Voies de signalisation des récepteurs couplés aux protéines G
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Voies de signalisation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG ou GPCR) Audrey Claing, Ph.D Département de Pharmacologie Université de Montréal [email protected] 10 janvier 2013 Plan du cours 1) Structure et fonction des GPCRs 2) Transduction signalitique protéines G dépendante et indépendante 3) Mécanismes de désensibilisation 4) Mécanisme d’internalisation/trafficking intracellulaire 5) Signalisation biaisée 6) Signalisation vers la voie des MAPK Adaptation de la réponse pharmacologique: -Plus de 40% des agents pharmacologiques ciblent les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) -Environ 1 000 gènes encodent les RCPGs -Les RCPG sont responsable de la pluspart des réponses physiologiques et leur fonction est déréglée lors du développement de pathophysiologies. The Nobel Prize in Chemistry Lefkowitz and Kobilka made groundbreaking discoveries, mainly in the 1980s, on an important family of receptors, known as G-protein-coupled receptors. In 2011, Mr. Kobilka's team captured an image of the receptor for adrenaline at the moment when it is activated by a hormone and sends a signal into the cell. Récepteurs couplés aux protéines G ODORANTS Ca2+ SMALL MOLECULES: • amino acids, amines • nucleotides, nucleosides • prostaglandins, PAF • peptides... NH2 LIGHT PROTEINS: • glycoprotein hormones • interleukines • chemokines... Extracellular Intracellular COO RECEPTOR H G PROTEIN INTRACELLULAR MESSENGERS EFFECTOR: • enzymes • channels Familles des RCPG (A) Three main families (1, 2 and 3) can be easily recognized when comparing their amino-acid sequences. Receptors from different families share no sequence similarity, suggesting that we are in the presence of a remarkable example of molecular convergence. Family 1 contains most GPCRs including receptors for odorants. Group 1a contains GPCRs for small ligands including rhodopsin and -adrenergic receptors. The binding site is localized within the seven TMs. Group 1b contains receptors for peptides whose binding site includes the N-terminal, the extracellular loops and the superior parts of TMs. Group 1c contains GPCRs for glycoprotein hormones. It is characterized by a large extracellular domain and a binding site which is mostly extracellular but at least with contact with extracellular loops e1 and e3. Family 2 GPCRs have a similar morphology to group Ic GPCRs, but they do not share any sequence homology. Their ligands include high molecular weight hormones such as glucagon, secretine,VIP-PACAP and the Black widow spider toxin, -latrotoxin (Krasnoperov et al., 1997; Davletov et al., 1998). Family 3 contains mGluRs and the Ca2+ sensing receptors (Pin and Bockaert, 1995). Last year, however, GABA-B receptors (Kaupmann et al., 1997) and a group of putative pheromone receptors coupled to the G protein Go (termed VRs and Go-VN) became new members of this family (reviewed in Bargmann, 1997). (B) Family 4 comprises pheromone receptors (VNs) associated with Gi (Dulac and Axel, 1995). Family 5 includes the 'frizzled' and the 'smoothened' (Smo) receptors involved in embryonic development and in particular in cell polarity and segmentation. Finally, the cAMP receptors (cAR) have only been found in D.discoïdeum but its possible expression in vertebrate has not yet been reported. The dendrogram has been established with Clustal W. Fonctions biologiques associées à l’activation des RCPG } } } } } } } } } ß-adrénergique R: contrôle du rythme cardiaque Angiotensine II R: contrôle de la pression artérielle Rhodopsin R: vision Dopamine R: comportement et contrôle de l’humeur Histamine R: contrôle de la réponse inflammatoire Acétylcholine R: contrôle de la transmission nerveuse Opioïd R: contrôle de la douleur Oxytocine R: contrôle de la contraction de l’utérus Etc….. Depuis longtemps, la nature intrinsèque du récepteur est importante pour la signalisation Neuron • October 1992 • Vol. 9 • p719-25 Constitutively