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Thesis
Rôle et régulation de MD-2, la protéine réceptrice de l'endotoxine
bactérienne
TISSIÈRES, Pierre
Abstract
Notre travail de recherche a pour thématique l'étude du rôle de MD-2 et la régulation de son
expression. MD-2, une glycoprotéine intimement liée à TLR4, joue un rôle primordial dans la
reconnaissance par l'hôte du lipopolysaccharide (LPS)le principal constituant de la paroi
externe des bactéries à Gram négatif. Dans la première partie, nous avons pu démontrer que
la forme soluble de MD-2 est une protéine de la phase aiguë, une opsonine qui lie les
bactéries à Gram négatif et facilite leur phagocytose. Cette découverte participe au concept
que l'inflammation aiguë induite par les bactéries est essentielle pour la résolution d'infections
à bactéries à Gram négatif. Dans la deuxième partie, nous avons étudié la régulation de
l'expression du gène MD-2 lors de l'induction d'une réponse de phase aiguë, et démontré le
rôle central de l'interaction entre deux facteurs de transcription : PU.1 ET C/EBPB.
Reference
TISSIÈRES, Pierre. Rôle et régulation de MD-2, la protéine réceptrice de l'endotoxine
bactérienne. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2009, no. Sc. 4120
URN : urn:nbn:ch:unige-37717
Available at:
http://archive-ouverte.unige.ch/unige:3771
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UNIVERSITE DE GENEVE
Département de Biologie Moléculaire
FACULTE DES SCIENCES
Professeur Ulrich Schibler
Département d’Anesthésiologie, Pharmacologie
et Soins Intensifs
FACULTE DE MEDECINE
Professeur Jérôme Pugin
Rôle et régulation de MD-2, la protéine réceptrice de l’endotoxine
bactérienne
THESE
présentée à la Faculté des Sciences de l’Université de Genève
pour obtenir le grade de Docteur ès Sciences, mention biologie
par
Pierre TISSIERES
d’Orsières, Valais
Thèse n° 4120
Genève
ReproMail
2009
LISTE DES ABBREVIATIONS
Akt
Protein kinase B
AP-1
Activated protein 1
AND/DNA
Acide deoxyribo-nucléique
ARN/RNA
Acide ribo-nucléique
CD14
Cluster of differentiation 14
C/EBP
CAAT/enhancer binding protein
ChIP
Chromatin immunoprecipitation
ERK
Extracellular signal regulated kinase
HMGB1
High mobility group box-1
IFN
Interféron
IKK
Inhibitor of Nuclear factor-kappaB kinase
IRAK
Interleukin-1 receptor-associated kinase
IRF3
Interferon regulatory factor-3
JNK
c-Jun N-terminal protein kinase
LBP
LPS-binding protein
LPS
Lipopolysaccharide, endotoxine
LRR
Leucine-rich repeat
MAPK
Mitogen-activated protein kinase
MD-2
Myeloid differentiation factor-2
sMD-2
Soluble MD-2
MyD88
Myeloid differentiation factor 88
NBS-LRR
Nucleotide binding-site – leucine-rich repeats
NFκB
Nuclear factor-kappaB
NOD
Nucleotide-binding oligomerization domain
PCR
Polymerase chain reaction
qPCR
Quantitative polymerase chain reaction
RAGE
Receptor for advanced glycation end-product
siRNA
Short-interfering RNA
TAK1
Transforming growth factor β activated kinase 1
TIRAP
Toll/IL-1R domain-containing adaptor protein
TLR
Toll-like receptors
TNF
Tumor necrosis factor
TRAF6
TNF receptor-associated factor 6
TRAM
TRIF-related adaptor molecule
TRIF
TIR-containing adaptor-inducing IFNβ
2
TABLE DES MATIERES
I.
REMERCIEMENTS .......................................................................................................................... 4
II.
RESUME ............................................................................................................................................ 5
III.
INTRODUCTION ............................................................................................................................... 6
III.1
Infection systémique et susceptibilité de l’hôte aux infections ..................................... 6
III.2
Immunité Innée .................................................................................................................... 8
III.3
Récepteurs Toll-like .......................................................................................................... 12
III.4
Structure et fonction de MD-2 ......................................................................................... 18
III.5
Reconnaissance des bactéries à Gram négatif par TLR4:MD-2 ............................... 20
IV.
IV.1
RESULTATS ................................................................................................................................... 25
MD-2 est une protéine de phase aiguë et une opsonine pour les bactéries
à Gram négatif ................................................................................................................... 25
IV.1.1 Article 1: MD-2 is an acute phase protein and an opsonin for Gramnegative bacteria. .............................................................................................................. 26
IV.1.2 Article 2: Role of MD-2 in the opsonophagocytosis of Gram-negative
bacteria. .............................................................................................................................. 37
IV.2
Article 3: Cooperation between PU.1 and CAAT/Enhancer binding protein
β is necessary to induce the expression of MD-2 gene. ............................................. 44
V.
DISCUSSIONS ET PERSPECTIVES .......................................................................................... 67
V.1
Est-ce qu’un déficit en MD-2 altère la réponse de l’hôte aux infections
Gram- négatives ? ............................................................................................................ 67
V.2
Quel sont les mécanismes de régulation de l’expression de MD-2 ? ....................... 70
V.3
Réponse de l’épithélium respiratoire lors du sepsis .................................................... 73
VI.
CONCLUSION ............................................................................................................................... 75
VII.
REFERENCES ............................................................................................................................... 76
3
I.
REMERCIEMENTS
Pour conclure ces cinq années de thèse, je souhaiterai remercier tous ceux qui y ont participé
directement ou indirectement.
Je remercie Séverine, mon épouse, et mes enfants Arthur et Charlotte, pour leur patience, et leur
soutien.
Je remercie Jérôme Pugin pour m’avoir fait confiance, et m’avoir tant appris, professionnellement et
scientifiquement, me préparant comme personne n’aurait pu le faire à ma future carrière.
Je remercie mes amis et mes collègues de laboratoire : Tanguy, Pierre-Emmanuel, Laurent, Vincent,
Julien, Alex, Stephan,
Irène, Thierry, Raphaël, Agnieszka, Geneviève, Angela, Evelyne, Clara,
Vandack, Isabelle, Rachel, et Pascale.
Je remercie, le Professeur Schibler d’avoir accepté de co-diriger ma thèse.
Je remercie la Professeure Régine Landmann d’avoir accepté de participer à mon Jury de Thèse,
ainsi que le Docteur Thierry Roger, qui a suivit le cheminement de ma thèse dès le début, pour ces
nombreux conseils, et pour avoir accepté de participer à mon Jury.
Je remercie Denis Devictor, mon mentor, qui depuis 15 ans m’accompagne dans ma carrière.
Je remercie Michel Berner et Maurice Beghetti pour leur soutien durant ma formation.
Je remercie Patrick Linder et Dominique Belin au contact desquels j’ai développé mon goût pour la
biologie fondamentale.
Je remercie aussi Peter Frey et Jacques-Antoine Haefliger qui ont dirigé mes premiers pas en
recherche et m’ont transmis leur enthousiasme.
Je remercie la Faculté de Médecine de Genève, la Roche Research Foundation, la Novartis
Consumer Health Foundation, la Novartis Foundation, la Fondation Boninchi, la Fondation Gertrud
von Meissner pour leur soutien financier.
Je tiens à rendre hommage à mes oncles, Paul et Alfred, qui par leur exemple ont orienté mon
parcours vers la biologie.
Pour conclure, je remercie mes parents, pour leur soutien indéfectible, durant ces nombreuses années
d’études.
4
II.
RESUME
Notre travail de recherche a pour thématique l’étude du rôle de MD-2 et la régulation de son
expression. MD-2, une glycoprotéine intimement liée à TLR4, joue un rôle primordial dans la
reconnaissance par l’hôte du lipopolysaccharide (LPS) le principal constituant de la paroi externe des
bactéries à Gram négatif. Les travaux présentés dans cette thèse ont été effectués durant les 5
années passées dans le laboratoire du Professeur Jérôme Pugin au sein du Département de
Microbiologie et Médecine Moléculaire de la Faculté de Médecine de l’Université de Genève.
Dans la première partie, nous avons pu démontrer que la forme soluble de MD-2 est une protéine de
la phase aiguë, une opsonine qui lie les bactéries à Gram négatif et facilite leur phagocytose.
1
(Tissières et al. Blood 2008) . Ce travail a été par la suite confirmé par d’autres auteurs.
2
Cette
découverte participe au concept que l’inflammation aiguë induite par les bactéries est essentielle pour
la résolution d’infections à bactéries à Gram négatif (Tissières et Pugin, Curr Opin Infect Dis 2009)
3
.
Dans la deuxième partie, nous avons étudié la régulation de l’expression du gène MD-2 lors de
l’induction d’une réponse de phase aiguë, c'est-à-dire médiée par l’IL-6, et montré que : 1) cette
régulation nécessitait la coopération de 2 facteurs de transcription : C/EBPβ et PU.1 et 2) un
promoteur alternatif régulait l’expression de MD-2 chez l’homme et la souris. Outre l’intérêt en terme
de mécanisme de régulation transcriptionnelle impliquant la coopération de deux facteurs permettant
le recrutement de la machine de transcription (« recrutement non-TATA »), et l’identification de
promoteurs spécifiques aux lignées myéloïdes et non-myéloïdes, ce travail a permis de mettre en
évidence pour la première fois le rôle central du facteur de transcription PU.1 dans une lignée nonmyéloïde, l’hépatocyte. PU.1 a initialement été reconnu comme un facteur de transcription essentiel
dans le mécanisme de différenciation des lignées myélo-monocytaires. Nous avons démontré que
PU.1 est un facteur de transcription essentiel dans l’induction de l’expression de phase aiguë de MD4
2. (Tissières et al. J Biol Chem 2009) .
Ces travaux sont introduits par une description détaillée des mécanismes innés de reconnaissance de
pathogènes par l’hôte, de la description de la famille des récepteurs Toll-like, et plus spécifiquement
du complexe-récepteur de reconnaissance du LPS et des bactéries à Gram négatif. Nous concluons
sur une mise en perspective de nos travaux, principalement axée sur les mécanismes de régulation
de l’expression de MD-2 et son importance fonctionnelle dans diverses situations physiopathologiques
impliquant la réponse de l’hôte lors d’infection à bactéries à Gram négatif.
5
III.
INTRODUCTION
III.1
Infection systémique et susceptibilité de l’hôte aux infections
Le sepsis sévère et le choc septique sont les formes les plus sévères d’infection bactérienne chez le
mammifère et l’homme en particulier. On compte plus de 750’000 cas chaque année aux Etats-Unis,
correspondant à 2-11% de l’ensemble des hospitalisations.
5-7
Le sepsis sévère et le choc septique
6
constituent la principale cause de mortalité en réanimation pouvant atteindre 40 à 70%. Cette
mortalité est d’autant plus importante que l’infection est associée à une dysfonction d’organes,
survient chez un hôte immuno-compromis, âgé, et/ou ayant subi une chirurgie à haut risque.
8
La
réponse de l’hôte à une infection implique de nombreux acteurs : bactéries, facteurs liés à l’hôte,
facteurs liés aux soins (antibiothérapie, iatrogénicité). La pathogénicité bactérienne inclus de multiples
aspects allant des facteurs de virulence, des résistances aux antibiotiques, de la charge bactérienne,
et du site d’infection. Les facteurs liés à l’hôte peuvent être catégorisés en cinq groupes que nous
allons décrire.
Une composante génétique influence la réponse de l’hôte. Le travail de Sorensen et al. publié en
1988 en est une brillante illustration.
9
Dans ce travail, intitulé « Influences génétiques et
environnementales influençant la mort prématurée d’adulte », l’évaluation du risque relatif (RR) de
décès avant l’âge de 50 ans, chez 960 sujets ayant été adoptés étant enfants, d’une cause identique
à celle de leur parents biologiques. Ce travail a mis en évidence que la première cause de décès liée
à un facteur familial sont les infections (RR 5.81, 95%CI 2.47-13.7), avec un risque relatif plus élevé
que les causes cardiovasculaires (RR 4.52, 95%CI : 1.3-15.4), ou les cancers (RR 1.19 ; 0.16-8.99).
Ce travail démontre l’existence d’une susceptibilité génétique aux infections et notamment aux
infections graves mortelles.
9
Au même titre, l’origine ethnique peut, dans certains cas, influencer la
réponse de l’hôte aux bactéries. L’un des exemples est celui des Eskimos, ou des Apaches des
« White Mountains » qui présentent un risque de développer une infection sévère à pneumocoque
huit fois plus élevé que le reste de la population des Etats-Unis.
