Modulation de l`expression de gènes reliés à la virulence et au

Modulation de l’expression de gènes reliés à la
virulence et au stress chez Porphyromonas gingivalis
par les polyphénols du thé vert
Mémoire
Jade Fournier Larente
Maîtrise en microbiologie
Maître ès science (M.Sc.)
Québec, Canada
 Jade Fournier Larente, 2014
II
RÉSUMÉ
Dans ce projet, la capacité des polyphénols du thé vert à moduler l’expression de
certains gènes chez Porphyromonas gingivalis, le principal agent étiologique de la
parodontite chronique, a été évaluée. Une analyse par PCR quantitative a démontré qu’à
des concentrations sous-inhibitrices, l’extrait de thé vert ainsi que l’épigallocatéchine-3gallate (EGCG) réduisent à différents degrés le niveau d’expression de gènes codant pour
d’importants facteurs de virulence chez P. gingivalis. Ces facteurs participent notamment à
la colonisation, l’acquisition des nutriments et la destruction tissulaire. De plus, les deux
composés ont augmenté le niveau d’expression du gène codant pour la protéine de
résistance au stress HtrA chez P. gingivalis. Les résultats de cette étude suggèrent que le
thé vert et l’EGCG pourraient contribuer à réduire la virulence de P. gingivalis, supportant
ainsi une potentielle utilisation pour la prévention et le traitement de la parodontite.
III
IV
TABLE DES MATIÈRES
RÉSUMÉ .............................................................................................................................. III
TABLE DES MATIÈRES ..................................................................................................... V
LISTE DES FIGURES ....................................................................................................... VII
LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................... IX
LISTE DES ABRÉVIATIONS ........................................................................................... XI
REMERCIEMENTS ........................................................................................................... XV
1 INTRODUCTION ............................................................................................................ 1
1.1 Structure du parodonte ............................................................................................... 1
1.2 Maladies parodontales ............................................................................................... 2
1.2.1 Généralités .......................................................................................................... 2
1.2.1.1 Gingivite ...................................................................................................... 2
1.2.1.2 Parodontite ................................................................................................... 2
1.3 Étiologie des maladies parodontales .......................................................................... 5
1.3.1 Composante bactérienne ..................................................................................... 5
1.3.1.1 Parodontopathogènes ................................................................................... 5
1.3.1.2 Porphyromonas gingivalis ........................................................................... 6
1.3.1.2.1 Facteurs de virulence ............................................................................ 7
1.3.1.2.2 Mécanismes de réponse aux stress...................................................... 10
1.3.2 Composante inflammatoire ............................................................................... 11
1.4 Polyphénols .............................................................................................................. 12
1.4.1 Généralités ........................................................................................................ 12
1.4.2 Classification .................................................................................................... 12
1.4.3 Thé .................................................................................................................... 14
1.4.4 Thé vert ............................................................................................................. 15
1.4.4.1 Composition ............................................................................................... 16
1.4.4.2 Effets bénéfiques sur la santé générale ...................................................... 17
1.4.4.3 Effets bénéfiques sur la santé buccale ....................................................... 17
1.4.4.3.1 Halitose ............................................................................................... 17
1.4.4.3.2 Carie dentaire ...................................................................................... 18
1.4.4.3.3 Parodontite .......................................................................................... 19
2 PROBLÉMATIQUE ....................................................................................................... 21
2.1 Hypothèse de recherche ........................................................................................... 21
2.2 Objectifs ................................................................................................................... 21
3 MATÉRIEL ET MÉTHODES........................................................................................ 23
3.1 Composantes à l’étude ............................................................................................. 23
3.2 Souche bactérienne et conditions de croissance ...................................................... 23
3.3 Détermination des concentrations minimales inhibitrices ....................................... 24
3.4 Traitements de Porphyromonas gingivalis .............................................................. 24
3.4.1 Évaluation de l’expression de gènes ................................................................. 25
3.4.1.1 Extraction de l’ARN .................................................................................. 25
V
3.4.1.2 Évaluation de la pureté et de la concentration des ARN ........................... 25
3.4.1.3 Préparation des ADN complémentaires par transcriptase inverse ............ 26
3.5 Préparation des amorces .......................................................................................... 26
3.6 PCR quantitative ..................................................................................................... 27
3.7 Analyse statistique................................................................................................... 29
4
RÉSULTATS ................................................................................................................. 31
4.1 Concentrations minimales inhibitrices .................................................................... 31
4.2 Expression des gènes codant pour les facteurs de virulence ................................... 31
4.2.1 Effet de l’extrait de thé vert.............................................................................. 31
4.2.2 Effet de l’EGCG ............................................................................................... 35
4.1 Expression du gène codant pour la protéine de stress HtrA .................................... 39
4.1.1 Effet de l’extrait de thé vert.............................................................................. 40
4.1.2 Effet de l’EGCG ............................................................................................... 41
5
DISCUSSION ................................................................................................................ 43
6
ANNEXE ....................................................................................................................... 53
7
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ....................................................................... 57
VI
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Représentation schématique des tissus de soutien de la dent (figure traduite et
adaptée de Encyclopædia Britannica, Inc. 2013). ................................................................... 1
Figure 2 : Représentation des complexes bactériens selon Socransky et collaborateurs (28).
................................................................................................................................................ 6
Figure 3 : Modes de production et composition en polyphénols des divers thés (figure
adaptée de Cooper et collaborateurs (80)). .......................................................................... 15
Figure 4 : Structure moléculaire de l’épigallocatéchine-3-gallate. ....................................... 16
Figure 5 : Effets de concentrations croissantes d’extrait de thé vert sur l’expression des
gènes codant pour les facteurs de colonisation HagA, HagB et FimA chez P. gingivalis
ATCC 33277. ........................................................................................................................ 33
Figure 6 : Effets de concentrations croissantes d’extrait de thé vert sur l’expression des
gènes codant pour les facteurs impliqués dans la destruction tissulaire et l’inactivation des
mécanismes de défense de l’hôte soit les protéases RgpA et Kgp chez P. gingivalis ATCC
33277. ................................................................................................................................... 34
Figure 7 : Effets de concentrations croissantes d’extrait de thé vert sur l’expression du gène
codant pour l’hémolysine chez P. gingivalis ATCC 33277. ................................................ 35
Figure 8 : Effets de concentrations croissantes d’EGCG sur l’expression des gènes codant
pour les facteurs de colonisation HagA, HagB et FimA chez P. gingivalis ATCC 33277. .....
.............................................................................................................................................. 37
Figure 9 : Effets de concentrations croissantes d’EGCG sur l’expression des gènes codant
pour les facteurs impliqués dans la destruction tissulaire et l’inactivation des mécanismes
de défense de l’hôte soit les protéases RgpA et Kgp chez P. gingivalis ATCC 33277. ....... 38
Figure 10 : Effets de concentrations croissantes d’EGCG sur l’expression du gène codant
pour l’hémolysine chez P. gingivalis ATCC 33277. ............................................................ 39
Figure 11 : Effets de concentrations croissantes d’extrait de thé vert sur l’expression du
gène codant pour la protéine de stress HtrA chez P. gingivalis ATCC 33277. .................... 40
Figure 12 : Effets de concentrations croissantes d’EGCG sur l’expression du gène codant
pour la protéine de stress HtrA chez P. gingivalis ATCC 33277. ........................................ 41
VII
VIII
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Classification des polyphénols........................................................................... 14
Tableau 2 : Composition de l’extrait de thé vert GT#9. ....................................................... 23
Tableau 3 : Amorces utilisées pour la quantification de l’expression des gènes chez P.
gingivalis par PCR quantitative. ........................................................................................... 28
IX
X
LISTE DES ABRÉVIATIONS
C
g
l
ADN
ADNc
ARN
ATCC
CD
CH3SH
CMI
CO2
DL-C
DNase
DO
EC
ECG
EGC
EGCG
EMMPRIN
g
GAPDH
GCG
GT9
h
H2
H2S
ICAM
IL
L
LPS
MAPK
METase
ml
mM
MMP
MOI
Degré Celsius
Microgramme
Microlitre
Acide désoxyribonucléique
ADN complémentaire
Acide ribonucléique
American Type Culture Collection
Cluster of differentiation
Méthyl mercaptan
Concentration minimale inhibitrice
Dioxyde de carbone
DL-Catéchines
Désoxyribonucléase
Densité optique
Épicatéchine
Épicatéchine gallate
Épigallocatéchine
Épigallocatéchine-3-gallate
Extracellular matrix metalloproteinase inducer
Gramme
Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase
Gallate catéchine gallate
Green tea #9
Heure
Dihydrogène
Sulfure d’hydrogène
Intercellular adhesion molecule
Interleukine
Litre
Lipopolysaccharide
Mitogen-activated Protein Kinase
L-méthionine-α-deamino-γ-mercaptomethane-lyase
Millilitre
Millimolaire
Métalloprotéinase matricielle
Multiplicity of infection
XI
MTS
MTT
MUC-1
N2
NF-B
nm
pb
PCR
%
qPCR
THB-HK
TNF-
TREM-1
Unité
XII
3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium
3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide
Mucine-1
Diazote
Facteur nucléaire kappa B
Nanomètre
Paires de bases
Polymerase chain reaction
Pourcentage
Quantitative polymerase chain reaction
Todd Hewitt broth-hémine-vitamine K
Facteur de nécrose tumorale alpha
Triggering receptor expressed on myeloid cells-1
U
There are some bacteria that cause a disease, but there are some diseases that bring about
a condition that is ideal for the growth of some bacteria.
- Louis Pasteur -
XIII
XIV
REMERCIEMENTS
J’adresse mes remerciements sincères à ceux et celles qui ont participé de près ou de loin à
la réalisation de ce projet.
Tout d’abord, à mon directeur de recherche Dr Daniel Grenier pour avoir été aussi présent,
pour son aide précieuse et pour le temps qu’il a bien voulu consacrer à répondre à toutes
mes questions et inquiétudes, sans lui, ce mémoire n'aurait jamais vu le jour.
Je voudrais également remercier les membres de mon comité aviseur, Dr Michel Frenette et
Dre Fatiha Chandad, pour leurs conseils qui ont été des atouts à l’élaboration et à la réussite
de ce projet.
Je voudrais exprimer ma reconnaissance envers mes collègues qui m’ont transmis leur
expertise et aider dans les moments d’incertitude. Je veux aussi vous dire merci de rendre le
laboratoire aussi vivant et chaque journée aussi agréable!
Un merci particulier à Laetitia Bonifait, qui a été mon mentor de microbiologie. Merci pour
les gants roses qui m’attendaient à mon arrivée au labo; j’avais les plus beaux pour faire
mes qPCR!
Merci à ma mère et ma sœur qui ont toujours été là pour moi, qui m’ont soutenue et
encouragée tout au long de mes études. Je tiens également à remercier mon copain pour sa
compréhension, son écoute et ses encouragements. J’y suis arrivée grâce à vous!
Enfin, je désire remercier mes amis pour leur présence et leur compagnie tant bien lors des
cours que dans les heures interminables d’étude et de travail!
XV
XVI
1
1.1
INTRODUCTION
Structure du parodonte
Le parodonte représente l’ensemble des tissus entourant et servant au soutien des dents. Il
comprend différentes structures dont la gencive, l’os alvéolaire, le cément et le ligament
parodontal (1) (Figure 1). La gencive fait partie de la muqueuse buccale et représente la
structure visible entourant la dent. L’os alvéolaire sert au maintien de la dent dans l’arcade
maxillaire et forme l’alvéole dentaire (1). Le cément est une structure avasculaire et non
innervée qui tapisse la surface externe de la dentine au niveau de la racine et qui assure
l’attache des fibres du ligament parodontal. Ce dernier, aussi appelé desmodonte, se situe
entre les racines et l’os alvéolaire et assure l’ancrage de la dent dans l’alvéole dentaire (2).
