MINI PROJET LICENCE ACADEMIQUE
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7 Université KASDI MERBAH-OUARGLA Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Département des Sciences Biologique MINI PROJET LICENCE ACADEMIQUE Domaine : Science de la Nature et de la Vie Filière : Biologie Spécialité : Microbiologie Fondamentale et Appliquée Présenté par : GUENDAFA Tarek KELLI Youcef Thème Le biofilm bactérien dans le domaine médical Encadré par : Djelloul-Daouadji Soumia Année Universitaire : 2014/2015 A cœur vaillant rien d’impossible A conscience tranquille tout est accessible Quand il y a la soif d’apprendre Tout vient à point à qui sait attendre Quand il y a le souci de réaliser un dessein Tout devient facile pour arriver à nos fins Malgré les obstacles qui s’opposent En dépit des difficultés qui s’interposent Les études sont avant tout Notre unique et seul atout Ils représentent la lumière de notre existence L’étoile brillante de notre réjouissance Comme un vol de gerfauts hors du charnier natal Nous partons livrés un combat héroïque et brutal Espérant des lendemains épiques Un avenir glorieux et magique Souhaitant que le fruit de nos efforts fournis Jour et nuit, nous mène vers le bonheur fleuri Nous prions dieu que ce mémoire Fera signe de gloire Et que nous serions enchantés Par notre travail honoré Remerciement On remercie dieu le tout puissant de nous avoir donné la santé Et la volonté de terminer ce mémoire. Tout d’abord, ce travail ne serait pas aussi riche et n’aurait pas pu avoir le jour sans l’aide et l’encadrement de Mlle Soumia DJELLOUL-DAOUADJI, on la remercie pour la qualité de son encadrement exceptionnel, pour sa patience, sa gentillesse et qualité humaine, son efficacité, capacité et son activité, ses réponses e-mails éclairs sont tous exceptionnelles. Sa disponibilité durant notre préparation de ce mémoire. Nous apprécions beaucoup votre effort pour faire réussir ce mémoire. Ce travail de thèse a été réalisé à laboratoire centrale de l’hôpital d’Ouargla au sein de l’équipe de microbiologie dirigée par Mme Kourime que je remercie pour son accueil. Un grand merci à Mr Benbrahim et pour tous ces bons moments passés ensemble que je n’oublierais jamais. Merci à tous pour votre soutien et votre bonne humeur au quotidien. Et aussi je désire remercier Mr Dada Moussa, et Mr Guellil AEK et aussi à nos amies Imene et Zohra pour avoir aidé dans notre travail merci à vous. A tout le personnel du laboratoire de Bactériologie pour leur bonne humeur, leur professionnalisme et leur aide précieuse. Ce travail n’aurait pu aboutir sans leur soutien. En fin à toute personne qui a participé de loin ou de près à l’élaboration de ce projet. Dédicace On dédie ce mémoire à … A mes chères parents Toufik et Wahiba Affables, honorables, aimables : vous représentez pour moi le symbole de la bonté par excellence, la source de tendresse et l’exemple du dévouement qui n’a pas cessé de m’encourager et de prier pour moi. Vos prières et vos bénédictions m’ont été d’un grand secours pour mener à bien mes études. Aucune dédicace ne saurait être assez éloquente pour exprimer ce que vous méritez pour tous les sacrifices que vous n’avez cessé de me donner depuis ma naissance, durant mon enfance et même à l’âge adulte. Vous avez fait plus que des parents puissent faire pour que leurs enfants suivent le bon chemin dans leur vie et leurs études. Je vous dédie ce travail en témoignage de mon profond amour. Puisse Dieu, le tout puissant, vous préserver et vous accorder santé, longue vie et bonheur. A la mémoire de mon grand-père Youcef Aucune dédicace ne saurait exprimer l’amour, l’estime, le dévouement et le respect que j’ai toujours eu pour vous. Rien au monde ne vaut les efforts fournis jour et nuit pour mon éducation et mon bien être. Ce travail est le fruit de tes sacrifices que tu as consentis pour mon éducation et ma formation. A ma grand-mère Menna Tes encouragements m’ont donnés la puissance de voire le plus loin possible et de rêvé toujours plus loin, toujours plus haut et de passé toujours aux devants de mes soucis et mes problèmes. A mes deux sœurs Sarah et Farah Merci pour votre soutien durant toutes ces années, vos plaisanteries et vos sourires qui me donnent l’amour tous attendue d’eux merci pour tous grandes sœurs. A toutes la famille Guendafa et la famille Kelli Merci pour tous vos encouragements. A notre chère et dynamique encadreur Mlle Soumia Djelloul-Daoudji Un remerciement particulier et sincère pour tous vos efforts fournis. Vous avez toujours été présente. Que ce travail soit un témoignage de ma gratitude et mon profond respect. A mon binôme Youcef Merci pour toutes ces expériences passées ensembles et tous ces travaux dures qu’on a fait ensembles. A mes très chers amis Nesrine, Imane, Hadjer, Khadija, Abdelkader, Abdenour, Amine, Adel, Mohamed, Taki,Omar,Mahfoud, Yakoub, Khaled, Didine, Seddik, Fouzi, et surtout Abderezzak qui m’ont soutenue durent ce long travail merci mes amis vous êtes uniques A mes deux Co-promotrices Imane et Zohra merci pour ce semestre inoubliable et à nos fou-rires ensembles merci pour vos encouragements et vos efforts au sein du laboratoire et de la fac et que dieu inchallah vous aide dans votre soutenance je suis avec vous de tous mon cœur... A tous mes collègues de la promo Microbiologie 2014/2015 Guendafa Tarek Dédicace Je dédie ce modeste travail à : A mes parents, aucun hommage ne pourrait être à la hauteur de l’amour dont ils ne cessent de me combler. Que dieu leur procure bonne santé et longue vie. A mes sœurs et mes frères pour m’avoir soutenue tout au long de mes études, pour votre amour, votre confiance et votre présence dans les moments difficiles et de déprime. J’ai pu à chaque fois me ressourcer auprès de vous pour repartir avec les batteries chargées à bloc. A ma belle Hadjar et toute la famille Benrostom. A Mlle Djalloul-Douadji Soumia, d’avoir accepté d’encadrer ce travail. Un immense merci pour ton soutien, tes précieux conseils et ta disponibilité. Tes compétences et ton investissement ont été déterminants pour l’aboutissement de cette étude. Je tiens également à te remercier de m’avoir initié aux joies de la Microbiologie. A mon binôme Tarek et toute la famille GUEUNDAFA. A Imane et Zohra pour les bons moments passés mais aussi pour vos qualités pédagogiques. Humainement et professionnellement, vous êtes une « belle rencontre ». A mes enseignants Mme BOUDJNAH, Mr BARADI, Mme KHALLAF, Mr BOUAL, et tous mes professeurs pour leur dynamisme et leur soutien pendant ces trois années difficiles, mais tellement enrichissantes. A monsieur le pharmacien Hachemi BENOUMAR. A mes amis Mazhor, Abdou, Rostom, Mahfoud, Omar, Ismaïl, Didine, Adnan, Taki, Roumissa , Maroua, Nadjiba, collègues de la promotion 2011/2012, mes collègues de la promotion microbiologie 2012/2013 et surtout groupe Anti-B, du département de la biologie, département de l’agronomie, de la nouvelle cité 2000, et d’ailleurs. Pour tous ces bons moments passés ensemble et ceux à venir, Pour tous ces fous rires, Pour toutes ces discussions interminables où le monde est à refaire, Pour qu’ils réalisent que les biofilms… sont partout ! Recevez ce mémoire en guise de remerciement pour votre dévouement et de témoignage de tout mon amour. Youcef Kelli TABLE DES MATIERES TABLE DES MATIERES INDEX DES ABREVIATIONS INDEX DES FIGURES INDEX DES TABLEAUX INDEX DES PHOTOS INTRODUCTION PARTIE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Chapitre I : Les biofilms bactériens 1. Histoire du biofilm …………………………………………………......... 2. Définition des biofilms ………………………………………………….. 3. La structure des biofilms ……………………………………………………..... 4. Les principaux constituants du biofilm ………………………………….. 4.1. Les micro-organismes …………………………………………......... 4.2. La matrice …………………………………………………………... 5. Les méthodes d’étude du biofilm ……………………………………….. 5.1. Mesure de la biomasse…………………………………………....…. 5.1.1. Crystal Violet…………………………………………………. 5.1.2. Syto9……………………………………………………........... 5.2. Mesure de la viabilité cellulaire ………………………………………….. 5.2.1. XTT (sel de tétrazolium) …………………………………….......... 5.2.2. Résazurine …………………………………………………… 5.2.3. FDA (Fluorescéine Diacétate) …………………………………….. 5.3. Mesure de la matrice ……………………………………………….. 5.3.1. DMMB (1,9-DiMethylMethylene Blue) ……………………... 5.4. Biofilm Ring Test…………………………………………………………. 6. Mode de développement d’un biofilm………….................................................. 6.1. L’adhésion des micro-organismes………………………………….. 6.2. La colonisation……………………………………………………… 6.3. La dispersion……………………………………………………….. 7. Les facteurs intervenant dans la formation de biofilms………………….. 7.1. Caractéristiques de la surface ………………………………………. 7.2. Caractéristiques du milieu …………………………………………. 7.3. Propriétés des cellules………………………………………….......... 8. Avantages et conséquences du mode biofilm …………………………… 9. Problèmes engendres par les biofilms………………………………...….. 9.1. Dans le domaine de l’industrie …………………………………….... 2 3 3 4 4 4 5 6 6 7 7 7 8 8 8 8 9 10 10 10 10 11 11 12 12 13 13 13 14 9.2. Dans l’environnement……………………………………………….. 14 9.3. Dans le domaine médical …………………………………………… Chapitre II : Biofilm dans le domaine médical 15 1. Biofilms et santé publique ………………………………………………. 15 2. Infections liées à la présence de biofilm ……………………………….... 16 3. Facteurs favorisant le développement d’infections dues à des biofilms… 17 3.1. Facteurs liés à la surface ………………………………………….. 17 3.2. Facteurs liés à l’environnement……………………………………. 18 3.3. Facteurs liés aux cellules constituant le biofilm…………………… 18 4. Biofilm et surface en milieu hospitalier …………………………………. 19 5. Pathogénie et micro-organismes impliqués ……………………………... 19 6. Résistance du Biofilm contre les agents antimicrobiens ………………… 20 7. Biofilm et système immunitaire …………………………………………. 21 8. Mécanisme de résistance du biofilm ……………………………………. 21 8.1. Le défaut de pénétration de l’antibiotique …………………………. 