10,11
Au même titre, l’incidence, sur la
base d’étude de population (« population-based incidence ») dans une très grande cohorte (> 71
millions de patients admis dans 68 hôpitaux aux Etats-Unis), a identifié un risque accru de sepsis,
ajusté aux conditions socio-économiques, dans la population afro-américaine par rapport à la
population caucasienne ou hispanique (respectivement, 6.08/1000 ; 4.06/1000 et 3.58/1000).
12
. La
susceptibilité génétique aux infections peut être théoriquement due à une modification du niveau
d’expression, ou d’expression « tronquée » de protéines impliquées dans la reconnaissance des
bactéries, la signalisation cellulaire, la réponse inflammatoire ou la clearance bactérienne.
13
La liste
des protéines pour lesquelles des mutations altèrent la réponse de l’hôte en le rendant susceptible
aux infections et au développement de sepsis est longue. Nous n’en évoquerons que certaines afin
d’illustrer les différents niveaux d’atteinte dans la réponse de l’hôte. Schématiquement, nous pouvons
considérer que la réponse de l’hôte aux bactéries nécessite les étapes suivantes : reconnaissance de
6
la présence d’un agent pathogène « non-soi », signalisation et induction d’une réponse inflammatoire.
A chacun de ces niveaux, des mutations de la protéine elle-même ou d’éléments de contrôle de son
expression peuvent affecter cette réponse. Par exemple, des mutations touchant les récepteurs de
l’immunité innée anti-microbienne TLR1, TLR2, TLR3 et TLR4 ont été largement décrites dans de
nombreuse situations physiopathologiques et nous en reparlerons plus loin.
13-16
L’atteinte de
protéines essentielles dans la transduction de l’un des signaux induits par les TLRs, telles que les
mutations d’Interleukin-1 receptor-associated kinase (IRAK) -1 et -4 sont aussi clairement associées à
une propension à développer des infections bactériennes récurrentes, ainsi qu’un pronostic plus
17,18
sombre en cas de sepsis bactérien.
Bien que l’âge de l’hôte soit communément reconnu comme un élément (dépendant de nombreux cofacteurs) influençant la réponse immunitaire aux infections, le sexe l’est moins. Une étude récente
évaluant une cohorte de 1608 patients, dont 608 femmes, a pourtant clairement montré que le risque
de décès durant leur séjour à l’hôpital d’un sepsis sévère était inférieur chez les femmes que chez les
hommes (OR 0.69, 95%CI 0.52-0.93).
19
Ce travail, confirmé dans une étude à moindre effectifs,
suggère une différence de mortalité - dans des cas de sepsis chirurgicaux - d’environ 30% en faveur
des femmes.
20
reste
l’heure
pour
Bien que le status hormonal puisse jouer un rôle, la relative protection du sexe féminin
mystérieuse.
L’état
immunologique
de
l’hôte
(inflammation
chronique,
immunosuppression), au même titre que différentes co-morbidités tels que le diabète ou des infections
virales peuvent influer sur la réponse de l’hôte. Il existe des données épidémiologiques corrélant la
survenue d’infection bactérienne sévère et d’infection virale. Par exemple le rythme saisonnier
d’infection invasive à pneumocoque corrèle fidèlement à celui d’infections virales à influenza et au
virus respiratoire syncitial (VRS).
21,22
Les mécanismes liant infections virale et bactérienne sont
multiples, et nous en discuterons certains plus loin (voir III. discussion et perspectives). Le hasard
pourrait être lui aussi un facteur influençant la réponse de l’hôte. Ainsi, comment expliquer le concept
de dose létale 50 (LD50), c'est-à-dire la dose nécessaire pour tuer 50% d’une population ? Par
exemple, comment expliquer que chez des souris parfaitement identiques sur le plan génétique
(animaux syngéniques), une concentration identique du même pathogène induit la mort de 50%
d’animaux, alors que l’autre moitié échappera à l’infection ? Il a été montré que parmi des souris
Balb/c, avec le même patrimoine génétique, 19% des gènes ont un niveau d’expression variant de 1.5
fois entre animaux, c’est ce que l’on nomme la variation génétique normale, ou un effet stochastique.
23
La reconnaissance par l’hôte de bactéries et l’activation de leucocytes (les macrophages, les
polynucléaires neutrophiles (PMN), les monocytes, les cellules dendritiques, les cellules NK) va avoir
des conséquences physiopathologiques multiples (Figure 1). Ainsi, bien que leur fonction initiale soit
d’identifier et de détruire les agents pathogènes, ces cellules activées de l’immunité innée vont induire
une cascade d’atteinte cellulaire et tissulaire, de troubles de la coagulation et potentiellement d’une
dysfonction d’organes. Ces conséquences sont induites par l’intermédiaire de la sécrétion de
7
cytokines pro- et anti-inflammatoires, de l’expression de protéines de surface, et de protéines
circulantes.
24
Bactéries
Reconnaissance innée des bactéries
Cellules de l’immunité innée
(macrophages, PMNs, endothélium)
Inflammation
(TNF, IL-1, IL-8, PAF)
Anti-inflammation
(IL-10, sTNFRs, IL-1ra)
Coagulation
(tissue factor,
thrombin, PAI-1)
Vasodilatation
(iNOS - NO)
Dysfonction Métabolique
(mitochondrie)
Lésions tissulaires
Immuno-suppression
CIVD
(microthromboses,
saignement)
Choc
(hypoperfusion tissulaire)
Dysfonction d’organes
Figure 1. La reconnaissance innée des bactéries par les cellules de l’immunité innée va induire
une réponse systémique de l’hôte et potentiellement mener à une dysfonction d’organes. La
sécrétion de cytokines pro- et anti-inflammatoires va générer des lésions tissulaires et provoquer,
dans un deuxième temps, un état d’immuno-paralysie. L’activation de la coagulation secondaire à
une dysrégulation de l’équilibre hémostatique, peut mener au développement d’un état de
coagulation intravasculaire disséminée (CIVD). La sécrétion de substances vasodilatatrices,
l’augmentation de la perméabilité capillaire, le développement d’une insuffisance circulatoire
associée à des perturbations du métabolisme tissulaire vont mener à une hypoperfusion tissulaire
et une anoxie cellulaire.
III.2
24 ,25
Immunité Innée
L’intensité et la qualité de la réponse de l’hôte aux bactéries dépendent avant tout des mécanismes
de reconnaissance, qu’ils soient spécifiques ou non. Ces dernières font référence au système
immunitaire adaptatif et au système immunitaire inné.
8
L’une des spécificités immunologiques uniques aux vertébrés est la présence d’un système capable
de générer une réponse immunitaire spécifique, et d’induire une mémoire immunologique de
l’infection. Ce système, appelé « immunité adaptative », est capable d’adapter sa capacité de réponse
à chaque contact successif d’un agent pathogène donné avec l’hôte. Les composants principaux de
l’immunité adaptative sont les lymphocytes et leurs produits, les anticorps. Le mécanisme de
reconnaissance par le système immunitaire adaptatif est basé sur la reconnaissance spécifique de
fragments de structure moléculaire (protéines, peptides, hydrates de carbones) par des anticorps. Ces
anticorps obtenus après réarrangement de segments de gènes et production clonale permet d’induire
une réaction de l’hôte retardée secondaire à l’activation d’effecteur. Ainsi, trois phases sont décrites :
la phase de reconnaissance, phase d’activation et phase effectrice. La phase de reconnaissance
consiste en la liaison d’antigènes à des récepteurs spécifiques (anticorps) liés ou non à des
lymphocytes matures. Les lymphocytes B expriment des anticorps à leur surface cellulaire qui lient
aussi bien des protéines « étrangères » que des sucres, des lipides ou autres structures chimiques.
Les lymphocytes T expriment à leur surface des récepteurs capables de reconnaître de courtes
séquences peptidiques issues des antigènes. Par ailleurs, les lymphocytes T ont la caractéristique
unique de pouvoir reconnaître et réagir uniquement à des peptides présentés par d’autres cellules
(cellules présentatrices d’antigènes, ou APC). La phase d’activation de la réponse immunitaire
adaptative consiste en la séquence d’évènements induits sur le lymphocyte par la reconnaissance
spécifique de l’antigène. Tous les lymphocytes subissent une phase de prolifération permettant une
expansion clonale, suivie d’une différentiation vers une cellule effectrice (dont la finalité est d’éliminer
l’antigène), ou une cellule « mémoire ». Certains lymphocytes ne vont pas se différencier et vont
mourir. Durant la phase effectrice de la réponse immunitaire adaptative, les lymphocytes
préalablement activés vont induire les mécanismes d’élimination de l’antigène.
Au contraire de l’immunité adaptative constituée d’un système hautement sophistiqué retrouvé
uniquement chez les vertébrés et nécessitant un réarrangement génétique, l’immunité innée est elle
phylogénétiquement conservée et est présente chez quasi tous les organismes multicellulaire.
26
Le
système immunitaire inné est caractérisé par une action rapide de molécules effectrices et de
leucocytes permettant de limiter la multiplication de bactéries pathogéniques et de les détruire.
27,28
Toutefois, l’immunité innée et l’immunité adaptative interagissent continuellement. Certains effecteurs
sont communs : Par exemple, la liaison d’antigènes par des anticorps induit la phagocytose, et
l’activation du système du complément. Les lymphocytes T activés sécrètent des cytokines qui vont
induire une réponse inflammatoire, et ce au même titre que la réponse immunitaire innée. Ainsi, bien
que les anticorps soient habituellement considérés comme faisant partie du système immunitaire
adaptatif, les anticorps naturels (NAbs) représentent une classe à part d’anticorps car ils sont
capables de détecter des antigènes que l’hôte n’a « jamais vu ».
29
Parmi les premières descriptions
d’NAbs, notons les travaux de Landsteiner (prix Nobel de Médecine en 1930) qui décrivit la présence
d’agglutinines anti-A et anti-B dans le sérum humain de groupe sanguin alternatif
(1)
http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1930/landsteiner-bio.html
9
(1)
. Ce sont
principalement des IgM qui sont produites, prioritairement par les lymphocytes B1 (CD5+). Les NAbs
sont codés par les gènes de type « germline variable » (V) avec peu de mutations somatiques, 80%
possède un gène VH de la famille VH3 et > 90% comportent une chaîne légère lambda. Ces anticorps
ont donc un répertoire restreint mais qui est hautement conservé dans l’évolution
30
. Les NAbs ont la
capacité de neutraliser directement un pathogène, mais aussi d’activer le système du complément et
de former des complexes antigène-anticorps secondairement éliminés par le système réticuloendothélial permettant ainsi de prévenir la prolifération de pathogènes et d’induire une réponse
immunitaire dans des organes lymphoïdes secondaires. Les NAbs ont clairement montré, du moins
chez l’animal, un rôle essentiel dans la réponse de l’hôte à des pathogènes tels que Streptococcus
pneumoniae, Nesseiria meningitidis, Salmonella typhimurium, mais aussi contre différents virus
31
. Le
système du complément ainsi que les NAbs constituent les deux systèmes de défense centraux dans
la réponse dites « humorale » (la fameuse « balle magique » en référence aux travaux de Behring,
Kitsao, et Ehrlich
32
), déterminant ainsi un lien entre l’immunité adaptative et innée. Le système du
complément est apparu tôt dans l’évolution, probablement il y a plus de 500 millions d’années
33
. C’est
un système complexe, constitué de plus de 30 protéines sériques et récepteurs cellulaires et qui joue
un rôle central dans la réponse de l’hôte aux infections. Il y a trois manières d’activer le système du
complément : 1) la « voie classique », par l’intermédiaire d’anticorps (IgM), de pentraxines (Pentraxin
3, PTX3 ; protéine C-réactive, CRP ; serum amyloïde protéine, SAP) et du C1q, 2) la « voie des
lectines » à partir de complexes multimériques constitués de lectines (tels que le mannose-binding
lectine, MBL ; les protéines du surfactant A et D, SP-A et SP-D), de ficolines (L-, M-, et H-ficoline) et
d’oligosaccharide d’origine bactérienne (mannose, N-acetylglucosamine, fucose) et 3) la « voie
alterne », activée spontanément à partir de l’hydrolyse de C3.
34,35 ,36,37
La reconnaissance par le
système du complément initie une cascade protéolytique résultant en l’induction d’une réponse
inflammatoire (anaphylatoxines, C3a, C4a, C5a), de la constitution d’un complexe d’attaque
membranaire (MAC : C5b6789n), de l’initiation de la phagocytose (MBL, C1q, C3b, iC3b, C4b) et de la
stimulation de lymphocytes B (C3d).
