxyde (O2 -) ou le radical hydroxyle (OH•) ERO un atome ou une molécule dont la structure chimique est caractérisée par la présence d'un électron libre rendant cette espèce chimique beaucoup plus réactive que l'atome ou la molécule dont il (elle) est issu(e) O2 1 Oxygène singulet hλ O2•- O2 4 eH2O e- Anion superoxyde e- H2 O 2 peroxyde d'hydrogène OH• e- Radical hydroxyle Espèces Réactives de l’Oxygène (ERO) une ERO est beaucoup plus réactive que l’oxygène qui leur a donné naissance Anion superoxyde O2•- peroxyde d'hydrogène H2 O 2 Radical hydroxyle OH• Il existe d’autres ERO RO2• Radical peroxyle RO• Radical alkoxyle ERO Origine des différentes ERO O2 Oxygène singulet O2 oxydases NAD(P)H oxydase Monoxyde d’azote Anion superoxyde ClFe3+ HOCl Ac hypochloreux • NO2 OH Radical hydroxyle Radicaux primaires, dérivent de O2 ou de N par réduction de 1eEspèces réactives de O2 (ERO) OX O2•- ONOO peroxyde d'hydrogène R pe D O S NO• Peroxynitrite H2 O 2 lo yé NOS hλ m Arg 1 Toxicité des différentes ERO Oxygène singulet O2 1 hλ H2 O 2 O2 peroxyde d'hydrogène Arg NO •- O2 • Monoxyde d’azote Peroxynitrite Nitration des protéines Fe3+ Anion superoxyde ONOO Activation de kinases • OH Oxydation des protéines Radical hydroxyle Peroxydation des lipides Oxydation du DNA Les Espèces Réactives de l’Oxygène Anion superoxyde (O2 •-) Produit par capture d’un électron anion superoxyde : O2 + 1e- l’oxygène moléculaire est réduit en •- O2 Il est produit majoritairement par la CRM, mais également par des oxydases Produit par une oxydase membranaire NAD(P)H oxydase : Modulation de la signalisation cellulaire Intervention dans les régulations métaboliques Parmi les RL du stress oxydant, l’anion superoxyde est celui qui a la réactivité vis-à-vis des substrats la plus faible Il ne réagit pas avec les Ac nucléiques et les protéines Les Espèces Réactives de l’Oxygène Le radical hydroxyle (OH•) La coexistence de l’anion superoxyde et du peroxyde d’hydrogène peut engendrer cette espèce oxygénée très réactive Cette réaction est catalysée par des métaux de transition (Fe2+ et Cu2+) Réaction de Fenton H2O2 + Fe2+ Fe3+ + OH- + OH• Fe2+ est reconstitué par divers réducteurs dont l’anion superoxyde Fe3+ + O2•- Fe2+ + O2 Les Espèces Réactives de l’Oxygène Le monoxyde d’azote (NO•) RLO produit in-vivo par les NO Synthases (NOS) Arg + 2 NADPH + O2 Citrulline + NO• + 2 NADP+ NO• est caractérisé par : Une grande difusibilité Une réactivité limitée Une ½ vie qui n’excède pas quelques secondes NO• est susceptible de réagir avec : La plupart des ERO Les fonctions thiols Les métaux (fer héminique) Les Espèces Réactives de l’Oxygène Le monoxyde d’azote (NO•) NO• peut être : Oxydé en ion nitrosonium (NO+) Réduit en anion nitroxyle NOLa production concomitante de NO• et d’anions superoxyde (O2•- ) en un même site entraîne la formation du peroxynitrite (ONOO-) hautement cytotoxique NO• + O2•- ONOOperoxynitrite NO• se rapproche de O2•- par sa faible réactivité sur les molécules biologiques Les Espèces Réactives de l’Oxygène Peroxyde d’hydrogène (H2O2) Peut être obtenu : Par réduction divalente de l’oxygène moléculaire (action des oxydases) O2 + 2e- + 2H+ H2O2 Par dismutation de l’anion superoxyde 2 O2•- + 2H+ H2O2 + O2 H2O2 électriquement neutre, réactivité limitée diffuse à travers les membranes biologiques plus facilement que l’anion superoxyde Il donne naissance à des radicaux plus réactifs. Les Espèces Réactives de l’Oxygène Oxygène singulet Atome d’oxygène seul • Il est très réactif - Durée de vie très courte • Il est produit par transfert d’énergie lumineuse par des protéines telles que la riboflavine, la bilirubine et le rétinal O2 hλ O2 1 Oxygène singulet ERO rencontrées dans l’organisme