22 8.2. La croissance ralentie des bactéries………………………………… 22 8.3. La réponse des bactéries à un stress………………………………... 23 8.4. La persistance de bactéries…………………………………………. Chapitre III: Moyens de lutte contre les biofilms 24 1. La lutte contre les biofilms dans le secteur médical……………………... 24 1.1. Empêcher la formation de biofilm …………………………………. 24 1.1.1. Les dispositifs imprégnés de substances hydrophiles………... 1.1.2. Les dispositifs imprégnés d’argent ou de substances 24 antimicrobiennes……………………………………………... 25 1.1.3. Les agents chélateurs…………………………………………. 25 1.1.4. L’éthanol…………………………………………………....... 25 1.2. Elimination des biofilms…………………………………………… 25 1.2.1. L’antibiothérapie …………………………………………….. 26 1.2.2. Cibler la matrice exopolysaccharidique …………………….. 26 1.2.3. Cibler les bactéries persistantes ……………………………... 26 1.2.4. Inhiber le quorum sensing……………………………………. 27 1.3. Axes de recherche actuels sur les biofilms ………………………… 27 1.3.1. Les extraits de plantes au secours des cliniciens…………... 27 1.3.2. La lutte biologique contre les biofilms ……………………… 28 1.3.3. Le retour de la phagothérapie ………………………………. PARTIE II : TRAVAIL EXPERIMENTAL 29 1. Matériels et Méthodes …………………………………………………… 35 2. Résultats ………………………………………………………………….. 36 3. Discussion ………………………………………………………………… CONCLUSION REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ANNEXE I : Composition des milieux utilisés ANNEXE II : Résultats de l'identification des micro-organismes ANNEXE III : Photos réalisées Index des abréviations ADN AL ARN BAP BFI BHI CDC CLSM CV DMMB EDTA EDTA EX FDA IN LAP MEC NIH PAA PH PNN QS RM RpoS SCN SP Ssp TSI UV VF VP I VP II WAP XTT ICU IUD Acide Désoxyribonucléique All Acide Ribonucléique Biofilm Associated Proteins Indice de biofilm Brain Heart Infusion Center for Disease Control Microscope confocale à balayage laser Cristal violet DiMethylMethylene Blue Ethylène Diamine Tétra acétique Acide Ethylène Diamine Tétra acétique Acide Exemple Fluorescéine Diacétate Infections Nosocomiales Loosely Attached Proteins Matrice Extra Celulaire National Institute of Health l’acide peracétique Potentiel hydrogène polynucléaires neutrophiles Quorum Sensing Rouge de Méthyle RNA Polymérase sigma S Staphylocoque à coagulase négative Espèce Sous-espèce Trois Sucres à Identifier Ultra-Violet Viande-Foie Naphtol à G% (VPI) Lessive de potasse à 40% Wall Associated Proteins Sel de tétrazolium Intensive Care Unit Intra Utérine Device Index des figures Figures Figure 01 : Figure 02 : Index Les biofilms dans les environnements naturels et artificiels (Hentzer et Givskov. 2003). Architecture d’un biofilm bactérien sur une surface abiotique, Pages 03 04 (Centre for Biofilm Engineering, 1996). Figure 03 : Principe de la mesure de la biomasse par la méthode au Crystal 07 Violet,(Filloux et Vallet, 2003). Figure 04 : Principe de la méthode Biofilm Test Ring, 09 (http://www.biofilmcontrol.com/procedure.html). Figure 05 : Cycle de développement simplifié d’un biofilm. 11 (http://www.biofilm.montana.edu), Avec accord du Montana State University Center for Biofilm Engineering. Figure 06 : Chaine epidemoilogique de transmission d’agents infectieux. 19 (Vale et al., 2006). Figure 07 : Présentation schématique de la réponse immunitaire lors d’une 21 infection liée au biofilm. (Costerton et al., 1999). Figure 08 : Trois hypothèses concernant les mécanismes de résistance aux 23 antibiotiques des biofilms. (Stewart et al., 2001). Figure 09 : Perforation du biofilm par des bactéries (Houry et al., 2012). 28 Index des tableaux Tableaux Tableau 01 : Index Gamme de composition du biofilm matrices. Pages 05 Tableau 02 : Tableau 03 : Liste non exhaustive des infections humaines impliquant le biofilm Répartition des germes selon le Gram 16 35 Tableau 04 : Répartition des prélèvements effectués dans le service de Réanimation 35 Tableau 05 : Répartition des prélèvements effectués dans service Hémodialyse 36 Tableau 06 : Annexe II Tableau 07 : Résultat de l'identification des 13 souches de Staphylocoques isolées à partir des surfaces Souche et leur indice Tableau 08 : Sites de prélèvements dans les services d’hémodialyse et de réanimation Annexe II Annexe II Index des photos Photos Index Pages Photo 01 : Aspect des colonies des Staphylococcus sur milieu Chapman Annexe III Photo 02 : Annexe III Photo 03 : Aspect des colonies de Staphylococcus sur milieu gélose au sang Aspect des colonies de Bacillus Sp sur milieu gélose au sang Photo 04 : Coloration de Gram (objectif x100) Annexe III Photo 05 : production de catalase par Cocci Gram positif Annexe III Photo 06 : Observation du test coagulase libre Annexe III Annexe III Introduction Introduction : Toute surface plongée dans un milieu humide non stérile se recouvre de microorganismes qui forment un biofilm. Les micro-organismes fixés synthétisent des polymères et forment ainsi des films de quelques micromètres à quelques millimètres d'épaisseur, totalement différents du milieu environnant et régis par une organisation interne complexe. Au sein des biofilms, les micro-organismes développent des caractéristiques propres qui échappent en grande partie aux méthodes d'investigation de la microbiologie traditionnelle en solution : modifications structurales, production d'exopolymères, communication chimique... Les biofilms sont ubiquitaires : ils colonisent les sols, les rivières, les végétaux et les organismes vivants supérieurs. Dans de nombreux cas, ils ont des effets positifs et même vitaux .En contrepartie, ils sont de plus en plus souvent identifiés comme la source de lourds problèmes industriels et sociétaux : En milieu hospitalier, la colonisation de la surface des implants, des cathéters ou des salles d'intervention est à l'origine d'environ 60 % des infections nosocomiales (CDC, 2007). Les surfaces inertes à l’hôpital constituent-elles des réservoirs microbiens susceptibles de contaminer les personnes hospitalisées directement ou indirectement par l’intermédiaire des dispositifs médicaux ou des mains du personnel ? Certainement, mais le risque est difficile à évaluer : certains le considèrent comme négligeable, d’autres pensent que l’environnement sert de relais dans les transmissions croisées notamment pour les bactéries à Gram positif. Ce risque dépend du micro-organisme et de sa survie sur une surface inerte. Il n’est pas identique partout dans l’hôpital et dépend de l’usage qui est fait des locaux. Pour l’évaluer, l’étude de la contamination des surfaces est un préliminaire indispensable (Lemmen et al., 2004) . C’est dans ce cadre que s’inscrit notre étude qui consiste à isoler, identifier les bactéries à partir de l’environnement hospitalier dans les services de Réanimation et Hémodialyse de l’hôpital Mohamed Boudiaf de Ouargla, de montrer leur grande capacité d’adhérence sur des surfaces inertes également de s’assurer de l’efficacité de la stérilisation dans les services concernés par notre étude. 1 PARTIE I Synthèse bibliographique CHAPITRE I Le biofilm bactérien PARTIE I Synthèse bibliographique I.1 Histoire du biofilm Antonie Van Leeuwenhoek observe la présence de microorganismes (animalcules) issus d’un échantillon de grattage de sa propre surface dentaire. Il peut être considéré comme le découvreur des biofilms…250 ans plus tard Heukelekian et Heller (1940) observent « l’effet de bouteille » : la fourniture d’un substrat solide auquel des microorganismes marins peuvent s’attacher augmente leur croissance et activité métabolique (Heukelekian et Heller, 1940). Zobell (1943) observe que dans le milieu marin la quantité de bactéries fixée à un substrat est largement supérieure à la quantité de bactéries libres dans la phase liquide (Zobel, 1943). Jones (1969), travaillant sur des filtres de station de traitement des eaux, grâce à l’utilisation de la microscopie électronique à transmission et à balayage, ajoutant le rouge de Ruthénium (marquage des sucres) au tétroxyde d’Osmium, confirme non seulement les agrégats mono ou polymicrobiens, mais aussi l’existence d’une matrice polyosidique (Jones et al., 1969). Characklis (1973), démontre que des dépôts microbiens au sein de conduites d’eau de systèmes industriels apparaissent tenaces et résistants aux désinfectants (Characklis, 1973). Costerton (1978), sur la base de l’observation de l’ultrastructure de la plaque dentaire et de communautés microbiennes sessiles dans les torrents de montagne, propose la théorie des biofilms (Costerton et al., 1973). Cette proposition, qui s’appuyait initialement sur la comparaison du nombre de bactéries sous forme planctonique et sous forme de biofilms dans une rivière, est désormais généralement admise par les microbiologistes. Depuis, un nombre croissant d'études ont été consacrées aux biofilms, aussi bien dans les domaines industriel et environnemental que dans le domaine médical. En dix ans, le nombre de publications scientifiques annuelles consacrées aux biofilms est passé d’une dizaine en 1996 à plus de 1200 en 2006. Plus récemment, la microscopie à balayage et les cultures ont été supplantées par d’autres techniques comme la microscopie confocale à balayage laser et les outils du génie génétique. Ces derniers sont par exemple applicables à l’étude des gènes impliqués dans l’adhésion et la formation du biofilm (Donlan, 2002). Longtemps occultés par le mythe de la culture pure, les biofilms représentent depuis quelques années un problème majeur de par leur impact dans différents domaines comme l’industrie et la santé .La connaissance approfondie des mécanismes de leur formation et de leurs propriétés permet d’orienter la recherche dans la prévention et le traitement des biofilms dans de nombreux domaines. 