36
Les NAbs ainsi que le système du complément sont ainsi à la
« croisée » de la réponse immunitaire innée et adaptative, mêlant phagocytose, inflammation, lyse
cellulaire et apoptose, présentation des antigènes, et stimulation des lymphocytes B.
Il y a plus d’un siècle, Metchnikoff recevait le Prix Nobel de Médecine (1908) pour l’identification des
phagocytes et la caractérisation de la phagocytose initiant la compréhension des mécanismes
cellulaire de l’immunité innée
(2)
. La théorie de la phagocytose développée par Metchnikoff a pour
origine une expérience effectuée à Messine en 1882. A cette occasion, il démontra qu’après ponction
d’une larve d’étoile de mer avec une épine de rose, des cellules mobiles, issues de la larve,
s’agglutinaient autour de l’épine comme si elles tentaient de l’ingérer. Cette expérience représenta
une révolution conceptuelle par laquelle des particules « étrangères » ou des agents pathogènes
étaient capables d’induire chez l’hôte une réaction inflammatoire aboutissant à la phagocytose de
ceux-ci. Bien que ce ne soit pas Metchnikoff, mais Osler qui décrivit le premier la phagocytose
bactérienne
(2)
38
, Metchnikoff porte le crédit d’avoir compris le rôle central de la phagocytose dans les
http://nobelprize.org/nobel_prizes/medecine/laureates/1908/mechnikov-lectures.html
10
mécanismes de défense de l’hôte contre les infections et est considéré comme le père de l’immunité
innée. Dans une publication datant de 1884, Metchnikoff rapporte l’observation selon laquelle des
cellules amoeboïdes s’accumulent autour d’acrospores ayant pénétré le tube digestif de daphnea, les
mouches d’eau, et la capacité de ces cellules de phagocyter et digérer ces spores.
39
. Le conflit entre
« humoralistes » et « cellularistes » comme Metchnikoff sera sujet à une violente polémique,
magnifiquement illustrée par les discours de Nobel de Metchnikoff en 1908. Ce seront Wright et
Douglas qui réconcilieront les théories humorale et cellulaire, en montrant que des facteurs (protéines
de l’hôte) accélèrent et favorisent le processus de phagocytose. Nous leur devons le concept des
opsonines et de l’opsonophagocytose (du grec « opsono » signifiant « préparer des victuailles pour »)
39
.
Ainsi, le système immunitaire inné constitue le premier échelon des défenses contre l’infection. Il est
activé rapidement, aussitôt qu’un pathogène traverse les barrières naturelles de l’hôte, tels que la
peau ou les épithéliums.
27
Il est constitué d’une part de protéines solubles (protéines de la phase
aiguë, cytokines, protéines du complément, lectines, etc…) et d’autre part de cellules dites
« sentinelles » que sont les monocytes, les macrophages, les polynucléaires neutrophiles, les cellules
dendritiques et les cellules NK). Il y a 20 ans, Charles A. Janeway proposa l’existence d’un
mécanisme de reconnaissance immun inné capable d’identifier des structures moléculaires, ou motifs,
conservés exprimés par divers pathogènes (bactéries, champignon, virus) et non par les cellules de
l’hôte, qu’il intitula pathogen-associated molecular patterns, ou PAMPs.
40
Ces motifs aussi variés que
la flagelline, le lipopolysaccharide (LPS), le peptidoglycan (PGN), l’acide lipotechoique (LTA), les
lipopeptides di- ou tri-acylés, l’ADN non-méthylé avec des motifs CpG, l’ARN simple-brin (sbARN), ou
double-brin (dbARN), etc.. sont autant de structures chimiques spécifiquement reconnues par des
récepteurs nommés pattern recognition receptors, ou PRRs.
41 ,42
Parmi les PRRs reconnaissant des
motifs bactériens nous en citerons quatre types. La famille des scavenger receptors (SR) est
composée d’un grand nombre de protéines membranaires (par exemple, MSR1 ou SR-A, MARCO)
participant
à
l’endocytose
de
ligands
polyanioniques,
telles
que
des
lipoprotéines
ou
lipopolysaccharides (LTA, LPS). La famille des C-type lectin receptors (CLR) regroupe 17 groupes de
récepteurs membranaires (tels que le mannose receptor, macrophage galactose CLR, Dectin 1 et 2,
Langerin) ou solubles (fibronectine, vitronectine). Une discussion détaillée des SR et des CLR est faite
dans l’article 2 (voir III.1.2). Les Toll-like receptors (TLRs) ainsi que les nucleotide-binding
oligomerization domain (Nod) proteins constituent d’importants groupes de PRRs. Les TLRs sont
situés à la surface cellulaire ou dans différents compartiments intra-cellulaires, tels que le Golgi ou le
réticulum endoplasmique (par exemple le TLR3), les protéines Nods ne se trouvant que dans le
cytoplasme.
27,43
Nous discuterons spécifiquement la fonction des TLRs dans le chapitre suivant (voir
II.3).
Les protéines « Nod » sont ainsi capables de reconnaître des bactéries dans le compartiment
cytoplasmique par le biais de constituant bactériens de surface. Les deux protéines « Nod » les mieux
connues sont Nod1 et Nod2, deux membres de la famille des mammalian nucleotide binding-site –
11
leucine-rich repeat (NBS-LRR). Les protéines du groupe NBS-LRR, se caractérisent par la présence
d’un segment riche en leucine et sont représentées outre Nod1 et Nod2, par IPAF, et les protéines
Nalp (Nalp 1-14), ainsi que le MHC class II transactivator (CIITA). Une certaine homologie se retrouve
avec les protéines du groupe des hélicases, tels que RIG-1, et Mda-5. L’ensemble des NBS-LRR et
des hélicases constitue la famille des Nod-like receptors (NLRs).
Cette famille de récepteurs est capable de reconnaître de nombreux ligands bactériens (tels que les
peptidoglycan (PGN), la flagelline, la toxine de l’anthrax et l’ARN bactérien), l’ADN viral double-brin
(dsDNA), mais aussi des ligands non-bactériens, tels que des cristaux d’acide urique, mais aussi
d’asbeste et d’hydroxyde d’aluminium.
44,45
L’une des caractéristiques des NLRs est de posséder un
domaine de signalisation, tels que caspase-activating and recruitment domain (CARD) et PYRIN
domain. Par ailleurs, à l’exception de RIG-1 et de Mda-5, les NLRs contiennent un domaine « Nod ».
Nod1 est ubiquitaire dans les tissus humains et possède un domaine CARD. Nod1 reconnaît
spécifiquement un muropeptide issu de peptidoglycans provenant de bactéries à Gram négatif
contenant un motif tripeptidique N-acetylglucosamine-N-acetylmuramic acid (GlcNAc-MurNAc).
46
Nod2 est principalement exprimé dans les cellules myélomonocytaire. Il est structurellement proche
de Nod1 à l’exception qu’il contient deux domaines CARD.
47
Nod2 reconnait un muramly dipeptide
(MDP) dérivé du peptidoglycan : MurNAc-L-Ala-D-isoGln, que l’on retrouve aussi bien chez les
bactéries à Gram négatif qu’à Gram positif. Ces deux récepteurs ont un rôle important dans la
reconnaissance de nombreux pathogènes. Ainsi, Nod1 a été identifié comme un récepteur des
peptidoglycans de Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Shigella flexneri, Chlamydia
48-50
pneumoniae, et Helicobacter pylori.
Pour sa part, Nod2 reconnait les peptidoglycans de
Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumoniae et Salmonella
typhimurium.
51-53
. Par ailleurs, la flagelline de Salmonella typhimurium est reconnue par IPAF et ce
indépendamment de TLR5 (voir II.3).
54,55
L’importance des NLRs dans la réponse de l’hôte aux
bactéries est illustrée par la corrélation entre une mutation de NOD2 (frameshift et missense) et la
maladie de Crohn (30% des patients souffrant de cette maladie ont une mutation de NOD2).
III.3
47,56
Récepteurs Toll-like
Le premier membre de la famille des récepteurs Toll, « Drosophila Toll, dToll », a été découvert
comme étant l’un des 12 gènes maternels nécessaires pour la formation de l’axe dorso-ventral chez
l’embryon de la mouche de vinaigre.
57
Il a été ensuite découvert que dToll était le récepteur d’une
protéine « Spätzle ». La stimulation du récepteur transmembranaire dToll par Spätzle active une
serine/thréonine kinase cytoplasmique, Pelle, via la protéine adaptatrice, Tube. L’activation de Pelle
permet la dégradation du complexe Cactus-Dorsal. Une fois que Cactus est dégradé, Dorsal, un
facteur de transcription, est transloqué dans le noyau activant l’expression de gènes nécessaires à la
formation de l’axe dorso-ventral de la mouche. Ces kinases sont les équivalents chez la mouche des
kinases impliquées dans la voie de signalisation « NF- B » chez les mammifères. C’est en 1996, que
le rôle de dToll dans la réponse contre un pathogène fut identifiée, initialement contre les
12
champignons (Aspergillus fumigatus), puis contre les bactéries à Gram positif.
58,59
Les mouches
déficientes en dToll sont incapables de se défendre contre ces pathogènes et meurent d’une infection
généralisée.
58,59
Rapidement, des protéines homologues à dToll sont identifiées chez l’homme et
d’autres mammifères et intitulées TLRs pour « Toll-like receptors ».
60
Les TLRs sont des
glycoprotéines transmembranaires de type 1, et sur la base d’une grande homologie de leur région
cytoplasmique, font partie d’une superfamille contenant le récepteur à l’IL-1 (IL-1R). Toutefois la
région extracellulaire des TLRs et de IL-1R diffèrent : les TLRs sont essentiellement constitués d’une
région riche en leucine (LRR), tandis que la région extracellulaire de IL-1R contient trois domaines
successifs de type immunoglobuline-like.
Le domaine extracellulaire des TLRs est constitué de 16 à 28 répétions du motif LRR. Ces
répétitions « leucine-rich » forment un brin-β (β-strand) et une hélice-α (α-helix) reliés par une boucle,
constituant ainsi une structure en forme de « fer-à-cheval » directement impliqué dans la
reconnaissance des ligands (voir II.5).
61,62
Des LRRs se retrouvent dans plus de 6'000 protéines
(3)
impliquées dans la réponse immunitaire (TLR, NLR, CD14, IL1-R, etc.), la transduction de signaux
intracellulaires, la régulation du cycle cellulaire, etc..
63
L’analyse des séquences et des structures
cristallines des LRRs a permis de les classifier en sept sous-familles.
sous-famille
contenant
des
modules
LRR
constitués
64
Les TLRs constituent une
du
motif
suivant :
XLXXLXXLXLXXNXLXXLPXXXFX. La structure cristalline des domaines LRR permet de distinguer
deux groupes de TLRs. TLR1, 2 et 4 ont une structure conformationelle légèrement différente des
autres TLRs.
65,66
Ils présentent deux transitions structurelles sur le brin-β, le divisant ainsi en trois
sous-domaines : N-terminal, central et C-terminal. De plus le domaine central ne possède pas
l’ossature constituée d’asparagine (au même titre que TLR6 et TLR10) permettant ainsi une
« distorsion » de la structure, observée pour TLR1, TLR2 et TLR4.
L’extrémité intracytoplasmique des TLRs contient une région d’environ 150 acides aminés avec un fort
degré d’homologie avec celle du récepteur à IL-1 (IL-1R). Cette région a été nommée domaine
« TIR » pour « Toll/IL-1R région ». Les structures cristallines des domaines TIR ont été décrites pour
TLR1, TLR2, et TLR10.
67-69
Elles ont en commun la présence de cinq brins-β parallèles entourées par
cinq hélices-α. L’analyse par mutation de cette région a permis de mettre en évidence le rôle central
de la boucle BB (« BB loop ») connectant le second brin-β (brin β-B) et la seconde hélice-α (hélice αB).
68,69
La boucle BB joue un rôle dans la dimérisation des domaines TIR et/ou le recrutement des
protéines adaptatrices, essentielles dans l’activation des voies de signalisation intra-cellulaires.
69,70
Actuellement treize TLRs différents ont été décrits chez les mammifères, dont 10 chez l’homme (TLR1
à -10). Nous venons de voir que la famille de TLRs est structurellement caractérisée par la présence
d’un domaine extracellulaire LRR, et d’une région intracytoplasmique contenant un domaine TIR.
