Applications Biomédicales des Impulsions Electriques milli- et microsecondes CHRISTOPHE Y. CALVET

Applications Biomédicales des Impulsions Electriques milli- et
microsecondes
CHRISTOPHE Y. CALVET1, 2, 3, LLUIS M. MIR1, 2, 3
1Université Univ Paris-Sud, Laboratoire de Vectorologie et Thérapeutiques Anticancéreuses, UMR 8203, Villejuif, 94805
2CNRS, Villejuif, Laboratoire de Vectorologie et Thérapeutiques Anticancéreuses, UMR 8203, 94805
3 Gustave Roussy, Laboratoire de Vectorologie et Thérapeutiques Anticancéreuses, UMR 8203, Villejuif, 94805
Résumé : Tout organisme vivant est constitué de petites unités fonctionnelles, appelées cellules,
délimitées par une membrane lipidique. L’application aux cellules de champs électriques intenses et
très courts, de l’ordre de la milli- ou microseconde, trouve de nombreuses applications dans le domaine
biomédical, en particulier dans le cadre de l’électrochimiothérapie antitumorale. En effet, ces
impulsions électriques perméabilisent réversiblement (transitoirement) les cellules. Elles permettent
alors d’augmenter la pénétration de l’agent anticancéreux dans les cellules cancéreuses et donc
d’améliorer son activité toxique. Des impulsions électriques similaires sont utilisées pour internaliser
des molécules d’ADN dans les cellules d’un organisme vivant et ainsi modifier leurs comportements en
leur faisant produire des protéines d’intérêt, utiles par exemple pour l’activation ou la stimulation du
système immunitaire dans le cadre d’un traitement antitumoral ou anti-infectieux. L’internalisation
d’ADN dans les cellules peut également être réalisée sur un prélèvement de tissus de patient afin de «
réinitialiser » les cellules de ce tissu, les spécialiser en un type cellulaire d’intérêt et les ré-administrer
au patient dans le but de remplacer des cellules mortes ou endommagées. Enfin, les impulsions
électriques qui induisent une perméabilisation irréversible (permanente) des cellules, et donc leur
mort, ont des applications évidentes en cancérologie. En résumé, les applications biomédicales des
impulsions électriques milli- et microsecondes sont nombreuses et permettent la prise en charge de
pathologies variées telles que le cancer, les infections, les maladies neurodégénératives ou
cardiovasculaires. La facilité du procédé, la bonne efficacité, la sûreté et la bonne tolérance de
l’électroperméabilisation laissent à penser que cette technique verra ses applications biomédicales
étendues au traitement ou à la prévention d’une grande variété de pathologies.
1. Introduction
Les cellules constituent les plus petites unités
fonctionnelles de notre organisme. Bien qu’autonomes,
elles fonctionnent de manière coordonnée au sein des
tissus. Une membrane lipidique, appelée membrane
plasmique, délimite l’intérieur de chaque cellule du
milieu extérieur. Cette membrane est une zone
d’échange qui permet à la cellule de communiquer avec
son environnement, grâce à la réception et à l’envoi de
signaux, et de réguler les flux de molécules entrantes
ou sortantes. Ainsi, les molécules hydrophobes peuvent
diffuser librement au travers de la membrane, tandis
que les molécules hydrophiles utilisent des
transporteurs ou des pores protéiques assurant les
échanges entre la cellule et le milieu extérieur.
Dans le domaine biomédical, les impulsions électriques
sont utilisées pour stimuler les cellules (défibrillation
cardiaque, traitement de la dépression, …) ou afin de
les rendre « perméables ». Dans le présent article, nous
nous focaliserons sur les impulsions électriques
capables de perméabiliser la membrane plasmique des
cellules, réversiblement ou de manière permanente.
De part et d’autre de la membrane plasmique d’une
cellule, il existe en permanence une différence de
potentiel transmembranaire (dite de repos) due à des
concentrations en ions différentes à l’intérieur et à
l’extérieur de la cellule. Lorsqu’un champ électrique
est appliqué, une différence de potentiel
transmembranaire induite est générée. Au-delà d’une
valeur seuil de la différence absolue de potentiel
transmembranaire, la membrane plasmique se
perméabilise. Ce phénomène est appelé
électroperméabilisation (ou électroporation).