Anion superoxyde Les radicaux libres de l’oxygène Faible action oxydative O2•- Formé par la mitochondrie Peut générer des radicaux secondaires Radical hydroxyle OH• Très réactif avec les macromolécules biologiques Oxyde nitrique NO• Réagit avec OH- peroxynitrite Les espèces réactives de l’oxygène Peroxynitrite ONOO Très réactif nitration de Tyr Ac Aminé polaire Oxygène singulet 1O 2 Atome d’oxygène seul ; Très réactif ; Durée de vie très limitée Peroxyde d’hydrogène H2O2 En présence Fe radical hydroxyle Origine des EOR Sources endogènes exogènes peroxysome pollution (NOx, O3) mitochondrie radiation, ultrasons auto oxydation phagocytes infections EOR pesticides cigarettes exercice détoxification enzymes oxydantes drogues ERO ET SANTÉ PUBLIQUE Existence d’une association entre altération des systèmes de défense antioxydants et développement de nombreuses pathologies : Maladies inflammatoires Diabète Athérosclérose cancer SIDA vieillissement Cataracte, dégénérescence rétinienne ERO Asthme Arthrite rhumatoïde Parkinson, démence Sources cellulaires des ERO Dans les cellules production essentiellement enzymatique : CRM NAD(P)H oxydase membranaire A degrés moindres NADH NAD+ Xanthine oxydase Enzymes du REL (cyt P450)… ~0,4 à 4% succinate fumarate 2H+ ½ O2 4H+ 4H+ 2H+ H2O C4 C3 tC C2 Cy C1 4H+ Matrice mitochondriale 2H+ EIM Sources cellulaires des ERO Au niveau mitochondrial Tetraréduction 95% Monoréduction 3-5% H2 O 4e- Cytochrome C oxydase O2 1e- O2•- MnSOD OH H2O2 • Radical hydroxyle Sources cellulaires des ERO NAD(P)H oxydase membranaire O2 NAD(P)H O2•H+ O2 NAD(P)+ H+ NAD(P)H O2•NAD(P)+ Polynucléaire neutrophile Cellule musculaire lisse Complexe multimérique localisé au niveau de la membrane plasmique. Complexe transmembranaire permettant d’interagir avec le substrat NAD(P)H cytoplasmique et de libérer l’anion superoxyde produit à l’extérieur de la cellule (PN) ou à l’intérieur (cellules musculaires lisses) Sources cellulaires des ERO Au niveau du peroxysome Les peroxysomes utilisent une part importante de l’O2 Production majoritaire de H2O2 Glycolate oxydase - acyl-CoA oxydase - D-amino acide oxydase… La catalase utilise H2O2 formée par ces enzymes pour oxyder différents substrats (AG) et pour la détoxification (éthanol) Au niveau du REL / CytP450 Réaction de mono-oxygénation L-H + O2 + NADPH + H+ L-OH + H2O + NADP+ Le REL est riche en cytP450 impliqués dans les processus de détoxification Sources cellulaires des ERO Autres systèmes de production Auto-oxydation Cyclo-oxygénase et lipo-oxygénase Système de transport des électrons dans la membrane nucléaire Xanthine/xanthine oxydase Activation des polynucleaires Hémoglobine et Myoglobine Sources cellulaires des ERO Les mitochondries : principale source de production de radicaux libres Mitochondries microsome peroxysome cytosol 45% 20% 30% 5% Exception pour le foie, où les microsomes sont les principaux producteurs Mitochondries microsome peroxysome cytosol 15% 45% 35% 5% Systèmes de Défense Systèmes de Défense Systèmes enzymatiques Superoxyde dismutases Catalase GSH peroxydases Première ligne de défense . O2 SOD H2O + O2 Catalase GSH GSSG Fe2+ H2O2 GPx H2O Fe3+ . OH Superoxyde dismutase .- . O2 - SOD H2O2 Enzyme qui permet l’élimination du radical O2 en le métabolisant en H2O2 par une réaction de dismutation. Différentes formes O2.- SOD Localisation Cu/Zn-SOD SOD1 cytosolique Mn-SOD SOD2 Mitochondriale (MIM) Cu-SOD SOD3 Matrice extracellulaire Enz-Cu2+ + O2.Enz-Cu+ + O2.- + 2H+ O2.