L’analyse des séquences d’acides aminés ainsi que de la structure génomique des TLRs chez
l’homme permet de les subdiviser en cinq sous-familles. La première, contenant TLR2, TLR1, TLR6 et
(3)
http://pfam.sanger.ac.uk
13
TLR10 se caractérise par la présence d’un seul exon codant (TLR2 possède trois exons, mais seul un
est codant). Par ailleurs, TLR6 et TLR1 sont localisé en tandem sur le chromosome 4p14 et présente
une très haute similarité dans les séquences d’acides aminés, ceci suggérant que TLR1 et TLR6
pourrait être issu d’une duplication au cours de l’évolution.
71
Il est par ailleurs intéressant de noter
que cette sous-famille est aussi caractérisée par l’absence d’une ossature asparagine (voir ci-dessus)
rendant la structure du domaine LRR moins rigide. Les TLRs de la sous-famille contenant TLR7, TLR8
et TLR9 sont codés par deux exons. TLR7 et TLR8 sont aussi structurellement très proches et
localisés en tandem sur le chromosome Xp22.
72 ,73
TLR4 et TLR5 sont respectivement codés par
quatre et cinq exons. TLR3 possède 5 exons, mais n’est codé que par les exons 2 à 5.
41
Le premier TLR à avoir été identifié chez l’homme fut TLR4 par le groupe de Janeway, préalablement
appelé hToll pour « human Toll ».
60
. Toutefois ce n’est qu’une année plus tard en 1998, que Poltorak
et al. identifièrent Tlr4 comme étant impliqué dans la reconnaissance du LPS.
74
Basé sur
l’observation selon laquelle les souris C3H/HeJ et C57BL/10ScCr ne répondent pas au LPS, mais
présente une très grande susceptibilité aux bactéries à Gram négatif, des mutations (missense et
mutation null, respectivement) touchant Tlr4 ont été identifiées suggérant le rôle de TLR4 dans la
reconnaissance du LPS.
74
Poltorak et Beutler ont en effet démontré qu’une proline mutée dans le
domaine TIR de TLR4 des souris C3H/HeJ expliquait leur résistance au LPS, et qu’une délétion d’une
partie de TLR4 était responsable de l’insensibilité des souris C57BL/10ScCr au LPS.
74
TLR4 participe
aussi à la reconnaissance de protéines virales, fongiques, et parasitaires. Il a été montré que TLR4 en
association avec CD14 est capable de reconnaître la protéine de fusion du virus respiratoire syncitial
(VRS).
75
Les polysaccharides capsulaires issus de Cryptococcus neoformans, les mannans de
Candida albicans, les glycoinositolphospholipides de Trypanosoma cruzi seraient également des
ligands microbiens de TLR4.
TLR2 reconnaît et lie les lipopeptides bactériens. La capacité de TLR2 de reconnaître les
peptidoglycans (PGN), un constituant important des parois bactériennes, reste discutée dans la
mesure où une contamination des préparations de PGN par d’autres ligands de TLR2 (LTA,
lipoprotéines) est possible.
76
TLR2 forme un heterodimère avec TLR1 ou TLR6. TLR2:TLR1 reconnaît
les lipopetides di- et tri-acylés, alors que TLR2:TLR6 ne reconnaît que les lipopeptides di-acylés.
77-80
Récemment la structure cristalline des domaines extracellulaires de TLR2 en association avec TLR1
et le lipopeptide synthétique tri-acylé Pam3CSK4 a été caractérisée.
65
L’hétérodimérisation de TLR2 et
TLR1 nécessite la présence du ligand, et forme une structure constituant un « M » avec les extrémités
N-terminal des deux TLRs sur les extrémités. Cette structure est identique à celle des homodimères
TLR3 et du dimère TLR4 associé à LPS et MD-2.
64,81
TLR2 a ainsi la capacité de reconnaître une
grande variété de microorganismes par le biais de molécules de surface bactériennes conservées.
Ceci inclus les lipoprotéines de bactéries à Gram négatif, mycoplasmes et spirochètes, les
peptidoglycans et l’acide lipotechoïque des bactéries à Gram négatif, le lipoarabinomannan des
mycobactéries, les glycoinositolphospholipides (protéine TC52) de Trypanosoma cruzi, des
lysophosphatidylsérine shistosomales, le zymosan et des phopholipomannanes des champignons,
14
des glycolipides de Treponema maltophilum, des porines de Nesseiria meningitidis et Hemophilus
influenzae.
28,41
De plus TLR2 semble reconnaître le LPS de Legionella pneumophila, Leptospira
interrogans (LPS penta-acylé) et Porphyromonas gingivalis.
82,83
contamination des extraits de LPS par des lipopeptides est réel.
Toutefois le risque d’une
84
De plus la capacité de
reconnaissance de bactéries à Gram négatif par TLR2 (que se soit à partir de lipopeptides ou de LPS)
semble être limitée en comparaison à la reconnaissance dépendante de MD-2:TLR4, dans la mesure
ou des concentrations bactériennes beaucoup plus importantes sont nécessaires pour activer la
réponse TLR2-induite par rapport à TLR4.
85
TLR2 est capable de reconnaître aussi des PAMPs issus
de virus, tels que les hémagglutinines du virus de la rougeole, et l’herpès simplex-1 (HSV-1).
86,87
TLR5 reconnaît spécifiquement la flagelline, le principal constituant protéique des flagelles bactériens.
88 ,89
Les flagelles s’étendent de la paroi externe des bactéries à Gram négatif, leur permettant de se
propulser, mais aussi de se lier aux cellules hôtes, participant ainsi à l’invasion des tissus. TLR3
reconnaît l’ARN double-brin (dbARN) produit par bon nombre de virus durant leur cycle de réplication.
L’acide polyinosinique-polycytidylique ou poly(I :C), un ARN double brin synthétique, a lui aussi la
capacité de lier TLR3.
90
. TLR3 a clairement été lié à la réponse de l’hôte contre HSV-1.
cristalline de TLR3 lié à de l’dbARN a récemment été caractérisée.
91
16
La structure
L’ARN double-brin interagit avec
les extrémités N-terminal et C-terminal de TLR3. A la différence de la liaison entre TLR2:TLR1 et les
lipopeptides ou les interactions hydrophobiques jouent un rôle majeur, l’ARN double brin se lie à TLR3
par des liaisons ioniques et hydrogènes.
TLR8 reconnaissent l’ARN simple-brin
virus influenza A.
93
92
65,91
Alors que TLR3 reconnaît l’ARN double-brin, TLR7 et
et semble être essentiel dans la réponse de l’hôte contre le
Des données récentes suggèrent que le TLR7, 8 et 9 pourraient participer à la
pathogénèse de maladie auto-immune, tel que le lupus érythémateux disséminé.
94,95
TLR9 détecte
les motifs CpG de l’ADN non-méthylé bactérien, fongique, ainsi que l’haemazoine issu de
Plasmodium.
96,97,98 ,99
Par ailleurs TLR9 reconnaît aussi Herpes simplex 2.
100
Le ligand de TLR10
reste pour l’instant inconnu.
L’activation des TLRs entraine l’expression de nombreuses cytokines et chémokines. La nature de
cette réponse dépend de la voie de signalisation activée, laquelle est déterminée par des protéines
adaptatrices qui se lient directement au domaine « TIR » des TLRs : MyD88, MAL(ou TIRAP), TRIF,
TRAM et SARM. Ces protéines adaptatrices, au nombre de cinq, sont couplées en aval à des
protéines kinases qui vont phosphoryler des cibles moléculaires en cascade pour finalement entrainer
l’activation de facteurs de transcriptions tel que Nuclear Factor kappaB (NF-κB) et des membres de la
famille des interferon (IFN) regulatory factors (IRFs). Ces cinq protéines adaptatrices contiennent, tout
comme les TLRs, un domaine « TIR ».
41,101,102
La plupart des réponses pro-inflammatoires induites
par les TLRs (TLR1, 2, 6, 4, 7, 8, 9) sont issues de la stimulation d’une voie commune, médiée par la
protéine adaptatrice MyD88 (Figure 2).
Après stimulation d’un TLR, MyD88 se lie au domaine « TIR » et recrute différentes isoformes de l’IL-1
receptor associated kinase (IRAK). IRAK4 est par exemple particulièrement important dans la réponse
15
induite par l’IL-1. Comme précédemment mentionné, un déficit en IRAK4 a été reporté chez des
patients souffrant d’infections bactériennes à répétition.
18
L’activation d’IRAK entraine une liaison
avec Tumor Necrosis Factor (TNF) Receptor-Associated Factor 6 (TRAF6), et l’activation de
différentes voies d’activation intracellulaire : a) c-JUN N-terminal protein kinase (JNK) par les mitogenactivated protein kinase kinase (MKK) -4 et -7, b) p38 (via MKK3/6), c) ERK1/2 (via MKK1/2), d) des
voies d’activation dépendantes du facteur de transcription nuclear factor-kappaB (NF-κB), ainsi que e)
l’induction par interferon (IFN) regulatory factor (IRF) 1, 5, 7. Ces derniers vont permettre l’expression
d’IFN de type 1 et de nombreux gènes de cytokines impliqués dans la réponse inflammatoire (TNF-α,
IL-8, IL-1, etc..). Il est intéressant de noter que l’induction de p38 et JNK induite par la stimulation
TLRs:MyD88-dépendante va aussi participer à la stabilisation des ARN messagers de TNF-α.
103
Figure 2. Protéines adaptatrices impliquées dans la signalisation des TLRs. TLR, Toll like
receptor ; TIRAP, Toll/IL-1R domain-containing adaptor protein ; TRIF, TIR-containing adaptorinducing IFN-β ; TRAM, TRIF-related adaptor molecule; SARM, sterile α- and armadillo-motifcontaining protein.
TIRAP (Toll/IL-1R domain-containing adaptor protein), aussi connu sous l’acronyme « Mal » (MyD88adaptor-like), coopère avec MyD88 et est nécessaire pour la signalisation induite par TLR2 et TLR4
(Figure 3).
104
La voie de signalisation MyD88-indépendante liée à l’activation LPS:MD-2:TLR4 et
dbARN:TLR3 permet l’activation du facteur de transcription IRF3 et l’expression d’IFN-β.
105
TRIF
(TIR-containing adaptor-inducing IFN-β) est nécessaire pour l’activation de la signalisation MyD88indépendante et l’activation d’IRF3.
106
Il est intéressant de noter que les souris doublement
déficientes en MyD88 et en Trif perdent toute capacité de réponse au LPS, suggérant que les deux
voies de signalisation sont les seules liées à TLR4.
107
TRAM (TRIF-related adaptor molecule) est un
co-adapteur de la signalisation MyD88-indépendante avec TRIF et IRF3.
108
SARM (sterile α- and
armadillo-motif-containing protein) est la protéine adaptatrice la plus ancienne sur le plan de
l’évolution, étant la seule présente chez le ver Caenorhabiditis elegans.
109,110
SARM, à l’inverse des
quatre autres protéines adaptatrices, est un régulateur négatif de l’activation de NF-κB et des IRFs.
Ainsi, SARM permet le blocage spécifique de l’activation des facteurs de transcription induite par
TRIF, sans altérer les voies de signalisation MyD88-dépendantes.
16
111
De nombreux signaux (NLR,
CLR Dectin-1, tyrosine kinase et phosphatase) interagissent avec la signalisation des TLRs (voir
article 2).
3,102
Figure
3. Représentation schématique
de la
signalisation
MyD88
dépendante
et
indépendante par TLR4. LPS, lipopolysaccharide ; TLR4, Toll-like receptor 4 ; TIRAP, Toll/IL-1R
domain-containing adaptor protein ; IRAK, IL-1 Receptor-Associated Kinase; TRAF, Tumor
Necrosis Factor Receptor-Associated Factor 6; TAK1, Transforming growth factor β activated
kinase 1; TRIF, TIR-containing adaptor-inducing IFN-β ; TRAM, TRIF-related adaptor molecule;
TBK1, Tumor necrosis factor receptor associated factor (TRAF) family member associated Nuclear
factor-kappaB (NF- B) activator binding kinase 1; SARM, sterile α- and armadillo-motif-containing
protein; IRF, interferon regulatory factor; IKK, inhibitor of NFκB kinase; Akt, protein kinase B ;
MAP3K, Mitogen-activated protein kinase kinase kinase; ERK, extracellular signal regulated kinase;
JNK, Jun N terminal kinase; AP-1, activated protein-1.
La réponse « TLR » est régulée par certaines protéines accessoires agissant au niveau de la
reconnaissance bactérienne, de la signalisation, et de la réponse.