2 PARTIE I Synthèse bibliographique 2. Définition des biofilms Les biofilms sont des communautés microbiennes complexes contenant des bactéries et des champignons. Ces micro-organismes synthétisent et sécrètent une matrice protectrice qui lie fortement le biofilm à une surface vivante ou non (Stoodley et al., 2002). Les biofilms sont des communautés hétérogènes dynamiques en constant changement (Stoodley et al., 2009). Ils peuvent se composer d’une seule espèce de bactéries ou de champignons ou, plus fréquemment, ils peuvent être polymicrobiens, c’est-à-dire qu’ils contiennent de multiples espèces variées (Dowd et al., 2008 ; Trengove et al., 1996). On en retrouve sur la plupart de surfaces animales, végétales et minérales. Contrairement aux idées reçues, les biofilms sont le mode de vie normal des bactéries (Klinger et al., 2005). Figure 01 : Les biofilms dans les environnements naturels et artificiels. (Hentzer et Givskov. 2003) 3. La structure des biofilms Les biofilms ont une architecture tridimensionnelle lorsqu’ils sont matures et dans laquelle des micro-colonies peuvent exister sous la forme de structures rappelant la forme de champignons ou de piliers cylindriques. Un réseau de canaux s’intercale entre ces structures pour fournir un accès aux nutriments et à l’oxygène (Costerton et al., 1999 ; Davey et O'toole, 2000 ; Donlan, 2002). Compte tenu de l’hétérogénéité structurale et microbiologique au sein du biofilm, l’expression des gènes peut être très variable. Ils résultent de nombreux facteurs parmi lesquels 3 PARTIE I Synthèse bibliographique la limitation de diffusion dans le biofilm des nutriments et de l’oxygène, les variations de pH et la concentration en métabolites bactériens (Stoodley et al., 2002 ; Jefferson, 2004). Figure 02 : Architecture d’un biofilm bactérien sur une surface abiotique (Centre for Biofilm Engineering, 1996) 4. Les principaux constituants du biofilm Les constituants essentiels d’un biofilm sont les micro-organismes agglomérés et la matrice qu’ils synthétisent. L’eau est leur principal composant, ce qui explique leur propriété hydrophile. La présence de canaux et de pores permet des flux d’eau, d’ions et de nutriments (Clutterbuck, 2007). 4.1. Les micro-organismes Les micro-organismes représentent 2 à 15 % du matériel du biofilm. La matrice extracellulaire représente 50 à 90% de la masse organique carbonée d’un biofilm. Le rapport C/N d’un biofilm est cinq fois plus élevé que pour une suspension de bactéries planctoniques, ceci étant dû à la prédominance de la matrice (Bury-Moné, 2007). 4.2. La matrice La matrice montre une grande microhétérogénéité, dans laquelle de nombreux microenvironnements peuvent exister. Bien que les exopolysaccharides fournissent le cadre de la matrice, un large éventail d'activités enzymatiques peut être trouvé au sein du biofilm, dont certains seront grandement affecter l'intégrité et la stabilité structurelle. Une grande partie de la matrice du biofilm - peut-être jusqu'à 97% - est faite d'eau. L'eau peut être lié à l'intérieur des capsules de cellules microbiennes ou peut exister en tant que solvant dont les propriétés physiques telles que la viscosité sont déterminés par les solutés dissous dedans. En dehors de l'eau et des cellules microbiennes, la matrice du biofilm est un complexe de polymères 4 PARTIE I Synthèse bibliographique sécrétées, absorbé éléments nutritifs et de métabolites, de produits de lyse des cellules et même matériau particulaire et les détritus provenant de l'environnement immédiat. Ainsi, toutes les grandes classes de macromolécule, des protéines, des polysaccharides, ADN et ARN peuvent être présentes en plus de peptidoglycane, de lipides, de phospholipides et d'autres composants cellulaires. La quantité de matériau cellulaire dans un biofilm peut lui-même varier considérablement. Le tableau 1 montre gamme de composition du biofilm matrices (Sutherland, 2001). Tableau 01 : Gamme de composition du biofilm matrices (Sutherland, 2001) Componet Water Microbial cells Polysaccharides (homo and heteropolysaccharides) Proteins (extracellular and resulting from lysis DNA and RNA Ions % of matrix up to 97% 2-5% (many species) 1-2% (neutral and polyanionic) <1-2% (many, inclyding enzymes) <1-2% (from lysed cells (bound and free) 5. Les méthodes d’étude du biofilm Les problèmes de Santé publique provoqués par les biofilms sont maintenant clairement définis. Pour prévenir et lutter contre ces biofilms, une meilleure compréhension de leurs mécanismes de formation est nécessaire. De nombreuses méthodes d’étude de la formation et du développement des biofilms ont été utilisées au cours des dernières années : des méthodes d’observation par microscopie (microscope à fluorescence, microscope confocale à balayage laser, microscope électronique à balayage) ou des méthodes de numération des bactéries après détachement des biofilms par sonication, frottement ou vortex des surfaces. Ces techniques permettent d’obtenir des informations détaillées mais sont difficiles et longues à réaliser . C’est pourquoi des modèles d’étude in vitro en microplaques ont été développés. Ces tests ont l’avantage d’être relativement rapides et peu coûteux. Ils permettent de réaliser de nombreux tests simultanément, notamment pour tester l’effet de plusieurs facteurs influençant la formation de biofilm, comparer la capacité de formation de biofilm de souches sauvages et de souches mutantes, ou encore tester la sensibilité des bactéries au sein du biofilm aux agents antimicrobiens. Après 24 à 48h de culture, un biofilm peut se former au fond de la microplaque. Des étapes de lavage éliminent les bactéries n’ayant pas adhérées, puis on peut observer et quantifier la formation de biofilm grâce à l’ajout d’un composé coloré 5 PARTIE I ou Synthèse bibliographique fluorescent. La détection du biofilm formé repose sur la mesure de la biomasse (quantification de la matrice et des bactéries vivantes ou non), de la viabilité (quantification des bactéries vivantes) ou de la matrice (quantification des composants spécifiques de la matrice) (Peeters et al, 2008). Dans ces méthodes basées sur la coloration des biofilms, plusieurs étapes ne sont pas bien standardisées, notamment les étapes de lavage qui sont très opérateur-dépendantes et peuvent influencer le résultat final. Ainsi, une autre méthode en microplaque appelée Ring Test® a été développée plus récemment (Chavant et al., 2007). 5.1 Mesure de la biomasse 5.1.1 Crystal Violet La méthode de quantification de la formation de biofilm utilisant le Crystal Violet (CV) a été décrite la première fois par Christensen et al. en 1985 (Christensen et al., 1985). Puis modifiée pour augmenter sa précision et permettre la quantification de la biomasse totale par résolubilisation du colorant (Extremina et al., 2011). Le CV est un colorant basique qui se lie aux molécules de surface chargées négativement et aux polysaccharides de la matrice extracellulaire. Les bactéries vivantes, les bactéries mortes et la matrice exopolysaccharidique sont donc colorées par le CV. Cependant, de nombreux facteurs physiques, chimiques et biologiques peuvent influencer cette fixation. Chaque puits de la microplaque est inoculé avec une suspension bactérienne. Après incubation de la microplaque, des étapes de lavage, de mise en contact avec le CV, de nouvelles étapes de lavage et de redissolution du colorant sont nécessaire pour mettre en évidence la formation de biofilm par une coloration violette (Figure 03). La densité optique, mesurée par spectrophotométrie à 560 nm dans un lecteur de microplaque, est proportionnelle à la quantité de biomasse dans le puits de la microplaque (Filloux et Vallet, 2003). 6 PARTIE I Synthèse bibliographique Figure 03 : Principe de la mesure de la biomasse par la méthode au Crystal Violet (Filloux et Vallet, 2003) 5.1.2 Syto9 Le Syto9 est un colorant vert fluorescent qui diffuse passivement à travers les membranes cellulaires et se lie à l’ADN présent à la fois chez les bactéries vivantes et chez les bactéries mortes, ainsi qu’à la matrice extracellulaire. Il permet une quantification de la biomasse du biofilm (Peeters et al., 2008). Le Syto9 a été utilisé pour la détection et la numération des bactéries au microscope confocal à balayage laser (CLSM) et pour les tests de quantification des biomasses des biofilms bactériens et fongiques (Honra et et al., 2005). 5.2 Mesure de la viabilité cellulaire Il peut être intéressant de différencier les bactéries vivantes des bactéries mortes, notamment lorsque l’on teste l’effet d’agents antimicrobiens sur les bactéries au sein du biofilm. Des techniques de quantification basées sur l’activité métabolique des bactéries vivantes ont été développées. 5.2.1 XTT (sel de tétrazolium) Le XTT est un composé jaune pouvant être réduit par les bactéries métaboliquement actives en formasan, un colorant orange. Le formasan est soluble dans l’eau et peut être directement quantifié par spectrophotométrie. Le test au XTT a été largement utilisé pour la quantification de cellules viables dans les cultures de bactéries planctoniques. Il a aussi été développé pour l’étude de la formation de biofilm chez des souches de Candida sp, et a montré son intérêt dans l’étude de la formation de biofilm chez d’autres espèces fongiques et bactériennes (Jin et al., 2004; Peeters et al., 2008; Pierce et al., 2008). Certaines limites à l’utilisation de ce réactif ont été décrites. Par exemple, la modification des états 7 PARTIE I Synthèse bibliographique métaboliques des bactéries au cours des différentes étapes de formation des biofilms peuvent entrainer des fluctuations dans leurs capacités à métaboliser le colorant (Pierce et al., 2008). De plus, des variabilités inter et intra-espèces ont été reportées (Honra et al., 2005). 5.2.2 Résazurine La résazurine est un colorant non toxique de couleur bleue qui peut être réduit par les bactéries métaboliquement actives en résorufine, un composé rose fluorescent. La quantité de résorufine, mesurée par fluorimétrie, est directement proportionnelle au nombre de bactéries viables présentes dans le milieu. La résazurine a souvent été employée pour l’évaluation de la viabilité des bactéries planctoniques. Plus récemment, elle a été utilisée avec succès pour la quantification de la formation de biofilm en microplaque et pour évaluer l’efficacité d’agents antimicrobiens dans la lutte contre les biofilms chez différentes souches bactériennes et fongiques (Jiang et al., 2011; Peeters et al., 2008; Pettit et al., 2005; Punithavathy et al., 2012). 