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2e mini-colloque international
de biologie prospective : gènes candidats de risque
cardiovasculaire et implications thérapeutiques
(Nancy, 22-23 mars 1999)
S. Bernard*
L
es maladies cardiovasculaires sont
des pathologies multifactorielles
pour lesquelles les interactions entre gènes
et environnement sont importantes à
connaître. La part de l’influence de la
génétique dans ces affections mérite
d’être précisée et étudiée. Les gènes
impliqués dans le métabolisme lipidique,
la croissance des cellules bordant les vaisseaux, le développement de la matrice
extracellulaire, les phénomènes de
thrombose et de coagulation, l’inflammation et dans bien d’autres mécanismes,
doivent être évalués comme des gènes
candidats de risque cardiovasculaire. De
nombreux polymorphismes ont été
décrits, qui entraînent des variations dans
l’effet de ces gènes ou des associations
plus ou moins fortes avec ces pathologies.
Ce deuxième colloque international de
biologie prospective a fait le point sur les
avancées technologiques dans le domaine de la biologie moléculaire appliquée
au déterminisme génétique des maladies
cardiovasculaires. La recherche s’oriente
vers une optimisation technologique
permettant d’augmenter le nombre
d’échantillons ou de polymorphismes
explorés de façon simultanée, et de
diminuer le volume des échantillons
ainsi que le temps de manipulation.
* Service d’endocrinologie et des maladies
de la nutrition, hôpital de l’Antiquaille, Lyon.
Ce mini-colloque était structuré en trois
parties :
• D’abord, il y eut un rappel des techniques utilisées pour extraire et conserver
l’ADN, mesurer les polymorphismes et
évaluer leurs effets sur des modèles cellulaires ou des animaux transgéniques.
• Puis, des exemples de polymorphismes
intéressants ont été présentés au cours
de sessions de communications plus spécialisées (hématologie, métabolisme
lipidique, effet de l’environnement, en
particulier de l’alimentation).
• Enfin, un dernier volet avait pour
objectif de relier ces polymorphismes à
la thérapeutique et au domaine en plein
développement de la pharmacogénomique.
Ce mini-colloque a rassemblé des chercheurs de quinze pays différents, des
industriels et des étudiants en thèse.
Les progrès technologiques :
quelques exemples
Détection de mutations inconnues
L’équipe du Dr Hanash (University of
Michigan Medical Center) a mis au point
une technologie permettant de détecter à
large échelle et de façon simultanée des
variations génétiques et épigénétiques au
sein de l’ADN génomique, grâce à l’analyse
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informatique des fragments de restriction
séparés par électrophorèse bidimensionnelle.
L’ADN subit une digestion enzymatique
suivie d’un marquage radio-isotopique des
sites de clivage. Les fragments de restriction
sont séparés par électrophorèse selon une
première dimension, puis sont soumis à une
seconde digestion in situ avant une nouvelle
séparation par électrophorèse selon une
deuxième dimension. Un système informatique spécifique va détecter la présence de
fragments polymorphiques qui pourront être
clonés, puis introduits dans des vecteurs
d’expression afin d’être séquencés. Cette
technique peut également être employée
avec des enzymes sensibles à la méthylation
et permettre ainsi de connaître l’activation
de gènes en fonction des tissus étudiés.
Détections de mutations connues
Les laboratoires Roche (Dr Cheng, Roche
Molecular System) ont développé une
technique permettant de détecter de façon
simultanée trente-cinq variations génotypiques connues au niveau de quinze gènes
candidats pour le développement et la
progression des maladies cardiovasculaires.
Chaque échantillon est soumis à deux PCR
multiplex : l’une avec quatorze paires d’oligonucléotides, l’autre avec treize paires. Les
fragments amplifiés sont ensuite hybridés
avec les sondes oligonucléotidiques polymorphiques spécifiques, et la détection s’effectue par méthode de fluorescence. Les
gènes candidats étudiés sont impliqués dans
le métabolisme lipidique, la régulation de la
pression artérielle, la coagulation, le métaLe Courrier de l’Arcol (1), n° 2, juin 1999
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bolisme de l’homocystéine et l’adhésion des
leucocytes à la paroi artérielle.
Apport des modèles
animaux pour une meilleure
compréhension physiopathologique des maladies
cardiovasculaires
L’amélioration des vecteurs viraux de type
adénovirus permet maintenant d’obtenir une
expression prolongée et stable d’un transgène sans toxicité décelable à moyen terme,
notamment hépatique. Cela peut permettre
d’éviter d’avoir recours à des lignées d’animaux transgéniques, technique lourde et
coûteuse. De plus, l’animal est son propre
contrôle par comparaison des phénotypes
pré- et post-transfert. Cette approche a été
employée par l’équipe du Dr Chan (Baylor
College of Medicine, Houston) avec le
gène du récepteur aux VLDL. Après transgenèse, les souris sont protégées vis-à-vis
de l’hypercholestérolémie induite par un
régime riche en graisses. Chez des souris
déficientes en récepteurs aux LDL, le transfert du gène du récepteur aux VLDL permet
de réduire les concentrations de cholestérol
LDL en augmentant le catabolisme des IDL.
L’obtention de vecteurs adénoviraux mieux
tolérés va permettre leur expérimentation
plus large dans le domaine de la thérapie
génique. Chez ces souris, l’efficacité d’expression du transgène est de presque 100 %.
