– UE VII : –

2016-2017 Génétique bactérienne
Nom du cours
– UE VII : –
Généralités, mutations, échanges horizontaux (suite)
Pas d'annexe
Semaine : 12 (du 21/11/16 au
25/11/16)
Date : 22/11/2016
Heure : de 8h00 à
10h00 Professeur : Pr. Romond
Binôme : n°26 Correcteur : n° 44
Remarques du professeur : Pas de remarques
PLAN DU COURS
I) Conjugaison
A) Expérience de Lederberg et Tatum
B) Expérience de Dauris
C) Sélection par antibiotiques
D) Plasmide conjugatif
1) Système classique F+/F-
2) Système haute fréquence HFR
3) Système d'erreur
4) Résumé
E) Plasmide non conjugatif
1) Les phages
2) Transduction généralisée
3) Transduction restreinte
II) Transformation
A) Expérience de Griffith
B) Conditions
C) Fréquences
III) Transposition
A) Séquences d'insertion
B) Transposons complexes
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C) Introns du groupe II
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2016-2017 Génétique bactérienne
I) Conjugaison
A) Expérience de Lederberg et Tatum
Nous allons envisager le mode de détermination qui ont permis aux premiers chercheurs de détecter un
transfert génétique différent de ce qu'ils connaissaient déjà, c'est à dire les mutations.
Il s'agit de l'expérience de Lederberg et Tatum, ces chercheurs ont sélectionné (et non induit) des mutants
auxotrophes (dépendance à des systèmes complexes pour trouver leur C et leur N), ils étaient de l'espèce
Escherichia Coli.
Ce qui caractérise une souche auxotrophe, c'est que sur un milieu minimum, dans lequel on apporte que
de l'azote (ammonium) et du carbone (carbonate), E. Coli sera incapable de se développer.
Ils ont séparé des sous classes, qu'on va appeler des clones d'E. Coli, qui en plus vont avoir des
spécificités particulières :
→ Un mutant A a des exigences par rapport à la biotine, à la méthionine (Bio Met -) : il faut apporter
dans le milieu Bio et Met sinon pas de croissance bactérienne, par contre ils sont Thréonine et leucine
indépendant (Thr Leu +) : en absence de Thr et Leu, ils trouveront les moyens nécessaires pour
synthétiser ces AA.
→ Un mutant B indépendant de la biotine et de la méthionine (Bio Met +) mais dépendant de la
thréonine et de la leucine (Thr Leu -).
Ils possède donc des bactéries qui sont dépendante de sources de carbone et d'azote complexe et ont un
niveau de sélections complexe : cherche a avoir une double dépendance
En terme de mutation, la fréquence est rare = 1/10^8, ce qui veut dire que lorsqu'on a besoin de bactéries
indépendantes de biotine et méthionine pour le mutant A ou de thréonine et leucine pour le mutant B, il
faut une double mutation car il faut 2 caractères qui vont muter.
Donc comme c'est indépendant, la fréquence est la même, 1/10^8 et on va atteindre pour les fréquences
les plus favorables 1/10^16 pour obtenir un mutant qui aurait une double mutation et donc population
gigantesque.
Lederberg et Tatum vont vérifier la probabilité de la double mutation réversible : ils vont prendre un
milieu minimum, sans Bio, sans Met, sans Thr, sans Leu.
Ils essayent en mettant une forte charge bactérienne,10^8 du mutant A, ils ensemencent sur leur milieu
minimum et ils vont vérifier si il y a une croissance. Au bout d'un certain temps d'incubation (24h),
à 37 °C, 0 colonies.
Ils reprennent le mutant B et refont la même expérience avec 10^8 ufc de mutant B, toujours le milieu
minimum, même résultat : 0 colonies
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Ensuite ils vont faire un complément d'expérience, ils vont mettre 10^8 de A et 10^8 de B dans un même
tube. Après 24 à 48h d'incubation, ils vont ensemencer 10^8 de A+B sur leur fameux milieu minimum.
Et la surprise, on a des colonies.
On a mit la même quantité de A et de B, au total ça fait 10^8, si on revient à la même quantité, ça veut
dire qu'on est à 5*10^7 dans les 2 cas, ce qui veut dire que la fréquence est en dessous de la fréquence
même d'une mutation unique et on a quand même une culture. Ca veut bien dire qu'on a des bactéries qui
ont acquis la capacité soit d'être soit Biotine + Met +, soit Thr+ Leu +.
Soit A devient A+B, soit B devient A+B
C'est incohérent par rapport à la fréquence, on a mit un tout petit peu moins de bactérie A, un tout petit
peu moins de bactéries B, donc c'est encore plus improbable mais cela existe quand même.
La mutation est un phénomène indépendant, donc il n'est pas possible d'avoir une double mutation , c'est
un autre phénomène.
De ce fait, on va calculer la fréquence du nombre de colonies, on répète plusieurs fois les expériences, on
calcule le nombre de colonies que l'on a par rapport au nombre de colonies déposées : on remarque que la
fréquence du phénomène est beaucoup plus élevée, elle est de 1/10^6. Mais pas possible, c'est irréalisable
en terme de mutation, la fréquence n'est pas cohérente avec 1/ 1million.