5.2.3 FDA (Fluorescéine Diacétate) Le FDA est un composé non fluorescent hydrolysable en un composé jaune, absorbant à 490 nm et très fluorescent, par des estérases intra et extracellulaires non spécifiques produites par les bactéries et les champignons viables. Une étude a montré la supériorité du test au FDA pour la quantification des biofilms par rapport aux tests utilisant le XTT et le Syto9 (Honraet et al., 2005). Les estérases responsables du clivage du FDA forment un groupe d’enzymes dont l’activité semble plus stable malgré les changements phénotypiques. 5.3 Mesure de la matrice 5.3.1 DMMB (1,9-DiMethylMethylene Blue) La matrice extracellulaire est un élément essentiel à la formation et au maintien d’un biofilm mature. Le DMMB forme un complexe insoluble en présence des polysaccharides sulfatés de la matrice du biofilm. Le taux de colorant libéré après ajout d’une solution de décomplexassions est mesuré par un spectrophotomètre : la densité optique est proportionnelle au taux de polysaccharides sulfatés présents dans la matrice. Le test au DMMB a été initialement développé pour la détection d’aminoglycanes, puis a été optimisé pour permettre la quantification des biofilms à S. aureus (Tote et al., 2008). Il a montré une bonne répétabilité pour différentes espèces bactériennes (Peeters et al., 2008). 8 PARTIE I Synthèse bibliographique 5.4 Biofilm Ring Test La technique Ring Test est basée sur l’immobilisation de billes magnétiques par la formation de biofilm au fond d’une microplaque. Les billes magnétiques sont rajoutées dans chaque puits contenant le milieu de culture et la microplaque est mise à incuber. Après ajout de liquide de contraste, une première lecture est réalisée. La microplaque est ensuite placée sur un support magnétique constitué de 96 aimants centrés sur chaque puits. Après contact magnétique, les billes libres vont se placer au fond du puits formant un spot rouge, tandis que celles bloquées par un biofilm vont rester en place (Figure 04). Une seconde lecture est faite. Les images de chaque puits avant et après magnétisation sont analysées par un logiciel Biofilm Control qui donne un indice de biofilm (BFI) allant de 0 à 30 : un BFI bas correspond à une faible mobilité des billes magnétiques et donc à une formation de biofilm (Chavantet al., 2007). La technique Ring Test n’a été validée qu’avec le milieu de culture BHI (Brain Heart Infusion) filtré dans des microplaques en polystyrène. Par rapport aux méthodes basées sur la coloration des biofilms, cette technique ne présente pas d’étape de lavage ni d’étape de coloration, ce qui limite les variations de résultats liées à l’opérateur et simplifie la technique. De plus, le Ring Test® permettrait de détecter plus précocement la formation de biofilm, dès l’étape d’adhérence des bactéries à la surface de la microplaque (Chavant et al., 2007 ; Nagant et al., 2010). Figure 04 : Principe de la méthode Biofilm Ring Test (http://www.biofilmcontrol.com/procedure.html) 9 PARTIE I Synthèse bibliographique 6. Mode de développement d’un biofilm : Les bactéries semblent initier la formation d’un biofilm en réponse à une pression environnementale, telle que le manque d’oxygène et de nutriments ou la présence d’un traitement. Les biofilms peuvent se développer sur une grande variété de surfaces, incluant les tissus vivants, les dispositifs médicaux, les canalisations des systèmes d’eau potable ou industriels, ou sur tout autre support retrouvé dans le sol ou dans les milieux aquatiques, selon le modèle développemental (Beloin et al., 2008). Les étapes de formation du biofilm sont : 6.1 L’adhésion des micro-organismes Attachement à une surface de bactéries planctoniques au moyen de divers facteurs d’adhérence, par mouvement brownien, par sédimentation ou par mobilité active (présence de flagelles). L’attachement peut avoir lieu en quelques minutes, elles s’y attachent de manière réversible par des interactions non spécifiques, électrostatiques et électrodynamiques. Cette étape est influencée par des conditions environnementales impliquant le pH, l’osmolarité du milieu, la température, la concentration en oxygène et en nutriments et l’hydrodynamique du fluide. La fixation à la surface solide devient irréversible en raison de la production d’exopolysaccharides par les bactéries et surtout grâce à des structures d’adhérence variables selon les espèces bactériennes (Beloin et al., 2008). 6.2 La colonisation Formation locale de microcolonies par multiplication bactérienne et colonisation de la surface. Début de la synthèse de la matrice extracellulaire qui consiste en polysaccharides, protéines et ADN. Cette étape a lieu en quelques heures, consécutivement à l’adhésion. Formation de macro-colonies et développement de la structure tridimensionnelle, possiblement complexe, du biofilm (ex : piliers, canaux). permettant l’acheminement d’oxygène et de nutriments nécessaires à la croissance des micro-organismes, ainsi que l’élimination des déchets (Filloux et Vallet, 2003 ; Tenke et al., 2006). La production et la sécrétion d’enzymes ou de toxines provoque la dégradation des tissus environnants de l’hôte et permet ainsi la libération de nutriments (Jacobsen et al., 2008). Les contacts rapprochés entre les micro-organismes favorisent le transfert horizontal de matériel génétique. Ce phénomène pourrait notamment faciliter la propagation des gènes de résistance aux antibiotiques (Trautner et Darouiche, 2004a). 6.3 La dispersion Biofilm établi, avec possibilité de mouvement par expansion locale (multiplication, swarming), dispersion mécanique ou programmée. Selon les conditions environnementales et les bactéries impliquées, le détachement de bactéries peut aussi être une stratégie active, 10 PARTIE I Synthèse bibliographique initiée par les bactéries elles-mêmes, leur permettant de coloniser de nouvelles surfaces et de survivre lorsque l’espace et les nutriments deviennent limités. Les bactéries peuvent se détacher seules ou par petits ou gros amas selon les mécanismes impliqués (Kaplan, 2010). le biofilm ne peut être composé que de quelques couches de cellules, ou atteindre plusieurs (millimètres/centimètres) d’épaisseur, Comme pour les autres étapes, le détachement de bactéries est un processus complexe qui implique des signaux environnementaux et une communication entre les bactéries. (Nadell et al ., 2009). Figure 05 : Cycle de développement simplifié d’un biofilm. (http://www.biofilm.montana.edu), avec accord du Montana State University Center for Biofilm Engineering. 7. Les facteurs intervenant dans la formation de biofilms La formation d’un biofilm est un phénomène complexe, sous l’influence de nombreux facteurs : caractéristiques du substrat sur lequel les bactéries vont se fixer, forces s’exerçant dans le milieu aqueux (hydrodynamique du fluide), caractéristiques du milieu et propriétés de la surface des cellules (Donlan, 2002). 7.1 Caractéristiques de la surface N’importe quel matériau en contact avec un fluide contenant des bactéries est un support potentiel pour la formation d’un biofilm. La rugosité, Plus une surface est rugueuse, plus la colonisation de cette surface par des microcolonies est importante (Characklis, 1990). 11 PARTIE I Synthèse bibliographique Les surfaces rugueuses sont colonisées de façon préférentielle car les forces répulsives sont moindres et la surface de fixation est augmentée, grâce à la présence d’aspérités (Donlan, 2002). Les micro-organismes se fixent plus facilement à des surfaces hydrophobes et non polarisées comme le Téflon ou d’autres matières plastiques, que sur des matériaux hydrophiles comme le verre ou les métaux. La présence de polymères sur un matériau modifie les propriétés physico-chimiques de sa surface, et a une influence directe sur l’attachement de bactéries à cette dernière. En effet, la présence préalable sur un biomatériau d’un film protéique comme le sang, les larmes, l’urine, la salive, le liquide interstitiel et les sécrétions respiratoires influence l’attachement de bactéries à sa surface, et favorise la formation de biofilms (Mittelman, 1996). La nature de ces films protéiques est différente selon les milieux. Prenons l’exemple des bactéries formant le biofilm de la plaque dentaire. Elles se fixent sur un film protéique, présent à la surface de l’émail dentaire et composé d’albumine, de lysozymes, de glycoprotéines, de phosphoprotéines et de lipides (Donlan, 2002). La présence de films protéiques sur des implants médicaux en contact direct avec un fluide favorisent la formation de biofilms. Par exemple, les cathéters veineux centraux, en contact direct avec le sang, sont recouverts de plaquettes, de plasma et de protéines: albumine, fibrinogène, fibronectine, laminine (Goller, 2008). 7.2 Caractéristiques du milieu La formation et la dispersion d’un biofilm nécessitent des équipements enzymatiques précis et des entités structurales particulières, dont l’activation dépend de facteurs environnementaux clefs. On peut citer les facteurs suivants : température, pH, concentration en oxygène, concentration en fer, osmolarité, présence d’ions spécifiques, sources de carbone. (Goller, 2008, Martinez, 2007). 7.3 Propriétés des cellules La plupart des bactéries sont chargées négativement et présentent à leur surface des zones hydrophobes. Plusieurs éléments structuraux des bactéries interviennent dans leur attachement à une surface : flagelles, fimbriae (Donlan, 2002). Les protéines de surface BAP (Biofilm Associated Proteins) ou LAP (Loosely Attached Proteins) ou WAP (Wall Associated Proteins) (Duez, 2012). Des bonnes conditions nutritives sont nécessaires aux étapes de formation du biofilm, alors que les phases de développement tardif sont possibles dans des conditions nutritives moins bonnes. Ainsi, le type de biofilm dépend des conditions nutritives, ce qui suggère une facilité de remodelage des biofilms (Clutterbuck, 2007). 