Figure 1 : Electroperméabilisation d’une cellule par des impulsions électriques. t : durée de l'impulsion (classiquement t=100 µs) ;
f : fréquence de répétition des impulsions ; n : nombre d'impulsions (classiquement n=8) ; E : amplitude du champ électrique.

Malgré la forte implication des scientifiques travaillant
dans ce domaine, les mécanismes exacts de
l’électroperméabilisation restent peu connus. La
communauté scientifique s’accorde cependant à penser
que des changements conformationnels et physico-
chimiques des lipides constitutifs de la membrane
plasmique sont induits par le champ électrique,
permettant une perte de l’imperméabilité membranaire
et donc un échange de molécules avec le milieu
extérieur (voir figure 1). La nature et l’intensité du
champ électrique dictent une perméabilisation
réversible ou permanente.
2. Electrochimiothérapie
2.1 Principe
L’électrochimiothérapie (ECT) anti-tumorale est
probablement le meilleur exemple d’utilisation chez
l’Homme d’impulsions électriques dans le cadre d’une
approche thérapeutique. Elle consiste en l’association
d’impulsions électriques et d’une chimiothérapie
(administration d’une molécule toxique), en particulier
la bléomycine, pouvant causer des dommages
irréversibles à l’ADN des cellules qu’elle pénètre. [1].
La bléomycine est un antibiotique naturel (fabriqué par
la bactérie Streptomyces verticillus) et présentant des
propriétés anti-tumorales. De par sa structure et ses
propriétés physico-chimiques, la bléomycine est
incapable de diffuser à travers la membrane plasmique
de la cellule. Lorsqu’ elle est administrée dans la
circulation sanguine du patient, elle n’est donc pas
capable de détruire les cellules qu’elle rencontre, dans
la mesure où elle n’a pas accès à leur ADN. Cependant,
l’application d’impulsions électriques délivrées
localement sur la tumeur à traiter permet une
perméabilisation transitoire des cellules cancéreuses, et
donc l’entrée massive et rapide de bléomycine, qui peut
alors générer des lésions sur l’ADN (voir figure 2).
De plus, ces dommages ne sont létaux que lorsque les
cellules se multiplient, ce qui est le cas pour les cellules
cancéreuses et non pour les cellules saines avoisinant la
tumeur, qui se divisent relativement peu (on dit
qu’elles sont quiescentes). De ce fait, malgré la
perméabilisation et l’entrée de la bléomycine dans ces
deux types de cellules situées dans la zone traitée,
seules les cellules cancéreuses subiront une mort
cellulaire rapide induite par la bléomycine. Ainsi, à
l’échelle de la tumeur, on observe une régression nette,
et très souvent complète, de la taille de la tumeur
traitée.
2.2 Le rôle des vaisseaux sanguins
Un blocage de la circulation sanguine dans les
vaisseaux nourrissant la tumeur a également été
observé suite à l’application d’un champ électrique [2].
Ainsi, la bléomycine, préalablement transportée
jusqu’à la tumeur par la circulation sanguine, se
retrouve piégée dans la zone soumise au champ
électrique, ce qui favorise son action.
De plus, les cellules qui forment la couche intérieure
des vaisseaux (cellules endothéliales) de la tumeur
sont, tout comme les cellules cancéreuses, des cellules
à division rapide, et sont par conséquent impactées par
le traitement [3]. En parallèle à l’activité toxique sur les
cellules cancéreuses, l’électrochimiothérapie permet
donc également l'interruption des processus mis en
place par la tumeur pour se nourrir et se développer.
Figure 2 : Electrochimiothérapie anti-tumorale avec le générateur d'impulsions électriques Cliniporator (IGEA), marqué CE, utilisé
actuellement en routine dans l'Union Européenne

2.3 L’impact du système immunitaire
L’activité propre anti-tumorale de l’ECT est
probablement complétée par le système immunitaire.
En effet, des études ont montré que des cellules
immunitaires sont recrutées dans la zone traitée [4]. La
libération de signaux inflammatoires induite par le
champ électrique [5], et la présence de cellules
cancéreuses mortes pourraient jouer un rôle attracteur
vis-à-vis de ces cellules immunitaires. Celles-ci ont
pour mission d’éliminer les cellules mortes de la zone
traitée et d’éduquer le système immunitaire à
reconnaître et détruire les cellules cancéreuses. De ce
fait, ceci augmente les effets de l’ECT, et peut induire
des effets anti-tumoraux à distance du site traité,
notamment si des agents stimulant la réponse
immunitaire sont administrés après
l'électrochimiothérapie [6], [7].
