Thème de recherche de l`équipe Etude de la diversité des bactéries

Thème de recherche de l’équipe
Etude de la diversité des bactéries phytopathogènes : recherche des déterminants moléculaires
de la spécificité pathovar-plantes hôtes.
Unité de recherche : UMR 077 PaVé (INRA, INH, Université d’Angers)
Responsables du stage : Stéphane Poussier et Charles Manceau
Objectif et contexte d’étude
L'objectif de ce programme est d'identifier les déterminants génétiques responsables de la
spécificité d'hôte au niveau pathovar/espèce végétale chez Xanthomonas axonopodis pv.
phaseoli.
Les Xanthomonas et les Pseudomonas sont des bactéries phytopathogènes qui causent des
nécroses sur les parties aériennes de très nombreuses plantes monocotylédones et
dicotylédones. Plusieurs espèces ont été définies au sein de ces genres telle que Xanthomonas
axonopodis. De plus, des groupes d'individus sont définis au sein de ces espèces en fonction
de leur spécificité d'hôte : les pathovars. Un pathovar regroupe les individus d'une espèce
bactérienne responsable d'un type de symptômes sur une espèce ou un groupe d'espèces
végétales. Cette spécificité se situe à un niveau supérieur à celui défini par l'interaction
race/cultivar. Et, contrairement à ce dernier qui repose sur une interaction gène pour gène, on
ne connaît pas les bases moléculaires régissant ce niveau de spécificité.
La recherche, entreprise récemment de notre groupe, des déterminants génétiques impliqués
dans cette spécificité d'hôte des pathovars constitue donc une approche originale puisque
jusqu'à présent aucun de ces déterminants a été mis en évidence. Le modèle choisi est l'espèce
bactérienne Xanthomonas axonopodis comprenant de nombreux pathovars dont le pathovar
phaseoli, l'agent responsable de la graisse commune du haricot, une maladie répandue dans
toutes les zones de production du haricot, quelles soient tempérées ou tropicales. L'objectif de
ces travaux est donc de mieux comprendre la spécialisation des souches du pathovar phaseoli
sur le haricot et par extension la spécificité d'hôte des pathovars définis chez les espèces
bactériennes phytopathogènes.
Le haricot est cultivé sur tous les continents à des fins de consommation locale mais aussi de
production de semences destinées à être commercialisées. Le haricot constitue pour les pays
en voie de développement la principale source de protéines. La graisse commune (ou brûlure
bactérienne, selon les auteurs) du haricot causée par X. a. pv. phaseoli est la bactériose la plus
dévastatrice sur cette plante. Les pertes économiques attribuées à cette maladie se traduisent
par une diminution de la production des semences et une réduction de leur qualité.
Globalement, la réduction de rendement varie entre 10 et 45 %. Cette maladie est observée
dans toutes les zones de culture du haricot aussi bien tempérées ou tropicales. Elle affecte les
différents cultivars de Phaseolus vulgaris et les espèces proches telles que P. acutifolius, P.
lunatus et P. coccineus. X. a. pv. phaseoli étant une bactérie transmise par semence de haricot,
les échanges commerciaux sur de longues distances présentent des risques sanitaires évidents,
une certification sanitaire ainsi que des "zones hors graisses" de production de semences ont
été mises en place ce qui a permis de limiter l'impact de cette bactériose. Néanmoins, la
maladie se manifeste toujours régulièrement. Nos connaissances sur cette maladie doivent par
conséquent encore s'améliorer pour pouvoir élaborer des stratégies de lutte plus efficaces et
durables. Aujourd'hui, la lutte contre cette phytobactériose repose essentiellement sur des
mesures prophylactiques, avec entre autres l'utilisation de semences saines, car aucune source