12 PARTIE I Synthèse bibliographique 8. Avantages et conséquences du mode biofilm Le mode de vie sous forme de biofilm protège les micro-organismes qui le constituent et leur confère de nombreux avantages : coopération dans certains systèmes cataboliques, synergies entre micro-organismes, expressions phénotypiques de facteurs de résistance lors de situations de stress (Costerton et al., 1999 ; Tomlin et al., 2005 ; Jouenne, 2008). En adoptant un mode de vie sessile, les microorganismes améliorent considérablement la capture et la concentration de nutriments vitaux tels que le carbone, l’azote et le phosphate par la matrice de polymère (Sutherland, 2001 ; Sutherland, 2001 ; Jefferson, 2004). La croissance bactérienne en biofilm permet l’acquisition d’avantages métaboliques par l’action synergique des différentes espèces bactériennes. L’organisation structurée en communauté des biofilms permet l’optimisation des mécanismes de capture des nutriments et ainsi la réalisation d’économies énergétiques et de réserves (Sutherland, 2001 ; Branda et al., 2005). De plus, des canaux peuvent traverser tout le biofilm formant un système circulatoire primitif, comme c’est le cas chez Pseudomonas aeruginosa. Ils permettent un échange de nutriments et de métabolites avec la phase aqueuse augmentant leur disponibilité et l’évacuation de métabolites toxiques (Costerton et al., 1995).Par ailleurs, l’organisation architecturale complexe des biofilms permet aux micro-organismes de coopérer pour dégrader certains nutriments complexes (Tomlin et al., 2005). Les biofilms peuvent être d’une grande utilité, notamment en matière d’épuration et de bioremédiation. Cependant, les biofilms peuvent aussi être source de problèmes tant dans le domaine médical que dans l’industrie ou même l’environnement. 9. Problèmes engendres par les biofilms 9.1 Dans le domaine de l’industrie Les biofilms sont la source de nombreux problèmes dans l’industrie agroalimentaire, en termes d’hygiène alimentaire et d’altération des qualités organoleptiques des produits alimentaires. Ils sont présents dans tous les secteurs : laiteries, brasseries, meuneries, sucreries, salaisonneries, etc. Les installations fabriquant des produits humides sont exposées à la formation de biofilms car tout équipement non stérilisé est porteur de microorganismes (Jeyasekaran et al., 2000). Ces biofilms représentent un risque pour la santé humaine, comme l’a montré l’épidémie survenue dans le nord de la France à l’hiver 2003. Plus récemment, une épidémie de gastroentérite et de syndrome hémolytique et urémique s’est déclarée en Europe au printemps 2011. Elle apparaissait liée à la présence de la souche Escherichia coli O104:H4 sur des graines germées. 13 PARTIE I Synthèse bibliographique 9.2 Dans l’environnement Les biofilms sont à l’origine d’un certain nombre de dégradations (bâtiments, corrosion pouvant mener à la perforation de la coque des bateaux, altération de machines par corrosion localisée) et ont par conséquent un impact économique important. De plus, des problèmes de corrosions sont associés aux salissures lorsqu’elles abritent en particulier, ex : des bactéries sulfato-réductrices proliférant en des milieux anaérobies et dont la respiration induit la formation de sulfures par réduction de l’ion sulfate (Guezennec et al., 1992). 9.3 Dans le domaine médical En médecine, les biofilms ont une importance particulière car ils sont impliqués dans un large éventail d’infections chez l’homme. Environ 65 % des infections sont dues à des biofilms dans les pays dits développés. Les biofilms sont aussi impliqués dans 60 % des infections nosocomiales et dans toutes les infections prothétiques (Costerton et al., 1995). De plus, près de 80 % des infections bactériennes chroniques sont associées à la présence de biofilms (Hall-Stoodley et al., 2004). En effet, en se maintenant attachées aux dents, les bactéries évitent les conditions acides rencontrées dans l’estomac (Gibbons et van Houte, 1975). Les biofilms dentaires deviennent de réels problèmes lorsque l’équilibre entre les différentes espèces est rompu. Ces biofilms détruisent progressivement la dent, c’est la carie (Loesche, 1986). Des biofilms ont ainsi pu être observés sur des pansements, du matériel de suture, dans des tubes de drainage, des seringues, des cathéters, des pacemakers, des prothèses dans les supports de stockage des lentilles de contact ou sur les verres de contact eux-mêmes, dans les systèmes de distribution d’eau et sur les murs des hôpitaux (Jouenne, 2008). Les bactéries les plus fréquemment rencontrées font partie de la flore commensale de l’organisme et sont organisées en biofilms (Costerton et al., 1999). 14 CHAPITRE II Le biofilm dans le domaine médical PARTIE I Synthèse bibliographique II.1 Biofilms et santé publique Les infections liées au biofilm sont devenues un vrai problème de santé publique de par leur fréquence, leur diagnostic difficile et surtout la résistance aux antibiotiques des bactéries impliquées. Elles sont, de plus, associées à une morbi-mortalité élevée, le biofilm est relevant dans un nombre important de situations de colonisation. ils sont à l’origine d’infections chroniques et d’infections contractées en milieu hospitalier, le plus souvent en rapport avec le port de prothèses médicales, on parle donc d’infections nosocomiales. Les biofilms posent de sérieux problèmes, comme nous le verrons avec des exemples (Duez, 2012). 2. Infections liées à la présence de biofilm Le « Center for Disease Control » (CDC) estime que 65% des infections nosocomiales (IN) seraient liées au biofilm, pour le « United States National Institute of Health » (NIH), 80% des infections chroniques seraient causées par des bactéries constituant un biofilm (Rhoads, et al., 2008 ; Rhoads, 2007). Les biofilms sont responsables d’infections présentant des caractéristiques communes à savoir une apparition retardée des symptômes (délai lié au développement du biofilm), un caractère chronique et une tendance à la récidive (Costerton et al., 1999). Un large spectre d’espèces bactériennes peut être à l’origine de ces infections. Ces bactéries peuvent être pathogènes ou opportunistes (Stoodley et al., 2009). 15 PARTIE I Synthèse bibliographique Tableau 02 : Liste non exhaustive des infections humaines impliquant le biofilm (Costerton et al., 1999) Infection or disease Dental caries Periodontitis Otitis media Musculoskeletal infections Necrotizing fasciitis Biliary tract infection Osteomyelitis Bacterial prostatitis Native valve endocarditis Cystic fibrosis pneumonia Meloidosis Nosocomial infection : Icu pneumonia Sutures Exit sites Arteriovenous shunts Schleral buckles Contact lens Uninary catheter cystitis Peritoneal dialyses (capd) peritonitis Iuds Endotracheal tubes Hickman catheters Central venous catheters Mechanical heart valves Vascular grafts Biliary stent blockage Orthopedic devices Penile prostheses COMMON BIOFILM BACTERIAL SPECIES Acidogenic Gram-positif Cocci(e.g,Streptococcus) Gram-negative anaerobic oral bacteria Nontypable strains of Haemophilus influenzae Gram-positive Cocci (e.g, Staphylococcus) Group A streptococci Enteric bacteria (e.g,Escherichia coli) Various bacterial and fungal species—often mixed E.coli and other Gram-negative bacteria Viridans group streptococci P.aeruginosa and Burkholderia cepacia Pseudomonas pseudomallei Gram-negative rods Staphylococcus epidermidis and S.aureus S.epidermidis and S.aureus S.epidermidis and S.aureus Gram-positive Cocci P.aeruginosa and Gram-positive cocci E.coli and other Gram-negative rods A variety of bacteria and fungi Actinomyces israelii and many others A variety of bacteria fungi S.epidermidis and C.albicans S.epidermidis and others S.epidermidis and S.aureus Gram-positive cocci A variety of enteric bacteria and fungi S.epidermidis and S.aureus S.epidermidis and S.aureus 3. Facteurs favorisant le développement d’infections dues à des biofilms La formation d’un biofilm est un phénomène complexe, sous l’influence de nombreux facteurs : caractéristiques du substrat sur lequel les bactéries vont se fixer, forces s’exerçant dans le milieu aqueux (hydrodynamique du fluide), caractéristiques du milieu et propriétés de la surface des cellules (Donlan, 2002). 16 PARTIE I Synthèse bibliographique 3.1 Facteurs liés à la surface N’importe quel matériau en contact avec un fluide contenant des bactéries est un support potentiel pour la formation d’un biofilm. La rugosité, Plus une surface est rugueuse, plus la colonisation de cette surface par des microcolonies est importante (Characklis, 1990). Les surfaces rugueuses sont colonisées de façon préférentielle car les forces répulsives sont moindres et la surface de fixation est augmentée, grâce à la présence d’aspérités (Donlan, 2002). Les micro-organismes se fixent plus facilement à des surfaces hydrophobes et non polarisées comme le Téflon ou d’autres matières plastiques, que sur des matériaux hydrophiles comme le verre ou les métaux. La présence de polymères sur un matériau modifie les propriétés physico-chimiques de sa surface, et a une influence directe sur l’attachement de bactéries à cette dernière. En effet, la présence préalable sur un biomatériau d’un film protéique comme le sang, les larmes, l’urine, la salive, le liquide interstitiel et les sécrétions respiratoires influence l’attachement de bactéries à sa surface, et favorise la formation de biofilms (Mittelman, 1996). La nature de ces films protéiques est différente selon les milieux. Prenons l’exemple des bactéries formant le biofilm de la plaque dentaire. Elles se fixent sur un film protéique, présent à la surface de l’émail dentaire et composé d’albumine, de lysosymes, de glycoprotéines, de phosphoprotéines et de lipides (Donlan, 2002). La présence de films protéiques sur des implants médicaux en contact direct avec un fluide favorisent la formation de biofilms. Par exemple, les cathéters veineux centraux, en contact direct avec le sang, sont recouverts de plaquettes, de plasma et de protéines: albumine, fibrinogène, fibronectine, laminine (Goller, 2008) 3.2 Facteurs liés à l’environnement La formation et la dispersion d’un biofilm nécessitent des équipements enzymatiques précis et des entités structurales particulières, dont l’activation dépend de facteurs environnementaux clefs. On peut citer les facteurs suivants : température, Ph, concentration en oxygène, concentration en fer, osmolarité, présence d’ions spécifiques, sources de carbone (Goller, 2008 ; O’Toole, 2000 ; Donlan, 2002 ; Martinez, 2007 ; Fletcher, 1988). Des bonnes conditions nutritives sont nécessaires aux étapes de formation du biofilm, alors que les phases de développement tardif sont possibles dans des conditions nutritives moins bonnes. Ainsi, le type de biofilm dépend des conditions nutritives, ce qui suggère une facilité de remodelage des biofilms (Clutterbuck, 2007). 