2.4 La réalité de la clinique
Deux types de générateurs d’impulsions électriques ont
été utilisés jusqu’à présent pour le traitement des
patients : le Cliniporator (IGEA, Carpi, Italie) et le
Medpulser (Harvard Bioscience Inc, Holliston, Etats-
Unis). Huit impulsions électriques de 100 µs sont
délivrées à une fréquence de 1 Hz. Un champ
électrique de 1300 V/cm est appliqué à l’aide
d’électrodes non invasives pour le traitement de
tumeurs superficielles, tandis que les tumeurs plus
profondes sont traitées avec des électrodes invasives et
un champ électrique de 1000 V/cm. Ce champ
électrique est plus faible que celui utilisé dans le cas
des électrodes non invasives, car ces dernières ne
traversant pas la peau, le champ électrique doit être
plus élevé pour compenser l’effet isolant de la couche
externe de la peau, l’épiderme.
Les premiers essais cliniques chez l’Homme ont été
réalisés à l’Institut Gustave-Roussy en 1991 [8].
Aujourd’hui, cette technique est utilisée dans plus de
100 centres de traitement du cancer en Europe,
principalement pour des indications palliatives (pour
soulager des malades au stade terminal), et lorsque les
approches thérapeutiques classiques (radiothérapie,
chirurgie, chimiothérapie) se sont avérées inefficaces
[9]. L’électrochimiothérapie est indiquée pour le
traitement des lésions cancéreuses cutanées et sous-
cutanées (métastases de mélanome, sarcome de Kaposi,
récidives locales des tumeurs du sein, ...). C’est
également un traitement de choix lorsqu’une ablation
par chirurgie s’avèrerait trop inesthétique (tumeur
faciale) ou lorsque la masse tumorale est trop
importante. Dans ce dernier cas,
l’électrochimiothérapie est utilisée dans un premier
temps en vue de diminuer la taille des tumeurs. Des
études cliniques, particulièrement l’étude ESOPE [10],
ont permis de définir des procédures opérationnelles
standard d’utilisation de l’électrochimiothérapie par les
médecins. Une régression complète des tumeurs est
observée dans 74% des cas traités et le taux de
« réponse objective » (c'est-à-dire incluant les patients
présentant une régression totale ou partielle de la masse
tumorale) atteint 85% après le traitement de tumeurs
cutanées et sous-cutanées chez l’Homme (voir figure
3).
Des résultats similaires ont été observés dans le cas de
tumeurs traitées sur des chiens, des chats et des
chevaux [11].
La bléomycine possédant une très forte activité
cytotoxique, de très faibles doses sont nécessaires, ce
qui limite drastiquement l’apparition d’effets
secondaires. Une anesthésie locale ou générale, selon le
cas, permet de limiter l’inconfort, voire la douleur,
associée à l’application des impulsions électriques. Une
contraction musculaire au niveau de la zone traitée peut
aussi être ressentie comme désagréable par les patients.
Des essais cliniques sont en cours afin de délivrer des
impulsions électriques au sein de tumeurs plus
profondes telles que des tumeurs du sein, de l’os, du
cerveau, du foie, du pancréas et du colon
(clinicaltrials.gov).
Figure 3 : Évolution d’une tumeur traitée par électrochimiothérapie (avec la permission de J. Gehl, Ugeskrift de Laeger, 2005)

3. Electrogenethérapie
L’ADN contenu dans le noyau des cellules est le
support de l’information génétique, et contrôle le
fonctionnement cellulaire. En effet, l’ADN est
composé de gènes qui sont décryptés et dont
l’information qu’ils contiennent est traduite en
protéines effectrices. Ainsi, ajouter des informations
génétiques à une cellule au moyen d’ADN exogène
(ADN extérieur à l’organisme) permet de modifier son
fonctionnement ou de lui faire produire une nouvelle
protéine.
Il y a maintenant plus de 30 ans, l’équipe du Pr.
