Le contrôle du transport de K+ chez les plantes : analyse

PROPOSITION DE STAGE M2R: Laboratoire BPMP, UMR5004, Équipe Canaux ioniques
Le contrôle du transport de K+ chez les plantes : analyse moléculaire
de l’adressage des sous-unités Shaker à la membrane plasmique des
cellules végétales
Responsables: Manuel Nieves-Cordones (post-doctorant, [email protected]) & Isabelle Gaillard
(CR, HDR, [email protected])
Contexte : Chez les plantes, le potassium (K+ ) est impliqué dans des fonctions très intégrées comme
le contrôle de l'ouverture stomatique et des échanges gazeux, la montée de sève brute ou la circulation
de la sève phloémienne, l'élongation cellulaire et la croissance. Les canaux potassiques de type Shaker
dominent la conductance potassique en étant responsables des flux de K
+ massifs à travers la
membrane plasmique des cellules végétales (Véry et Sentenac, 2003). Chez Arabidopsis thaliana, la
famille des gènes Shaker comprend 9 membres codant des sous-unités capables de s'associer pour
former des canaux fonctionnels tétramériques à la membrane plasmique. On parle d’homotétramère
lorsque les 4 sous-unités sont identiques, c'est-à-dire codées par le même gène, et d’hétérotétramère
lorsqu’elles sont codées par des gènes Shaker différents. Ce phénomène d'hétérotétramérisation génère
une grande diversité fonctionnelle, l’hétérotrétramère possède des propriétés distinctes de celles de ses
sous-unités parentales. Les sous unités Shaker possèdent toutes une structure commune caractérisée
par un domaine hydrophobe constitué de six segments transmembranaires suivi d’un long domaine C-
terminal intracellulaire. Chez Arabidopsis thaliana, la sous-unité Shaker AtKC1 occupe une place
particulière en constituant une sous-unité régulatrice de l'ensemble des autres canaux Shaker entrant.
Exprimée seule, AtKC1 reste électriquement silencieux, localisé au niveau du réticulum
endoplasmique (RE) et incapable de former des homotétramères fonctionnels à la membrane
plasmique. Co-exprimée avec une autre sous-unité Shaker de type canal entrant, AtKC1 forme des
canaux hétérotétramériques adressés à la membrane plasmique et possédant des caractéristiques
fonctionnelles qui leur sont propres (Duby et al, 2008; Jeanguenin et al. 2011).
Des résultats récents, obtenus dans l'équipe, indiquent que la région C-terminale d’AtKC1 est
impliquée dans la rétention de cette sous-unité au niveau du RE en absence d'interaction avec d'autres
sous-unités Shaker. Afin de pouvoir identifier précisément les déterminants moléculaires responsables
du non adressage d’AtKC1 à la membrane plasmique, nous avons analysé au laboratoire une série de
chimères d’adressage obtenues par l’échange progressif de sous domaines de la région C-terminale
d’AtKC1 avec les sous domaines correspondants d’un Shaker capable de s’adresser à la membrane.
Cette étude a été complétée par une analyse fine, effectuée par mutagénèse dirigée, des sous domaines
retenus couplée à l’établissement d’un modèle en 3D, élaboré en collaboration avec une équipe du
Centre de Biologie Structurale de Montpellier (Alain Chavanieu). Quatre acides aminés impliqués
dans la rétention de cette sous unité au niveau du RE et/ou la fonctionnalité d’AtKC1 ont été
identifiés.
L’objectif du stage consistera à analyser l’importance de ces acides aminés dans l’adressage et le
fonctionnement des différentes sous-unités formant les canaux potassiques (d'absorption) chez
différentes espèces (Arabidopsis, riz, Medicago truncatula), et ainsi examiner comment les
déterminants moléculaires d’adressage et de fonctionnalité identifiés chez AtKC1 se retrouvent chez
d'autres canaux Shaker végétaux.
Méthodologies mises en œuvre : Les ADNc des canaux ciblés sont tous disponibles dans l'équipe
d'accueil. A partir de cet acquis, le travail expérimental sera:
1- Construction des différentes chimères selon la technique des ponts PCR (Mehta et Singh, 1999) -
mutagénèse dirigée – utilisation du système Gateway.
2- Localisation subcellulaire des différentes chimères obtenues par microscopie confocale après
transformation transitoire de protoplastes de feuille de tabac.
3- Analyse fonctionnelle des chimères obtenues par électrophysiologie en ovocyte de xénope.
Références : Mehta, R.K. et Singh, J. (1999) Biotechniques, 26, 1082-1086 – Duby et al. (2008) Plant J., 53, 115-123 Jeanguenin et al. 2011,
Plant J., 67, 570-582 -Véry, A.A et Sentenac, H (2003).. Annu. Rev. Plant Biol.. 54, 575–603.