active mutants of rhodopsin. Robinson PR, Cohen GB, Zhukovsky EA, Oprian DD. Graduate Department of Biochemistry, Brandeis University, Waltham, Massachusetts 02254. Nature • October 14, 1993 • Vol. 365 Somatic mutations in the thyrotropin receptor gene cause hyperfunctioning thyroid adenomas. Jasmine Parma *† , Laurence Duprez *, Jacqueline Van Sande *, Pascale Cochaux *†, Christine Gervy *, Jean Mockel *, Jacques Dumont * and Gilbert Vassart*† * Institut de Recherche Interdisciplinaire and † Service de génétique Medicale, Faculty of Medicine, University of Brussels, Campus Erasme, 808 route de Lennik, 1070 Brussels, Belgium. A constitutively activating mutation of the luteinizing hormone receptor in familial male precocious puberty. Andrew Shenker *, Louisa Laue ‡, Shinji Kosugi§||, John J. Merendino Jr *, Takashi Minegishi ¶ and Gordon B. Cutler Jr. ‡ * Molecular Pathophysiology Branch, Building 10, room 8C-101, NIDDK, ‡ Developmental Endocrinology Branch, NICHD, and § Cell Regulation Section, Laboratory of Biochemistry and Metabolism, NIDDK, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892, USA. || Department of laboratory Medicine, Kyoto University School of Medicine, Kyoto 606, Japan. ¶ Department of Obstetrics and Gynecology, Gunma University School of Medicine, Maebashi, Gunma 371, Japan MB 2004 Premières expériences: Mutations activatrices ß2AR Activité basale Rasmussen et al., 1999 Récentes évidences: haute activité constitutive des GPCR Signalisation indépendante des ligands Exemple: Récepteur de la Ghrelin (GHS-R1) - plus haute activité basale (Gq: 50% de la réponse maximale) (Damian M et al., 2011, JBC) agoniste inverse agoniste inverse - In vivo: signalisation augmentée pour la prise alimentaire et le gain de poids Chez l’humain, une mutation associée au gène GHS-R1a supprime l’activité constitutive et est associé à une petite stature. Ces effets dépendent d’un défault de « traficking ». (Pantel J et al., 2006, JCI) Signalisation dépendante des protéines G Diversité des protéines G Rappel de la voie Gs Adenylate cyclases: Isoformes et Activateurs: 1. I, III, VIII: Gsα, Fsk, Ca2+/CaM 2. II, IV, VII: Gsα, Fsk, Gßγ, PKC 3. V, VI: Gsα, Fsk, PKC 4. IX: Gsα 5. soluble: HCO3- Rôles de la voie cAMP/PKA: Régulation du cycle cellulaire Prolifération/différentiation Régulation de la dynamique des microtubules Condensation et décondensation de la chromatine Désassemblage et assemblage de l’enveloppe nucléaire Régulation des mécanismes de transport intracellulaire Régulation du flux ionique Exocytose Régulation de la stéroidogénèse Reproduction Effets des autacoïdes/hormones, neurotransmetteurs http://sitemaker.umich.edu/sunahara/g_protein-coupled_signaling_cascade Rappel de la voie Gq Hormone Phosphatidylinositol 4-5 biphosphate Exterior 1,2-diacyglycerol Protein kinase C Protein (inactive) Cytosol Receptor G protein Inositol 1,4,5, triphosphate Endoplasmic reticulum Protein-P (active) Phospholipase C ER Ca2+ channel sensite to inositol 1,4,5-triphosphate Ca2+ Cellular response Rappel de la voie G12/13 Voies de signalisation protéines Gindépendantes ß2AR NHE3 NHERF Réabsorption du Na dans tubule proximal Hall et al., Nature 1998 Réponse biologique Mécanismes de désensibilisation: contrôle de la durée et de l’intensité de la réponse A A A Control Adenylate cyclase activity (%) maximum 100 2 min 80 10 min 60 min 60 160 min 40 20 0 -8 -7 -6 Log [agonist] M -5 -4 MB 2004 Mécanismes de désensibilisation Agonist Ctrl Des GRK PK P P Adenylyl Cyclase Activity Ctrl Des Log [Agonist] 1ère étape: Phosphorylation des récepteurs • Kinases des seconds messagers: Désensibilisation hétérologue • Kinases des récepteurs couplés aux protéines G: Désensibilisation homologue β2AR Mécanismes de désensibilisation 1ère étape: Phosphorylation des récepteurs • Kinases des récepteurs couplés aux protéines G (GRK): - Serine/Threonine kinases - 3 classes: GRK1 (rhodopsin kinase), GRK7 (opsin kinase): rod outer segment, cone GRK2 (BARK-1), GRK3 (BARK-2): leukocytes, cortex, heart, lung, kidney