- + 2H+ Enz-Cu+ + O2 Enz-Cu2+ + H2O2 H2O2 + O2 Catalase H2O2 Catalase H2O + O2 Enzyme tétramérique héminique Chaque unité porte un hème un NADPH Présentes dans les peroxysomes d’un grand Particulièrement abondantes dans le foie et les GR nombre de tissus Sont localisées dans les peroxysomes La réaction se fait en deux étapes : H2O2 Catalase-Fe3+ + H2O2 Composé1 + 2 H2O2 2 H2O2 Substrat : H2O2 Composé1 + H2O Catalase-Fe3+ + H2O + O2 2 H2O + O2 Glutathion peroxydases Enzyme à sélénocystéine Enzymes capables de détoxifier H2O2 et d’autres peroxydes d’origine lipidique. Réaction couplée avec l’oxydation d’un substrat réducteur (GSH) Quatre types différents (1 à 3 tétramérique) GPx1 : localisation cytosolique, ubiquitaire, fortement exprimée GSH GSSG H2O2 GPx H2O GR reins foie GPx2 : localisation cytosolique cellules du tractus gastro-intestinal GPx3 : localisation plasmatique GPx4 : monomérique - localisation interface MIN – cytoplasme Au niveau des membranes, elle peut réduire les hydroperoxydes des Phospholipides et du Cholestérol (GSH 2ème substrat) Glutathion peroxydases Substrats: H2O2 et hydroperoxydes organiques de type ROOH Action de la Glutathion peroxydase ROOH + 2 GSH ROH + GSSG + H2O Glutathion réductase GSSG + 2 NADPH, H+ 2 GSH + 2 NADP+ GPx ne sont pas spécifiques de H2O2 peuvent agir sur tous les hydroperoxydes des esters de Cholestérol ou des PL des Mb cellulaires GPx sont spécifiques de GSH toutes sont inhibées par le cyanure Systèmes de Défense Systèmes non enzymatiques : piégeurs de radicaux libres Antioxydants liposolubles: - α-tocophérol - carotène Antioxydants hydrosolubles: - ascorbate LA DOUBLE VIE DES RADICAUX LIBRES INTRODUCTION Faible concentration ERO sont des médiateurs cellulaires ayant des fonctions diversifiées : ERO impliquées dans inflammation; phagocytose et réaction immunitaire ERO participent aux voies de transduction du signal de plusieurs Ho et FC (PDGF, insuline…) ½ vie courte, diffusion rapide, réactivité avec protéines et lipides médiateurs parfaits Forte concentration Équilibre redox perturbé ERO s’accumulent dépendante de la dose, de la nature et de la cellule Cibles des ERO exercent une toxicité ADN ; ARN ; protéines ; lipides et/ou glucides Problème essentiel de la notion de seuil : Où commence la toxicité où finit la physiologie? Stress oxydant et résistance à l’insuline INTRODUCTION L’hyperglycémie chronique est impliquée dans la survenue des complications macro et surtout microangiopathiques par l’intermédiaire de l’exacerbation de 4 voies métaboliques : • la voie des polyols • l’activation accrue d’isoformes de PKC • l’activation des hexosamines • la glycation non enzymatique des protéines Ces voies sont toutes intriquées et aboutissent à un stress oxydant A ces facteurs métaboliques liées à l’hyperglycémie sont associés des facteurs environnementaux et génétiques Exacerbation de 4 voies métaboliques Glucose NADPH NADP+ NAD+ NADH Sorbitol Polyol pathway Gluc-6-P GFAT Fruct-6-P Gln Fructose Glucosamine - 6 - P UDP - GIcNac Glu Hexosamine pathway NADH DHAP Gly-3-P NAD+ GAPDH NADH 1,3 – Di-P-glycerate NAD+ α - Glycerol - P DAG Protein kinase C pathway Methylglyoxal . O2 . OH PKC AGEs AGE pathway adapted from M. Brownlee, (Nature 2001) Voie des polyols Lorsque la concentration en glucose devient élevée des polyols dans les tissus insulino-indépendant Glucose NADPH AR Sorbitol NADP+ Activation de la voie SDH NAD+ Fructose NADH Conséquences : Baisse des coenzymes (NADPH, NAD+) Baisse du GSH Baisse de l’activité des enzymes antioxydantes Accumulation de sorbitol et de fructose peu diffusibles (osmolarité) Rôle dans la neuropathie diabétique (pseudo ischémie de l’hyperglycémie) AR : Aldolase Reductase SDH : sorbitol Deshydrogenase Activation des hexosamines En période hyperglycémique L’excès d’héxosamines favorise la transcription des gènes des facteurs de croissance par N-acétyl-glucosaminylation Principalement le