Figure 1 : Représentation schématique des tissus de soutien de la dent (figure traduite et
adaptée de Encyclopædia Britannica, Inc. 2013).
1
1.2
Maladies parodontales
1.2.1 Généralités
Les maladies parodontales sont des maladies inflammatoires d’origine bactérienne affectant
les tissus entourant et supportant les dents. Elles représentent les principales affections de la
cavité buccale avec la carie dentaire. Les maladies parodontales constituent un problème de
santé important dans la population (3). Il en existe 2 principales, soit la gingivite et la
parodontite.
1.2.1.1 Gingivite
La gingivite est la maladie parodontale la plus répandue. Elle a une grande prévalence chez
les adultes et est ubiquitaire chez les enfants (4, 5). Environ 50% de la population nordaméricaine souffre de cette maladie et des proportions similaires ont été observées pour
d’autres pays (4). La gingivite correspond à une inflammation des gencives engendrant de
la rougeur, un gonflement et le saignement des gencives, le tout, ne menant pas à une perte
d’attache de la dent (6-8). Cette maladie est réversible, et ce, par une meilleure hygiène
buccale et dans certains cas un traitement dentaire. Cependant, lorsque non traitée, la
gingivite peut mener à une maladie parodontale beaucoup plus sévère, soit la parodontite
(6, 9).
1.2.1.2 Parodontite
La parodontite se définit comme une maladie inflammatoire sévère et progressive affectant
l’ensemble des structures de soutien de la dent. La prévalence varie selon le sexe, la race et
la région géographique. En Amérique du Nord, environ 40% de la population présente des
symptômes de parodontite et au niveau mondial entre 5 et 15% de la population est atteinte
d’une forme sévère de parodontite (4, 10). La parodontite progresse par phases cycliques de
recrudescence, de rémission et de latence qui sont en étroite relation avec l’efficacité de la
2
réponse immunitaire de l’hôte. Il existe différentes formes de parodontite, dont la
parodontite chronique et la parodontite agressive. La parodontite chronique affecte
principalement les adultes et les personnes âgées, et correspond à la forme la plus commune
de parodontites chez ces groupes d’âge (11). Elle peut être subdivisée en parodontite
généralisée ou localisée, selon son étendue. Le principal agent étiologique responsable de
cette forme est Porphyromonas gingivalis (9, 12). La parodontite agressive, quant à elle,
diffère de la parodontite chronique par sa prévalence très faible et son évolution très rapide.
Même si cette forme débute vers l’adolescence, elle n’est souvent cliniquement
diagnostiquée que vers les 20-30 ans (13, 14).
Plusieurs facteurs peuvent prédisposer un individu au développement d’une parodontite.
Comme déjà mentionné, les adultes et les personnes âgées sont principalement atteints, et
un homme s’avère plus propice qu’une femme au développement d’une parodontite (3, 15).
Également, une personne souffrant de diabète verra ses chances de développer la maladie
tripler comparativement à un non-diabétique (16, 17). D’autres problèmes de santé comme
l’obésité et le SIDA peuvent aussi être considérés comme étant des facteurs de risques pour
la parodontite (18-20). De plus, les fumeurs ont un risque plus élevé puisque la cigarette a
un
effet
immunosuppresseur,
diminuant
ainsi
l’efficacité
d’élimination
des
microorganismes pathogènes, en plus d’augmenter l’adhésion des bactéries aux cellules
épithéliales (19).
Tel que mentionné précédemment, certaines maladies peuvent mener au développement de
la parodontite, toutefois, la parodontite peut elle aussi prédisposer au développement de
maladies. Par exemple, le diabète peut être à la fois une cause et une conséquence de la
maladie (21). De plus, la parodontite peut être responsable du développement de maladies
cardiovasculaires et de problèmes respiratoires, telle la pneumonie. Elle peut également
augmenter les risques de naissance prématurée et de bébés prématurés de petits poids (19).
La parodontite chronique découle souvent d’une gingivite non traitée. En effet, la plaque
dentaire, également connue sous le nom de biofilm dentaire (22), présente dans les sites
supragingivaux, ainsi que le tartre vont progresser sous la gencive provoquant ainsi la
3
destruction du ligament parodontal. Ce ligament étant attaché au cément, un détachement
de la gencive se produira, créant du fait même une poche parodontale (9). Lors de la
progression de la maladie, les populations bactériennes colonisant les sites sous-gingivaux
vont gagner en importance et intensifier la réaction inflammatoire. L’évolution de la
maladie va se faire progressivement et sur une longue période de temps au cours de laquelle
les populations bactériennes se modifieront. La microflore buccale, habituellement
constituée de bactéries anaérobies facultatives à Gram-positif, deviendra majoritairement
composée de bactéries anaérobies strictes à Gram-négatif, ce qui caractérise le passage vers
un état pathologique (23, 24). À plus long terme, s’il y a absence de traitement, l’os
alvéolaire pourra être affecté et se dégrader de telle sorte qu’il y aura perte de la dent.
Il est possible de traiter la parodontite, mais les dommages causés s’avèrent permanents. Le
traitement de la maladie doit être adapté selon l’individu, mais est réalisé suivant deux
étapes essentielles. La première étape consiste en un détartrage qui permet d’enlever la
plaque et le tartre s’étant formés dans la poche parodontale. La deuxième étape implique un
surfaçage radiculaire. Un polissage de la racine de la dent est réalisé afin de favoriser le
rattachement de l’épithélium à la dent et la guérison (12). Advenant que certains sites ne
répondent pas au traitement, une chimiothérapie peut être ajoutée pour l’élimination des
parodontopathogènes (12, 25). Par exemple, la doxycycline pourra être administrée
localement ou par voie systémique, alors que la chlorhexidine sera administrée localement
(26). De plus, avoir recours à la chirurgie pourra corriger les défauts et permettre une
régénération osseuse (3). Le détartrage et le surfaçage radiculaire combinés avec des
mesures personnelles d’élimination de la plaque, comme le brossage et l’utilisation de la
soie dentaire, ont été prouvés comme permettant à eux seuls un retour vers une flore
normale, soit exempte de P. gingivalis (12). Une réduction de la quantité de P. gingivalis
des sites parodontaux est souvent indicatrice d’une résolution de la maladie (27).
4
1.3
Étiologie des maladies parodontales
1.3.1 Composante bactérienne
1.3.1.1 Parodontopathogènes
Les maladies parodontales sont des maladies d’origine polymicrobienne causées par un
groupe de bactéries appelées parodontopathogènes. Il a été découvert, grâce aux travaux
réalisés par Socransky et collaborateurs, que les parodontopathogènes présents dans les
sites sous-gingivaux se présentent sous forme de complexes bactériens (28) (Figure 2). Ce
groupe de chercheurs a décrit six complexes représentant la séquence de colonisation et
marquant le début de la maladie. À l’état sain, le complexe jaune regroupant les bactéries
du genre Streptococcus, le complexe mauve constitué des espèces Actinomyces
odontolyticus et Veillonella parvula, en plus du complexe vert comportant les bactéries du
genre Capnocytophaga ainsi que les espèces Eikenella corrodens et Aggregatibacter
actinomycetemcomitans (sérotype a), colonisent la surface de la dent avec les Actinomyces
(complexe bleu). Ces quatre complexes représentent les colonisateurs primaires. Le début
de l’état pathologique est marqué par l’apparition du complexe orange, comportant les
bactéries
des
genres
Campylobacter,
Fusobacterium,
Eubacterium,
Prevotella,
Peptostreptococcus et Streptococcus. Le complexe rouge représente les colonisateurs
tardifs et est associé, avec le complexe orange, aux stades avancés des parodontites. Le
complexe rouge est plus spécifiquement associé à la forme chronique et est composé de
trois bactéries soit P. gingivalis, le principal agent étiologique de la parodontite chronique,
Treponema denticola et Tannerella forsythia (28).
5
Figure 2 : Représentation des complexes bactériens selon Socransky et collaborateurs (28).
1.3.1.2 Porphyromonas gingivalis
P. gingivalis est une bactérie asaccharolytique à Gram négatif, anaérobie stricte, qui
morphologiquement se présente sous forme de coccobacille, d’environ 2 µm de longueur et
1 µm de diamètre, isolé ou en courte chaîne. Cette bactérie est souvent retrouvée dans les
sites sous-gingivaux de par la faible teneur en oxygène qui y est retrouvée. Comme
mentionné précédemment, P. gingivalis est l’un des principaux agents étiologiques
responsables de la parodontite, plus spécifiquement de la forme chronique. Sur gélose sang,
cette bactérie a la particularité de former des colonies à pigmentation noire résultant de
l’accumulation dans ses membranes de protoporphyrine dérivée de l’hémine contenue dans
le milieu (27). Ce sont les différents mécanismes de pathogénicité de cette bactérie qui lui
6
permettent de coloniser la cavité buccale, de contourner le système immunitaire et
d’engendrer la destruction tissulaire.
1.3.1.2.1
Facteurs de virulence
Les facteurs de virulence ont d’abord été décrits comme étant des composantes
bactériennes ayant un effet néfaste sur les cellules hôtes. La bactérie P. gingivalis possède
plusieurs facteurs contribuant à sa virulence lui permettant entre autres de : coloniser les
sites sous-gingivaux, provoquer la destruction tissulaire et contourner les systèmes de
défense.
Différents fimbriae (0.3 à 3 µm de longueur par 5 nm de largeur) se présentent de façon
péritriche à la surface de P. gingivalis. Les fimbriae majeurs de type I (FimA) se trouvant à
la surface de P. gingivalis permettent la colonisation des sites sous-gingivaux. Ils sont
responsables de l’adhérence initiale de la bactérie à l’intérieur de la poche parodontale,
c’est-à-dire à la surface de la dent ou au biofilm déjà présent. Le gène de FimA n’est
présent qu’en une seule copie sur le chromosome de la bactérie et la séquence protéique ne
présente pas d’homologie avec d’autres protéines fimbriales (29). Chez P. gingivalis, on
compte 6 génotypes de fimbriae appelés type I à V et Ib. À cause de leur longueur, les
fimbriae majeurs ont été proposés comme étant la première structure de la bactérie à entrer
en contact avec les surfaces et les colonisateurs primaires (29). En effet, FimA est
responsable de la coadhésion à différentes bactéries par l’entremise de différents récepteurs,
dont la glycéraldéhyde-3-phosphate (GAPDH) déshydrogénase chez certains streptocoques.
En plus des fimbriae majeurs, on retrouve également à la surface de la bactérie des fimbriae
mineurs qui permettent eux aussi la coadhésion aux bactéries déjà présentes (29-32). Ces
fimbriae proviennent du gène mfa1 codant pour la sous-unité protéique Mfa. Par ailleurs,
les fimbriae majeurs stimulent les cellules de l’hôte et déclenchent une réponse
inflammatoire. En réponse au fimbriae, les cellules épithéliales et les monocytes vont
sécréter des cytokines pro-inflammatoires via l’activation du CD14 et de la voie NF-B
(29). Il a été démontré que la production de cytokines par les cellules dendritiques est
grandement diminuée lorsque P. gingivalis n’exprime pas de fimbriae majeur (33).