GRK4: testis, brain; GRK5: heart, lung, skeletal muscle, brain, liver; GRK6: brain, skeletal muscle Receptor recognition domain catalytic domain Protein/protein interaction domain Reviewed in Pitcher et al. (1999) Ann Rev Biochem 2. Partenaires d’interaction: Gβγ, PIP2, PI-3K, tubulin, actin, α-actinin, GITs, r P2 3. Spécificité: Dépend de l’affinité pour le récepteur et de la distribution des kinases. Mécanismes de désensibilisation Agonist ßarr GRK P P P P PK 2e étape: liaison des arrestines • découplage des protéines G ßarr Mécanismes de désensibilisation 2e étape: liaison des arrestines 1. Caractérisation: arrestin (visual system: cones) rarrestin (visual system: rod) ßarrestin 1 and ßarrestin 2 (ubiquitous) 2. Partenaires d’interaction: Clathrin, AP-2, NSF, Src, PIP3, IP6, ARNO, ARF6, JNK3, Erk, MDM2, ect. 3. Spécificité: Distribution Certains récepteurs ßarrestin 1 = 2 ou ßarrestin 2 > ßarrestin 1 ßarrestine est recrutée au ß2AR par l’action de GRKs spécifiques HEK 293 U2-OS Violin JD et al., JBC 2006 Rôle de la ßarrestine sur la désensibilisation Effect of siRNA-mediated ßarrestin depletion on cAMP accumulation by endogenously expressed ß2-AR Ahn et al. (2003) Effect of reduced ßarrestin levels on second messenger generation Kohout et al. (2001) Mécanismes d’internalisation La plupart des récepteurs désensibilisés sont internalisés. L’internalisation est un processus différent de la désensibilisation. Étapes: Stop Go Rôle de la ßarrestine dans l’internalisation Fig. 3. Effect of siRNA-mediated suppression of ßarrestin levels on 7MS receptor internalization Ahn, S et al. (2003) Protéines interagissant avec la ßarrestine 337 identifiées, Xiao et al., 2007 Receptors RalGDS ARF6 ARNO Clathrin JNK3 AP-2 Dvl MDM2 NSF Src ßarrestine/AP-2/clathrine Clathrin triskelion AP-2: hétérotétramère AP-2 NH2 σ α β µ COOH ß-adaptine µ-adaptine La ßarrestine interagit directement avec la la clathrine et la protéine AP-2 Rôle de l’interaction ßarrestin/ß2adaptine dans l’internalisation ßarr2 deficient in ß-adaptin binding translocates to the ß2AR, but receptor/ßarr2 complexes are excluded from CCV. Laporte et al., JBC 275, 23120-23126, 2000 Rôle de la clathrine dans l’internalisation Inhibition de l’internalisation des ß2AR dans les cellules déplétées en CHC. Mangmool S, JBC. 2006 281: 31940-9. Epub 2006 Aug 18 Protéines qui contrôlent le recrutement de la clathrine et AP-2 au récepteur activé: ARFs ARFs: Facteur d’ADP-ribosylation Interrupteur moléculaire responsable de la sélection, de lʼamplification et du" “timing” de la transduction signalétique provenant de différentes sources" - Petite GTPase de la famille de Ras" - ~21 kDa" - 6 isoformes (ARF1 à 6)" ARF GEF" (Facteur dʼéchange de nucléotide guanine)" ARF" GDP" ARF" GTP" ARF GAP" (protéine activatrice GTPasique)" Formation et mouvement " des vésicules" Transformation des lipides " membranaires: Activation de " PLD et PIP5K" Remodelage de lʼactine " La déplétion d’ARF6 inhibe internalisation du ß2AR HEK 293 cells Houndolo et al., 2004 ARF6 contrôle le recrutement de l’AP-2 et clathrin au récepteur activé Poupart ME et al., 2007 Les ARF6 interagit avec la ßarrestine, l’AP-2 et la clathrine Claing et al, 2001 Les ARF6 interagit avec la ßarrestine, l’AP-2 et la clathrine Poupart ME et al, 2007 Rôle de l’activation d’ARF6 Mécanismes qui dictent le trafficking intracellulaire des GPCRs Classe B Classe A Mécanismes qui dictent le trafficking intracellulaire des GPCRs ß2AR V2R/ß2ARCT ß2AR/V2RCT V2R ß2AR V2R ß2AR/V2RCT V2R/ß2ARCT Oakley, R. H. et al. 1999 Recyclage des récepteurs vers la membrane plasmique Oakley, R. H. et al. 1999 Un motif SSS dicte le profil d’internalisation du complexe récepteur/ßarrestin Oakley, R. H. et al. 2001 Comment un défaut de l’internalisation peut-il mener à l’état pathologique? Exemple du V2R(R137H): mutation retrouvée chez les diabétiques WT R137H Barak et al. (2001) La mutation des sites SSS dans la queue CT renverse le phénotype conféré par la mutation Barak et al. (2001) Résumé Activation