17 PARTIE I Synthèse bibliographique 3.3 Facteurs liés aux cellules constituant le biofilm La plupart des bactéries sont chargées négativement et présentent à leur surface des zones hydrophobes. Plusieurs éléments structuraux des bactéries interviennent dans leur attachement à une surface : flagelles, fimbriae (Donlan, 2002). Les protéines de surface BAP (Biofilm Associated Proteins) ou LAP (Loosely Attached Proteins) ou WAP (Wall Associated Proteins) (Duez, 2012). 4. Biofilm et surfaces en milieu hospitalier Les surfaces inertes à l’hôpital constituent-elles des réservoirs microbiens susceptibles de contaminer les personnes hospitalisées directement ou indirectement par l’intermédiaire des dispositifs médicaux ou des mains du personnel (Talon, 1999 ; Lemmen et al., 2001). La biocontamination des surfaces participe probablement à la survenue de certaines infections nosocomiales (Hota, 2004). Ce risque dépend du micro-organisme et de sa survie sur une surface inerte, il n’est pas identique partout dans l’hôpital et dépend de l’usage qui est fait des locaux (Dettenkofer et al., 2004). Ce mode de transmission, même s’il est difficile à mettre en évidence est vraisemblablement une voie de contamination pour les espèces qui résistent à la dessiccation comme les staphylocoques, les entérocoques ou Acinetobacter baumannii (Kramer et al., 2006). Les surfaces sont contaminées soit par contact, soit par sédimentation des microorganismes présents dans l'air. La répartition de cette contamination des surfaces se fait le plus souvent de manière hétérogène. L'adhérence des bactéries est possible selon l'état de la surface. Cette adhérence peut s'accompagner de la création d'un biofilm (Carpentier et Cerfo, 1993). Du fait de conditions de croissance défavorables, certaines bactéries peuvent se miniaturiser (bactéries naines) (Montfort et Baleux, 1999). Et sont alors difficiles à mettre en évidence dans les prélèvements (bactéries viables et non cultivables). D’autres bactéries peuvent prendre une forme sporulée Clostridium difficile (Fekety, 1981). La chaîne épidémiologique de transmission d'agents infectieux est caractérisée par un réservoir émetteur et un réservoir récepteur reliés par un mode de transmission (Pelmont, 1993) 18 PARTIE I Synthèse bibliographique Figure 06 : Chaine épidémiologique de transmission d’agents infectieux. (Vale et al., 2006). 5. Pathogénie et micro-organismes impliques L'environnement hospitalier (l'air, l'eau et aux surfaces sols, murs, mobilier, équipement, est colonisé par de nombreux micro-organismes qui constituent parfois de véritables niches écologiques. Ces différents types de micro-organismes peuvent appartenir aussi bien aux espèces opportunistes (peu ou pas pathogènes) qu’aux espèces strictement pathogènes. La flore saprophyte est composée de Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus non aureus, Pseudomonas et divers bacilles à Gram négatif, levures et champignons contaminants. La flore commensale est composée de germes d'origine humaine comme par exemple Enterococcus, les entérobactéries ou encore Staphylococcus aureus. Certains germes pathogènes peuvent aussi contaminer l'environnement à partir d'un réservoir humain comme les salmonelles, Clostridium difficile, etc. De plus, l'hôpital est un réservoir de germes ayant acquis un caractère propre à l'hôpital, en particulier de résistance aux antibiotiques : Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline, entérobactéries sécrétrices de bétalactamase à spectre élargi, Enteroccocus résistant à la vancomycine ou encore Pseudomonas aeruginosa résistant à la ceftazidime. L'environnement immédiat des patients porteurs est en général fortement contaminé par ces micro-organismes (Boycej et al., 1995 ; Grattard et Pozzetto,1999). 6. Résistance du Biofilm contre les agents antimicrobiens Pour prévenir les infections nosocomiales et assurer l’hygiène des surfaces en milieu hospitalier, l’utilisation de traitements nettoyant/désinfectant efficaces est essentielle. Si l’élimination des cellules à l’état planctonique semble satisfaisante, elle est moindre et non normalisée dans le cas des cellules sous forme de biofilm. Ces différences d’efficacité 19 PARTIE I Synthèse bibliographique peuvent s’expliquer entre autres par les méthodes utilisées pour évaluer l’effet antibactérien des détergents/désinfectants et des désinfectants. En effet, dans beaucoup de cas les essais antibactériens sont réalisés sur des bactéries en suspension ou des bactéries déposées et séchées sur des supports et non sur un véritable biofilm. Or, dans les écosystèmes naturels, les bactéries se retrouvent la plupart du temps sous forme de biofilm. Sous cet état physiologique les bactéries présentent des modifications des propriétés de surface, de morphologie, de potentiel de biosynthèse dont la production importante d’exopolysaccharides (glycocalix) qui jouent un rôle protecteur contre les substances antibactériennes contenues dans les produits chimiques et rendent donc leur action plus difficile ( Chihib et al., 2012). 7. Biofilm et système immunitaire La capacité des bactéries sessiles à résister à la réponse immunitaire de l’hôte favorise le développement d’infections persistantes. (Hall-Stoodley et al., 2009). Même chez les individus immunocompétents, les infections liées au biofilm sont rarement résolues par les mécanismes de défense de l’hôte. (Costerton et al., 1999). Les mécanismes de résistance aux défenses immunitaires sont mal connus et incluraient (Leid ,2009) : -Une pénétration limitée des cellules phagocytaires au sein des biofilms et la diffusion médiocre de leurs molécules bactéricides, bien que certaines études aient prouvé que les polynucléaires neutrophiles (PNN) soient capables de pénétrer dans cette structure (Leid et al.,2002) - Le blocage de l’accès des anticorps aux bactéries du biofilm ; ces germes peuvent via des déterminants antigéniques stimuler la synthèse d’anticorps spécifiques mais ces derniers sont incapables d’accéder à leur cible. - Le rôle du QS dans la mise en place d’un programme de résistance aux phagocytes et à leurs effecteurs bactéricides. - L’inhibition des propriétés bactéricides des effecteurs des PNN par des molécules concentrées dans la MEC du biofilm. - La diminution de la capacité de phagocytose des cellules de l’immunité recrutées par les composants du biofilm. De même, la réponse phagocytaire étant dépendante de la taille, de la composition et de la densité des particules in situ, elle peut être inhibée en présence de débris prothétiques (polyéthylène, ciment…) et de production importante de cobalt (cas des prothèses avec une interface métal-métal) (Bernard, 2006).On parle de « frustrated phagocytosis » (Costerton et al., 1999). 20 PARTIE I Synthèse bibliographique - Un « Switch génétique » permettant d’augmenter la résistance bactérienne. - Les cellules phagocytaires libèrent des enzymes ayant peu d’effet sur le biofilm ; cependant, ces enzymes associées aux complexes immuns formés par les anticorps sont responsables de lésions tissulaires et de la libération de bactéries sous forme planctonique assurant la dissémination de l’infection vers un tissu voisin ou à distance. Ce phénomène, s’il persiste, peut aboutir au descellement de l’implant (KHOURY et al., 1992). Figure 07 : Présentation schématique de la réponse immunitaire lors d’une infection liée au biofilm. (Costerton et al., 1999). 8. Mécanisme de résistance du biofilm Les bactéries vivant au sein du biofilm sont moins sensibles aux antibiotiques et désinfectants que leurs homologues planctoniques (Bridier et al., 2011 ; Simoes, 2011). Les concentrations d’antibiotiques nécessaires pour inhiber les bactéries au sein d’un biofilm peuvent être 10 à 1000 fois plus élevées que celles utilisées pour inhiber les mêmes bactéries à l’état planctonique (Simoes, 2011). Ainsi, le traitement antibiotique est généralement efficace contre les bactéries planctoniques libérées du biofilm mais ne permet pas l’élimination complète du biofilm. Ce phénomène est un élément clé de la persistance des infections chroniques liées aux biofilms, créant un sérieux problème de Santé publique. Plusieurs mécanismes sont impliqués : 8.1 Le défaut de pénétration de l’antibiotique Le premier mécanisme de résistance est lié au défaut de pénétration des agents antimicrobiens dans les profondeurs du biofilm. Les multiples couches de cellules et les exopolysaccharides constituent une structure complexe et compacte que les antibiotiques et désinfectants ont du mal à traverser (Bridier et al., 2011). Dans le cas des petites molécules, 21 PARTIE I Synthèse bibliographique cette barrière permet uniquement de ralentir le passage (Lewis, 2001). Pour les molécules chargées positivement comme les aminosides, la diffusion pourrait être limitée par leur liaison aux exopolysaccharides de la matrice qui sont chargés négativement (Fux et al., 2005; Lewis, 2001). De plus, le retard de pénétration des molécules peut aussi favoriser l’activité inhibitrice des enzymes produites par les bactéries comme les β-lactamases (Fux et al., 2005; Lewis, 2001). Une diminution significative de la pénétration de β-lactamines, des glycopeptides et des aminosides a été rapportée mais de tels résultats n’ont pas été toujours retrouvés ; certains antibiotiques comme les fluoroquinolones, les tétracyclines, la fosfomycine ou la rifampicine semblent parfois bien pénétrer dans les biofilms (Del Pozo et Patel, 2007; Rodriguez et al., 2007; Singh et al., 2010; Stewart, 2002; Tenke et al., 2006; Zheng et Stewart, 2002). Ainsi, d’autres mécanismes de résistance doivent intervenir. 