7
Des protéines membranaires, comme les hémagglutinines (HagA à E) contribuent
également à l’établissement de la bactérie dans les sites sous-gingivaux (34). Ces protéines
permettent la liaison de la bactérie à des récepteurs, comme les oligosaccharides présents
sur les cellules humaines. Elles permettent l’adhésion de la bactérie à la surface des
érythrocytes pour faciliter l’acquisition de nutriments. En effet, l’inactivation des gènes
hagA, hagB et hagC a démontré une diminution de l’activité d’hémagglutination de la
bactérie (35).
P. gingivalis possède également des facteurs contribuant à l’inactivation des mécanismes
de défense de l’hôte et à la destruction tissulaire, soit les protéinases. Ces dernières
appartiennent à la famille des cystéines protéinases et se retrouvent à la surface de la
membrane de P. gingivalis ou sont sécrétées sous forme soluble (36). P. gingivalis possède
trois protéinases majeures, aussi connues sous le nom de gingipaïnes, possédant une
activité amidolytique pour des acides aminés spécifiques. L’Arg-gingipaïne A et B (RgpA,
RgpB) clivent la région carboxy-terminale des résidus arginine alors que la Lys-gingipaïne
(Kgp) clive la région carboxy-terminale des résidus lysine (37). RgpA ainsi que Kgp
possèdent des domaines hémagglutinines qui contribuent à la colonisation de la cavité
buccale par P. gingivalis (38). Les adhésines des Rgp permettent l’adhésion de P.
gingivalis aux cellules épithéliales alors que leurs domaines catalytiques permettent la
désorption des bactéries (39). Une étude a démontré que des mutants n’exprimant pas
certaines protéinases montraient une capacité atténuée à former des biofilms (40, 41).
De plus, les protéinases ont la capacité de dégrader des protéines structurales comme le
collagène de type I, III, IV et V, la fibronectine et les laminines (42). En effet, les Arggingipaïnes sont des collagénases responsables de la dégradation du collagène de type I.
Des essais réalisés ont démontré que leur inactivation entraînait une perte de la capacité de
P. gingivalis à dégrader le collagène de type I. C’est la forme associée à la membrane de
ces protéases qui est responsable de la dégradation la plus efficace de ces fibres de
collagène (43). La destruction tissulaire qui marque la progression de la parodontite résulte
de la dégradation de la protéine constituant majoritairement les tissus parodontaux par les
protéases, soit le collagène de type I. Les protéases contribuent également au saignement
8
lors du sondage par la dégradation du fibrinogène (38). La dégradation de la fibronectine
par les protéases de P. gingivalis permet aussi d’exposer des récepteurs présents à la
surface des cellules, soit les cryptitopes. Ces récepteurs n’étant habituellement pas
disponibles vont permettre l’attachement de la bactérie et ainsi contribuer à la capacité
d’adhérence de P. gingivalis (44).
Certaines immunoglobulines, en plus des cytokines et du CD14 à la surface des monocytes,
peuvent être dégradés par les protéinases, contribuant ainsi à la progression et au maintien
de P. gingivalis à l’intérieur de la poche parodontale (45-50). La cascade du complément
est un mécanisme de défense déclenché par les cellules de l’hôte en réponse à la présence
de microorganismes dans le but de les éliminer. Cependant, les protéases de P. gingivalis
protègent la bactérie contre cette cascade en dégradant les facteurs du complément comme
le facteur C3 (38, 51). Le complément, bien que son activation permette d’éliminer les
organismes pathogènes, peut moduler une destruction tissulaire s’il n’est pas régulé
correctement. Le CD46, un cofacteur membranaire, permet entre autres la régulation du
complément en inactivant les facteurs d’activation. Or, les protéases de P. gingivalis
peuvent cliver le CD46 de la surface des cellules provoquant ainsi son relâchement et
prévenant l’inactivation des molécules du complément favorisant ainsi la progression de la
maladie (52). Les protéases de P. gingivalis interviennent, également, dans l’acquisition de
nutriments. Elles peuvent dégrader la transferrine, une protéine riche en fer et présente en
grande quantité dans le liquide créviculaire, afin de fournir une source de fer à la bactérie
(53). En effet, des mutants de P. gingivalis pour les Arg- et Lys-gingipaïnes n’étaient plus
en mesure de dégrader la transferrine (53). Les protéases de P. gingivalis engendrent
également la sécrétion de cytokines proinflammatoires par les macrophages. En effet, la
stimulation de ces cellules avec les Arg-gingipaïnes active la voie de transduction de signal
de la MAPK p38 (Mitogen-activated Protein Kinase) entraînant la sécrétion de TNF- et
d’IL-8 (54).
Finalement, l’hémolysine est responsable de l’acquisition d’une source de fer. Elle permet à
P. gingivalis de lyser les érythrocytes, libérant ainsi l’hémoglobine ce qui fournit l’hémine
nécessaire à la croissance de la bactérie (35, 51).
9
Les bactéries à Gram-négatif, dont P. gingivalis, possèdent à leur surface du
lipopolysaccharide (LPS), une composante qui fait partie intégrale de leur enveloppe
externe. La structure du LPS est divisée en trois parties soit le lipide A, l’antigène O et le
polysaccharide central. Le LPS joue un rôle majeur dans le développement des maladies
parodontales et le lipide A est la partie principalement responsable de la stimulation du
système immunitaire. Le LPS de P. gingivalis induit notamment la sécrétion de diverses
cytokines et peut activer la voie RANK/RANKL contribuant ainsi à la progression de la
maladie (55, 56).
1.3.1.2.2
Mécanismes de réponse aux stress
Les bactéries possèdent différents mécanismes leur permettant de survivre à des situations
de stress. Selon le stimulus, une réponse différente peut être déclenchée. Par exemple,
OxyR, une protéine tétramérique se liant à l’ADN, présente entre autres chez Escherichia
coli et P. gingivalis, est activée en présence d’H2O2 (57). Cette protéine induit la
transcription de différents gènes nécessaires à la bactérie pour la résistance au stress
oxydatif (57, 58). De plus, cette même protéine est activée chez P. gingivalis lorsque la
bactérie est cultivée dans un milieu limité en hémine (59). Lorsque mise en présence
d’oxyde nitrique, la protéine HcpR (hybrid cluster protein), une enzyme redox, est
exprimée par P. gingivalis. Elle permet de réduire l’hydroxylamine produite à partir de
l’oxyde nitrique ou du nitrite en eau et en ammoniaque (60).
Également, la protéine HtrA (high temperature requirement A) possède 2 fonctions lui
permettant de jouer un rôle lors de stress. À température élevée, HtrA joue le rôle de sérine
protéase alors qu’à basse température elle est une protéine chaperonne (61). En situation de
stress, il devient essentiel pour la survie des bactéries de dégrader les protéines
endommagées qui s’accumulent. HtrA est responsable de la dégradation de ces protéines.
Chez les bactéries à Gram-négatif, HtrA est une protéine périplasmique (62). Elle est
présente chez plusieurs espèces bactériennes et possède différentes fonctions. Par exemple,
chez Bordetella pertussis, elle sert de chaperonne à son adhésine principal lors de sa
sécrétion alors que chez Listeria monocytogenes elle permet de résister aux changements de
10
pH (63). Également, HtrA confère à Legionella pneumophila une résistance à la
phagocytose par les macrophages et une protection contre les antibiotiques à
Staphyloccocus aureus (63). Chez P. gingivalis, HtrA est responsable de la résistance au
stress oxydatif et n’intervient pas dans la protection lors des changements de pH et de
l’augmentation de température (62, 63).
1.3.2 Composante inflammatoire
Bien que la présence d’un biofilm bactérien dans les sites sous-gingivaux soit un facteur
essentiel pour le développement de la maladie, il ne peut, à lui seul, provoquer la
destruction tissulaire caractéristique de la parodontite. En effet, une réaction inflammatoire
destructrice induite par l’agression bactérienne est déclenchée et contribue au
développement de la maladie.
Chez un individu sain, une réponse immunitaire et inflammatoire basale est toujours
présente puisque les cellules sont constamment stimulées par la présence de la microflore
buccale (64, 65). Une proportion de bactéries sera éliminée par la salive et par le
mouvement ascendant du fluide créviculaire, mais bon nombre de celles-ci demeurent en
contact avec l’épithélium de la gencive (66). Ce dernier représente la première ligne de
défense rencontrée par les bactéries et est responsable de la sécrétion de β-défensines
reconnues pour leurs propriétés antimicrobiennes. Les β-défensines sont retrouvées en
grande quantité dans la région de la gencive en contact direct avec les parodontopathogènes
(67). De plus, le système immunitaire de l’hôte reconnaît des motifs moléculaires des
microorganismes menant à la production de diverses molécules, dont les E-sélectines, la
molécule d’adhésion intracellulaire (ICAM) et l’interleukine (IL-8) afin de recruter des
neutrophiles au site d’infection où se retrouvent les bactéries parodontopathogènes (68). Le
système de défense est donc en mesure de contrôler la prolifération bactérienne et
d’empêcher l’invasion tissulaire par les bactéries. Cependant, lors d’un débalancement, par
exemple une déficience momentanée du système immunitaire, les mécanismes de défense
de base ne suffisent plus et les bactéries sont en mesure de proliférer et d’envahir les tissus
sous-jacents. Le système immunitaire se retrouve alors stimulé de façon trop importante,
11
entraînant ainsi une réponse immunitaire anormale. Ce phénomène engendre la libération
d’une grande quantité de molécules pro-inflammatoires au site d’infection qui
s’accumulent, provoquant alors une réponse inflammatoire destructive par l’hôte.
Plus spécifiquement, les cytokines, incluant l’IL-1β, l'IL-6, l’IL-8 et le facteur de nécrose
tumorale (TNF)-α, ont grandement été associées à la progression de la maladie (66). Elles
sont retrouvées en quantité importante dans les sites sous-gingivaux en phase active de la
maladie et leur sécrétion est entre autres responsable du recrutement des cellules
immunitaires, au site de l'inflammation (56). De plus, la sécrétion des cytokines et des
médiateurs
de
l'inflammation
favorise
la
production
excessive
de
certaines
métalloprotéinases matricielles (MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9), provoquant par le fait
même la dégradation du collagène, de la fibronectine et de la laminine, et une destruction
osseuse caractéristique de la maladie parodontale (8, 22, 56, 69-73).
1.4
Polyphénols
1.4.1 Généralités
Les polyphénols sont des composés naturellement retrouvés dans le règne végétal ; ils sont
en grande partie responsables des propriétés organoleptiques en plus d’assurer une
protection contre les rayons ultraviolets, les microorganismes pathogènes, et les prédateurs
(74, 75). Les polyphénols, reconnus pour leur fort potentiel antioxydant, sont consommés
dans l’alimentation courante et apportent de grands bienfaits pour la santé humaine. Les
proportions ainsi que la nature des polyphénols varient grandement d’un végétal à l’autre
(76).
1.4.2 Classification
La structure moléculaire des polyphénols comprend plusieurs groupements aromatiques,
des phénols, auxquels sont attachés des groupements hydroxyles. Jusqu’à présent, la
12
structure et les caractéristiques de plus de 8 000 polyphénols ont été répertoriées (77, 78).
La classification de ceux-ci est basée sur divers critères tels leur provenance, leur fonction
biologique ainsi que leur squelette de carbone (79). Plus spécifiquement, les polyphénols
sont d’abord classés selon leur appartenance à la classe des flavonoïdes ou des nonflavonoïdes, puis divisés en sous-classes (Tableau 1) (79).