Neumann a démontré que la pénétration d’ADN
exogène à l’intérieur des cellules est possible grâce à
l’application d’un champ électrique court et intense
[12]. Ces molécules d’ADN, du fait de leur
hydrophilie, sont incapables de traverser la membrane
plasmique hydrophobe des cellules. L’application d’un
champ électrique, induisant une perméabilisation
temporaire de la membrane plasmique, permet donc
l’entrée des molécules d’ADN dans les cellules. Dans
de nombreux tissus tels que la peau et le muscle, la
taille et l'hydrophilie des molécules d'ADN sont des
facteurs limitant leur accès aux cellules cibles. Dans ce
cas, les types d’impulsions électriques délivrées pour
assurer un transfert de gènes efficace sont de deux
types. Premièrement, des impulsions électriques
courtes (100 µs) et intenses (environ 1000 V/cm),
appelées HV (comme High Voltage), permettent une
perméabilisation de la membrane plasmique, tandis que
des impulsions électriques longues (quelques centaines
de ms) et peu intenses (environ 100 V/cm), appelées
LV (comme Low voltage), permettent d’amener l’ADN
au contact des cellules électroperméabilisées, facilitant
ainsi son entrée à l’intérieur de ces dernières [13].
L’électrogènethérapie est donc une approche
thérapeutique qui vise à ajouter un ou plusieurs gènes à
une cellule ou un tissu au moyen d’impulsions
électriques. Les applications concernent, par exemple,
la thérapie génique, la vaccination génétique ou encore
la génération de cellules souches.
3.1 Les approches de thérapie génique
La thérapie génique vise à introduire un gène dans
l’organisme d’un patient afin de remplacer un gène
défectueux ou produire une protéine d’intérêt
thérapeutique. Les applications possibles concernent le
traitement du cancer, de l’hémophilie, de la
mucoviscidose, du diabète de type 1, de certains
déficits immunitaires, …
Le transfert de gènes dans le tissu d’un patient peut être
réalisé par des méthodes virales (utilisant des virus) ou
non virales. Les méthodes virales présentent des
risques biologiques dus à l’utilisation de virus, bien
qu’ils soient inactivés [14]. Par ailleurs, l’injection au
patient de particules virales induit fréquemment des
réactions immunitaires qui réduisent grandement
l’efficacité du traitement lors d’administrations
répétées. En effet, lors de la première injection de
virus, le système immunitaire du patient apprend à
reconnaître et à éliminer ces particules étrangères. Lors
des administrations suivantes, les particules virales sont
rapidement reconnues et éliminées par l’organisme,
avant même de pouvoir délivrer aux cellules cibles le
gène d’intérêt qu’elles contiennent. Afin de contourner
les risques et les inconvénients rencontrés lors de
l’utilisation de virus, les méthodes non virales de
transfert de gènes sont privilégiées. Parmi celles-ci,
l’électrotransfert de gènes est une méthode de choix qui
allie une bonne efficacité de transfert de gènes, une
bonne tolérance et une facilité d’utilisation notable.
A ce jour, l’interleukine-12 (IL-12) est le meilleur
candidat pour le traitement de certains cancers cutanés
par une approche de thérapie génique [15]. Le transfert
du gène de l’IL-12, réalisé directement dans les cellules
tumorales du patient, permet d’activer le système
immunitaire et permet ainsi à l’organisme de lutter
contre la prolifération des cellules cancéreuses. De
plus, il prévient également la formation des vaisseaux
sanguins nourrissant la tumeur. L’IL-12 a fait l’objet
du premier essai clinique sur l’électrotransfert de
gènes. Cette approche de thérapie génique concerne le
traitement du mélanome. L'essai de Phase 1 visant à
évaluer la tolérance de ce traitement a été publié en
2008 [16]. L'évaluation clinique est toujours en cours,
tout comme celles visant à traiter d’autres cancers
cutanés tels que les lymphomes et les carcinomes à
cellules de Merkel (clinicaltrials.gov).
3.2 Vaccination génétique
La vaccination est un procédé visant à induire une
protection de l’organisme par une stimulation du
système immunitaire au moyen d’une protéine
reconnue comme anormale ou étrangère, ou de ses
fragments appelés épitopes [17].
Deux approches sont possibles. L’approche classique
consiste à injecter les protéines ou les épitopes
directement dans l’organisme. Cependant, la
production de protéines ou d’épitopes peut être longue,
laborieuse, et implique des coûts importants de
purification. Par ailleurs, la stabilité des protéines doit
être assurée par leur maintien à basse température, sans
rupture de la chaîne du froid. Une nouvelle approche
vise à introduire, dans des cellules du patient, le gène
qui code pour l’épitope nécessaire à l’induction d’une
réponse immunitaire. Les avantages majeurs sont la
facilité et le faible coût de production de l’ADN, et des
conditions de transport et de stockage peu
contraignantes.