8.2 La croissance ralentie des bactéries Il existe un gradient de sensibilité aux antibiotiques de haut en bas du biofilm (Fux et al., 2005). En effet, les bactéries au sein du biofilm ont un métabolisme hétérogène : celles en surface ont un meilleur accès à l’oxygène et aux nutriments, elles synthétisent plus de protéines et ont une croissance plus active que les bactéries situées en profondeur du biofilm (Bridier et al., 2011). Ces dernières ont un métabolisme ralenti et un taux de croissance faible ou nul, elles sont dites en dormance. Or, les antibiotiques sont plus efficaces sur les bactéries en division. De plus, le manque d’oxygène en profondeur du biofilm réduit l’activité antimicrobienne des aminosides (Del Pozo et Patel, 2007). 8.3 La réponse des bactéries à un stress Dans un biofilm, les bactéries subissent des adaptations phénotypiques pouvant mener à une augmentation de la résistance aux agents antimicrobiens. Ces modifications résultent de l’expression de gènes spécifiques en réponse aux conditions environnementales. Par exemple, les bactéries au sein d’un biofilm peuvent augmenter leur capacité d’expression de leur β-lactamase chromosomique suite à une exposition prolongée aux β-lactamines (Del Pozo et Patel, 2007). Un autre exemple concerne les entérobactéries synthétisant un facteur sigma RpoS, sous la dépendance du régulon RpoS, en réponse à différents stress. Ce facteur a un rôle régulateur clé dans la survie bactérienne et dans la résistance généralisée à différents stress. Les biofilms à E.coli ayant une délétion du gène RpoS ont une densité plus faible (Adams et McLean, 1999; Collet et al., 2008). Les modifications phénotypiques peuvent aussi toucher les cibles habituelles des bactéries planctoniques, comme la paroi bactérienne, diminuant ainsi l’efficacité des antibiotiques (Tenke et al., 2006). 22 PARTIE I Synthèse bibliographique Par ailleurs, l’induction de l’expression de gènes codant pour les pompes d’efflux, systèmes permettant aux bactéries d’éliminer des molécules toxiques, pourrait être un autre mécanisme expliquant la résistance aux agents antimicrobiens mais leur impact n’a pas encore été clairement défini (Bridier et al., 2011). 8.4 La persistance de bactéries Une dose croissante d’antibiotique entraine une décroissance initiale du nombre de bactéries vivantes dans un biofilm, jusqu’à un seuil au-delà duquel l’augmentation des doses n’augmente plus le nombre de bactéries tuées, car une population de bactéries persiste quelle que soit la dose administrée (Lewis, 2001). Ce taux de bactéries persistantes serait plus important dans les biofilms que chez les bactéries planctoniques (Stewart, 2002), notamment en profondeur du biofilm (Del Pozo et Patel, 2007). Figure 08 : Trois hypothèses concernant les mécanismes de résistance aux antibiotiques des biofilms. (Stewart et al., 2001). 23 CHAPITRE III Moyens de lutte contre les biofilms PARTIE I Synthèse bibliographique III.1 La lutte contre les biofilms dans le secteur médical Le biofilm pose de graves problèmes de santé publique et un impact économique important. Il est nécessaire de développer des moyens de lutte efficaces. La lutte contre le biofilm se définit selon deux axes principaux : empêcher sa formation puis, lorsqu’il est présent, l’éliminer. 1.1 Empêcher la formation de biofilm Quelques principes fondamentaux sont indispensables à la prévention des infections sur matériel liées aux biofilms et empêcher sa formation sur les surfaces . Il faut limiter l’utilisation des dispositifs médicaux au strict nécessaire, les garder en place le moins longtemps possible, les poser dans des conditions strictes d’hygiène, cependant ces règles ne sont pas suffisantes et de nombreuses recherches sont consacrées à la lutte contre la formation des biofilms. Les idées principales sont les suivantes : 1.1.1 Les dispositifs imprégnés de substances hydrophiles L’adhérence bactérienne dépend fortement des propriétés physicochimiques des matériaux constituants les dispositifs médicaux implantés, notamment leur hydrophobicité et les charges présentes à leur surface. Les dispositifs médicaux constitués de polymères hydrophiles à leur surface permettent de limiter l’adhérence des bactéries (Francolini et Donelli, 2010). 1.1.2 Les dispositifs imprégnés d’argent ou de substances antimicrobiennes L’argent limiterait l’attachement et la croissance des bactéries (Zhang et al., 2011). Des analyses ont montré que ces systèmes seraient efficaces pour prévenir les bactériuries lors des sondages de courte durée. Le nitrofurane aurait les même propriétés (Muzzi-Bjornson et Macera, 2011; Trautner et Darouiche, 2004b). L’argent a également montré son efficacité dans la prévention de la formation de biofilm pour les dispositifs intravasculaires mis en place moins de 10 jours (Donlan et Costerton, 2002). Des sondes urinaires recouvertes d’antiseptique ont également été testées : la formation de biofilm serait moins importante sur des sondes urinaires recouvertes de Gendine, un antiseptique constitué de violet de gentiane et de chlorhexidine, que sur des sondes urinaires en hydrogel imprégnées d’argent et sur des sondes urinaires non recouvertes d’agent antimicrobien (Hachem et al., 2009). Les cathéters intravasculaires imprégnés de chlorhexidine et d’argent mis en place pendant moins de 14 jours ont montré une réduction du risque d’infection d’environ 40 %, mais des cas de réaction anaphylactique ont été retrouvés avec ce type de cathéter (Trautner et Darouiche, 2004). 24 PARTIE I Synthèse bibliographique 1.1.3 Les agents chélateurs Certains cations métalliques comme le calcium, le magnésium ou le fer peuvent être impliqués dans le développement et le maintien de la structure de la matrice du biofilm. Les agents chélateurs déstabiliseraient la structure du biofilm. De plus, certains agents chélateurs comme l’EDTA (Ethylène Diamine Tétra acétique Acide) ou le citrate de sodium possèdent également une activité antimicrobienne. Des études ont été menées avec la lactoferrine, un agent chélateur du fer, dans le cadre des infections urinaires sur sonde mais de tels dispositifs n’ont pas encore été développés (Donlan, 2011). 1.1.4 L’éthanol Pour les cathéters intravasculaires, l’utilisation de « verrou antimicrobien » à base d’éthanol permettrait de limiter les infections liées à ces cathéters. La combinaison de 4 % de citrate de sodium et de 30 % d’éthanol préviendrait la formation de biofilm par des souches cliniques de E. coli pendant 72 heures (Donlan,2011). 1.2 Elimination des biofilms Une fois le biofilm formé, il est très difficile de l’éliminer. Dans le cadre des infections associées à un dispositif invasif, la réussite du traitement est très souvent conditionnée par l’ablation du dispositif. Cependant, l’antibiothérapie à long terme est nécessaire lorsque le dispositif ne peut être retiré. Des alternatives sont en cours de recherche. 1.2.1 L’antibiothérapie Les biofilms sont caractérisés par une résistance aux antibiotiques élevée. Les antibiotiques sont surtout efficaces pour ralentir la progression de la formation de biofilm en éliminant les bactéries planctoniques libérées et en limitant l’activité métabolique des bactéries en surface (Tenke et al., 2006). Les molécules qui pénètrent bien dans le biofilm telles que les fluoroquinolones et la rifampicine sont plus efficaces (Donlan, 2011). Une étude a également montré que l’association amoxicilline-acide clavulanique pénètre bien dans le biofilm (50 % de la concentration initiale après 1 heure d’incubation, 60 à 70 % après 6 heures), de même que la fosfomycine et la ciprofloxacine mais plus lentement. Le cotrimoxazole a en revanche une pénétration beaucoup plus réduite (Rodriguez-Martinez et al. 2007). D’autre part, les antibiotiques qui inhibent la synthèse de la paroi bactérienne, comme les glycopeptides, sont peu efficaces sur l’élimination des biofilms car de nombreuses bactéries ont un taux de croissance ralentie. Les macrolides ont montré leur efficacité dans la réduction des exopolysaccharides du biofilm : ils favorisent alors la pénétration des autres antibiotiques (Donlan, 2011). De nouvelles molécules comme le ceftobiprole, une 25 PARTIE I Synthèse bibliographique céphalosporine de 4ème génération, sont à l’étude (Simoes, 2011). Cependant, l’antibiothérapie reste trop peu souvent efficace et ne doit pas remplacer le retrait du dispositif lorsque cela est possible (Donlan, 2011). 