13
Tableau 1 : Classification des polyphénols.
Classes
Sous-classes
Exemple de composés
Flavanones
Naringénine
Flavones
Lutéoline
Isoflavonoïdes
Glabridine
Quercétine
Flavonols
Myricétine
Monères
Catéchine
Flavonoïdes
Constitué de sousFlavanols Polymères
condensés
épicatéchines
(Tannins)
hydrolysables
flavonoïdes
Constitué d’acide
gallique ou éllagique
Anthocyanines
Cyanidine
Chalcones
Butéine
Acides phénoliques
Non-
unités catéchines ou
Stilbènes
Lignanes
Coumarins
Acide gallique
Eugénol
Resvératrol
Magnolol
Honokiol
Collinine
Lacinartine
1.4.3 Thé
Le thé, Camellia sinensis, est le breuvage le plus consommé dans le monde après l’eau.
C’est un composé naturel dans lequel de grandes quantités de polyphénols sont présentes.
Les polyphénols retrouvés dans le thé ainsi que leurs proportions varient entre les différents
types de thés. Ces différences sont principalement reliées à leur mode de préparation. Les
thés peuvent être fermentés, partiellement fermentés ou non-fermentés (80). Les méthodes
14
de production de thés ainsi que les types de polyphénols qu’ils renferment sont présentés
dans la Figure 3.
Figure 3 : Modes de production et composition en polyphénols des divers thés (figure
adaptée de Cooper et collaborateurs (80)).
1.4.4 Thé vert
Le thé vert est un thé non-fermenté provenant de feuilles matures qui, une fois récoltées,
sont traitées à la vapeur afin de prévenir la fermentation, puis séchées (80, 81). Chaque
année, environ 2.5 millions de tonnes de thé sont produites et le thé vert en constitue
environ 20% (82). Le Japon, la Chine, l’Inde et certains pays du Moyen-Orient représentent
les plus grands consommateurs de thé vert (80).
15
1.4.4.1 Composition
Plusieurs facteurs influencent la composition du thé, notamment le climat, les saisons et le
degré de maturation des feuilles (83). Le thé contient de la théanine, un acide aminé dérivé
de la glutamine et propre au thé. Une faible quantité de caféine, environ 3%, est également
présente en plus de différents composés incluant des polyphénols, des protéines, des lipides
et de la chlorophylle (83). Les polyphénols qui composent principalement le thé vert font
partie de la classe des flavonoïdes, plus précisément des catéchines. Les catéchines sont des
composés hydro-solubles, incolores qui confèrent l’astringence au thé (83). Il existe 6
catéchines différentes parmi lesquelles 4 sont plus abondantes dans le thé vert;
l’épicatéchine (EC), l’épicatéchine gallate (ECG), l’épigallocatéchine (EGC), et
l’épigallocatéchine-3-gallate (EGCG) (Figure 4) (84, 85). L’EGCG est considéré comme le
composé le plus bioactif du thé vert (86) et constitue la catéchine retrouvée en plus grande
proportion. Les catéchines sont des isomères avec une configuration trans alors que
l’épicatéchine est un isomère de configuration cis (79).
Figure 4 : Structure moléculaire de l’épigallocatéchine-3-gallate.
16
1.4.4.2 Effets bénéfiques sur la santé générale
Au cours des dernières années, plusieurs études ont été réalisées, démontrant les effets
bénéfiques du thé vert et de ses composantes sur la santé générale. En effet, plusieurs
études ont apporté des preuves appuyant un effet anti-cancer de ces composés, notamment
en regard du développement du cancer du poumon, du foie, du sein et de la prostate (8791). Une étude réalisée chez le rat a aussi démontré des effets anti-thrombotiques associés
aux catéchines du thé vert (92). Ce dernier, de par son potentiel antioxydant, peut
également prévenir le développement de certaines maladies induites par le stress oxydatif
comme les maladies cardio-vasculaires, en plus d’avoir un effet sur les fonctions
plaquettaires (93-97). De plus, les polyphénols du thé vert offrent un potentiel pour la
prévention et le traitement de certaines maladies inflammatoires comme l’arthrite, en
diminuant la production de cyclooxygénase-2 et de TNF- dans les articulations
arthritiques (98, 99). Ces polyphénols peuvent également contrôler l’obésité en inhibant la
prolifération des adipocytes et leur différentiation en cellule 3T3-L1, en plus d’augmenter
l’oxydation des graisses et le niveau d’adiponectine (100-102).
1.4.4.3 Effets bénéfiques sur la santé buccale
1.4.4.3.1
Halitose
L’halitose, communément appelée mauvaise haleine, est principalement causée par la
présence de composés sulfurés volatils (CSV) générés par la transformation d’acides
aminés contenant du soufre par certaines espèces bactériennes se trouvant à l’intérieur de la
cavité buccale (103). Les deux principaux composés responsables de l’halitose sont le
sulfure d’hydrogène (H2S) et le méthyl mercaptan (CH3SH) (6, 104). L’élimination des
bactéries par le brossage quotidien des dents et de la langue permet de diminuer la sévérité
de l’halitose, tout comme l’utilisation de produits antimicrobiens ou de produits capables de
convertir les CSV en composés non-odorants (105). Le thé vert fait partie des produits
capables de tels effets (106, 107). L’utilisation du thé vert sous forme de rince-bouche a été
démontrée comme ayant un impact sur la quantité de CSV présent (103). De plus, l’ajout de
17
catéchines à des gommes à mâcher réduit la quantité de méthanethiol, un composé
contribuant également à l’halitose (6, 108). Des essais in vitro ont également démontré la
capacité d’un extrait de thé vert à diminuer la quantité de H2S et de CH3SH au niveau de la
cavité buccale (109). De plus, l’expression du gène mgl et l’enzyme L-méthionine-αdeamino-γ-mercaptomethane-lyase (METase), impliqués dans la production de CH3SH par
P. gingivalis, ont pu être inhibé en présence de concentrations sous-inhibitrices d’EGCG
(110).
1.4.4.3.2
Carie dentaire
La carie dentaire est une maladie multifactorielle qui se développe par la présence de
bactéries cariogènes, notamment Streptococcus mutans et Streptococcus sobrinus. C’est la
maladie la plus répandue des tissus calcifiés des dents (111). L’alimentation joue un rôle
important dans le développement de cette maladie et certains aliments peuvent contribuer
ou encore prévenir son développement (112). Une étude utilisant un rince-bouche à base de
thé vert a pu établir un lien entre la diminution du nombre de pathogène causant la carie
dans l’environnement buccal et l’utilisation de ce rince-bouche (113). Plusieurs équipes de
chercheurs ont aussi démontré un effet antibactérien du thé vert sur la principale bactérie
responsable de la carie dentaire, S. mutans (114-116). S. mutans ainsi que d’autres
microorganismes ont la capacité de produire des acides comme sous-produits de la
fermentation des sucres, plus spécifiquement le saccharose. Par la production d’acides, une
déminéralisation de l’émail de la dent peut se produire et entraîner le développement de la
carie dentaire. Or, par le rinçage de la cavité buccale avec l’EGCG, il a été démontré qu’il
est possible de réduire la quantité d’acide produite par les bactéries (117). De plus,
l’EGCG, à des concentrations sous-inhibitrices, a engendré une inhibition chez S. mutans
de l’expression du gène gtf codant pour la glucosyl transférase qui est impliquée dans la
formation du biofilm (118). L’ajout de polyphénols du thé dans des sucreries et dans des
gommes à mâcher a démontré un effet inhibiteur sur la formation de plaque dentaire ainsi
que sur le développement de la carie dentaire (6).
18
1.4.4.3.3
Parodontite
Comme décrite précédemment, la parodontite est une maladie inflammatoire destructrice
qui s’attaque aux structures de soutien de la dent. Les deux composantes étiologiques de la
maladie se doivent d’être contrôlées pour prévenir efficacement la maladie. D’une part, il
est primordial de limiter la colonisation de la cavité buccale par les bactéries
parodontopathogènes. D’autre part, la présence de bactéries parodontopathogènes engendre
une réponse inflammatoire menant à la production de cytokines et de MMPs qui
contribuent au développement de la maladie (8). L’EGCG peut avoir un effet direct ou
indirect sur la voie NF-B et ainsi réduire, voire inhiber la production de certaines
cytokines. Cela a pour effet de diminuer la réponse inflammatoire, entre autres par
l’inhibition de la production de l’IL-1 responsable de la production des MMPs qui
engendrent la destruction de la matrice extracellulaire (116). Plusieurs études ont déjà
évalué la capacité de l’EGCG à réduire la destruction osseuse médiée par les MMPs (119).
Plus spécifiquement, l’étude a montré qu’en plus d’inhiber l’expression de l’ARNm de la
MMP-9, l’EGCG permet aussi d’inhiber la formation d’ostéoclastes (119). D’autres études
viennent appuyer les effets de l’EGCG sur les MMPs et les ostéoclastes (120, 121). Une
étude sur le thé vert a démontré qu’il est possible, par l’utilisation locale de bandelettes
saturées de thé, de réduire la profondeur des poches parodontales ainsi que le nombre de
bactéries anaérobies à pigmentation noire (122). Lombardo Bedran et collaborateurs ont
démontré que le thé vert et l’EGCG augmentent l’expression des gènes codant pour les défensines ainsi que la production de celles-ci par les cellules épithéliales buccales (123).
Ils ont aussi démontré que le thé vert et l’EGCG prévenaient la dégradation des défensines par les protéases de P. gingivalis. Une autre étude a également rapporté les
effets anti-protéases du thé vert, en plus de propriétés antibactérienne, anti-adhérence et
anti-inflammatoire sur la bactérie P. gingivalis (124).
19
20
2
PROBLÉMATIQUE
Les maladies parodontales telle la parodontite représentent un problème de santé important
dans la population. Leur développement est multifactoriel et fait intervenir des facteurs de
l’hôte, microbiologiques et environnementaux. Malgré les connaissances déjà acquises sur
ces maladies, beaucoup reste à découvrir. En effet, les mécanismes de pathogénicité ainsi
que la réponse de l’hôte face aux microorganismes demeurent encore peu connus. Une
réponse inflammatoire initiée par les cellules épithéliales et les macrophages au niveau du
parodonte engendre une destruction importante du tissu de soutien de la dent et cette
réponse est amplifiée par un contact prolongé avec les bactéries parodontopathogènes,
incluant P. gingivalis. Cette bactérie joue un rôle majeur dans l’initiation et la progression
de la parodontite, c’est pourquoi un contrôle efficace de celle-ci est associé à une
amélioration des conditions de la pathologie. Les traitements aux antibiotiques actuellement
utilisés pour éliminer les bactéries parodontopathogènes amènent de bons résultats, mais
contribuent cependant à l’apparition de résistances bactériennes aux antibiotiques.
L’identification de nouveaux composés capables d’agir sur la prolifération ou sur
l’expression des facteurs de virulence de P. gingivalis s’avère donc d’intérêt.
2.1
Hypothèse de recherche
Les polyphénols du thé vert ont la capacité de moduler l’expression de gènes reliés à la
virulence et au stress chez la bactérie parodontopathogène P. gingivalis.
2.2
-
Objectifs
Vérifier l’effet des polyphénols du thé vert sur l’expression des gènes codant pour
certains facteurs de virulence chez P. gingivalis;
-
Vérifier l’effet des polyphénols du thé vert sur l’expression du gène codant pour la
protéine de stress HtrA chez P. gingivalis.
