Les systèmes de réparation de l`ADN
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10/02/2016 Stratégies diagnostiques et thérapeutiques innovantes Responsable : P.O. Schischmanoff 01 48 95 59 28 Programme 2016 : 8 cours - 2 ECTS date 09 02 horaire Salle intervenant intitulé P.O. Dépistage et diagnostic moléculaire des formes 16 - 18h 1-154 Schischman héréditaires de cancer colorectal off 16 02 16 - 18h 1-142 G. des Guetz Biothérapies des cancers et résultats cliniques 23 02 16 - 18h 1-154 15 03 C. LaguillierCiblage thérapeutique et biothérapies Morizot Diagnostic moléculaire des anémies corpusculaires 16 - 18h 1-145 E. Fabre héréditaires P.O. Nouvelles biothérapies dans le traitement des 16 - 18h 1-144 Schischman anémies off Y. Lalatonne Nanoparticules à visée diagnostique et thérapeutique 16 - 18h 1-133 22 03 16 - 18h 1-144 A. Sutton / P. Nahon 29 03 16 – 18h 1-144 E. Guyot 01 03 08 03 Métabolisme du fer et hémochromatose Glycobiologie et pathologies 1 10/02/2016 Validation • Validation : – Examen écrit d'une heure avril - mai Date affichée par Mme BELKANEM – Présence aux enseignements => Signature feuille émargement Dépistage et diagnostic moléculaire du syndrome HNPCC (cancer colorectal héréditaire sans polypose) 2 10/02/2016 Plan • Contexte • Lésions génotoxiques et variabilité du génome (cf. PAES) • Systèmes de réparation de l’ADN – voies de signalisation induites – conséquence d’une anomalie des S. de réparation • Le syndrome HNPCC Contexte 3-5% des cancers colorectaux sont d'origine héréditaire Biologie : mutations germinales prédisposant aux cancer CRC : 36 000 /an F. héréditaires ~ 1 000 /an Dans une famille donnée, caractériser la mutation : => rassurer les individus non atteints => proposer un suivi adapté aux sujets prédisposés pour prévenir la survenue de cancer 3 10/02/2016 Survie d’une espèce => stabilité de l’information génétique => aptitude à évoluer selon contexte STABILITE EVOLUTION Réplication fidèle de l’ADN Réparation des agressions subies par ADN Évolution information génétique : Mutations ponctuelles Recombinaison (méiose) Mécanismes de réparation de l’ADN Lésions de l’ADN Réactions chimiques endogènes - dépurination - désamination Agents toxiques - endogènes ROS - exogènes * UV, cancérigènes * chimiothérapie Métabolisme ADN - réplication - recombinaison Systèmes de réparation => préserver l’intégrité du génome => prévenir les pathologies 4 10/02/2016 • Les ADN polymérases font des erreurs • Erreurs de réplication un côté positif => moteur de l'évolution les êtres humains ont en moyenne un nucléotide variant tous les 400 bases de l'ADN. à chaque génération de nouvelles mutations sont « testées » …tcagcctgggtgacagagcaagactctgtctcaaaaaaaaaaaaaacaaaaaccaagaaaagaaaaaaaaactcttctaaga ggatttttttttcctggattaaatcaagaaaatgggaattcaaagagatttggaaaaatgagtaacatgattatttactcatc tttttggtatctaacagAAAGAAGATCTGGATATTGTATGTGAAAGGTTCACTACTAGTAAACTGCAGTCCTTTGAGGATTTA GCCAGTATTTCTACCTATGGCTTTCGAGGTGAGgtaagctaaagattcaagaaatgtgtaaaatatcctcctgtgatgacatt gtctgtcatttgttagtatgtatttctcaacatagataaataaggtttggtaccttttacttgttaaatgtatgcaaatctga gcaaacttaatgaactttaactttcaa … Polymorphismes (SNIP) en rouge Fonds génomique • Erreur de réplication le côté "obscur" => pathologies, etc … Plan • Origine des lésions génotoxiques • Les systèmes de réparation de l’ADN • Le syndrome HNPCC 5 10/02/2016 Mécanismes de réparation de l’ADN Entre 1000 et 1 million de lésions de l’ADN par cellule par jour Conséquences Agents génotoxiques C C