Hommais - Spiral

PROPOSITION SUJET de MASTER 2016-2017
TITRE : Mutagenèse par le système CRISPR/Cas9: mise au point chez les
phytopathogènes Dickeya spp
Nom, Prénom du Maitre de Stage : Hommais Florence
Qualité : MC
Téléphone : 31621 E-mail : [e-mail]
Nom, Prénom du co-encadrant : Reverchon Sylvie
Qualité : MC
Téléphone : 32695 E-mail :[e-mail]
Laboratoire d’accueil, Responsable et équipe :
UMR5240 Microbiologie Adaptation Pathogénie
Equipe Chromatine et Régulation de la Pathogénie bactérienne
Adresse :
Campus de la Doua, bat Lwoff 10 rue Dubois 69622 Villeurbanne
Nom du candidat éventuellement proposé :
S'il n'est pas retenu, acceptez-vous un autre candidat ? Oui - Non
Description du sujet au verso 

Sujet (objectif, démarche et technique, collaboration(s),...) :
L’identification de la fonction d’un gène dépend de la possibilité de modifier de manière contrôlée la
séquence de ce gène soit en introduisant des mutations ponctuelles, des petites insertions/délétions ou des
insertions/délétions plus larges au sein du génome de la cellule. Chez les organismes procaryotes, plusieurs
méthodes de mutagenèse existent. Ainsi, il est possible d’introduire un marqueur de sélection dans le gène
d’intérêt. Cette méthode requiert des processus de sélection et de contre sélection de marqueurs,
généralement des résistances à des antibiotiques. Plus récemment, des techniques basées sur la
recombinaison ont été développées (1). Elles permettent la modification de l’ADN par recombinaison
homologue entre le génome et des fragments d’ADN linéaire. Cependant ces techniques sont très peu
efficaces et, en l’absence de marqueurs de sélection, il est nécessaire de cribler d’un grand nombre de
colonies pour identifier la souche mutante. Ceci est long et fastidieux.
L’équipe Chromatine et Régulation de la Pathogénie bactérienne étudie les bactéries du genre Dickeya. Ce
sont des pathogènes responsables de l’apparition de pourriture molle chez de nombreuses plantes d’intérêt
agronomique comme la pomme de terre ou l’endive (2). Actuellement, on observe une émergence de
souches hyper-virulentes en Europe. Dans le but d’identifier les mécanismes de régulation contrôlant les
fonctions de virulence et de comprendre la mise en place des infections, nous utilisons des approches multi-
échelles qui impliquent notamment la construction de mutants de différents types (micro-délétion ou large
délétion de gènes dans le génome, insertion de fragment d’ADN, introduction de mutation ponctuelle…etc).
Dès lors, la mise au point d’une méthode de mutagenèse efficace, rapide et permettant de réaliser une large
gamme de modifications est d’un grand intérêt.
Récemment, le système CRISPR/Cas9 a été utilisé pour effectuer de la mutagenèse dans divers
organismes eucaryotes et chez quelques bactéries (3). Actuellement, les outils disponibles pour la
modification des génomes bactériens sont optimisés pour quelques souches modèles de laboratoire.
L’objectif de ce stage est de mettre au point cette technique de mutagenèse chez Dickeya y compris les
nouvelles souches environnementales émergentes. Cette mise au point nécessitera notamment l’utilisation
d’approches de génétique, de biologie moléculaire et de microbiologie.
(1) Lee DJ, Bingle LE, Heurlier K, Pallen MJ, Penn CW, Busby SJ, Hobman JL. Gene doctoring: a method for
recombineering in laboratory and pathogenic Escherichia coli strains. BMC Microbiol. 2009 Dec 9;9:252.
(2) Reverchon S, Nasser W. Dickeya ecology, environment sensing and regulation of virulence programme. Environ
Microbiol Rep. 2013 Oct;5(5):622-36.
(3) Jiang Y, Chen B, Duan C, Sun B, Yang J, Yang S.Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9
system. Appl Environ Microbiol. 2015 Apr;81(7):2506-14.