Dans 10 mL, on est à 10^9 bactéries, au bout de 18h ; La ça veut dire qu'on va avoir 10^3 possibilités de
colonies sur 1 milliard de bactéries.
Il doit y avoir des échange de message génétique.
B) Expérience de Dauris
Avant même d'envisager le sens, la première question c'est est-ce qu'il y a
besoin d'un contact ?
Un deuxième chercheur Dauris, complexifie l'affaire avec un tube en U qui
sépare la population A de la population B.
Les bactéries ne peuvent pas passer, le filtre est suffisant pour bloquer les
tailles bactériennes (1 micromètre de diamètre), donc seuls les métabolites peuvent passer
Il met 10^8 de A, 10^8 de B, il refait l'expérience de Tatum : il incube pour avoir un temps total qui
permet les échanges et il va ensemencer 10^8 A+B.
Il incube et le lendemain, 0 colonies.
Conclusion : si pas de contact étroit entre deux bactéries, rien ne se passe.
2ème notion : il y a nécessité de contact (la 1è = la fréquence)
C) Sélection par antibiotiques
3ème notion : est-ce qu'il y a un sens ?
Si je prends des mutants qui résistent aux antibiotiques, on pourra peut être connaître le sens :
donc sélection de mutants qui vont être sensibles à un antibiotique (utilise surtout la streptomycine)
je vais donc avoir mon A ( Bio- Met- / Thr+ Leu+ ) avec une sous classe résistante à la streptomycine et
une sous classe sensible. En B même chose ( Bio+ Met+ / Thr- Leu- ), je prend des mutants résistants et
des mutants sensibles.
On croise As et Bs, Ar et Bs, Ar et Br, Ar et Br, on croise ces différentes population et on regarde ce qui
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cultive en ayant un milieu minimum et un sélecteur qu'est la streptomycine (double sélection). Résultat :
As x Bs : pas de recombinant
As x Br : recombinant
Ar x Bs : pas de recombinaison
Ar x Br : recombinant
Que nous dit cette expérience ?
Ca nous confirme que ce n'est pas une mutation, car on a des chiffres trop bas pour sélectionner une
double mutation.
On a des solutions qui passent dans les deux sens, c'est a dire que :
Br était réceptif et a récupéré les gènes d'As (Thr+ Leu+)
et Br pour cultiver sur un milieu minimum il lui faut l'ensemble. Et comme c'est lui qui va être résistant à
la streptomycine, à ce moment la on peut voir les recombinants.
Si on avait l'inverse c'est à dire Bs envoyait les gènes vers Ar, j'obtenais une acquisition Biotine + Met +,
et comme j'avais Ar qui était résistant, on aurait pu voir un recombinant or ici on n'a qu'un des deux qui
va donner un transfert de gène avec acquisition de ces nouveaux gènes.
Il y a bien un sens, un système de transfert dirigé.
La conjugaison, c'est donc une fréquence qui augmente par rapport à la mutation, qui correspond à un
contact étroit entre 2 bactéries et un transfert dirigé d'ADN.
Il fallait trouver la présence de quelque chose de transférable, et quand on a fait l'extraction de l'ADN et
qu'on a fait un isolement de l'ADN de la bactérie (B), on s'est aperçu que contrairement à A on avait en
chlorure de césium après extraction et séparation, 2 structures d'ADN qui avaient migré plus ou moin,
alors que quand on compare à la bactérie qui ne transfère pas il n'y a que 1 chromosome et donc nous
avons retrouvé le plasmide.
La conjugaison entre bactéries consiste en un transfert partiel, à sens unique du matériel génétique d'une
bactérie donneuse vers une bactérie réceptrice .
On avait défini à partir du moment ou on a au sein d'une espèce une partie des bactéries qui ont acquis un
élément supérieur, on peut parler de sexualité chez les bactéries. On a des plasmides conjugatifs qui vont
être porteurs des mêmes éléments, qui vont leur permettre le transfert.
Voyons ce que nous a donné ce facteur IF en terme de conjugaison, ce qui en est ressorti.
Ce système de conjugaison a posé d'énormes soucis, ça explique en partie les politiques actuelles de
maîtrise des antibiotiques. On avait déjà compris avec les mutations qu'il faut aller très vite pour avoir
des petites populations et ne pas sélectionner des mutants. Il faut adapter la prise d'antibiothérapie à la
nécessité réelle. L'abus d'utilisation des antibiotiques a été une catastrophe à cause de ces éléments qu'on
va pouvoir faire transférer d'une bactérie à une autre.
D) Plasmide conjugatif
1) Système classique F+/F-
1 Système classique
Voyons d'abord le système classique F+/F- :
Si je prend l'exemple F+ vers F- , j'ai ma bactérie F+ caractérisée par la présence du chromosome et en
plus la présence de ce fameux plasmide.
1ère chose qu 'on voit apparaître au cour du temps, c'est l'émission d'une forme de pili, il faut un système
qui par rapport à la bactérie F- qui n'a pas de chromosome qui puisse créer un contact.
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