Réponse biologique Resensibilisation Restauration de la réponse biologique Désensibilisation Activation de voies alternatives Contrôle de la réponse biologique Efficacité des ligands ß2AR complet" Réponse! Agonist" partiel" R R* R R* Antagonist" 0! partiel" complet" Log [ligand]! Agoniste" Inverse" Nature du ligand 1. Classification selon l’activité pharmacologique full" Réponse! Agonist" partial" 0 Antagonist" partial" full" Inverse" Agonist" Log [ligand]! Chidiac P, et al .Mol Pharmacol. (1994) 45(3):490-9. Efficacité des ligands ß2AR Classification selon leur puissance à produire cAMP: FBS Iso Basal Pro ICI ERK1/2 HEK293 525 425 325 125 100 75 50 25 0 * * Fsk Basal Iso ICI pERK1/2 Iso Basal Tim Pro * ICI ERK1/2 phosphorylation (% of basal) cAMP accumulation (% of basal) Isoprotérenol: agoniste Timolol: antagoniste Propranolol: agoniste inverse ICI 118551: agoniste inverse Nomenclature à réviser selon la voie de signalisation étudiée 350 Cos 1 * 300 250 200 * 150 * 100 50 0 Basal Iso Pro ICI Tim: no effect (similar to basal) Azzi M et al. PNAS (2003) 100: 11406 Activation des voies mitogéniques par les GPCRs: G protéines Activation des voies mitogéniques par les GPCRs: transactivation des RTKs Activation des voies mitogéniques par les GPCRs: les ßarrestines Localisation de l’activation des MAPK Endosomes (late) Noyau Membrane ruffles Modèle d’activation des GPCRs: signalisation biaisée Multi-State Model Receptor Switch « on/off » Adapted from Kenakin 2003 A B Gαβγ contraction ßarr internalisation C RTK prolifération Signalisation biaisée endogène: exemple physiologique Kohout T et al., 2004 Differential Desensitization, Receptor Phosphorylation, ßArrestin Recruitment, and ERK1/2 Activation by the Two Endogenous Ligands for the CC Chemokine Receptor 7* CCL19 stimulation, but not CCL21, promotes CCR7 desensitization desens CCL19 and CCL21 are equipotent for the activation of CCR7-G protein coupling and Ca2+ mobilization G protein coupling Ca2+ Signalisation biaisée endogène: exemple physiologique Kohout T et al., 2004 ßArrestin-2 is recruited to CCR7 following stimulation with CCL19, but not CCL21 CCL19 and CCL21 induce ERK1/2 MAPK activation CCL19 is more potent ßArrestin-2 mediates ERK1/2 activation induced by CCL19 21 G Ca2+ Erk1/2 19 G Ca2+ ßarrestin Erk1/2 desens Exemple du récepteur de l’Angiotensine II: 1 récepteur, plusieurs ligands Affinité de 5 analogues de l’Ang II Ang II ATR ATR ATR ßarr prolifération Ang II-DVG Ang II-SI migration ßarr migration ßarr prolifération Modèle d’activation des GPCRs: signalisation biaisée/ protéine G vs ßarr Receptor Switch « on/off » Multi-State Model Adapted from Kenakin 2003 A B Gαβγ ßarr Signalisation biaisée endogène: exemple d’application thérapeutique Discovery of β-Arrestin–Biased Dopamine D2 Ligands for Probing Signal Transduction Pathways Essential for Antipsychotic Efficacy Allen JA et al., 2011 D2R-mediated Gi-coupling ßarrestin 2 translocation UNC9975, UNC0006, and UNC9994 are functionally selective, β-arrestin–biased dopamine D2 partial agonists. Quinpirol: agonist; Haloperidol: antagonist Discovery of β-Arrestin–Biased Dopamine D2 Ligands for Probing Signal Transduction Pathways Essential for Antipsychotic Efficacy Allen JA et al., 2011 UNC9994 exhibits potent antipsychotic-like activity in mouse hyperlocomotion studies that is completely abolished in β-arrestin-2 knockout mice. *** Ces composés seraient donc d’efficaces antipsychotiques et auraient moins d’effets secondaires Modèle d’activation des GPCRs: modulation des réponses par les ligands allostériques et/ou A Novel Biased Allosteric Compound Inhibitor of Parturition Selectively Impedes the Prostaglandin F2α-mediated Rho/ROCK Signaling Pathway Goupil E et al., JBC, 2010 Peptido-mimetic FP receptor ou PDC113.824 Tocolytic action of PDC113. PDC113.824-mediated increase of PGF2α-dependent ERK1/2 activation. Cell ruffling induced by PGF2α through the Gα12-Rho-Rock pathway is inhibited by PDC113.824. PDC113.824-mediated biased signaling effects through FP receptor.