Cisplatine Arrêt transitoire du cycle cellulaire et réparation Agents alkylants Mort cellulaire C Mécanismes de réparation COOPERATION Hoeijmakers JHJ, Nature, 2001, 411:366-374 systèmes de réparation REPARATION X arrêt cycle cellulaire réparation et survie ? p53 ? apoptose 6 10/02/2016 Cassure double brin de l’ADN et et arrêt du cycle MRN ATM / ATR BRCA1 CHK2 CHK1 p53 c-Abl GADD45a Arrêt du cycle d’après Bernstein et al. / Mutation Research (2002) Cassure double brin de l’ADN et et apoptose MRN BRCA1 ATM / ATR CHK2 CHK1 E2F1 p53 c-Abl p73 GADD45a H-RAS Arrêt du cycle MEKK4 JNK FAS Apoptose Caspase C. Bernstein et al. (2002) 7 10/02/2016 Anomalie des systèmes de réparation de l’ADN Conséquences Agents génotoxiques X Arrêt transitoire du cycle cellulaire C C Cisplatine Agents alkylants Mort cellulaire Anomalie des systèmes de réparation Mutations => accumulation d’erreurs dans l’ADN - Cancers - Maladies héréditaires - Résistance aux agents génotoxiques Hoeijmakers JHJ, Nature, 2001, 411:366-374 Réparation des lésions systèmes de réparation NHEJ NER BER HR MMR X arrêt cycle cellulaire ? p53 apoptose 8 10/02/2016 Mutations favorisant la cancérogenèse I SURVIE systèmes de réparation OK Mutation de p53 - 50 % des cancers ont des mutations de p53 - f. héréditaire : syndrome de Li Fraumeni NHEJ NER BER HR MMR X ? p53 arrêt cycle cellulaire apoptose Mutations favorisant la cancérogenèse II SURVIE Anomalie des systèmes de réparation - K. héréditaires : BRCA1 -> sein - MMR -> colon NHEJ NER BER HR MMR Résistance à la chimiothérapie p53 OK X arrêt cycle cellulaire ? p53 apoptose 9 10/02/2016 Plan • Origine des lésions génotoxiques • Les systèmes de réparation de l’ADN • Exemple d’anomalie d’un système de réparation : le syndrome HNPCC Le syndrome « HNPCC/Lynch » (cancer colique héréditaire non polyposique) • ~ 3-5 % des cancers du colon sont d'origine héréditaire • Formes les plus fréquentes liées à des mutations des gènes codant des protéines du système Mismatch Repair (MMR) : MLH1, MSH2, 6 • Maladie génétique de transmission autosomique dominante • Mutation délétère d’un gène MMR prédispose au cancer colique • N.B. : le spectre des tumeurs associées à ces mutations dépasse les cancers coliques Spectre étroit Spectre large 10 10/02/2016 Importance des risques chez la personne prédisposée Spectre étroit Valeur prédictive de l’existence d’une mutation pré-disposante forte Endomètre Intestin grêle Voies urinaires Spectre large Valeur prédictive de l’existence d’une mutation pré-disposante faible Estomac Ovaires Voies biliaires Glioblastome (Turcot) Pancréas Glandes sébacées (Muir-Torr) - risque de cancer du colon débute vers 20 ans est ~ 80% à 80 ans - risque de cancer de l'utérus débute vers 30 ans est ~50% à 80 ans (Banïti-Pellié et al 2009). Les protéines MMR s’organisent en complexes multiprotéiques Mésappariement Délétion Insertion correction des erreurs de réplication de l’ADN d’après Duval et Hamelin, 2002 11 10/02/2016 Mécanisme moléculaire du syndrome HNPCC Système complexe conservé au cours de l'évolution MSH2 Détecte : - mésappariements - insertions, délétions (1 à 2 nt) MSH6 MLH1 PMS2 MSH2 MSH3 Détecte : - insertions, - délétions > 2 nt MLH1 PMS2 12 10/02/2016 Magnitude et direction de la torsion de l’ADN induite par des mésappariements de l’ADN. A : Modèle d’iso-probabilité de torsion de l’ADN. Les cercles concentriques représentent les angles de torsion respectivement de 15°, 30° et 45°. B : Iso-probabilité de torsion avec un