PROPOSITION SUJET de MASTER 2016-2017 TITRE : Mutagenèse par le système CRISPR/Cas9: mise au point chez les phytopathogènes Dickeya spp Nom, Prénom du Maitre de Stage : Qualité : MC Téléphone : 31621 Nom, Prénom du co-encadrant : Qualité : MC Téléphone : 32695 Hommais Florence E-mail : [email protected] Reverchon Sylvie E-mail :[email protected] Laboratoire d’accueil, Responsable et équipe : UMR5240 Microbiologie Adaptation Pathogénie Equipe Chromatine et Régulation de la Pathogénie bactérienne Adresse : Campus de la Doua, bat Lwoff 10 rue Dubois 69622 Villeurbanne Nom du candidat éventuellement proposé : S'il n'est pas retenu, acceptez-vous un autre candidat ? Oui - Non Description du sujet au verso Sujet (objectif, démarche et technique, collaboration(s),...) : L’identification de la fonction d’un gène dépend de la possibilité de modifier de manière contrôlée la séquence de ce gène soit en introduisant des mutations ponctuelles, des petites insertions/délétions ou des insertions/délétions plus larges au sein du génome de la cellule. Chez les organismes procaryotes, plusieurs méthodes de mutagenèse existent. Ainsi, il est possible d’introduire un marqueur de sélection dans le gène d’intérêt. Cette méthode requiert des processus de sélection et de contre sélection de marqueurs, généralement des résistances à des antibiotiques. Plus récemment, des techniques basées sur la recombinaison ont été développées (1). Elles permettent la modification de l’ADN par recombinaison homologue entre le génome et des fragments d’ADN linéaire. Cependant ces techniques sont très peu efficaces et, en l’absence de marqueurs de sélection, il est nécessaire de cribler d’un grand nombre de colonies pour identifier la souche mutante. Ceci est long et fastidieux. L’équipe Chromatine et Régulation de la Pathogénie bactérienne étudie les bactéries du genre Dickeya. Ce sont des pathogènes responsables de l’apparition de pourriture molle chez de nombreuses plantes d’intérêt agronomique comme la pomme de terre ou l’endive (2). Actuellement, on observe une émergence de souches hyper-virulentes en Europe. Dans le but d’identifier les mécanismes de régulation contrôlant les fonctions de virulence et de comprendre la mise en place des infections, nous utilisons des approches multiéchelles qui impliquent notamment la construction de mutants de différents types (micro-délétion ou large délétion de gènes dans le génome, insertion de fragment d’ADN, introduction de mutation ponctuelle…etc). Dès lors, la mise au point d’une méthode de mutagenèse efficace, rapide et permettant de réaliser une large gamme de modifications est d’un grand intérêt. Récemment, le système CRISPR/Cas9 a été utilisé pour effectuer de la mutagenèse dans divers organismes eucaryotes et chez quelques bactéries (3). Actuellement, les outils disponibles pour la modification des génomes bactériens sont optimisés pour quelques souches modèles de laboratoire. L’objectif de ce stage est de mettre au point cette technique de mutagenèse chez Dickeya y compris les nouvelles souches environnementales émergentes. Cette mise au point nécessitera notamment l’utilisation d’approches de génétique, de biologie moléculaire et de microbiologie. (1) Lee DJ, Bingle LE, Heurlier K, Pallen MJ, Penn CW, Busby SJ, Hobman JL. Gene doctoring: a method for recombineering in laboratory and pathogenic Escherichia coli strains. BMC Microbiol. 2009 Dec 9;9:252. (2) Reverchon S, Nasser W. Dickeya ecology, environment sensing and regulation of virulence programme. Environ Microbiol Rep. 2013 Oct;5(5):622-36. (3) Jiang Y, Chen B, Duan C, Sun B, Yang J, Yang S.Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9 system. Appl Environ Microbiol. 2015 Apr;81(7):2506-14.