VEGF, facteur proangiogénique et de perméabilité capillaire Glucose G 6-P Glucosamine (GlcN) F 6-P GlcN 6-P glycolyse UDP-GlcN O-glycosylation des protéines Rôle central dans la rétinopathie proliférante (prolifération de néovaisseaux) Activation des PKC En période hyperglycémique Activation liée principalement à l’augmentation de la formation de DAG (DiAcylGlycérol), activateur de PKC, à partir des phosphatidyl inositol membranaire Voies d’activation associées aux PKCs stress oxydant - AGE - VEGF Conséquences : • augmentation de la perméabilité vasculaire • augmentation de l’endothéline • diminution du NO responsables d’une diminution du flux sanguin rétinien (ischémie), • augmentation de l’angiogenèse et de la croissance cellulaire • Inhibition de la réponse métabolique induite par l’insuline Impliquées dans la rétinopathie, la néphropathie et la neuropathie AGEs ( Produits de Glycation avancée ) Impliqués dans les complications microvasculaires du diabétique Ils sont la conséquence de l’HYPERGLYCEMIE Ils sont formés par des réactions non-enzymatiques entre les groupements aminés des protéines et le glucose ou un de ses dérivés Inducteurs hors de la cellule : GLUCOSE ; FRUCTOSE Inducteurs intracellulaire : dérivés carbonyles du glucose 3-DEOXY GLUCOSONE (décomposition des produits d’Amadori) GLYOXAL (auto-oxydation du glucose) METHYL GLYOXAL (Fragmentation du Glycéraldéhyde 3-P et DHAP) Glycation non enzymatique des protéines Réaction de Maillard in vivo qui conduit à la formation des produits avancés de la glycation (AGEs) Produits précoces de la glycation Glucose [Base de Schiff] Produits d’Amadori (fructosamine) Transformation Produits intermédiaires de la glycation Produits avancés (terminaux) de la glycation (1,3 ou 4)-Deoxyglucosone CML Phase de propagation de la glycation Pyrraline Glycation: produits intermédiaires Produits intermédiaires de la glycation : aldéhydes réactifs Glucose Peroxidation Lipidique Pr NH2 Glycolyse (Degradation) Base de Schiff Voie des Polyols Trioses Phosphate Glyoxal Methylglyoxal Glycation Produits d’Amadori 3-Deoxyglucosone α-cétoaldehydes Glycation: produits intermédiaires Produits intermédiaires de la glycation : aldéhydes réactifs Degradation du glucose Voie des Polyols Lipid Peroxidation Produits d’Amadori Trioses Phosphate H3 C C α CH 3-Deoxyglucosone H C α HO HO HO O O CH O O HC α Methylglyoxal O Glyoxal O α-cétoaldehydes CH2OH Glycation: Produits avancés de glycation Produits avancés de la glycation Glucose Pr NH2 Base de Schiff Pr NH2 Produits d’Amadori (fructosamine) Pr NH2 AGEs Intermédiaires glycolytiques : Trioses Phosphate Peroxydation Lipidique stress oxydant / Diabète Voie métabolique obligatoire impliquée très précocement dans l’évolution du diabète et responsable de l’ensemble des complications par interaction avec les autres voies. hypothèse unifiante de Brownlee (Nature 2001) ERO et action l’insuline Voie PIP3 IR SS YP YP YP YP YP YP YP YP YP B 1 P IRS-1 T P PKC λ,ζ YP PH PP2A YP EN T P PIP3 PH kinase YP PTB PIP3 PH PKB YP PIP3 PH PDK1/2 YP SS SH2 SH2 SS PI-3K Synthèse glycogène GSK3 Transport glucose ERO et action l’insuline Protéine-YP active Protéine-YOH PTP-SH HCXXAGXXRSG O2•Inactive PTP-SOH mais réversible O2•Inactive PTP-SO2H et irréversible Forme acide sulfenique Forme acide sulfinique ERO et action l’insuline O2•- IR SS SS SOD H2O2 Glucose SS NAD(P)H oxydase ? DPi Inhibition des PTPases ou autre(s) intervenant(s) thiol ? O2•H2O2 de YP de IR et IRS (48% et 43%) AUGMENTATION DE LA REPONSE BIOLOGIQUE ERO et action l’insuline Voie MAPK IR SS PH Ras GTP PTB GDP Raf YP YP SOS MEK M MAPK Grb2 YP YP SS SS YP YP YP YP YP YP YP YP YP -1 P K Différenciation Croissance cellulaire YP ERO et resistance