17
112
Parmi celles-ci, RP105, une
protéine transmembranaire de type 1 (comme les TLRs) contenant un domaine extracellulaire de type
LRR. RP105 se trouve à la surface des lymphocytes B, et est associé à MD-1 (qui présente une
grande homologie avec MD-2). MD-1 est nécessaire à l’expression de surface de RP105, dont le
complexe MD-1:RP105 interagit directement avec MD-2:TLR4 et TLR2
113
Le rôle de MD-1:RP105
semble varier selon le type cellulaire. Il régule positivement la réponse TLR2 et TLR4 dans les
lymphocytes B, et négativement dans les macrophages et les cellules dendritiques.
114
Cette fonction
régulatrice pourrait avoir un rôle dans le développement du lupus érythémateux disséminé à anticorps
antinucléaires négatifs
115
UNC93B est une protéine conservée chez les mammifères et est située
dans le réticulum endoplasmique. UNC93B interagit spécifiquement avec TLR3,7 et 9 permettant leur
transfert du réticulum endoplasmique aux endolysosomes.
116
PRAT4A est aussi une protéine du
réticulum endoplasmique, indispensable à l’expression membranaire de TLR4 et TLR1, mais aussi
endolysosomiale de TLR9, TLR7, mais pas de TLR3.
117
118
à la maturation réticulo-endoplasmique des TLRs.
La glycoprotéine 96 (gp96) est indispensable
CD36 fait partie des récepteurs « scavenger »
3
(voir article 2) . Parallèlement à sa fonction dans les mécanismes de phagocytose, CD36 régule la
réponse TLR2/TLR6 aux lipopeptides di-acylés, ainsi qu’au LTA.
120
hétérotopique avec TLR2/TLR6 et leurs ligands.
119
CD36 forme une liaison
HMGB1 (high mobility group box-1) est une
protéine nucléaire libérée lors de la nécrose et/ou souffrance cellulaire. HMGB1 dans le milieu
extracellulaire est capable d’induire une réponse inflammatoire, la réparation tissulaire, de recruter des
cellules pluripotentes et d’induire leur prolifération.
121
HMGB1 est un co-facteur de TLR9, capable de
lier l’ADN microbien ainsi que le receptor for advanced glycation end-products (RAGEs). HMGB1 est
ainsi recruté dans des vésicules contenant TLR9 et permet d’accélérer la redistribution de TLR9 du
réticulum endoplasmique aux endosomes précoces et la formation de complexe CpG ADN:TLR9.
98
LL37 est un peptide antimicrobien participant au mécanisme auto-immun observé lors de psoriasis. En
effet, LL37 est capable de convertir de l’ADN endogène amorphe en un inducteur TLR9-dépendant
reconnu par les cellules dendritiques plasmocytoïdes.
III.4
122
Structure et fonction de MD-2
Au même titre que CD14, dont nous parlerons plus loin, MD-2 est une protéine accessoire essentielle
à la reconnaissance des ligands de TLR4. Par ailleurs MD-2 est une protéine chaperonne de TLR4
permettant sa glycosylation et son transport intracellulaire (« cell trafficking »), en tout cas chez la
souris.
123 ,124-127
MD-2, pour myeloid differentiation factor-2, anciennement appelé Ly96, est une glycoprotéine de 160
acides aminés dont le gène se trouve sur le chromosome 8q21.11. Le gène MD-2 est constitué chez
tous les vertébrés de 5 exons et de 3 introns. MD-2 existe lié à TLR4 à la surface cellulaire et sous
forme soluble dans les liquides biologiques. La forme soluble recombinante de MD-2 est un mélange
en solution de monomères, dimères et multimères.
128-130
Toutefois, seule la forme monomérique est
capable de se lier à TLR4 et de jouer son rôle de co-facteur dans la réponse au LPS.
18
131
La raison de
la tendance de MD-2 à ce multimériser (ponts di-sulfure) est inconnue. Le MD-2 produit par
bacculovirus est principalement monomérique et dimérique.
132
MD-2 soluble migre sur SDS-PAGE en
condition réduite en deux bandes (25 et 30 KDa). Un traitement par endoglycosidase réduit la
migration d’une seule bande à 18KDa.
par analyse de mutant.
123,133
130
MD-2 a deux sites de N-glycosylation (N
26
et N
114
), confirmé
MD-2 monoglycosylé ou aglycosylé interagissent avec TLR4, sont
capable de lier LPS et d’induire une signalisation, suggérant que le niveau de glycosylation n’est pas
directement impliqué dans la reconnaissance du LPS et l’initiation de la signalisation. La première
publication suggérant que MD-2 lie le LPS est celle de Viriyakosol et al.
Figure 4. Structure du complexe MD-2/TLR4 humain.
81
134
La dimérisation de l’hétérodimère
constitué par MD-2/TLR4 forme un « M ». Ce complexe est stabilisé par des interactions
hydrophobes, hydrogènes et des ponts phosphates entre MD-2, et MD-2:LPS et TLR4* de
l’hétérodimère complémentaire, ainsi qu’entre LPS et TLR4, TLR4* et MD-2.
(4)
(4)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/index.shtml . Crystal Structure of the Human Tlr4-Human Md-2-E.Coli
Lps Ra Complex. [MMDB ID:70004; PDB ID: 3FXI].
19
La caractérisation de liaison du LPS au MD-2 est récente.
66,135
L’activité endotoxinique maximale a
été identifiée avec un LPS dont le lipide A est hexa-acylé (6 chaînes d’acides gras) et contient 2
groupes phosphates, alors que le lipide A penta- ou hepta-acylé est 100 fois moins actif.
136,137
L’Eritoran (E5564) est un dérivé synthétique tétra-acylé du lipide A issu du LPS non-pathogénique de
Rhodobacter sphaeroides
138
. L’Eritoran est un puissant antagoniste MD-2/TLR4 bloquant la réponse
au LPS, actuellement en étude de phase III dans le traitement du sepsis sévère
(5)
. Un autre Lipide A
tétra-acylé, le lipide IVa, possède une activité antagoniste avec MD-2:TLR4 humain, mais partiel chez
la souris. La structure cristalline de TLR4-VLR avec Eritoran et de MD-2 avec le Lipide IVa a
récemment été publiée.
66,135
MD-2 possède une poche constituée par deux feuillets β antiparallèles,
reliés sur l’un des côtés, avec des résidus hydrophobes sur leur face interne (« hydrophobic groove »).
Cette poche hydrophobe est bordée en son ouverture de résidus chargés positivement.
Ainsi la structure et les caractéristiques électrostatiques sont favorables pour des ligands
ampiphatiques, tel que le LPS. La poche hydrophobique du MD-2 est capable de contenir les quatre
chaînes acylaires du Lipid IVa et 5 des 6 chaînes d’un LPS « commun ». MD-2 interagit avec TLR4
principalement à partir de liaisons ioniques et hydrogènes. Ces deux travaux ont ainsi montré que le
récepteur du LPS est principalement MD-2 et que LPS ne lie pas directement à TLR4.
mécanisme de dimérisation et d’activation de MD-2:TLR4 a été récemment caractérisé.
81
66,135
Le
Ainsi, cinq
des six chaînes acylaires du LPS s’insèrent dans la poche hydrophobique, la sixième chaîne formant
une liaison hydrophobe avec TLR4*. L’insertion des cinq chaînes acylaires dans la poche
hydrophobique provoque une modification structurelle de MD-2 permettant son interaction avec TLR4*
et provoquant ainsi la dimérisation des complexes LPS:MD-2:TLR4.
81
Une vue schématique des
interactions moléculaires LPS:MD-2:TLR4 est résumée dans la Figure 4.
III.5
Reconnaissance des bactéries à Gram négatif par TLR4:MD-2
Les infections à bactéries à Gram négatif ont de particulier que le principal constituant de leur paroi
externe, l’endotoxine bactérienne ou LPS, est capable d’induire chez l’humain une réaction
systémique majeure avec lésions tissulaires, coagulation intra-vasculaire et état de choc. Le système
immunitaire inné est capable de détecter des concentrations de LPS de l’ordre du picomolaire et
d’induire l’expression de centaines de gènes.
139,140
La reconnaissance du LPS par les cellules des
mammifères implique plusieurs protéines principalement le LPS-binding protein (LBP), CD14, MD-2
et TLR4.
Les lipopolysaccharides sont constitués d’un lipide A et d’une partie polysaccharidique débordant de
la membrane externe (Figure 5). Le lipide A est constitué de deux sucres aminés (glucosamine, 3aminoglucosamine) liés à des acides gras hydroxylés et non-hydroxylés. La nature des sucres aminés
(5)
ClinicalTrials.gov identifier number: NCT00334828
20
et des acides gras, ainsi que le nombre de chaînes lipidiques varient selon l’espèce bactérienne. La
fraction polysaccharidique est constituée du noyau (« core ») interne (constitué d’heptose et d’acide 3désoxy-D-manno-2-octulosnique, ou KDO) lié au lipide A, et d’un noyau externe (nombre variable
d’hexose et hexosamine) lié à une chaîne polysaccharidique terminale, appelée chaîne O spécifique
ou antigène O (« O-antigen »). Chez certaines bactéries à Gram négatif, telles que Neisseria et
certains Haemophilus, le LPS est remplacé par un lipo-oligosaccharide constitué uniquement du lipide
A et des noyaux interne et externe. La chaîne O spécifique est la partie la plus variable du LPS dont la
taille va définir le LPS rugueux (« rough LPS » = chaîne courte ou absente) et le LPS lisse (« smooth
LPS » = chaîne longue). Ainsi, le LPS est une molécule amphiphile formant de larges agrégats en
solution, des plans ressemblant à des membranes, voire des micelles.
Figure 5. La paroi bactérienne est constituée, de l’intérieur à l’extérieur, d’une membrane
plasmique, séparée de peptidoglycans présents dans l’espace périplasmique, puis de la membrane
externe, dont le feuillet externe est constitué à > 90% de lipopolysaccharide (LPS), et de diverses
protéines. Le LPS est constitué d’un lipide A, d’un core et d’un antigène O d’une longueur
21
varaiable. Le core ainsi que l’antigène O sont constitués de divers polysaccharides. KDO, acide 3désoxy-D-manno-2-octulosnique ; Hep, heptose ; Gal, galactose ; Glu, glucose ; GluNAc, acide N
acetylglutamic ; Rha, rhamnose ; Man, mannose ; Abe, abedose.
La caractérisation récente de la structure cristalline du complexe LPS:MD-2:TLR4 suggère que seul la
forme monomérique du LPS lie MD-2:TLR4.
81
La « désagrégation » du LPS nécessite LBP. LBP est
une glycoprotéine sérique de 58-60 kDa. C’est une protéine de phase aiguë de type I synthétisée par
le foie, mais aussi par les cellules épithéliales et musculaires.
141
Le LBP appartient à la famille des
lipid transfer/LBP comprenant aussi BPI (bactericidal/permeability-increasing protein), CETP
(cholesteryl ester-binding protein), et PLTP (phospholipid transfer protein). La cristallisation de la
structure de BPI a permis (homologie >40% avec LBP) d’identifier à l’extrémité N-terminale de LBP
une niche de résidus cationique nécessaire pour la désagrégation et la reconnaissance du LPS.
L’extrémité C-terminale est elle nécessaire à l’interaction entre LBP et CD14.
145
142-144
Le LBP a une double
fonction lors de son interaction avec LPS : à faible concentration, LBP accentue la signalisation en
l’extrayant des parois bactériennes et en formant un complexe LBP:LPS monomérique, alors qu’à
haute concentration, LBP inhibe la réponse en transportant le LPS à des lipoprotéines (HDL) et en
formant des agrégats.
146,147
Le CD14 (« cluster of differentiation 14 ») est une glycoprotéine qui existe aussi bien ancrée à la
membrane sous forme « GPI-anchored », que sous forme soluble. Le CD14 est nécessaire pour la
reconnaissance de faibles concentrations de LPS.
148
CD14 est un PRR capable de lier des
phospholides anioniques et de participer à leur transport.
149-151
La structure cristalline de CD14
montre qu’il s’agit d’une protéine de la famille des LRR, ressemblant à un « fer à cheval », et
constituée d’un brin β sur la surface concave et d’hélice α sur la surface convexe.
152
Le segment
aminoterminal, impliqué dans la liaison au LPS, circoncit une poche hydrophobique permettant d’y
recevoir les chaînes acylaires du lipide A.
153
polysacchardiques du LPS et des peptidoglycans.
la réponse des TLRs.
156
CD14 est aussi capable de lier les chaînes
154,155
CD14 est une protéine accessoire influençant
Récemment, il a été montré que le CD14 était nécessaire pour l’activation
par le LPS lisse de la signalisation TLR4-MyD88 indépendant.