mésappariement G:T en tandem. C : Iso-probabilité de torsion avec un mésappariement C:C. La flèche représente la direction de la torsion vers le petit sillon de l’ADN. Le carré correspond à la probabilité de la stabilité maximale. (Curuksu et al; 2008) 13 10/02/2016 Réparation des mésappariements produits lors de la réplication de l’ADN Réparation des anomalies du brin néo-synthétisé 3’ 5’ 5’ 3’ mésappariement brin matrice brin néo-synthétisé détection du mésappariement MSH2 MSH6 PCNA 5’ 3’ ? MLH1 PMS2 3’ 5’ RFC EXO1 Excision EXO1 RPA RPA Re-synthèse 5’ 3’ RPA Pol d 3’ 5’ Ligation 5’ 3’ 3’ 5’ 14 10/02/2016 Signalisation induite par le système MMR Li 2008 Rôles du système MMR Stabilité génomique Diversité des anticorps • Réparation des mésappariements • Détection lésions ADN chimio-induites • Commutation de classe des Ig • Réparation ponts inter-brins • Mutation hypersomatique des Ig • Inhibition recombinaison homéologue 15 10/02/2016 Syndrome HNPCC = Mutation germinale d’un gène MMR Désorganisation des complexes MMR Perte de la fonction de réparation de l’ADN Instabilité génomique Accumulation de mutations dans l'ensemble du génome tumorigenèse phénotype d’instabilité des microsatellites (MSI) Instabilité des microsatellites (MSI) Les zones de l'ADN très répétitives sont touchées car difficiles à répliquer (microsatellites) Ex : BAT 26 répétition de 26 Thymines (intron 5 gène MSH2) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTT 16 10/02/2016 Conséquences de l’instabilité des microsatellites Les microsatellites sont dispersés dans le génome Majorité localisée dans les régions non codantes => instabilité sans conséquence Certains localisés dans des régions codantes => décalage cadre de lecture => synthèse de protéines anormales ou tronquées => perte de fonction Gènes concernés = gènes cibles de l’instabilité des microsatellites Gènes cibles de l’instabilité des microsatellites Présence d’un microsatellite dans la séquence codante Inhibiteurs de croissance TGFbRII Récepteur facteur de croissance IGFIIR Facteur de croissance WSP-3 Protéines du cycle cellulaire PTEN Facteurs pro-apoptotiques Bax Bcl 10 Caspase 5 FAS APAF1 Réparation de l’ADN RAD50 MSH 3 MSH6 MSH2 BLM CHK1 17 10/02/2016 Mutation d'un gène MMR et progression tumorale Taille BAT 26 26 24 le nombre de gènes touchés 22 18 14 augmente exponentiellement suite à l’inactivation des autres gènes MMR Caractéristiques des cancers liés à une instabilité des microsatellites • • • • prédominent dans le colon proximal peu différenciés tumeurs mucineuses infiltration péri-tumorale de lymphocytes • p53 non mutée • tumeurs diploïdes • souvent peu agressives 18 10/02/2016 Impact pronostique de l’instabilité des microsatellites (MSI vs MSS) • Cancer coliques avec MSI : • meilleur taux de survie Survie globale des patients avec cancer du colon selon statut MSI Survie globale (%) 42 MSI 245 MSS Années Ribic, et al 2003 Impact pronostique de l’instabilité des microsatellites (MSI vs MSS) • Pourquoi un meilleur taux de survie si CRC avec MSI ? - stade tumoral moins avancé au diagnostic - moins de métastases => réduction de ~ 35% du risque de décès (méta analyse sur 1227 patients, Popat, JCO 2005) Gènes cibles de l’instabilité => protéines anormales => stimulation immunité => Infiltration lymphocytaire => meilleur contrôle immunitaire ? 