Cette expression s’effectue de façon spécifique au niveau hépatique, où environ 90 %
des hépatocytes expriment le transgène.
L’expression est immédiate après l’injection, dose-dépendante, régulable par un promoteur, et se maintient un à deux ans. Cette
technique permet donc d’évaluer à la fois
les effets aigus et chroniques du transgène.
L’équipe du Dr Chan a également rapporté
les résultats de l’inactivation de l’anti-oncogène p53 dans le modèle d’athérosclérose
des souris déficientes en ApoE. L’anti-oncogène p53 est exprimé dans les lésions athéromateuses et pourrait intervenir dans le
processus inflammatoire de l’athérosclérose. L’inactivation de p53 accroît les
lésions de ces souris par augmentation de la
prolifération cellulaire et non par celle du
phénomène d’apoptose. Les lésions d’athéLe Courrier de l’Arcol (1), n° 2, juin 1999
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rosclérose ne sont pas augmentées chez les
souris déficientes en p53 mais avec expression normale de l’ApoE.
N. Duverger (Rhône-Poulenc Rohrer,
Vitry/Seine ; Institut Pasteur, Paris) a utilisé les souris déficientes en ApoE pour évaluer la régression de l’athérosclérose après
transfert du gène de l’ApoE. Ces souris de
souche nude étaient immunodéficientes, ce
qui a permis une meilleure tolérance du
transgène. Il a été observé une réduction des
lésions athéromateuses après injection du
transgène de l’ApoE, et ce de façon indépendante de la baisse en cholestérol, ce qui
suggère un effet direct de l’ApoE au niveau
de la plaque.
Applications cliniques
Stratégie de recherche des gènes
de prédisposition aux maladies
cardiovasculaires
(L.Tiret, INSERM U525, Paris)
Elle repose principalement sur l’étude des
variations génotypiques de gènes candidats,
les études de liaisons génétiques étant peu
adaptées aux maladies multifactorielles
comme les maladies cardiovasculaires.
Il faut tester par analyse statistique l’association entre le polymorphisme étudié
(génotype) et le phénotype, qui peut être la
maladie elle-même (événements cardiovasculaires) ou un phénotype intermédiaire
comme les marqueurs ou facteurs de risque
cardiovasculaires, qu’ils soient cliniques
(pression artérielle), biologiques (cholestérolémie) ou morphologiques (épaisseur intima-média). Le phénotype intermédiaire doit
avoir une héritabilité plus forte et un déterminisme génétique moins complexe que la
maladie. Il doit également être mesurable
avant l’apparition de la maladie et permettre
une meilleure compréhension physiopathologique de celle-ci.
Le nombre de polymorphismes détectables
dans un gène est corrélé à la longueur explorée de ce gène, mais il existe des gènes pour
lesquels on ne trouve pas de polymorphisme.
En moyenne, on peut mettre en évidence
quatre à cinq polymorphismes par gène. On
peut calculer la diversité nucléotidique d’un
gène en fonction du rapport fréquence polymorphique/nombre de paires de base explorées. Elle augmente dans les régions flanquantes non codantes. Les polymorphismes
peuvent être synonymes ou non synonymes,
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entraînant dans ce cas un changement d’acide
aminé. Les différents polymorphismes d’un
gène sont le plus souvent en déséquilibre de
liaison les uns avec les autres.
Étude génétique de l’hyperlipidémie
combinée familiale (HCF)
(Dr Enholm, Helsinki, Finlande)
Cette dyslipidémie a une prévalence de 1 à
2 % et elle est responsable de 10 à 20 % des
événements coronariens précoces. Il s’agit
de la dyslipidémie génétique la plus fréquente. Aucun gène majeur n’a été impliqué, son mode de transmission est inconnu
et son déterminisme génétique hétérogène.
Le phénotype lipidique est variable (de type
IIa, IIb, ou IV), ce qui rend difficile le diagnostic clinico-biologique et l’étude génotypique. Cette étude finlandaise a déterminé
les marqueurs polymorphiques intragéniques et les zones flanquantes de dix
régions chromosomiques contenant des
gènes candidats pour le métabolisme lipidique chez plus de trente familles porteuses
d’HCF. Une région chromosomique a été
incriminée par cette étude de liaison : 1q21q23. Parmi les gènes proches de ce locus, on
trouve celui de l’ApoAII, mais il reste néanmoins trop éloigné des marqueurs polymorphiques pour être mis en cause. La
recherche d’un gène plus proche est en
cours. Deux autres loci semble également
associés à l’HCF dans cette étude familiale :
10p11.2 lorsqu’il existe une hypertriglycéridémie, et 21q21 lorsqu’il existe une élévation de l’ApoB.
Conclusion
Les modèles animaux surexprimant ou au
contraire n’exprimant plus un gène candidat
pour le processus de l’athérosclérose améliorent la compréhension des mécanismes
reliant facteurs de risque et maladies cardiovasculaires. Ils pourront également être à
l’origine d’innovations thérapeutiques.
D’autre part, les progrès technologiques
vont permettre d’explorer de façon simultanée un grand nombre de polymorphismes
ou de patients. Cela est indispensable si l’on
veut à plus long terme développer l’approche multigénique du risque cardiovasculaire dans le cadre d’une politique de prévention.
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