Les applications possibles sont le traitement du cancer
ou des maladies infectieuses. Par ce biais, les cellules
ayant reçu l’ADN vaccinant décryptent celui-ci afin de
produire l’épitope analogue à celui d’un pathogène ou
d’une cellule cancéreuse. Le système immunitaire
reconnaît cet épitope comme étranger ou anormal, et
développe des stratégies spécifiques de défense de
l’organisme contre le pathogène ou les cellules
cancéreuses présentant cet épitope. Ainsi, dès que la
présence de cet épitope à la surface d’un pathogène ou
d’une cellule cancéreuse est détectée par le système
immunitaire, celui-ci mettra en œuvre sa stratégie de

défense afin de détruire ces cibles indésirables (voir
figure 4).
De plus, l’électroperméabilisation favorise l’efficacité
de la vaccination [5]. Non seulement elle est
indispensable à l’entrée de l’ADN dans les cellules,
mais elle induit également la libération de signaux
inflammatoires qui recrutent les cellules du système
immunitaire au niveau de la zone électroperméabilisée.
Ainsi, ces dernières s’activeront lors de la détection de
l’épitope à la surface des cellules
électroperméabilisées, et se mettront activement à la
recherche des pathogènes ou des cellules cancéreuses
présentant le même épitope.
L’injection de l’ADN vaccinant se réalise de manière
identique à celle des vaccins « classiques » à base de
protéines, c’est-à-dire dans le muscle ou dans la peau.
Le muscle présente l’avantage de produire de grandes
quantités de protéines, pendant plusieurs mois, à la
suite d’un seul électrotransfert de gènes. La peau, quant
à elle, est un tissu riche en cellules immunitaires qui
seront donc directement activées par la présence locale
des épitopes produits après l’électrotransfert.
A la différence des vaccins « classiques », qui sont le
plus souvent préventifs, la vaccination génétique est
testée chez l’Homme pour des traitements curatifs. Des
essais sont en cours pour la prise en charge du cancer
de la prostate, du colon, des ovaires, des testicules et du
mélanome (clinicaltrials.gov). Dans ces cas-là, l’ADN
injecté code pour un épitope spécifique ou très
largement représenté dans les cellules tumorales, par
comparaison aux cellules saines. Des études similaires
sont réalisées pour le traitement des infections par le
parasite du paludisme et par les virus du SIDA ou de
l’hépatite B.
Figure 4 : Vaccination génétique anti-tumorale au moyen d'un électrotransfert de gènes dans le muscle. Classiquement, HV=700
V/cm, 100 µs et LV=100 V/cm, 400 ms.
3.3 Génération de cellules souches par
électrotransfert de gènes
La thérapie cellulaire consiste à traiter le patient avec
des cellules permettant de restaurer ou d’aider au
fonctionnement d’un organe ou d’un tissu malade.
L’utilisation de cellules souches (pouvant se spécialiser
dans une fonction au sein d’un tissu donné) permet de
générer le type de cellules désirées pour le
remplacement des cellules malades ou absentes du
patient. Pour des raisons éthiques, l’utilisation de
cellules souches provenant d’embryons humains est
proscrite en France. Une alternative consiste à prélever
des cellules spécialisées de la peau d’un patient et à
leur ajouter des informations génétiques (ADN) de dé-
spécialisation, appelées facteurs de reprogrammation,
par des méthodes de transfert de gènes (voir figure 5)
[18]. Cette méthode a été décrite pour la première fois
en 2007 par le Dr. Yamanaka [19], prix Nobel de
médecine 2012. Ces cellules reprogrammées, appelées
cellules souches pluripotentes induites, peuvent être
modifiées afin de réparer un gène défectueux. Elles
sont ensuite multipliées puis re-spécialisées vers le type
cellulaire désiré (par exemple, des cellules cardiaques)
avant d’être ré-administrées au patient en vue du
remplacement du tissu ou de l’organe malade (dans
notre exemple, le cœur). Les risques de rejet de greffe
sont limités du fait de l’utilisation des propres cellules
du patient. Les applications sont nombreuses et
concernent, entre autres, la prise en charge de
l’infarctus du myocarde ou des maladies
neurodégénératives et neuromusculaires. Un essai
clinique est en cours pour le traitement de patients