19 10/02/2016 Le diagnostic biologique du syndrome HNPCC Pourquoi un diagnostic biologique ? la découverte de la mutation permet de proposer aux apparentés la recherche de la prédisposition à ce syndrome. - libres de refuser le test - doivent être informés des limites du test - peuvent refuser de prendre connaissance des résultats Un sujet avec une mutation a un risque accru de développer un cancer et aura un suivi médical adapté. N.B. : Un sujet sans mutation a le même risque de développer un cancer du colon qu'un individu de la population générale. 20 10/02/2016 Quelle stratégie de dépistage ? • • Identifier les apparentés à risque Proposer une prophylaxie Clinique critères d’Amsterdam de Bethesda Phénotypage MSI mutation germinale gène MMR Immunohistochimie MLH1 MSH2 MSH6 PMS2 Analyse longue et coûteuse Associer critères cliniques et tests biologiques Au moins 2 personnes apparentées au 1er degré Endomètre atteintes d’un cancer Intestin grêle du spectre étroit Voies urinaires dont l’une avant 50 ans Très spécifiques mais peu sensibles nombreux cas non détectés => critères plus utiles …. 21 10/02/2016 Sélection des patients Critères de Bethesda révisés Les patients concernés présentent l’un des critères suivants : Cancer colorectal diagnostiqué avant 50 ans Second cancer colorectal synchrone ou métachrone ou autre tumeur du spectre HNPCC élargi Cancer colorectal avec au moins un parent au premier degré présentant une tumeur du spectre HNPCC diagnostiquée avant l’âge de 50 ans Cancer colorectal avec au moins deux parents au premier ou au deuxième degré Liste non exhaustive présentant une tumeur du spectre HNPCC indépendamment de l’âge de survenue ces critères sont plus souples que les critères d’Amsterdam => plus de patients y correspondent et sont susceptibles d’être suivis Associer critères cliniques et tests biologiques MSI 22 10/02/2016 Immunohistochimie + : oriente d’emblée vers un gène - : interprétation dépend de l’observateur Témoin interne 23 10/02/2016 Etude expression MLH1 Interprétation dépend de l’observateur MLH1 très sensible à la fixation (faux négatif) B A Immunohistochimie A) Absence d’expression de la protéine MLH1 Absence de marquage nucléaire dans le tissus tumoral. (N.B. : la légère coloration cytoplasmique observée n’est pas un critère de positivité.) Les lymphocytes et macrophages du tissu stromal présentent eux un marquage nucléaire et sont utilisés comme témoin positif. B) Présence de la protéine MSH2 Très nette expression de MSH2 dans les noyaux des cellules tumorales. 24 10/02/2016 Recherche de l’instabilité des microsatellites Phénotypage MSI Phénotypage RER Phénotypage MSI – matériel biologique Pièces exérèse (formol) incluses en paraffine Une lame colorée (Hématéine-Éosine-Safran ) zone tumorale délimitée par le Pathologiste Quatre coupes épaisses blanches contiguës Extraction et quantification de l’ADN 25 10/02/2016 Phénotypage MSI – principe Mesure taille de 5 microsatellites mononucléotidiques monomorphes (R. Hamelin) (Suraweera et al, 2002, Buhard et al, 2006) (BAT 26 : AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA) Tissu normal Taille normale Marqueur raccourci « MSI » Amplification PCR multiplex des 5 marqueurs (pentaplex) Mesure de la taille des fragments par électrophorèse capillaire Avantages Stabilité de la taille des marqueurs dans la population => facile à interpréter => pas besoin de comparer à un tissu normal (ADN leucocytaire) => PCR pentaplex 124 nt 26 10/02/2016 Performance du test : discrimination populations MSS et MSI Suraweera et al, 2004 Répartition des polymorphismes des µS selon les ethnies Conséquences