157
Ainsi, sans CD14, le lipide A active
TLR4 et permet le recrutement uniquement de MyD88 et MAL, alors qu’en présence de LPS lisse,
l’absence de CD14 ne permet pas l’activation de TLR4. Toutefois, en présence de CD14, aussi bien le
LPS rugueux que lisse sont capables de recruter la voie de signalisation MyD88:MAL et TRIF:TRAM.
CD14 est aussi capable d’amplifier la réponse TLR2, l’activation de TLR2:TLR6 (conformation du
dimère permettant le recrutement de MyD88) nécessitant la présence de CD14.
119
Ainsi, le LPS lie LBP et le CD14 avec une grande affinité (constantes d’association de l’ordre du
nanomolaire), permettant ainsi son transport jusqu’à MD-2, la protéine réceptrice de l’endotoxine, qui
va avec TLR4 former un double hétérodimère (LPS:MD-2:TLR4:LPS*:MD-2*:TLR4*). Cette
dimérisation semble être dépendante du ligand bactérien LPS.
66,156,158
De plus il semble aussi que
c’est cette dimérisation (« ligand-dependent ») qui rapproche les domaines TIR des 2 molécules de
22
TLR4, induisant la cascade de signalisation.
81
La haute spécificité de la reconnaissance du LPS par
le complexe MD-2/TLR4 est en ligne avec le fait que ce récepteur joue un rôle central dans la réponse
de l’hôte aux bactéries à Gram négatif. Ainsi, l’endotoxine bactérienne peut être reconnue aussi bien
par des cellules immunes « professionnelles » tels que les macrophages, les monocytes et les
neutrophiles, que par des cellules endothéliales ou des cellules épithéliales exprimant une ou
plusieurs protéines constituant le récepteur à l’endotoxine. Les protéines « manquantes » (CD14, MD2) peuvent être « amenées » par le plasma par exemple ou elles se trouvent sous forme soluble
(Figure 6).
Figure 6. Représentation schématique de la reconnaissance par les cellules myélo-monocytaires,
l’endothélium et les cellules épithéliales de l’endotoxine bactérienne. LPS, lipopolysaccharide/
endotoxine ; LBP, LPS-binding protein ; sCD14, CD14 soluble ; sMD-2, MD-2 soluble ; TLR4, Tolllike receptor.
Les mécanismes de reconnaissance varient entre différents tissus et ce afin de répondre à des
contraintes physiologiques spécifiques. Par exemple, certains tissus épithéliaux sont exposés en
permanence à une charge bactérienne importante (épithélium intestinal, épithélium respiratoire) alors
23
que d’autres (épithélium urinaire ou méningé) se situent dans un environnement physiologiquement
stérile. Il a été ainsi montré que les cellules d’origine myélo-monocytaires répondaient au LPS par la
présence à leur surface de MD-2 lié au récepteur TLR4, et de CD14.
148
Au même titre, l’endothélium
possède le complexe MD-2:TLR4 à sa surface, toutefois l’activation par le LPS nécessite du CD14
sous forme soluble, présent dans le plasma et dans certains liquides biologiques.
159
La
compréhension des mécanismes de réponse de l’épithélium à l’endotoxine bactérienne permet de
mettre en perspective bon nombre de pathologies infectieuses, telles que les infections bactériennes
respiratoires, digestives, méningées et urinaires. L’épithélium, au sens histologique, ne peut pas en
situation physiologique répondre à l’endotoxine bactérienne sans exposer l’hôte à un état
inflammatoire continu. Il n’exprime donc pas de CD14, ni de MD-2, mais peut dans certaines
circonstances exprimer TLR4. Ainsi, l’épithélium respiratoire peut exprimer à sa surface TLR4 en
réponse à différents stimuli, lors d’une infection virale, par exemple.
160
C’est cette inductibilité de
TLR4 qui permet, potentiellement, à l’épithélium de répondre au LPS, et ce seulement si les cofacteurs solubles CD14 et MD-2 sont présents.
161-163
La fonction de la forme soluble de MD-2 (sMD-2) a récemment pris une perspective supplémentaire. Il
a été montré que le plasma, ainsi que les liquides biologiques (œdème pulmonaire et urine) de
patients souffrant de sepsis contenaient du sMD-2 capable d’induire une réponse au LPS et aux
bactéries à Gram négatif par des cellules épithéliales n’exprimant que TLR4.
162,164,165
Ces travaux
suggèrent que l’induction de MD-2, lors d’une infection systémique, a un rôle physiologique central
dans les mécanismes de défenses contre les bactéries à Gram négatif.
3
Dès lors, l’étude de la
fonction et de la régulation de l’expression de MD-2, la protéine réceptrice de l’endotoxine
bactérienne, prend tout son sens.
24
IV.
IV.1
RESULTATS
MD-2 est une protéine de phase aiguë et une opsonine pour les bactéries à
Gram négatif
L’augmentation des concentrations de MD-2 soluble dans le plasma de patients au cours d’un épisode
infectieux grave suggère que cette protéine pourrait être sécrétée en réponse à une réaction de type
« phase aiguë ».
162
La réaction de phase aiguë est caractérisée par la sécrétion, principalement par
le foie, de diverses protéines en réponse à une agression telle qu’un traumatisme, une brûlure
étendue, ou une infection.
166
Cette sécrétion est principalement induite par deux cytokines, l’IL-1β et
l’IL-6. Un grand nombre de protéines circulantes sont des protéines de la phase aiguë. Parmi celles-ci
citons les protéines du compléments C3, C4, C9, le facteur B, le C1 inhibiteur, et le mannose-binding
lectin (MBL), des protéines majeures de la coagulation comme le fibrinogène, le plasminogène, le
plasminogen-activator inhibitor 1 (PAI-1), mais aussi un grand nombres d’anti-protéases, de protéines
de transport (haptoglobine, céruloplasmine) et des protéines elles-mêmes directement liées avec la
réponse inflammatoire tels que la phospholipase A2, l’interleukin-1 receptor antagonist (IL1-RA), ou le
granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF). Plusieurs protéines de phase aiguë jouent un rôle dans
l’opsonophagocytose de bactéries, tels que la protéine sérum amyloïde A (SAA), la fibronectine, le
MBL, le C3b, la protéine C-réactive, ainsi que deux protéines du complexe de reconnaissance du
LPS : le LBP et le CD14 soluble.
167,168
Notre hypothèse expérimentale initiale était de déterminer si
MD-2 soluble est une protéine de phase aiguë.
25
IV.1.1 Article 1: MD-2 is an acute phase protein and an opsonin for Gram-negative
bacteria.
(MD-2 est une protéine de phase aiguë et une opsonine pour les bactéries à Gram
négatif)
Nous avons initialement établi que l’induction in vivo chez la souris C57BL/6 d’une réaction de phase
aiguë par injection sous-cutanée de turpentine, induisait la production hépatocytaire de MD-2 (figure
3). L’inductibilité dite « de phase aiguë», c'est-à-dire dépendante d’IL-6, a été démontrée en induisant
-/-
une réaction de phase aiguë chez des souris C57BL/6 wild type et des souris C57BL/6 IL-6
(IL-6
k.o.). L’absence d’induction de l’expression de MD-2 lors d’une induction de phase aiguë chez les
souris IL6
-/-
et non chez les wild-type suggère que le MD-2 soluble est une protéine de phase aiguë.
Nous avons ensuite montré par qPCR, western blot, et gène reporteur assay sur différentes lignées
cellulaires (THP-1, HepG2), que MD-2 étant induit par IL-6 mais non par l’IL-1β, permettant de
conclure que MD-2 est une protéine phase aiguë de type II (type I : inductible par IL-6 et IL.1β). Nous
avons décrit la cinétique de sécrétion de sMD-2 et avons déterminé la fonction du MD-2 soluble. Nous
nous sommes d’abord intéressés à la capacité de MD-2 soluble de se lier à des bactéries à Gram
négatif. En utilisant un MD-2 humain soluble « taggé » His (« 6xHis tag ») à des concentrations
croissantes, nous avons montré par cytométrie en flux (FACS) que sMD-2 se liait de manière dosedépendante à des bactéries à Gram négatif (E.coli), mais pas à des bactéries à Gram positif
(S.aureus). Trois fonctions possibles de MD-2 soluble ont été testées : un potentiel effet bactéricide de
sMD-2, sa capacité d’induire une inflammation en présence de bactéries à Gram négatif, et un rôle
putatif comme opsonine. En utilisant un test de croissance bactérienne avec ou sans sMD-2, aucune
capacité bactéricide n’a pu être mise en évidence. Toutefois, le sMD-2 permet la reconnaissance de
bactéries à Gram négatif par des cellules épithéliales n’exprimant que TLR4 (HEK293 TLR4+/MD2-)
et d’induire une réaction inflammatoire. La fonction opsonophagocytaire du MD-2 soluble a été
démontrée en utilisant un test dans lequel la phagocytose de bactéries à Gram négatif fluorescentes
par des granulocytes humains a été mesurée par FACS après 5, 10 ou 20 minutes d’opsonisation
avec du MD-2 soluble.
Ce travail a ainsi permis de décrire pour la première fois la fonction opsonisante de MD-2 soluble et sa
caractérisation comme étant une protéine de phase aiguë de type II.
Tissières P, Dunn-Siegrist I, Nobre V, Elson G, Schappi M, Comte R, Pugin J. Soluble MD-2 is an
acute phase protein and an opsonin for Gram negative bacteria. Blood 2008;111(4):2122-31.
26
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33
34
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36
IV.1.2 Article 2: Role of MD-2 in the opsonophagocytosis of Gram-negative bacteria.
(Rôle de MD-2 dans l’opsonophagocytose de bactéries à Gram négatif)
Le rôle de MD-2 dans la phagocytose de bactéries à Gram négatif et de fait dans le contrôle de
l’infection, change fondamentalement la compréhension de la fonction des mécanismes de
reconnaissance innée des pathogènes par les TLRs. Il devient apparent que les TLRs, et dans notre
cas MD-2:TLR4, sont des éléments essentiels dans les mécanismes de phagocytose, de clearance
bactérienne, et de présentation des antigènes au système immunitaire adaptatif.
l’observation faite selon laquelle les souris Md-2
-/-
169
Ainsi,
ont une résistance augmentée à l’endotoxine, mais
une susceptibilité accrue aux infections à bactéries à Gram négatif, prend toute sa valeur.
170
La mise
en perspective de l’interaction de MD-2 soluble, une nouvelle opsonine, avec les mécanismes de
phagocytose habituels (IgG, système du complément, etc.), a été récemment résumée dans l’article
suivant.
Tissières P, Pugin J. The role of MD-2 in the opsonophagocytosis of Gram-negative bacteria. Curr
Opin Infect Dis 2009;22(3):286-91.
37
38
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42
43
IV.2
Article 3: Cooperation between PU.1 and CAAT/Enhancer binding protein β is
necessary to induce the expression of MD-2 gene.
(La coopération entre PU.1 et C/EBPβ est nécessaire pour induire l’expression du gène
MD-2)
Dans ce travail, nous nous sommes attachés à caractériser le mode de régulation de l’expression du
gène MD-2 humain. Nous avons associé une approche standard, consistant à utiliser diverses
délétions et mutations du promoteur de MD-2 couplé à un gène reporteur (luciférase), avec des
techniques d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) suivie par qPCR. L’analyse du promoteur
nous a permis d’identifier 2 régions, dans sa partie proximale, importantes pour l’expression basale et
l’expression induite de MD-2 par l’IL-6 (screening de l’intégralité du promoteur par C/EBPβ ChIP).
Après analyse bio-informatique, les facteurs de transcriptions et leurs sites de liaison ont été
confirmés par mutations des sites de liaison sur le promoteur proximal avec ou sans « RNA
silencing » pré-test, ChIP sur ADN génomique et sur plasmides (contenant les différents constructions
du promoteur), et western blot après RNA silencing dirigé contre les facteurs de transcription. Ces
expériences nous ont permis de montrer que deux facteurs de transcription, PU.1 et C/EBPβ étaient
essentiels pour l’expression basale et pour l’induction par IL-6. Par ailleurs, nous avons montré que
l’induction de MD-2 médiée par IL-6 nécessitait une coopération directe entre PU.1 et C/EBPβ et leurs
sites de fixation sur la chromatine.
Nous avons montré, à partir d’analyse par RACE et des bases de données CAGE (Cap Analysis of
Gene Expression - CAGE databases
(6)
), que les fenêtres d’activation de la transcription du gène MD-
2 variaient selon le type cellulaire (myéloïde ou non-myéloïde), complétant des données récentes sur
TLR4.
