PROPOSITION DE STAGE M2R: Laboratoire BPMP, UMR5004, Équipe Canaux ioniques Le contrôle du transport de K+ chez les plantes : analyse moléculaire de l’adressage des sous-unités Shaker à la membrane plasmique des cellules végétales Responsables: Manuel Nieves-Cordones (post-doctorant, [email protected]) & Isabelle Gaillard (CR, HDR, [email protected]) Contexte : Chez les plantes, le potassium (K+ ) est impliqué dans des fonctions très intégrées comme le contrôle de l'ouverture stomatique et des échanges gazeux, la montée de sève brute ou la circulation de la sève phloémienne, l'élongation cellulaire et la croissance. Les canaux potassiques de type Shaker dominent la conductance potassique en étant responsables des flux de K+ massifs à travers la membrane plasmique des cellules végétales (Véry et Sentenac, 2003). Chez Arabidopsis thaliana, la famille des gènes Shaker comprend 9 membres codant des sous-unités capables de s'associer pour former des canaux fonctionnels tétramériques à la membrane plasmique. On parle d’homotétramère lorsque les 4 sous-unités sont identiques, c'est-à-dire codées par le même gène, et d’hétérotétramère lorsqu’elles sont codées par des gènes Shaker différents. Ce phénomène d'hétérotétramérisation génère une grande diversité fonctionnelle, l’hétérotrétramère possède des propriétés distinctes de celles de ses sous-unités parentales. Les sous unités Shaker possèdent toutes une structure commune caractérisée par un domaine hydrophobe constitué de six segments transmembranaires suivi d’un long domaine Cterminal intracellulaire. Chez Arabidopsis thaliana, la sous-unité Shaker AtKC1 occupe une place particulière en constituant une sous-unité régulatrice de l'ensemble des autres canaux Shaker entrant. Exprimée seule, AtKC1 reste électriquement silencieux, localisé au niveau du réticulum endoplasmique (RE) et incapable de former des homotétramères fonctionnels à la membrane plasmique. Co-exprimée avec une autre sous-unité Shaker de type canal entrant, AtKC1 forme des canaux hétérotétramériques adressés à la membrane plasmique et possédant des caractéristiques fonctionnelles qui leur sont propres (Duby et al, 2008; Jeanguenin et al. 2011). Des résultats récents, obtenus dans l'équipe, indiquent que la région C-terminale d’AtKC1 est impliquée dans la rétention de cette sous-unité au niveau du RE en absence d'interaction avec d'autres sous-unités Shaker. Afin de pouvoir identifier précisément les déterminants moléculaires responsables du non adressage d’AtKC1 à la membrane plasmique, nous avons analysé au laboratoire une série de chimères d’adressage obtenues par l’échange progressif de sous domaines de la région C-terminale d’AtKC1 avec les sous domaines correspondants d’un Shaker capable de s’adresser à la membrane. Cette étude a été complétée par une analyse fine, effectuée par mutagénèse dirigée, des sous domaines retenus couplée à l’établissement d’un modèle en 3D, élaboré en collaboration avec une équipe du Centre de Biologie Structurale de Montpellier (Alain Chavanieu). Quatre acides aminés impliqués dans la rétention de cette sous unité au niveau du RE et/ou la fonctionnalité d’AtKC1 ont été identifiés. L’objectif du stage consistera à analyser l’importance de ces acides aminés dans l’adressage et le fonctionnement des différentes sous-unités formant les canaux potassiques (d'absorption) chez différentes espèces (Arabidopsis, riz, Medicago truncatula), et ainsi examiner comment les déterminants moléculaires d’adressage et de fonctionnalité identifiés chez AtKC1 se retrouvent chez d'autres canaux Shaker végétaux. Méthodologies mises en œuvre : Les ADNc des canaux ciblés sont tous disponibles dans l'équipe d'accueil. A partir de cet acquis, le travail expérimental sera: 1- Construction des différentes chimères selon la technique des ponts PCR (Mehta et Singh, 1999) mutagénèse dirigée – utilisation du système Gateway. 2- Localisation subcellulaire des différentes chimères obtenues par microscopie confocale après transformation transitoire de protoplastes de feuille de tabac. 3- Analyse fonctionnelle des chimères obtenues par électrophysiologie en ovocyte de xénope. Références : Mehta, R.K. et Singh, J. (1999) Biotechniques, 26, 1082-1086 – Duby et al. (2008) Plant J., 53, 115-123 Jeanguenin et al. 2011, Plant J., 67, 570-582 -Véry, A.A et Sentenac, H (2003).. Annu. Rev. Plant Biol.. 54, 575–603.