sur l’interprétation Minimum de trois marqueurs instables pour diagnostiquer une MSI En général, en cas d'instabilité, on observe une réduction de la taille de quatre ou cinq des marqueurs. Buhard et al, 2006 27 10/02/2016 Interprétation : Interprétation : MSS = 0/5 marqueurs instables MSI = 5/5 marqueurs instables bp 28 10/02/2016 Limites de la méthode • Mauvaise conservation ADN éviter le Bouin • Faux positifs liés à des polymorphismes (ex. africains) risque limité car il faut 3 marqueurs instables sur 5. • Faux négatifs : MSI non détecté - si moins de 10% des cellules de l'échantillon sont cancéreuses (rôle du pathologiste) Si MSS chez un sujet < 50 ans il faut aller plus loin … Toutefois, phénotype instable ne veut pas toujours dire syndrome HNPCC Intérêt séquençage Méthylation promoteur MLH1 Mutation V600E BRAF nul +++ 100 % 30 % 40 % 0% 29 10/02/2016 Stratégie à l’hôpital Avicenne Tout CRC quel que soit l’âge Phénotypage MSI MSI Rapide Sensible MSS BRAF + Arrêt Si CRC avec MSI d’origine sporadique MSI+ BRAF+ • survenue plus tardive • surtout des femmes • fumeurs 30 10/02/2016 Stratégie à l’hôpital Avicenne Tout CRC quel que soit l’âge Rapide Sensible Phénotypage MSI MSI MSS BRAF IHC - + Arrêt consultation oncogénétique Séquençage (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) 41%, 40%, 12%, 7% Sensibilité 95% Spécificité 65-75 % Répartition des mutations des gènes MMR MLH1 (41%) Domaine ATPase Interaction MSH2/MSH6 MSH2 (40%) Interaction PMS2/MLH3/PMS1 MSH6 (12%) Exon 4 Liaison ADN Interaction MSH3/MSH6 Interaction MLH1/PMS2 PMS2 (7%) Exon 11 31 10/02/2016 Si la recherche de mutation s’avère négative chez le cas index N’élimine pas la possibilité que la personne soit prédisposée. => proposer une surveillance adaptée à tous les apparentés Si une mutation est trouvée chez le cas index Chez le cas index : peut modifier le schéma thérapeutique Chez les apparentés : influence majeure 1°) identifier parmi les apparentés indemnes des personnes porteuses de la mutation et de leur proposer des mesures de prévention - primaire : chirurgie prophylactique - secondaire : dépistage à des fins de diagnostique précoce 2°) rassurer les apparentés non porteurs de la mutation sont affranchis d’une surveillance étroite 32 10/02/2016 Suivi des apparentés porteurs d'une mutation MMR Côlon et rectum Dépistage des tumeurs colorectales par coloscopie, à débuter au plus tard à 25 ans, sans doute pas avant l’âge de 20 ans, et à répéter tous les 2 ans. Endomètre La mesure de l’épaisseur endométriale par échographie ou l’évaluation de la cavité utérine par hystéroscopie peuvent être proposées annuellement à partir de 30 ans. Autres localisations Compte tenu des fréquences de ces cancers, la chirurgie prophylactique n’est pas indiquée. Bénéfice des mesures de prévention Surveillance par coloscopie très efficace Permet : - diagnostic précoce à un stade précoce - prévention grâce à l’identification et à l’exérèse des polypes => réduction très importante (>60%) du risque et de la mortalité par cancer colo-rectal Aussi la chirurgie prophylactique n’est pas recommandée chez une personne indemne Bénéfice moins bien évalué dans les autres cancers du spectre HNPCC 33 10/02/2016 Impact psycho-social des tests Modéré Période vulnérabilité dans les 15 jours suivant l’annonce augmentation transitoire de l’anxiété et de la détresse en cas de résultat positif A moyen terme niveaux anxiété et détresse sont identiques à 12 mois à Ceux avant le test 34