171
Par ailleurs le rôle de PU.1, un facteur de transcription impliqué dans la différentiation des
lignées myéloïdes et hématopoïétiques, a été pour la première fois associé à la régulation
transcriptionelle dans une lignée cellulaire non-myéloïde.
Tissières P, Araud T, Ochoda A, Drifte G, Dunn-Siegrist I, Pugin J. Cooperation between PU.1 and
CAAT/Enhancer binding protein β is necessary to induce the expression of MD-2 gene. J Biol Chem.
2009 Jul 24. [Epub ahead of print]
(6)
http://fantom3.gsc.riken.jp
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V. DISCUSSIONS ET PERSPECTIVES
Dans notre premier travail, nous avons identifié deux fonctions immunes primordiales de MD-2
soluble. MD-2 se comporte comme une protéine de phase aiguë ainsi qu’une opsonine pour les
bactéries à Gram négatif.
1
Cette caractérisation a été faite dans un modèle in vitro sur lignée
hépatocytaire humaine (HepG2) et in vivo chez la souris et les tests de réponse fonctionnelle avec du
LPS ou des bactéries tuées par la chaleur. L’absence de caractérisation de la réponse de phase aiguë
chez l’homme est certainement une limite de notre travail. Toutefois, des données démontrent la
présence de MD-2 soluble chez les patients septiques et, dans une moindre mesure, chez des
malades avec poussée d’arthrite rhumatoïde.
134,162
Ces données sont renforcées par le travail de
Wolfs et coll. qui montrent dans un modèle d’endotoxinémie expérimentale chez l’homme la présence
de MD-2 soluble suivant une cinétique caractéristique d’une réponse de phase aiguë.
165
La
caractérisation de la fonction opsonophagocytaire de MD-2 a été confirmée de façon indépendante
quelques mois après la publication de notre travail, par celui d’un autre groupe. Jain et coll. ont ainsi
caractérisé dans un modèle in vivo murin la capacité opsonisante de MD-2 pour les bactéries à Gram
négatif et plus spécifiquement de Yersinia pestis.
2
Le travail de Jain et al. ainsi que le nôtre souffre
toutefois d’une simplification méthodologique. Etudier l’opsonophagocytose en relation à un
mécanisme unique est certainement réductionniste. Nous avons discuté de la complexité des
mécanismes de la phagocytose et le lien avec MD-2 ans l’article 2. Toutefois, aussi bien Jain et al.
que nous-mêmes avons pu montrer la spécificité de la phagocytose médiée par MD-2:TLR4 en
bloquant spécifiquement TLR4. Ces deux travaux soulèvent un certain nombre de questions.
V.1
Est-ce qu’un déficit en MD-2 altère la réponse de l’hôte aux infections Gramnégatives ?
Le travail de Nagai et collègues le suggère clairement. Ainsi les souris déficientes dans le gène Md-2
présentent une susceptibilité accrue aux infections à Salmonella, alors qu’elles sont résistantes à
l’endotoxine.
170
Chez l’homme, les données sont encore incertaines. Alors que de multiples travaux
ont étudié le rôle de polymorphisme génétique impliquant les régions codantes de TLR4 (pour une
revue extensive du sujet, voir Bochud et al.
13
), peu de d’études existent en ce qui concerne les
variations polymorphiques de MD-2. Hamann et al. ont caractérisé une mutation touchant le premier
exon (A103G) de MD-2 chez l’homme, résultant en une mutation Thr35Ala.
172
Cette mutation dans
une région codante modifie la capacité de réponse au LPS, illustré par une sécrétion réduite de TNF-α
après stimulation ex vivo des leucocytes de ces patients par LPS. Une autre mutation altérant la
réponse au LPS, C95Y, a été décrite sur une lignée cellulaire CHO, mais n’a pas été identifiée jusqu’à
présent chez l’homme.
173
région promotrice de MD-2.
Récemment, Gu et al. ont recherché des polymorphismes touchant la
174
Trois « single nucleotide polymorphisms » (SNPs) ont été étudiés (C-
1625G ; A-1064G, et A-475T). Leur travail suggère que seul le SNP touchant -1625G diminue in vitro
67
la capacité d’activation du promoteur de MD-2. Parmi un collectif réduit de 105 patients admis pour un
trauma, C-1625G semble être associé à un risque augmenté de développement de sepsis. Cette
étude, bien que limitée par la taille du collectif, suggère que la régulation du niveau d’expression de
MD-2 pourrait influencer la réponse de l’hôte aux infections. Nous avons donc décidé de rechercher
un déficit en MD-2:TLR4 dans une population présentant une prédisposition accrue aux infections à
bactéries à Gram négatif, à savoir chez les grands prématurés.
Le sepsis est un problème important chez le nouveau-né prématuré, et est associée à une mortalité
ainsi qu’une morbidité élevées.
175,176
Il est estimé qu’environ 20 % des prématurés survivant au-delà
des trois premières semaines de vie vont développer un ou plusieurs épisodes de sepsis bactériens. Il
existe un nombre croissant de données épidémiologiques et biologiques suggérant que les enfants
prématurés sont plus susceptibles aux infections que les nouveau-nés à terme et les adultes.
177,178
L’immaturité du système immunitaire, en particulier la réponse innées aux pathogènes, paraît être
essentielle dans la pathogénèse du sepsis néonatal. Il semble évident qu’une relation lie l’immaturité
fœtale et la dysfonction du système immunitaire du prématuré. Durant les premiers mois de vie, le
système immunitaire inné du nouveau-né est essentiel pour sa défense contre les agents pathogènes,
ce d’autant plus que le système immunitaire adaptatif est immature et que la mémoire immunologique
commence à se développer. Comme décrit précédemment, le système immunitaire inné repose
principalement sur deux constituants : les protéines solubles et les cellules phagocytaires. Parmi les
protéines solubles participant à la reconnaissance innée des agents pathogènes, certaines ont une
fonction bactéricide, et/ou les présentent de manière efficace aux phagocytes (opsonine).
L’opsonisation de bactéries est un mécanisme complexe au cours duquel les anticorps et le système
du complément jouent un rôle central.
3
Le prématuré
présente une hypogammaglobulinémie
associée à un déficit de l’activité du complément contribuant ainsi à une opsonophagocytose altérée.
179
D’autres opsonines, non-spécifiques, ont un taux plasmatique réduit chez les prématurés tels que
le sérum amyloïde A (SAA), le mannose-binding lectin (MBL), et la fibronectine.
180-182
L’expression
des récepteurs reconnaissant spécifiquement les bactéries, que sont les TLRs, a été peu étudiée chez
le prématuré, bien que leur rôle semble être central dans le développement du système immunitaire
inné fœtal. Ainsi, la présence des récepteurs TLR2 et TLR4 ont été retrouvés dès la 18ème semaine
d’âge gestationnel dans l’intestin du fœtus. Il est intéressant de noter que l’expression des récepteurs
Toll-like ainsi que des protéines essentielles de la signalisation TLR, tels que (MyD88 et IRAK1), sont
exprimés de la même manière chez le nouveau-né à terme et l’adulte, alors qu’une différence du
niveau d’expression semble exister selon l’âge gestationnel.
183-185
L’identification de la forme soluble
de MD-2 comme élément majeur dans l’opsonophagocytose de bactéries à Gram négatif
1,2
et
l’extrême susceptibilité des prématurés à ce type de pathogène, nous a amenés à poser l’hypothèse
qu’un déficit en MD-2 pouvait être présent chez ces grands prématurés.
Pour répondre à ces questions, nous avons caractérisé de manière systématique, chez 80 sujets : 1)
l’expression de TLR2, TLR4, CD14 et MD-2 à la surface des monocytes et des PMNs , 2) la réponse
fonctionnelle des leucocytes cultivés avec des bactéries et 3) la capacité opsonophagocytaire du
68
plasma. Cette étude, inscrite sur un registre d’étude clinique
(7)
, nous a permis de démontrer que le
niveau d’expression de surface de MD-2 et TLR2 leucocytaire variait de manière importante tout au
long des dernières semaines de gestation, et que l’extrême prématurité (âge gestationnel inférieur à
28 semaines) était associée à un défaut « global » des TLRs, mais particulièrement marqué pour ce
qui est de l’expression de TLR2 et MD-2 (Figure 7).
TLR4
MD-2
TLR2
Figure 7. Niveau d’expression à la surface de granulocytes de TLR4, MD-2 et TLR2 chez des
nouveau-nés nés à moins de 28 semaines d’âge gestationnel (<28 GA), moins de 32 semaines
(<32 GA), à terme (term), et chez des adultes contrôles (Adult). Mesure faites par cytométrie en
flux (FACS) par des anticorps spécifiques, exprimée par « index geomean » par rapport à
l’anticorps isotype contrôle.
Par ailleurs, ce défaut d’expression des récepteurs de surface est fonctionnellement corrélé à un
défaut de réponse du sang complet à des bactéries pathogènes tels que E. coli, S. aureus, S.
epidermidis et L. monocytogenes. Pour ce faire, le taux plasmatiques d’IL-8 et d’IL-6 a été mesuré par
ELISA sur du sang complet stimulé durant 15 heures par des souches cliniques de bactéries
pathogènes. Nous observons un défaut marqué de la réponse des leucocytes des grands prématurés
par rapport aux bébés nés à terme et aux adultes, une réponse également plus tardive lors d’étude de
la cinétique de la réponse inflammatoire aux bactéries. Ces observations suggèrent un défaut tant au
niveau de la reconnaissance bactérienne des leucocytes des grands prématurés que sur leur capacité
de signalisation la présence de bactéries. Par ailleurs, nous avons aussi montré une atteinte de la
(7)
ClinicalTrial.gov : NCT00866567
69
capacité opsonophagocytaire du plasma chez le grand prématuré, une atteinte indépendante du
complément (Figure 8).
< 28 weeks of GA
28-32 weeks of GA
Term newborn
Adult
E. coli
S. aureus
Figure 8. Capacité opsonophagocytaire du plasma inactivé par la chaleur (inactivation du
complément) de nouveau-nés nés à moins de 28 semaines, et moins de 32 semaines d’âge
gestationnel, à terme et d’adultes. Phagocytose d’E.coli et de S.aureus fluorescents mesurée par
FACS. Incubation de plasma de nouveaux-nés (ou d’adultes) avec leurs propres leucocytes, en
présence d’E.coli fluorescents (ligne supérieure) et de S.aureus fluorescents (ligne inférieure).
Courbes violettes ; temps « 0 », courbes rouges : « temps 10 minutes » et courbes vertes : « temps
20 minutes ».
L’importance d’une telle étude réside dans la compréhension des interactions hôte-pathogène chez le
patient «immature», ainsi que dans l’élaboration et le développement de traitements permettant la
« maturation » du système immunitaire innée du prématuré. Nous avons ensuite démontré, ex vivo,
que la capacité du prématuré à répondre à un pathogène pouvait être rétablie par traitement (données
non communiquées). Ainsi, ces différentes observations nous permettent de conclure à l’existence
d’un déficit de l’immunité innée chez le grand prématuré, réversible, et se corrigeant progressivement
durant les dernières semaines de gestation (manuscrit en cours de rédaction). La possibilité de
restaurer un système immunitaire inné fonctionnel chez les grands prématurés ouvre des perspectives
cliniques importantes. Toutefois, la compréhension des mécanismes de régulation des protéines
impliquées dans l’immunité innée reste partielle et nécessite d’être développée.
V.2
Quel sont les mécanismes de régulation de l’expression de MD-2 ?
La compréhension des mécanismes de régulation de l’expression de MD-2 apparaît donc comme
4
essentielle. Dans notre troisième article , nous avons décrit les mécanismes de régulation de
l’expression de phase aiguë de MD-2 (Article 3). Dans ce travail, nous avons abordé l’importance des
mécanismes transcriptionels dans la régulation de cette expression et leur rôle potentiel dans le
70
contrôle de l’expression de MD-2 dans des lignées cellulaires non-myélocytaires. La principale limite
de ce travail est qu’il a été effectué uniquement sur lignées cellulaires. Des données préliminaires
tendent à suggérer que l’activation des MAPK peut influencer l’expression de MD-2.
sur cellules primaires pourrait être modifiée comme le suggère Sandanger et al.
187
186
La régulation
Ainsi, l’analyse de
la régulation devrait aussi inclure l’étude de tissus primaires.
L’une des spécificités de MD-2 soluble est sa capacité d’induire une réponse aux bactéries à Gram
négatif dans des tissus non-myéloides, tels que des endothélias et épithélias.
1,85,162,188
Pour ce qui est
de l’endothélium vasculaire, il a récemment été démontré que ce tissu était une des source importante
de MD-2 soluble.