21
22
3
3.1
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Composantes à l’étude
L’EGCG a été acheté de la compagnie Sigma-Aldrich Canada Co. (Oakville, ON, Canada)
et l’extrait de thé vert GT#9 (BCY-CT002) a été acheté de la compagnie Gosun
Biotechnologies Co., Ltd. (Hangzhou Zhejiang, Chine). La composition de l’extrait de thé
selon les analyses de la compagnie est présentée dans le Tableau 2.
Tableau 2 : Composition de l’extrait de thé vert GT#9.
Composé
Pourcentage
Polyphénols totaux
98.42 %
Catéchines totaux
82.60 %
EGCG
47.92 %
EGC
7.56 %
DL-C
2.16 %
EC
6.19 %
GCG
4.54 %
ECG
14.23 %
Caféine
Max 1.0 %
Les solutions concentrées de l’extrait de thé vert et de l’EGCG ont été préparées à
10 mg/ml dans de l’eau distillée puis stérilisées par filtration (0.2 µm). La solution d’EGCG
a été entreposée à -20C et la solution d’extrait de thé vert a été préparée chaque semaine et
conservée à 4C.
3.2
Souche bactérienne et conditions de croissance
La souche bactérienne utilisée dans cette étude a été P. gingivalis ATCC 33277 (American
Type Culture Collection, Manassas, VA, Etats-Unis). Cette souche a été cultivée dans un
23
milieu Todd Hewitt broth (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA)
supplémenté d’hémine (10 µg/ml) et de vitamine K (1 µg/ml) (THB-HK) à 37°C durant
18 h ou 24 h en anaérobiose (75% N2 ; 10% H2 ; 15% CO2).
3.3
Détermination des concentrations minimales inhibitrices
La densité optique à 660 nm (DO660) d’une culture fraîche de P. gingivalis (24 h) a été
mesurée, puis la culture a été centrifugée à 10 000 x g pendant 15 minutes. Par la suite, le
culot bactérien a été resuspendu dans du milieu THB-HK frais à une DO660 de 0.2. Dans
une microplaque 96 puits (Sarstedt Inc., Newton, NC, USA) ont été déposés 100 µl de la
suspension bactérienne et 100 µl de dilutions sérielles (1:2) (2 mg/ml à 3.9 µg/ml) de
l’extrait de thé vert et d’EGCG préparé dans le milieu THB-HK. La plaque a été incubée
pendant 24 h à 37°C dans une chambre anaérobie. La DO660 finale a été mesurée et la
concentration minimale inhibitrice (CMI) correspondait à la plus faible concentration
capable d’inhiber totalement la croissance bactérienne.
3.4
Traitements de Porphyromonas gingivalis
Des milieux THB-HK (40 ml) ont été ensemencés avec différents volumes d’inoculum (1 à
100 µl) d’une culture fraîche de P. gingivalis. Après 18 h, la DO660 de chaque culture a été
mesurée. Pour le traitement, une culture de P. gingivalis en début de phase exponentielle
montrant une DO660 autour de 0.2 a été utilisée. Un millilitre de cette culture a été déposé
dans des microtubes stériles de 1.5 ml en présence de concentrations croissantes d’extrait
de thé vert et d’EGCG, 0 à 125 µg/ml et 0 à 62.5 µg/ml, respectivement. Les cultures ont
été incubées en anaérobiose à 37°C durant 8 h, après quoi les étapes pré-congélation de la
trousse RNAprotect (Qiagen Inc., Mississauga, ON, Canada) ont été réalisées et les
échantillons ont été congelés à -20°C jusqu’à l’extraction-purification de l’ARN.
24
3.4.1 Évaluation de l’expression de gènes
3.4.1.1 Extraction de l’ARN
L’extraction-purification de l’ARN bactérien a été réalisée suivant les protocoles #4 (lyse
enzymatique et digestion à la protéinase K) et #7 (purification de l’ARN par le RNeasy
mini kit) fournis avec la trousse RNAprotect (Qiagen Inc., Mississauga, ON, Canada).
À la suite du traitement de P. gingivalis aux polyphénols, les échantillons ont été traités
avec la solution RNAprotect permettant la protection de l’ARN. Après cette étape, les
échantillons ont pu être conservés à -20°C jusqu’à l’extraction-purification de l’ARN.
Après la décongélation des échantillons, une lyse bactérienne par lysozyme (15 mg/ml) et
une digestion des protéines par la protéinase K (2 mg/ml) ont été réalisées simultanément
durant une période de 10 minutes à la température de la pièce (volume final 900 µl). Par la
suite, 500 µl d’éthanol 100% ont été ajoutés au 900 µl d’échantillon pour permettre la
précipitation des protéines. Les échantillons ont été déposés sur une colonne (incluse dans
la trousse) puis lavés. La DNase I (0.34 unité Kunitz/µl) a été ajoutée à la colonne pour
permettre la digestion de l’ADN. Finalement des lavages ont été effectués puis l’ARN a été
élué avec de l’eau ne contenant pas de nucléases. Les étapes suivant l’extraction ont été
effectuées dans la même journée afin d’éviter les pertes d’ARN par la congélationdécongélation. Les ARN ont été conservés à -80°C.
3.4.1.2 Évaluation de la pureté et de la concentration des ARN
Avant la synthèse des ADN complémentaires (ADNc), la qualité, la pureté et la
concentration des ARN ont été établies. Les ratios 260/280 et 260/230 déterminés à l’aide
du Nanodrop (Themo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) ont permis d’évaluer la
pureté des ARN. Suivant les normes, les échantillons d’ARN ayant des ratios situés entre
1.8 et 2.0 ont pu être considérés purs. L’appareil Experion™ Automated Electrophoresis
System (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON, Canada) avec la trousse RNA stdSens
25
analysis (Bio-Rad Laboratories) ont été utilisés suivant le protocole du manufacturier pour
déterminer la qualité des ARN grâce au gel virtuel obtenu après le traitement des
échantillons. La concentration en ARN des échantillons a aussi été déterminée par
Experion™ Automated Electrophoresis System.
3.4.1.3 Préparation des ADN complémentaires par transcriptase inverse
La préparation des ADNc a nécessité 1 µg d’ARN dans un volume total de 10 µl. À l’ARN
ont été ajoutés 1 µl d’hexamères aléatoires (50 µM) (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN,
USA) ainsi que 1 µl de dNTPs (10 mM) (Life Technologies Inc., Burlington, ON Canada).
Cette préparation a été incubée pendant 5 minutes à 70°C, puis mise sur glace pour un autre
5 minutes avant l’ajout des réactifs suivants : 4 µl du tampon RT 5X (Life Technologies
Inc.), 2 µl de dTT (0.1 M) (Life Technologies Inc.), 1 µl de RNase out (200 U/µl) (Roche
Diagnostics) et 1 µl de transcriptase inverse M-MLV (200 U/µl) (Life technologies Inc.).
Les échantillons ont ensuite été placés dans un thermocycleur pendant 10 minutes à 25°C,
50 minutes à 37°C et 15 minutes à 70°C, pour terminer à 4°C. Les ADNc ont été conservés
à -20°C et dilués d’un facteur 5 avant leur utilisation.
3.5
Préparation des amorces
Dans la présente étude, les gènes codant pour les protéases (RgpA, Kgp), les
hémagglutinines (HagA, HagB), le fimbriae (FimA), l’hémolysine (Hem) et la protéine de
stress (HtrA) ont été étudiés. Le gène codant pour l’ARN ribosomal 16S a servi de contrôle.
Les amorces utilisées sont décrites dans le Tableau 3. À la réception, les amorces ont été
réhydratées dans de l’eau sans nucléases (Sigma-Aldrich Canada Co.) à une concentration
finale de 50 µM et conservées à -80°C. Les amorces ont été combinées (sens et anti-sens) et
amenées à une concentration de 10 µM. Avant l’utilisation des amorces, un gradient de
température a été réalisé pour déterminer la température d’hybridation optimale de chaque
paire d’amorces et pour s’assurer de l’absence d’auto-hybridation.
26
3.6
PCR quantitative
Le CFX96™ Real-Time System C1000™ thermal cycler (Bio-Rad Laboratories) a servi
pour l’analyse qPCR. Un volume de 25 µl par réaction a été utilisé. Chaque réaction a été
préparée avec 5 µl d’ADNc, 1 µl d’amorces (sens/anti-sens), 6.5 µl d’eau sans nucléases
(Sigma-Aldrich Canada Co.) et 12.5 µl du supermix IQ SYBR Green (Bio-Rad
Laboratories).
Le cycle qPCR utilisé a consisté en une première étape de 5 minutes à 95°C, suivie d’une
dénaturation de 1 minute à 95°C, d’une hybridation de 1 minute à 60°C et d’une élongation
de 30 secondes à 72°C. Les résultats obtenus ont été normalisés en fonction du gène de
référence soit l’ARNr 16S.
27
Tableau 3 : Amorces utilisées pour la quantification de l’expression des gènes chez P. gingivalis par PCR quantitative.
Gènes
Locus
Sens
Fimbriae
Longueur du
Amorces (5’---> 3’)
fragment
Anti-sens
fimA
180
CAGCAGGAAGCCATCAAATC
CAGTCAGTTCAGTTGTCAAT
140 pb
rgpA
1970
GCCGAGATTGTTCTTGAAGC
AGGAGCAGCAATTGCAAAG
256 pb
kgp
1728
AGCTGACAAAGGTGGAGACCAAAGG
TGTGGCATGAGTTTTTCGGAACCGT
186 pb
hagA
1733
ACAGCATCAGCCGATATTCC
CGAATTCATTGCCACCTTCT
188 pb
hagB
1904
TGTCGCACGGCAAATATCGCTAAAC
CTGGCTGTCCTCGTCGAAAGCATAC
176 pb
Hémolysine
hem
1511
GAAGCCTTGTTCTCCTCA
CAATGAATATGCCGGTTTCC
167 pb
Protéine de stress
htrA
0637
GAGAGTGGGTATTGGCCGTA
CCCGTTTGGCTGTAGATCAT
232 pb
TGTAGATGACTGATGGTGAAA
ACTGTTAGCAACTACCGATGT
138 pb
Protéases
Hémagglutinines
ARNr 16S
28
3.7
Analyse statistique
La moyenne  l’écart-type des trois réplicas a été calculée et le test t de Student a été utilisé
pour les analyses statistiques avec une valeur de p  0.05 considérée comme statistiquement
significative.
29
30
4
RÉSULTATS
4.1
Concentrations minimales inhibitrices
Pour la détermination des concentrations minimales inhibitrices, P. gingivalis a été mis en
culture en présence de concentrations croissantes d’extrait de thé vert et d’EGCG. La
densité optique de la culture a été mesurée après 24 h d’incubation et les valeurs ont été
comparées aux contrôles (absence de composés), ce qui a permis d’évaluer l’inhibition.
Pour l’extrait de thé vert, la plus petite concentration capable d’inhiber totalement la
croissance (CMI) a été de 125 µg/ml et pour l’EGCG de 62.5 µg/ml.
4.2
Expression des gènes codant pour les facteurs de virulence
4.2.1 Effet de l’extrait de thé vert
Dans un premier temps, l’effet de l’extrait de thé vert sur l’expression de gènes codant pour
les facteurs de virulence de P. gingivalis a été évalué. Pour réaliser cette expérience, une
culture de P. gingivalis en début de phase exponentielle a été mise en présence de
concentrations croissantes d’extrait de thé vert se situant entre 0 et 125 µg/ml pour une
période de 8 h en anaérobiose. La durée de l’incubation a été sélectionnée à la suite d’essais
préliminaires ayant évalué des temps entre 15 minutes et 24 h. L’ARN a ensuite été purifié
et quantifié afin de synthétiser les ADNc en vue de réaliser des qPCR.