de résistance majeure chez Phaseolus est connue à ce jour. En apportant de nouvelles
connaissances sur l'interaction entre X. a. pv. phaseoli et le haricot, nos travaux devraient
ainsi contribuer à l'amélioration de la lutte contre cette maladie.
Le pathovar phaseoli est scindé en deux groupes, fuscans et non-fuscans, selon l'aptitude des
souches à produire ou non un pigment brun dans le milieu de culture. L'étude, réalisée par
Seyed Medhi Alavi (étudiant iranien bénéficiant d’une bourse de thèse, 2004-2206, dans le
cadre de la coopération bilatérale franco-iranienne), a permis de confirmer que ces deux
populations définies sur un critère biologique constituent des populations génétiques
distinctes. En effet, l'analyse par AFLP de la diversité génétique d'une collection mondiale de
souches de X. a. pv. phaseoli et de souches appartenant à d'autres pathovars de cette espèce
(pv. allii, pv. citri, pv. vesicatoria…) a révélé que les souches du pathovar phaseoli se
répartissent au sein de 4 lignées génétiques. Les souches fuscans sont homogènes (une seule
lignée) alors que les souches non-fuscans sont plus diverses (3 lignées). Le pathovar phaseoli
présente donc une structure génétique complexe. De plus, cette analyse a montré que ces
lignées se différencient autant entre elles qu'avec d'autres lignées de pathovars ayant des
gammes d'hôtes très différentes telles que des Alliacées, des Citrus ou des Solanacées. Ces
résultats suggèrent que le pathovar phaseoli et chacune de ses lignées génétiques possèdent
des séquences nucléiques spécifiques.
Avant cette analyse par AFLP, une hybridation soustractive entre la souche CFBP 4834 du
pathovar phaseoli et 3 souches appartenant à d'autres pathovars de X. axonopodis, avait été
effectuée pour générer un outil moléculaire de diagnostic des populations du pathovar
phaseoli. Cette approche nous a permis d'isoler une séquence nucléique spécifique des
souches de X. a. pv. phaseoli. Cette séquence nous a ainsi tout d'abord servi de matrice pour
développer un réactif de détection moléculaire utilisé dorénavant dans les schémas de contrôle
sanitaire des semences de haricot. Cette séquence permet la reconnaissance spécifique des 4
lignées génétiques du pathovar phaseoli identifiées par AFLP. La caractérisation moléculaire
de cette séquence nous a permis de montrer qu'il s'agit d'une séquence d'insertion que nous
avons nommé (ISXax1) (Alavi et al., soumis). Cet IS ne porte pas de gène codant une
fonction qui pourrait jouer un rôle dans l'interaction avec la plante-hôte. De plus, nous avons
montré qu'il existe un fort polymorphisme d'insertion de cette séquence chez les souches de X.
a. pv. phaseoli. Enfin, nos résultats ont révélé qu'aucune copie de l'IS (1 à 7 copies selon les
souches) est inserée dans un gène commun à toutes les souches de X. a. pv. phaseoli indiquant
que cet IS n'est pas impliqué dans le déterminisme de la spécificité des souches du pathovar
phaseoli vis-à-vis du haricot.
Sujet de stage proposé
La démarche que nous proposons maintenant pour identifier des gènes communs au pathovar
phaseoli et donc des fonctions qui pourraient expliquer ce niveau de spécificité est la suivante:
- Sélectionner par hybridation soustractive, les zones génomiques spécifiques de chaque
lignée génétique qui constitue le pathovar phaseoli vis-à-vis des pathovars les plus proches au
sein de l'espèce X. axonopodis.
- Puis, extraire les zones génomiques communes à toutes les lignées du pathovar phaseoli.
- Enfin, séquencer le génome commun et identifier les fonctions codées par ce génome. Nous
chercherons les homologies de séquences à partir des génomes entiers déjà ou bientôt
disponibles de Xanthomonas (X. a. pv. citri, X. a. pv. vesicatoria, X. campestris pv.
campestris, X. c. pv.armoraciae, X. oryzae pv. oryzae, X. o. pv.oryzicola). Une mutagénèse de
gènes candidats sera alors effectuée pour vérifier leur rôle dans la spécificité d'hôte.

Méthodologies et techniques utilisées
Microbiologie, pathologie végétale (inoculation de plantes), biologie moléculaire, PCR,
Southern-blot, clonage, hybridation soustractive, analyses bioinformatiques des séquences
nucléiques et protéiques.