187
Pour ce qui est des épithelias, les surfaces muqueuses du système respiratoire,
digestif et urinaire, sont recouvertes par une barrière épithéliale formant une protection contre les
bactéries. Dans le tube digestif, l’épithélium est continuellement exposé à des bactéries, mais il n’en
résulte aucune inflammation. L’épithélium digestif n’induit une réponse inflammatoire uniquement
lorsque les bactéries envahissent le tissu, et plus spécifiquement le compartiment basolatéral. TLR4
est faiblement exprimé dans le tissu épithélial intestinal.
189,190
Toutefois sous certaines conditions,
TLR4 peut être sur-exprimé comme lors de maladies inflammatoires digestives.
191
La régulation de
l’expression de MD-2/TLR4 dans les épithélias est ainsi primordiale pour éviter d’induire une réponse
inflammatoire excessive et réguler la réponse épithéliale aux bactéries.
Sur le plan de la physiopathologie de la réponse immunitaire innée de l’épithélium, nos travaux sur
MD-2 soluble et son induction de phase aiguë permettent de poser l’hypothèse selon laquelle la
réponse immunitaire innée des épithélias peut être reconstituée en situation pathologique et ce par un
mécanisme de dé-compartimentalisation des constituants afin de permettre une réponse
inflammatoire et antibactérienne (Figure 9).
L’étude des mécanismes permettant l’induction de la réponse aux bactéries mérite d’être étudiée,
notamment lors de sepsis, d’inflammation aiguë et chronique, d’infection virale, de traitements
médicamenteux, de la ventilation mécanique, et autres stress cellulaires. D’autres questions
mériteraient d’être discutées : l’espace interstitiel est-il réellement inerte sur le plan de son immunité
innée en situation normale ?; quel est le rôle des macrophages associés aux épithélias ainsi que des
neutrophiles circulant dans la réponse immunitaire innée des épithélias ? Pour ce faire, nous
illustreront notre propos par la discussion des mécanismes de réponse des l’épithélium respiratoire
aux bactéries lors d’infection virale respiratoire.
71
Figure 9. Représentation schématique de la capacité des épithélias d’être activable par les
bactéries à Gram négatif lors d’un sepsis, par exsudation de protéines de la phase aiguë dans
l’espace extravasculaire (intra-tissulaire), notamment LBP, sCD14 et sMD-2, et reconstitution d’un
récepteur au LPS fonctionnel à la surface de la cellule épithéliale exprimant TLR4 à l’aide de ces
protéines.
Les surinfections bactériennes lors d’infections virales sont associées à une morbidité et une mortalité
élevées.
192
Celles-ci peuvent survenir, chez l’enfant, pendant ou au décours d’une infection virale,
comme par exemple les infections à Streptococcus pyogenes compliquant une varicelle, lors de
surinfections à Bordetella pertussis, Streptococcus pneumoniae, à Hemophilus influenzae lors
d’infections au virus respiratoire syncitial (VRS) et à Staphylococcus aureus lors d’une grippe à
influenza.
193,194
Les surinfections bactériennes peuvent atteindre 35% des cas de bronchiolites à VRS
en période épidémique, et sont associées à une morbidité respiratoire significative - ventilation
mécanique, hospitalisation prolongée en réanimation - et une mortalité atteignant 7%.
72
195,196
Le modèle de la réponse de l’hôte aux bactéries à Gram négatif lors d’infection à VRS est intéressant
pour plusieurs raisons.
197
D’une part, on observe une « coopération » entre le VRS et Haemophilus
influenzae, facilitant l’invasion de l’épithélium par ce dernier.
198
D’autre part, il a été clairement
démontré non seulement que le VRS interagit avec TLR4, mais aussi que TLR4 détermine la réponse
de l’hôte à VRS (polymorphisme TLR4 influençant la réponse de l’hôte à VRS). Cette propriété est
d’ailleurs exploitée pour le développement de vaccin anti-VRS.
199
Par ailleurs, TLR4 est essentiel
pour la reconnaissance par l’épithélium respiratoire de Haemophilus influenzae.
200
Ainsi, cette
interaction entre VRS et bactéries à Gram négatif est complexe. Il est clairement établi que VRS
permet d’induire la capacité de réponse de l’épithélium respiratoire au LPS en induisant l’expression et
la localisation membranaire de TLR4.
160
Le mécanisme sous jacent n’est toutefois pas clair. Des
données préliminaires récentes suggèrent une participation de l’INF-γ et de l’IL-10 dans cette
pathogénèse. Dans un autre registre, il a été démontré que la réponse de l’hôte et la susceptibilité aux
surinfections bactériennes lors de malaria était induite par l’INF-γ, suggérant le rôle central de ce
dernier dans les mécanismes de « priming » lors de co-infection.
établi que l’IL10 est un inducteur de l’expression de MD-2.
201
187
Parallèlement, il a été également
Ce dernier travail prend toute sa
pertinence lorsque l’on sait que lors d’une infection à VIH persistante (charge virale persistante, ou
après arrêt du traitement) l’on retrouve aussi bien des taux d’IL-10 et de sMD-2 élevés mais aussi la
persistance d’une endotoxinémie.
202
Les questions sont multiples, mais le rôle de l’IFN-γ, de l’IL-6, et
de l’IL-10 dans la régulation de l’expression des protéines impliquées dans la reconnaissance de
bactéries à Gram négatif semblent être majeure. Ces cytokines sont centrales dans la polarisation
Th1/Th2. Cette perspective rejoint d’ailleurs l’étude de la maturation du système immunitaire innée du
nouveau-né et ce en relation avec l’équilibre Th1/Th2 chez la mère lors de la grossesse (voir 5.2).
V.3
203
Réponse de l’épithélium respiratoire lors du sepsis
L’étude de la réponse immunitaire innée aux bactéries à Gram négatif est indissociable
des
mécanismes de réponses lors du sepsis. Ainsi, la mise en perspective clinique de la régulation de MD2 doit inclure la réponse de l’hôte lors de thérapies fréquemment utilisées en réanimation, telles que la
suppléance ventilatoire et l’utilisation de substances vaso-actives.
La ventilation mécanique (VM) est une technique de suppléance incontournable en réanimation où la
défaillance respiratoire est l’un des principaux motifs d’admission. Les données expérimentales
nombreuses et consistantes ont montré que la VM était susceptible de provoquer en elle-même des
dommages pulmonaires, notamment de l’inflammation, et ce particulièrement lorsque le poumon était
préalablement agressé. Ces phénomènes pourraient contribuer à favoriser la survenue d’infections
bactériennes pulmonaires, voire aggraver une pneumopathie préexistante chez les patients soumis à
la VM. Les contraintes mécaniques anormales auxquelles sont soumis les poumons ventilés
pourraient participer directement à ces perturbations de l’homéostasie pulmonaire jusqu’à modifier la
réponse immune de cet organe.
204-206
Le stretch cellulaire, comme modèle de la ventilation
73
mécanique, a clairement montré sa capacité inductrice de la sécrétion de cytokine, mais aussi
l’expression de TLRs.
207-209
Par ailleurs, la modulation de l’expression de TLR2 et TLR4 lors de la
210,211
ventilation a été démontrée.
Ainsi, la VM devrait induire une modulation de la réponse de l’hôte
aux infections. Ses modalités restent à être caractérisées.
L’utilisation de substances vaso-actives est fréquente en réanimation, parmi celles-ci, les agonistes βadrénergiques dont les fonctions principales sont d’augmenter la contractilité cardiaque, de dilater les
vaisseaux périphériques et les bronches. Le rôle des β-agonistes sur la réponse inflammatoire lors de
sepsis est complexe.
212,213
Son impact sur la capacité de reconnaissance de bactéries par l’hôte est
inconnu. Dans un travail préliminaire, nous avons montré que l’isoproterenol (un agoniste β2) induit
l’expression de MD-2 (activation du promoteur de MD-2, de l’expression d’ARNm et sécrétion de sMD2). Par ailleurs, nous avons montré que cette induction était en réalité induite par l’AMP cyclique
(cAMP), et donc secondaire à l’activation de l’adénylate cyclase par la stimulation des récepteurs
membranaires β (Figure 10).
Figure 10. La sécrétion de MD-2 par les hépatocytes est induite par un agoniste ß 2 (Iso,
isoprénaline), un activateur de l’adénylate cyclase (Forskoline), mais bloquée par un inhibiteur de
l’adenylate cyclase (dd-ADO, dideoxyadenosine).
L’analyse de la régulation de la transcription induite par l’AMP nécessite d’étudier le rôle de trois
facteurs de transcription liés à l’induction cAMP-dépendante : CREB, CREM et ATF-1. Les résultats
préliminaires semblent indiquer la présence au sein du promoteur proximal d’un répresseur de la
réponse cAMP, tels qu’ICER. Le rôle d’ICER (« inducible cAMP early repressor »), mais aussi de coactivateurs tels que NONO, la famille des TORCs, et l’interaction avec les MAP Kinases doivent être
évaluées. NONO représente une cible d’intérêt dans la mesure où il lie de nombreux facteurs de
transcription, dont PU.1 (voir article 3).
214
Les données récentes sur CREB et ces co-activateurs
suggèrent qu’ils sont capables de recruter de novo la machinerie transcriptionelle
que PU.1 et C/EBPβ, comme nous l’avons préalablement montré.
74
215
, au même titre
VI.
CONCLUSION
Le système immunitaire inné des mammifères est capable de produire une réponse spécifique, rapide
et efficace lors d’invasion bactérienne. Cette réponse nécessite plusieurs étapes débutant par la
reconnaissance de PAMPs par les PRRs. La reconnaissance et la capacité de l’hôte d’induire une
réponse ne sont pas systématiquement liées. Plusieurs raisons expliquent la complexité de cette
réponse. Tout d’abord, de nombreuses protéines constituent la cascade de signalisation, résultant
ultimement en l’activation de l’expression de gènes inflammatoires. Cette signalisation, comme
préalablement discuté, est régulée par de multiples protéines accessoires, de kinases et de protéases,
qui permettent une réponse de l’hôte fine et nuancée. Par ailleurs, le contrôle de la réponse est aussi
dépendante
d’une
compartimentalisation
physiologique
du
système
immunitaire
inné.
La
caractérisation de la capacité du MD-2 soluble de reconstituer en situation physiopathologique, tels
que lors d’une réaction de phase aiguë, une réponse immunitaire innée, nous permets de considérer
que tout tissu peut, sous certaines conditions, être impliqué dans une réponse de l’hôte aux infections.
Cette capacité qu’ont les tissus à participer à la réponse immunitaire innée explique pourquoi, lors
d’une infection systémique, autant d’organes peuvent présenter des signes d’atteintes et parfois de
dysfonction. Comme nous l’avons discuté, la décompartimentalisation de la réponse inflammatoire du
milieu vasculaire vers le millieu interstitiel est caractérisée par le transfert de protéines solubles (sMD2, opsonines) et de cellules (macrophages activés, cellules dendritiques), permettant la reconstitution
sur des tissus physiologiquement inertes (en terme de réponse aux bactéries) d’une réponse
immunitaire innée.
En caractérisant la sécrétion de MD-2 soluble lors d’une réponse de type « phase aiguë », nous
confortons le concept selon lequel MD-2 n’agit pas uniquement sur des tissus immunitaires
« professionnels », mais aussi sur des tissus non-professionnel, tels que les épithélia (respiratoire,
digestif, urinaires, méningés), ou des organes (le foie, les reins, l’os), et ouvre ainsi toute la
perspective de la réponse immunitaire des organes et de la compartimentalisation de la réponse.
Cette perspective est d’autant plus importante à considérer, que nous avons pour MD-2, comme
d’autres pour TLR4
187
, montré que les modes de régulation de l’expression varient selon le type
cellulaire. Il est ainsi primordial de considérer pour les futures études sur le sujet que le modèle
(animal, type cellulaire) détermine la réponse immunitaire innée et que celle-ci ne peut être extrapolée
à l’ensemble des tissus.
Pour conclure, je citerai Metchnikoff qui, dans son discours lors de la réception de son prix Nobel en
1908, dit : « Parmi les applications pratiques de la doctrine de la phagocytose, il faut mentionner
l’utilisation, en chirurgie, de substances capable d’amener un grand nombre de corpuscules blancs
dans des régions opérées ou sujettes à l’infections. (….) avec pour objectif d’amener sur ces sites une
armée de phagocytes protecteurs pour éliminer les microbes », et poserai la question suivante : lors
d’infection bactérienne grave, faut-il induire ou bloquer l’expression de MD-2, et dans quel
compartiment ?
75
VII.
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