Les résultats présentés ont été regroupés selon le rôle des différents facteurs de virulence de
P. gingivalis dans le processus pathogénique de la maladie parodontale, soit les facteurs de
colonisation qui regroupent les gènes codant pour le fimbriae (FimA) et les
hémagglutinines (HagA et HagB), les facteurs contribuant à l’inactivation des mécanismes
de défense de l’hôte et à la destruction tissulaire qui incluent les protéases Arg-gingipaïne
(RgpA) et Lys-gingipaïne (Kgp), et les facteurs permettant l’acquisition d’une source de fer
soit l’hémolysine.
31
D’une part, pour les facteurs de colonisation, une diminution significative et dosedépendante de l’expression des gènes a été observée pour l’ensemble des concentrations
d’extrait de thé vert testées (Figure 5). En effet, à la concentration la plus faible, une baisse
de 20% de l’expression des hémagglutinines a été observée alors que pour le fimbriae, la
diminution de l’expression était de 60%. À la plus forte concentration, soit 125 µg/ml, une
diminution de 53% a été observée pour le fimbriae et de 60% pour les hémagglutinines.
D’autre part, en ce qui a trait aux deux protéases, une tendance similaire a été notée, soit
une diminution dose-dépendante de l’expression des gènes allant jusqu’à un maximum
d’environ 70-75% à une concentration de 125 µg/ml (Figure 6). À la concentration la plus
faible, une diminution se situant entre 35-40% a été obtenue pour les deux protéases. De
plus, pour l’Arg-gingipaïne (RgpA), la diminution obtenue s’est avérée significative à
toutes les concentrations testées alors que pour la Lys-gingipaïne (Kgp), seules les
concentrations de 75 µg/ml et 125 µg/ml ont engendré une diminution significative de
l’expression.
Enfin, en ce qui concerne l’hémolysine, une inhibition dose-dépendante de l’expression du
gène a, tout comme pour les autres facteurs, été observée (Figure 7). Également, une baisse
significative de l’expression du gène, soit d’environ 70%, a été notée à la concentration la
plus élevée soit 125 µg/ml.
32
Figure 5 : Effets de concentrations croissantes d’extrait de thé vert sur l’expression des
gènes codant pour les facteurs de colonisation HagA, HagB et FimA chez P. gingivalis
ATCC 33277. Les résultats ont été normalisés avec le gène de l’ARNr 16S et sont exprimés
selon la moyenne  l’écart-type. L’analyse statistique a été effectuée avec le test t de
Student (* : p < 0.05 par rapport au contrôle de 0 µg/ml ; † : p < 0.05 par rapport aux
concentrations 75 et 100 µg/ml).
33
Figure 6 : Effets de concentrations croissantes d’extrait de thé vert sur l’expression des
gènes codant pour les facteurs impliqués dans la destruction tissulaire et l’inactivation des
mécanismes de défense de l’hôte soit les protéases RgpA et Kgp chez P. gingivalis ATCC
33277. Les résultats ont été normalisés avec le gène de l’ARNr 16S et sont exprimés selon
la moyenne  l’écart-type. L’analyse statistique a été effectuée avec le test t de Student (* :
p < 0.05).
34
Figure 7 : Effets de concentrations croissantes d’extrait de thé vert sur l’expression du gène
codant pour l’hémolysine chez P. gingivalis ATCC 33277. Les résultats ont été normalisés
avec le gène de l’ARNr 16S et sont exprimés selon la moyenne  l’écart-type. L’analyse
statistique a été effectuée avec le test t de Student (* : p < 0.05).
4.2.2 Effet de l’EGCG
Les traitements avec l’EGCG ont été réalisés avec des concentrations allant de 0 à
62.5 µg/ml et selon les mêmes conditions que pour l’extrait de thé vert. Les résultats sont
de nouveau regroupés selon la fonction des gènes à l’étude.
Tout comme l’extrait de thé vert, l’EGCG a engendré une diminution dose-dépendante de
l’expression des gènes codant pour les facteurs de colonisation (Figure 8). Cependant, la
diminution observée s’est avérée inférieure à celle obtenue pour le thé vert et l’effet dosedépendant était moins important. Une diminution significative d’environ 60% a été
observée pour le fimbriae à 50 µg/ml et pour l’hémagglutinine A à 62.5 µg/ml.
35
D’autre part, pour l’expression des gènes codant pour les protéases, la même tendance a été
obtenue (Figure 9). Pour le gène rgpA, la diminution observée a été significative à toutes
les concentrations testées et a atteint un maximum de 60% avec l’EGCG à 62.5 µg/ml. Un
effet dose-dépendant a été obtenu pour le gène kgp et une diminution significative de 50% a
été atteinte à 62.5 µg/ml.
Finalement, l’EGCG a engendré une diminution dose-dépendante pour le gène codant pour
l’hémolysine (Figure 10). Aucune diminution significative n’a été observée et le niveau
d’expression le plus bas a été noté à 50 µg/ml qui correspond à une diminution de 40% de
l’expression.
36
Figure 8 : Effets de concentrations croissantes d’EGCG sur l’expression des gènes codant
pour les facteurs de colonisation HagA, HagB et FimA chez P. gingivalis ATCC 33277.
Les résultats ont été normalisés avec le gène de l’ARNr 16S et sont exprimés selon la
moyenne  l’écart-type. L’analyse statistique a été effectuée avec le test t de Student (* : p
< 0.05 par rapport au contrôle de 0 µg/ml ; † : p < 0.05 par rapport à la concentration de 50
µg/ml).
37
Figure 9 : Effets de concentrations croissantes d’EGCG sur l’expression des gènes codant
pour les facteurs impliqués dans la destruction tissulaire et l’inactivation des mécanismes
de défense de l’hôte soit les protéases RgpA et Kgp chez P. gingivalis ATCC 33277. Les
résultats ont été normalisés avec le gène de l’ARNr 16S et sont exprimés selon la moyenne
 l’écart-type. L’analyse statistique a été effectuée avec le test t de Student (* : p < 0.05).
38
Figure 10 : Effets de concentrations croissantes d’EGCG sur l’expression du gène codant
pour l’hémolysine chez P. gingivalis ATCC 33277. Les résultats ont été normalisés avec le
gène de l’ARNr 16S et sont exprimés selon la moyenne  l’écart-type. L’analyse statistique
a été effectuée avec le test t de Student à p < 0.05.
4.1 Expression du gène codant pour la protéine de stress HtrA
Pour faire suite à l’évaluation de l’effet de l’extrait de thé vert et de l’EGCG sur
l’expression des facteurs de virulence, des traitements de P. gingivalis ont également été
réalisés afin d’évaluer la réponse de la bactérie au stress. Ceci a été possible en mesurant
l’expression du gène codant pour la protéine HtrA après une exposition de P. gingivalis aux
composés pour une période de 2 h. La procédure des traitements tout comme les
concentrations des composés ont été les mêmes que celles décrites précédemment. L’ARN
a ensuite été purifié, quantifié et les ADNc synthétisés pour la réalisation des qPCR.
39
4.1.1 Effet de l’extrait de thé vert
Suivant l’exposition de P. gingivalis aux concentrations croissantes d’extrait de thé vert,
une augmentation dose-dépendante de l’expression du gène codant pour la protéine de
stress HtrA a été observée (Figure 11). Cette augmentation s’est avérée significative à partir
d’une concentration  75 µg/ml. À la CMI soit 125 µg/ml, une expression relative 6 fois
plus élevée que celle du contrôle a été notée.
Figure 11 : Effets de concentrations croissantes d’extrait de thé vert sur l’expression du
gène codant pour la protéine de stress HtrA chez P. gingivalis ATCC 33277. Les résultats
ont été normalisés avec le gène de l’ARNr 16S et sont exprimés selon la moyenne  l’écarttype. L’analyse statistique a été effectuée avec le test t de Student (* : p < 0.05).
40
4.1.2 Effet de l’EGCG
Tout comme l’extrait de thé vert, l’EGCG a augmenté l’expression du gène codant pour la
protéine de stress HtrA (Figure 12). Cette augmentation est significative à 50 et 62.5 µg/ml
et est dose-dépendante. À ces concentrations, l’expression du gène a été augmentée environ
2.5 fois par rapport au contrôle. L’EGCG a démontré un effet moindre comparativement à
l’extrait de thé vert, mais induit tout de même une condition de stress chez P. gingivalis. De
plus, dans le cas des 2 composés, les concentrations se rapprochant de la CMI ont causé les
plus fortes augmentations d’expression.
Figure 12 : Effets de concentrations croissantes d’EGCG sur l’expression du gène codant
pour la protéine de stress HtrA chez P. gingivalis ATCC 33277. Les résultats ont été
normalisés avec le gène de l’ARNr 16S et sont exprimés selon la moyenne  l’écart-type.
L’analyse statistique a été effectuée avec le test t de Student (* : p < 0.05).
41
42
5
DISCUSSION
Les affections parodontales sont des maladies inflammatoires affectant les tissus de soutien
de la dent. Ce sont des infections polymicrobiennes rencontrées chez une grande proportion
de la population, et plus fréquemment chez les adultes (4). Au-delà de 700 espèces
bactériennes différentes sont présentes à l’intérieur de la cavité buccale. Toutefois, ce n’est
pas l’intégralité de ces bactéries qui sont responsables du développement des maladies
parodontales. En effet, seules certaines d’entre elles ont pu être associées à l’état
pathologique. Notamment, les bactéries du complexe rouge, soit P. gingivalis, T. forsythia
et T. denticola, sont reconnues comme les agents étiologiques de la parodontite chronique
(28, 125). Lors du développement de cette maladie, la présence du biofilm bactérien dans
les sites sous-gingivaux constitue un facteur essentiel, mais n’est pas responsable à lui seul
de la destruction tissulaire caractéristique de la parodontite. En effet, une réponse immunoinflammatoire incontrôlée en réponse à l’agression bactérienne est déclenchée et permet la
progression de la maladie.
Au cours de la dernière décennie, bon nombre d’études ont été menées sur les composés
naturels en vue de leur utilisation comme solution alternative aux médicaments
conventionnels pour le traitement de diverses affections. En effet, plusieurs composés
naturels ont des propriétés bénéfiques pour la santé humaine et auraient le potentiel d’être
utilisés dans le traitement de diverses maladies, incluant les maladies parodontales. Des
produits comme la canneberge, le curcuma, les agrumes ou encore les huiles essentielles
ont fait l’objet d’études démontrant le potentiel prometteur de ces composés (126-129).
Dans le cadre de ce projet, la capacité d’un extrait de thé vert et de sa composante
principale, l’EGCG, à moduler l’expression de certains gènes chez P. gingivalis a été
évaluée. Plusieurs effets bénéfiques du thé vert et de l’EGCG ont déjà été rapportés dans la
littérature, notamment leur potentiel antioxydant, leur effet anti-inflammatoire et leur
propriété anti-cancer (87-91, 93-97). De plus, certains de leurs effets en regard des
problèmes buccaux, ont déjà été évalués. Par exemple, les polyphénols du thé vert peuvent
neutraliser les composés sulfurés volatils causant l’halitose (105-107). De plus, ils peuvent
inhiber les propriétés d’adhérence et la croissance de certaines bactéries comme S. mutans
43
et P. gingivalis, les principaux agents responsables de la carie dentaire et de la parodontite
chronique, respectivement. Malgré ces découvertes, les mécanismes responsables de ces
effets ne sont toujours pas clairement élucidés. De plus, peu d’études ont à ce jour évalué
l’effet des polyphénols du thé vert et de l’EGCG sur l’expression de différents gènes
bactériens.