à l’insuline (1/2) ERO médiateurs cellulaires ERO sont des médiateurs cellulaires qui activent de nombreuses voies sensibles au stress oxydant dommages cellulaires Certaines de ces voies sont impliquées dans de la RI Voie de NFκB impliquée dans la réponse immunitaire, l’inflammation et l’apoptose NFκB régule un grand nombre de gènes dont plusieurs associés aux complications du diabète (VEGF; RAGE) Activation de NFκB induit des phosphorylation sur ser protéasome Activation de NFκB activation de PKC, augmentation des AGEs ERO et resistance à l’insuline (2/2) ERO médiateurs cellulaires Voie de Jnk super famille des MAPKinases; Jnk / P38 kinases du stress Jnk activées par stress endogène / exogène ; choc osmotique, cytokines proinflammatoires Jnk activées apoptose Voie de P38 super famille des MAPKinases; Jnk / P38 kinases du stress P38 activées hyperglycémie; diabètes ERO action de NFκB (monocyte) Stress oxydant NFκB Protéines d’adhésion Cytokines eNOS MCP-1 REMODELAGE VASCULAIRE VCAM-1 ERO et résistance à l’insuline Glucose Acides gras ERO mitochondries Dommages macromoléculaires Stress oxydant NFκB Jnk P38 Hexosamines Sorbitol AGEs DAG RAGE PKC Résistance à l’insuline cytokines Dysfonction des cellules β ERO et résistance à l’insuline Glucose Acides gras cytokines YP SS SS SS YP PTB YP YP YP YP YP YP YP YP IRS-1 ERO / ERN YP YP Réponse normale à l’insuline YP YP SS SS PH SH2 SH2 SS IR PI-3K YP YP YP YP YP SP YP YP SP PH PTB IRS-1 YP SP YP SP IKKB Jnk ERK autres kinases Peu ou pas de réponse à l’insuline SH2 SH2 IR PI-3K CASCADE D ’EVENEMENTS METABOLIQUES HYPERGLYCEMIE AGEs VOIE DES POLYOLS NADH/NAD+ O2•- NO DAG PKC VEGF LESIONS CELLULAIRES Na/K ATPase CONCLUSIONS • La connaissance des mécanismes moléculaires liées à l’hyperglycémie chronique et impliqués dans les complications dégénératives ouvre de nouvelles perspectives thérapeutiques • Les voies d’altération glycémique alimentent la production radicalaire mitochondriale, responsable du stress oxydant La recherche s’oriente vers des thérapeutiques ayant une action synergique sur toutes les voies ou luttant contre le stress oxydant Biologie moléculaire et régulation de la communication cellulaire Aspects fondamentaux et cliniques Méthodes et outils d’étude du métabolisme Introduction à la communication et à la signalisation cellulaire J. Giudicelli 3h 13 mars J. Giudicelli 3h 20 mars Glucotoxicité (glycation / stress oxydant) J. Giudicelli 3h 27 mars Acides gras nutritionnels et signalisation P. Grimaldi 2h 03 avril Métabolisme des lipoprotéines / Dislipidémies P Bayer 2h 03 avril Modes d'action moléculaires, fonctions biologiques, pathologies associées et nouvelles stratégies thérapeutiques V Goffin 2h 10 avril Signalisation dans le tissu osseux : Applications actuelles et futures. H Schmid-Antomarchi 2h 10 avril Chimiokines et cancer A Schmid-Alliana 2h 17 avril Thérapie génique du diabète F Suavet 2h 24 avril Spectrométrie de masse ; applications médicales M Samson 2h 24 avril Les voies de signalisation et de transduction des signaux Grandes voies de signalisation médiées par l'insuline / résistance à l’insuline Homéostasie du glucose/ métabolisme lipidique/ Pathologies associées Signalisation et pathologies Approches méthodologiques modernes Biologie moléculaire et régulation de la communication cellulaire Aspects fondamentaux et cliniques Voies de signalisation autres Le contrôle génétique du "milieu intérieur chez la drosophile P Léopold 2h 15 mai Voies de signalisation et mitochondries B Sibille 2h 15 mai Voies de signalisation mTOR, insulino-résistance et déficience en synthèse protéique I Satney 2h 22 mai Sarcopénie (à définir) St Schneider 2h 22 mai Signalisation et nutrition