Dans ce projet, la bactérie P. gingivalis a été étudiée. Ce choix a été justifié par le fait que
cette espèce bactérienne est le principal agent étiologique de la parodontite chronique. De
plus, P. gingivalis produit plusieurs facteurs de virulence qui lui permettent de coloniser et
survivre à l’intérieur de la poche parodontale, tout en contribuant à la destruction tissulaire.
Dans un premier temps, une évaluation de l’effet de l’extrait de thé vert, sur la croissance
de P. gingivalis a permis de démontrer qu’à une concentration minimale de 125 µg/ml, ce
composé inhibe totalement la croissance de la bactérie. Dans une autre étude utilisant le
même extrait de thé vert, une CMI (200 µg/ml) comparable à la nôtre avait été obtenue
(124). Dans cette étude, d’autres extraits de thés (blanc, noir et Oolong) avaient également
été testés et des CMI du même ordre de grandeur avaient été obtenues. Pour l’EGCG, une
concentration minimale de 62.5 µg/ml a permis d’inhiber complètement la croissance de P.
gingivalis. Il est estimé que dans une tasse de thé vert, soit 2.5 g de feuille de thé dans
200 ml d’eau, environ 90 mg d’EGCG s’y retrouvent, pour une concentration finale de
450 µg/ml d’EGCG (130). Considérant ces données, il est fort logique de penser que les
effets antibactériens liés à l’EGCG puissent se produire in vivo. D’autres études ont
démontré que l’EGCG a également un effet sur la croissance d’autres bactéries buccales
comme S. mutans et S. sobrinus (114). Divers mécanismes pourraient expliquer l’inhibition
de la croissance observée. Par des essais de diffusion sur milieu gélosé, Yi et collaborateurs
ont démontré que l’EGCG inhibe la croissance de Pseudomonas aeruginosa. Une analyse
par microscopie électronique leur a permis de constater que l’EGCG entraîne une perte
d’intégrité de la membrane externe chez la bactérie, inhibant ainsi la croissance bactérienne
(131). Une seconde étude a démontré que l’EGCG inhibe la dihydrofolate réductase chez
Stenotrophomonas maltophilia, ce qui entraîne, entre autres une perturbation de la synthèse
d’ADN et empêche la prolifération de la bactérie, ainsi que sa croissance (132). Une
44
inhibition de cette enzyme a également été rapportée lors d’une étude réalisée chez E. coli
(133).
L’adhérence primaire de P. gingivalis à l’intérieur de la cavité buccale fait intervenir entre
autres les fimbriae majeurs de type I (FimA) exprimés à sa surface. Ils sont essentiels à
l’adhérence de la bactérie à la surface de la dent puisqu’ils permettent la coadhésion aux
bactéries déjà présentes et l’adhésion aux surfaces (29-32). On retrouve également des
hémagglutinines qui permettent la liaison de la bactérie à des récepteurs, comme les
oligosaccharides présents sur les cellules humaines et qui permettent notamment l’adhésion
de la bactérie à la surface des érythrocytes (35). Dans ce projet, l’évaluation de l’effet de
l’extrait de thé vert et de l’EGCG sur l’expression des gènes codant pour les fimbriae et
pour les hémagglutinines a permis de démontrer que, même à de faibles concentrations
(50 µg/ml), l’extrait de thé vert diminue significativement l’expression de ces gènes.
Également, l’effet observé s’est avéré dose-dépendant. L’EGCG est apparu également
efficace, engendrant une diminution significative à 50 µg/ml pour le fimbriae et 62.5 µg/ml
pour l’hémagglutinine A. L’effet de ces composés sur l’adhérence de P. gingivalis aux
cellules épithéliales buccales a déjà été étudié par d’autres groupes de chercheurs. Sakanaka
et collaborateurs ont rapporté que l’EGCG était en mesure de bloquer presque
complètement l’adhérence de P. gingivalis aux cellules épithéliales à une concentration de
250 µg/ml (134). Plus récemment, notre équipe a démontré que l’extrait de thé vert, tout
comme des extraits de thés noir, blanc et Oolong, diminuait à plus de 60% l’adhérence de
la bactérie aux cellules épithéliales à une concentration de 25 µg/ml (124). Il a été proposé
que les composantes du thé se lieraient spécifiquement ou non-spécifiquement à des
molécules de surface de P. gingivalis empêchant ainsi son adhérence aux cellules
épithéliales buccales. En effet, diverses études ont démontré la capacité de liaison des
polyphénols à des constituants membranaires (135, 136). Une étude sur les mécanismes
d’action de l’EGCG chez E. coli a démontré par microscopie électronique que le composé
se fixait à la membrane externe. Plus spécifiquement, l’EGCG se liait aux résidus arginines
de la porine OmpG, bloquant ainsi le canal OmpG responsable du transport de petites
molécules hydrophiles (135). Une étude portant sur le virus de l’influenza a démontré que
l’EGCG se lie aux hémagglutinines du virus bloquant ainsi sa capacité d’adhésion aux
45
cellules (136). Ces études permettent de suggérer que l’inhibition de l’adhérence serait due
à la liaison des composés à des constituants membranaires. Toutefois, notre étude est la
première à rapporter un mécanisme d’inhibition impliquant une modulation de l’expression
de gènes laissant place à l’hypothèse que la diminution de la propriété d’adhérence, comme
il a été démontré dans une étude antérieure, pourrait également résulter d’une diminution de
l’expression des gènes.
Dans un deuxième temps, l’effet de l’extrait de thé vert et de l’EGCG sur l’expression des
gènes codant pour les protéases a été étudié. Nous avons démontré que l’exposition de P.
gingivalis à des concentrations croissantes de ces deux composés engendre une diminution
significative et dose-dépendante de l’expression des gènes rgpA et kgp codant pour une
Arg- et une Lys-gingipaïne, respectivement. Les protéases étant essentielles à plusieurs
fonctions physiologiques et pathologiques chez P. gingivalis, différents groupes de
chercheurs ont étudié les conséquences associées à une inactivation de ces gènes (rgpA,
rgpB, kgp). Grenier et collaborateurs ont démontré qu’un mutant de P. gingivalis déficient
pour la production de protéases devenait plus susceptible à l’action du complément et
voyait sa capacité d’hémagglutination aux érythrocytes, sa capacité à proliférer
efficacement dans le sérum humain et son pouvoir hémolytique diminués significativement
(41). Une autre étude a démontré que l’inactivation du gène kgp entraînait une perte de la
pigmentation des colonies de P. gingivalis sur gélose sang et une diminution des activités
hémagglutinine et hémolytique de la bactérie (137). Pathirana et collaborateurs ont
démontré, grâce à un modèle murin, que des mutants pour les protéases (RgpA, RgpB et
Kgp) de P. gingivalis voyaient leur virulence diminuée. En effet, la capacité des mutants à
coloniser la surface de la dent, à déclencher une réponse inflammatoire et à engendrer une
résorption osseuse étaient affectées négativement (138). Un autre groupe de chercheurs,
ayant démontré une perte de l’activité protéolytique chez des mutants de P. gingivalis, a
voulu vérifier la virulence de ces mutants dans un modèle murin. Lorsqu’injecté chez la
souris, les mutants de P. gingivalis ont démontré une virulence atténuée (139). Considérant
les résultats des études précédentes, la capacité des polyphénols du thé vert à diminuer
l’expression des gènes codant pour les protéases pourrait donc avoir plusieurs
conséquences sur P. gingivalis.
46
De plus, Okamoto et collaborateurs ont démontré que les catéchines du thé vert,
principalement les gallates, diminuaient significativement l’activité catalytique des
protéases de P. gingivalis (140). Il a également été rapporté que les catéchines du thé vert
inhibaient les activités protéolytiques de P. gingivalis, de façon similaire à ce qui avait été
observé pour la doxycycline et les dérivés non-antimicrobiens modifiés de la tétracycline
(141). En plus d’avoir un effet sur les protéases bactériennes, les polyphénols du thé vert
affectent également l’activité des MMPs et leur production par les cellules de l’hôte. En
effet, l’EGCG peut inhiber à la fois l’activité des MMPs et l’expression du gène codant
pour certaines d’entre elles (119, 121, 142)
Une diminution de l’expression de FimA et des protéases par les polyphénols du thé vert
pourraient également contribuer à réduire l’inflammation, car ces facteurs de virulence ont
la capacité d’induire la production de cytokines entre autres par les monocytes et les
macrophages (29, 54, 56).
Bien que les protéases de P. gingivalis puissent contribuer à l’hémolyse des érythrocytes
(143), il a été démontré qu’une activité hémolytique est toujours présente malgré
l’inactivation des gènes codant pour les protéases (137). Ceci résulte du fait que P.
gingivalis possède une hémolysine aussi impliquée dans la lyse des érythrocytes. Notre
analyse des effets du thé vert et de l’EGCG sur le gène de l’hémolysine (hem) montre que
son expression est modulée négativement de façon dose-dépendante par les deux composés.
L’extrait de thé vert a engendré une diminution significative de l’expression du gène à la
CMI (125 µg/ml), mais un tel effet n’a pas été observé pour l’EGCG. Une étude réalisée
chez S. aureus a démontré que l’expression des gènes codant pour l’-toxine (possédant
une activité hémolysine) (hla et agrA) était diminuée par la licochalcone A (licA), un
polyphénol de la famille des chalcones. De plus, à des concentrations sous-inhibitrices, licA
est en mesure de diminuer jusqu’à 95% la production d’-toxine chez cette bactérie. (144).
Cette étude suggère que la diminution de l’expression du gène de l’hémolysine pourrait être
en lien avec une diminution de l’activité hémolytique de la bactérie. Il serait donc
intéressant d’analyser la modulation de ce pouvoir hémolytique chez P. gingivalis pour
mettre en corrélation les effets observés. D’autres produits naturels tels que le menthol,
47
l’eugénol et la naringénine ont également la capacité d’inhiber l’expression du gène codant
pour l’-toxine chez S. aureus (145-147).
Des études réalisées chez d’autres bactéries, buccales et non-buccales, ont démontré une
inhibition de l’expression des gènes impliqués dans la virulence par les polyphénols du thé
vert. Ainsi, Lee et collaborateurs ont démontré que l’EGCG réduit l’expression des gènes
(eae, escN, espA, sepZ et tir) responsables du quorum sensing chez E. coli O157:H7 (148).
L’EGCG, à des concentrations sous-inhibitrices, a également engendré une inhibition chez
S. mutans de l’expression du gène gtf codant pour la glucosyl transférase qui est impliquée
dans la formation du biofilm (149). Un autre groupe de chercheurs a démontré que l’EGCG
inhibait l’expression de gènes codant pour des facteurs de virulence de S. mutans, soit
atpD, eno, ldh et aguD (118).
Après avoir étudié la modulation de l’expression des gènes codant pour les facteurs de
virulence majeurs de P. gingivalis, une analyse de la modulation du gène codant pour la
protéine de résistance au stress HtrA a été réalisée. Nous avons déterminé que l’expression
de ce gène est augmentée de manière dose-dépendante par l’extrait de thé vert et l’EGCG.
Plus spécifiquement, l’expression du gène était environ 6 fois plus élevée que pour le
contrôle lorsque la bactérie était en présence de 125 µg/ml de l’extrait de thé vert. Pour
l’EGCG, un niveau d’expression 2.5 fois supérieur au contrôle a été observé à 62.5 µg/ml.
Dans les résultats décrits précédemment, l’EGCG engendrait un effet généralement
inférieur à celui obtenu avec l’extrait de thé vert, et ce, pour tous les gènes analysés. Le thé
vert ayant démontré un meilleur effet, il semble logique d’observer un niveau de stress plus
élevé chez la bactérie. D'après une analyse de la littérature, notre étude est la première à
rapporter l’effet des polyphénols du thé vert sur l'expression de gènes codant pour la
protéine HtrA. Toutefois, Kang et collaborateurs ont démontré que l’expression du gène
htrA chez S. mutans était augmentée lorsque la bactérie était placée en milieu acide (150).
Ils ont également démontré par l’utilisation d’un mutant déficient pour le gène htrA que la
capacité de croissance de la bactérie était diminuée. Dans le même ordre d’idée, lors de
l’étude d’un mutant de P. gingivalis déficient pour la protéine HtrA, il a été démontré que
ce dernier était plus sensible au stress oxydatif que la souche sauvage (62). HtrA étant une
48
protéine de résistance au stress, l’augmentation de l’expression de son gène codant suggère
que P. gingivalis est en situation de stress lorsque mise en présence des polyphénols du thé
vert. Une étude réalisée chez P. aeruginosa a par ailleurs démontré que les polyphénols du
thé vert peuvent induire un stress oxydatif chez cette bactérie. Cela a pour effet d’engendrer
une augmentation de l’expression de plusieurs gènes liés au stress oxydatif comme katB,
sodM, ohr, lexA et recN (151).
Plusieurs études ont évalué l’effet du thé vert et de l’EGCG sur la croissance de P.
gingivalis et l’activité de certains de ses facteurs de virulence (124, 134, 140). Cependant,
aucune étude n’a été menée en regard de l’effet de ces composés sur l’expression de gènes
chez P. gingivalis. Notre étude est donc la première à identifier le thé vert et l’EGCG
comme étant des composés en mesure de diminuer de manière significative et dosedépendante l’expression des gènes codant pour : les facteurs de colonisation (FimA, HagA
et HagB), les facteurs impliqués dans la destruction tissulaire et l’inactivation des
mécanismes de défense de l’hôte (RgpA et Kgp); et l’hémolysine chez cette bactérie. De
plus, une augmentation de l’expression du gène codant pour la protéine de stress HtrA chez
P. gingivalis a été démontrée pour la première fois lors de cette étude. Des études à venir
permettront d’identifier les mécanismes impliqués dans l’inhibition des gènes à l’étude.
En conclusion, ce projet nous a permis de générer des données préliminaires permettant de
supporter le potentiel préventif et thérapeutique du thé vert et de sa composante principale,
soit l’EGCG. En effet, les résultats obtenus montrent que ce sont des composés
antibactériens capables de diminuer l’expression des gènes codant pour les facteurs de
virulence majeurs de P. gingivalis. Cette bactérie étant le principal agent étiologique de la
parodontite chronique, les propriétés de ces produits pourraient s’avérer utiles en regard de
la prévention et du traitement des maladies parodontales. Nos résultats ajoutent un nouvel
aspect sur les modes d’action possibles des polyphénols du thé vert pour la santé
parodontale. Plusieurs propriétés des polyphénols du thé vert sont déjà connus, par exemple
leur effet anti-inflammatoire ou leur capacité à stimuler la production de -défensines par
les cellules épithéliales (123). Des études chez le rat ont également démontré que les
polyphénols du thé vert sont dotés de propriétés permettant de réduire la résorption osseuse
49
(119-121). Dans le même ordre, Yoshinaga et collaborateurs ont démontré qu’un extrait de
thé vert était capable de diminuer la perte d’attache ainsi que le niveau de résorption
osseuse chez le rat lorsque stimulé avec le LPS de E. coli (152). Un autre groupe de
chercheurs a démontré que l’administration d’EGCG dans un modèle de parodontite chez le
rat engendre une diminution de l’expression de l’IL-6 et du TNF ce qui a mené à une
diminution de l’activité des ostéoclastes et donc une diminution de la destruction osseuse
(153). Enfin, une étude dans un modèle murin a également permis de démontrer que les
catéchines du thé vert sont en mesure d’inhiber la production d’IL-1, la résorption
osseuse, ainsi que l’ostéoclastogenèse lors d’une parodontite induite par une injection de
LPS de E. coli (154).
À l’heure actuelle, le thé vert est déjà utilisé comme additif dans divers produits d’hygiène
buccale tels que le rince-bouche, le dentifrice et même la gomme à mâcher (Listerine
natural green tea, Pepsodent et Mega-T). Cependant, aucune information précise
relative à la quantité de thé vert et au pourcentage d’EGCG ni même relative à l’efficacité
des composantes du thé vert une fois ajouté à ces produits ou aux interactions qu’elles
pourraient avoir avec les autres molécules de ces produits n’est disponible ou même
connue. Des études supplémentaires sont donc nécessaires pour s’assurer de l’efficacité des
produits. À plus long terme, l’utilisation du thé vert et de l’EGCG à des fins de prévention
ou de traitement des affections buccales pourrait être envisageable. L’introduction de ces
composés naturels dans un gel, une fibre ou encore une bandelette pour une application
locale comme il est actuellement possible de faire avec la tétracycline, le métronidazole et
la chlorhexidine pourrait permettre un meilleur contact des parodontopathogènes avec les
composés bioactifs (8, 122).
En perspective, bien que P. gingivalis soit un parodontopathogène important, il n’en
demeure pas moins que T. denticola et T. forsythia sont deux autres agents pathogènes
d’importance dans la parodontite chronique puisqu’elles sont également des membres du
complexe rouge. Il serait donc justifié d’évaluer l’effet du thé vert et de l’EGCG sur
l’expression des gènes codant pour leurs facteurs de virulence. Également, il pourrait
s’avérer pertinent d’étudier l’effet des polyphénols du thé vert sur l’expression de la
50
leucotoxine, le facteur de virulence principal d’A. actinomycetemcomitans responsable de la
forme agressive de la parodontite.
51
52
6
ANNEXE
Au cours de mes études de deuxième cycle, d’autres expériences se rapportant à la
problématique des maladies parodontales ont été réalisées. Plus spécifiquement, ces
expériences ont été menées sur une lignée de cellules épithéliales et une lignée de
monocytes, dans le but d’analyser l’expression de certaines protéines ayant un rôle à jouer
dans la réponse inflammatoire. Les résultats mentionnés dans la présente section n’ont pas
été inclus dans le mémoire.
Dans un premier temps, une expérience visant à étudier la modulation de l’expression du
gène
codant
pour
la
protéine
de
surface,
EMMPRIN
(Extracellular
matrix
metalloproteinase inducer) chez la lignée de cellules épithéliales buccales GMSM-K a été
réalisée. L’EMMPRIN, aussi appelée CD147, est une glycoprotéine transmembranaire qui
active la production de MMPs par les cellules épithéliales et les fibroblastes. L’objectif
était de vérifier la capacité du thé vert à diminuer l’expression de cette protéine en vue
d’abaisser la réponse immuno-inflammatoire. Tout d’abord, un test de viabilité cellulaire
soit le test du MTT a été réalisé pour déterminer la plus forte concentration de l’extrait de
thé vert qui permettait de conserver la viabilité cellulaire. La concentration obtenue était de
100 µg/ml. Par la suite, des stimulations des cellules épithéliales avec le LPS de P.
gingivalis, un extrait sonique et des cellules de P. gingivalis ATCC 33277 ont été
effectuées afin d’obtenir une condition pour laquelle il y avait augmentation de l’expression
de la protéine. Cependant, malgré plusieurs essais réalisés pour différents temps (1 h à
48 h) et avec plusieurs concentrations de ces stimulants, il a été impossible d’obtenir un
niveau d’expression élevé de façon reproductible. Cette trop grande variabilité des résultats
n’a donc pas rendu possible l’analyse de la modulation de l’expression du gène codant pour
l’EMMPRIN chez les cellules épithéliales par les polyphénols du thé vert.
Par la suite, chez la même lignée cellulaire, la protéine MUC-1 a été étudiée dans le but
encore une fois d’atténuer la réponse immuno-inflammatoire. Cette protéine de surface a un
rôle protecteur grâce à sa capacité à lier les agents pathogènes afin de prévenir leur contact
avec les cellules épithéliales buccales. Pour cette expérience, les cellules ont été mises en
53
présence de 100 µg/ml d’extrait de thé vert et d’EGCG, après quoi, une analyse par qPCR a
été réalisée afin d’analyser le niveau d’expression du gène codant pour la protéine. Une
augmentation de l’expression environ 4 fois supérieure au contrôle a été obtenue pour les
deux composés. Cependant, aucune autre analyse supplémentaire n’a été réalisée.
Finalement, une lignée de cellules monocytaires (U-937) a été étudiée. Ces cellules,
qu’elles soient ou non différenciées en macrophages, expriment à leur surface la protéine
TREM-1 (Triggering receptor expressed on myeloid cells-1). L’activation de TREM-1
engendre la formation d’un complexe avec DAP12 qui mène à la libération de médiateurs
de l’inflammation comme le TNF-α et l’IL-8. Un test de viabilité de type MTS a été réalisé
sur les monocytes afin de déterminer les concentrations maximales d’extrait de thé vert et
de l’EGCG à utiliser pour éviter une perte de viabilité cellulaire. La concentration identifiée
pour les 2 composés était de 100 µg/ml. Des stimulations de 2, 4 et 6 h avec des MOI (25 et
100) de P. gingivalis ont été réalisées. Cependant, aucun résultat représentatif démontrant
une modulation significative de l’expression n’a été obtenu dû à une trop grande variabilité.
Des expériences contribuant à la réalisation de deux autres projets en vue de publications
ont également été réalisées. Pour le premier projet, des traitements de P. gingivalis suivant
la même procédure et les mêmes conditions que pour nos essais avec l’extrait de thé vert et
l’EGCG ont été réalisés, mais en utilisant le rhein, un anthraquinone isolé de la rhubarbe.
Des analyses en qPCR ont été effectuées pour évaluer l’effet sur l’expression des gènes
codant pour les facteurs de virulence majeurs préalablement analysés dans ce mémoire.
Article : Jabrane Azelmat, Jade Fournier-Larente, Daniel Grenier, The anthraquinone
rhein exerts synergistic antibacterial activity in association with metronidazole or natural
compounds and attenuates virulence gene expression in Porphyromonas gingivalis. En
cours de rédaction.
Pour le second projet, S. moorei, une bactérie à Gram-positif qui a été associée à l’halitose,
a été étudiée. Des résultats déjà obtenus démontraient que l’extrait de thé vert et l’EGCG
inhibaient son activité -galactosidase. Nous avons donc réalisé des analyses en qPCR afin
de déterminer si l’expression du gène codant pour cette enzyme était inhibée. Les CMI
54
étant connues, nous avons réalisé des traitements avec les composés suivant la même
procédure que pour P. gingivalis et avons démontré une diminution de l’expression du gène
de la -galactosidase. Article : Marie-Pierre Morin, Telma Bedran, Jade FournierLarente, Bruno Haas, Jabrane Azelmat and Daniel Grenier, Green tea extract and its
major constituent epigallocatechin-3-gallate inhibit growth and halitosis-related properties
of Solobacterium moorei. Soumis pour publication à BMC Complementary and Alternative
Medicine.
55
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