1.2.2 Cibler la matrice exopolysaccharidique : La matrice exopolysaccharidique est essentielle pour la survie du biofilm. Les substances capables de dépolymériser, dissoudre ou d’empêcher la synthèse de cette matrice vont permettre l’exposition des micro-organismes du biofilm aux agents antimicrobiens (Del Pozo et Patel, 2007). En règle générale, la matrice est composée de polysaccharides et de protéines associés à des lipides et des acides nucléiques, mais cette composition est variable, qualitativement et quantitativement, en fonction des souches et des conditions de croissance. Par exemple, la cellulose est un composant crucial dans la matrice extracellulaire de E. coli, et le poly-N-acétylglucosamine est le composant majoritaire des biofilms à Staphyloques. En fonction de la composition des biofilms, différentes enzymes sont utilisables comme les protéases, cellulases, polysaccharide dépolymérases, alginate lyases, dispersin B ou DNAse (Bridier et al., 2011). Les biofilms étant souvent constitués de plusieurs espèces, des formulations contenant plusieurs enzymes semblent fondamentales pour une stratégie de contrôle efficace (Simoes, 2011). Certains bactériophages peuvent aussi produire des enzymes comme la polysaccharide dépolymérase qui peuvent dégrader la matrice des biofilms (Donlan, 2011). 1.2.3 Cibler les bactéries persistantes Le développement de substances capables de détruire la population bactérienne persistante en profondeur du biofilm pourrait être une nouvelle approche thérapeutique. Les gènes responsables de ce phénotype persistant pourraient également servir de cible. Ces inhibiteurs de bactéries persistantes seraient combinés à un traitement antimicrobien conventionnel pour tenter d’éradiquer les biofilms (Del Pozo et Patel, 2007). 1.2.4 Inhiber le quorum sensing Pour de nombreuses espèces, le quorum sensing joue un rôle significatif dans la persistance du biofilm. L’utilisation de molécules interférant avec les voies de signalisation du quorum sensing perturberait l’architecture du biofilm et ainsi l’établissement du processus infectieux. Les furanones sont des inhibiteurs potentiels du quorum sensing chez les bacilles à Gram négatifs (Francolini et Donelli, 2010). Une étude a testé l’effet d’inhibiteurs du quorum sensing sur des biofilms à P. aeruginosa et S. aureus formés in vivo et in vitro. Associé à un traitement antibiotique, ces inhibiteurs pourraient améliorer la sensibilité des bactéries au sein des biofilms à cet antibiotique (Brackman et al., 2011). 26 PARTIE I Synthèse bibliographique 1.3 Axes de recherche actuels sur les biofilms Plusieurs recherches portent sur la mise au point de procédés physiques: champs électriques ou magnétiques pulsés, UV, laser, ultrasons, lumière pulsée, ionisation, plasmas non thermiques…. ou chimiques: emploi de désinfectants comme l’eau oxygénée, l’eau de javel, le chlorure de benzalkonium, l’acide peracétique (PAA), mais ces traitements entraînent aussi l’apparition de résistance chez certains microorganismes s’ils ne sont pas appliquées pendant des temps bien plus longs que pour éliminer des cellules planctoniques. Une conclusion s’impose : un seul de ces moyens arrive rarement à bout du problème. Un traitement antibiotique, là aussi, un seul antibiotique arrive rarement à bout d’un biofilm. L’action combinée de deux antibiotiques est souvent nécessaire pour éradiquer un biofilm en raison des différences de métabolisme entre les sous-populations bactériennes, différences générées par la position des bactéries dans l’épaisseur du biofilm. 1.3.1 Les extraits de plantes au secours des cliniciens De nombreuses molécules d’origine végétale (contenues en particulier dans les huiles essentielles) permettent un contrôle du développement bactérien en biofilm. C’est le cas avec : - l’extrait d’ail - le carvacrol, un terpène naturel extrait du thym et de l’origan - le casbane diterpène du Croton nepetaefolius - la thymoquinone de la graine de Nigella sativa - Des huiles essentielles (eucalyptus, théier...) - L’α-terpinéol, - Des dérivés naphtalènes Employées en synergie avec des antibiotiques, ces molécules augmentent l’efficacité de ces derniers comme cela a été montré in vitro sur des biofilms de Pseudomonas aeruginosa traités à la tobramycine. 1.3.2 La lutte biologique contre les biofilms Certaines bactéries flagellées péritriches (du genre Bacillus par ex.) sont à même de creuser la matrice d’un biofilm, facilitant ainsi l’accès de molécules antibiotiques à la base du biofilm ou d’enzymes dégradant la paroi bactérienne (par ex : la lysostaphine, une endopeptidase spécifique de la paroi de S. aureus). Des cellules nageuses de Bacillus (B.licheniformis, B.subtilis, B.thuringiensis) sont capables de former des pores dans un biofilm de S.aureus, E.faecalis, Yersinia enterolitica, 27 PARTIE I Synthèse bibliographique P.aeruginosa ou Listeria monocutogenes. L’infiltration de ces bactéries à la base du biofilm sensibilise les cellules aux antimicrobiens et aux enzymes lytiques. (A.Houry et al.2012) Figure 09 : Perforation du biofilm par des bactéries (Houry et al., 2012) 1.3.3. Le retour de la phagothérapie Dans les années 1920-1930 plusieurs microbiologistes se sont intéressés au pouvoir lytique des bactériophages (virus se répliquant en grand nombre dans une bactérie qui finit par lyser) pour soigner des épidémies. L’apparition des antibiotiques dans les années 40 a supplanté l’utilisation de phages sauf à l’Est du rideau de Fer. En effet, contrairement aux phages dont la spécificité est assez étroite, les antibiotiques, du moins dans un premier temps, permettaient de traiter des espèces bactériennes de genres très différents. L’émergence de nombreuses résistances aux antibiotiques remet à l’honneur la phagothérapie et en particulier les caudovirus (photo ci-dessus) pour lutter ou compléter d’autres modes d’action contre les biofilms. Un bactériophage adopte soit un cycle de vie lysogénique (s’intégrant dans le chromosome de la bactérie hôte et étant répliqué en même temps que ce dernier) soit un cycle lytique au cours duquel de très nombreuses particules de virions seront formées, encapsidées et libérées de la cellule hôte dont la paroi sera détruite. La lysogénie du phage ne présente pas d’intérêt pour la thérapie et constitue même un risque de transmission de marqueurs acquis dans des bactéries résistantes aux antibiotiques. Tout comme il est intéressant de combiner des moyens physiques ou chimiques avec des antibiotiques pour venir à bout d’un biofilm installé, la combinaison d’un phage et d’un antibiotique permet à ce dernier d’atteindre sa cible. En effet, de nombreux phages codent pour des glycanases qui s’attaquent à la matrice polysaccharidique, réduisent son épaisseur et permet la progression à la fois du phage et de l’antibiotique vers l’intérieur du biofilm (Duez, 2012) 28 PARTIE II Travail Expérimental PARTIE II Travail Expérimental 1. Matériel 1.1 Souches bactériennes La totalité des 25 souches, objet de notre travail, a été isolée entre le 15 mars et 30 avril et à partir des différents services du CHU de Mohamed Boudiaf-Ouargla « Réanimation et Hémodialyse ». 1.2 Milieux de culture 1.2.1 Milieux de culture liquides Bouillon cœur cervelle (BHIB) (Merck) Bouillon nutritif (BN) (Fluka) 1.2.2 Milieux de culture solides Gélose Chapman (Merck) Gélose nutritive (Fluka) Mueller Hinton (Fluka) Gélose au sang 1.3 Tests biochimiques Eau oxygénée à 10 volumes ; Milieu de Citrate de Simmons ; Milieu Clark et Lobs ; Milieu TSI ; Milieu King A et King B; Milieu Mannitol mobilité ; Bouillon Cœur-cervelle 1.4 Réactifs -Eau physiologique stérile ; -Violet de Gentiane ; -Lugol ; -Alcool 90° ; -Fuchsine ; -Réactif de Kovac ; -Urée-Indole ; -Eau distillée ; -Rouge de méthyl ; -VP I, VP II ; -Huile de paraffine ; 29 PARTIE II Travail Expérimental -Eau physiologique stérile. 2. Méthode 2. 1 Origine de prélèvement Notre stage s’est déroulé, en période discontinues, du 15 mars 2015 au 30 avril 2015, les prélèvements ont été effectués à l’hôpital, au niveau des deux services : Service hémodialyse : il comprend : Nombre de salle 06 : -bureau du médecin chef -les vestiaires -la salle d’attente des patients -la salle d’épuration d’eau -Deux salles de dialyse : -Une salle d’urgence avec un seul lit -Une grande salle mixte comprenant 6 lits - Grand hall qui porte 8 lits Nombre de lits 15 Service de réanimation : il comprend Nombre de salle 07 : -la cuisine -les vestiaires séparés hommes-femmes -bureau du médecin chef -sanitaires hommes et femmes -bureau de chef de service -bureau de secrétariat -les chambres des patients : -Huit Chambres : -six chambres individuelles (total 6 lits) -deux grandes chambres dont chacune comprennent 3 lits. Nombre de lits 12 30 PARTIE II Travail Expérimental 2.2 Prélèvements Les prélèvements de surfaces telles que (appareils et objets, sol, mur …) sont effectués à l’aide d’un écouvillon stérile humidifié à l’eau distillée stérile et on a fait passer l’écouvillon en stries parallèles rapprochées, en faisant tourner légèrement l’écouvillon mouillé. On répète l’échantillonnage de la même zone par des stries perpendiculaires aux premières. Sans oublié de noter nos échantillons. Celui-ci est acheminé rapidement (moins de 2 heures) au laboratoire dans son étui de protection stérile pour être déchargé successivement sur la surface des milieux utilisés dans notre étude. 2.3 Isolement et purification A proximité du bec bunsen, on utilise la méthode de l’écouvillonnage c’est-à-dire ensemencé avec l’écouvillon directement dans les trois milieux (Chapman, Gélose au sang, Hektoen). Ensuite incubé les boites à 37° pendant 24H à 48H. Afin de confirmer la pureté des souches, nous avons effectué des repiquages successifs en alternant milieu liquide et milieu gélosé sélectif. 2.4 Identification L’identification comporte une série d’étape, se succédant le plus souvent dans un ordre déterminé ; les souches isolées ont été identifiées par des techniques microbiologiques standards. Les résultats obtenus au cours de chaque étape permettent l’orientation des démarches ultérieures. 3 Test d’identification : a) Réalisation de la coloration de Gram : 1-Mettre une goutte d’eau distillée sur une lame, puis choisir et prendre une colonie bien isolée dans la boite pétrie et l’étalée sur la lame . 2-Fixation par la chaleur : la lame est passée sur le bec bunsen jusqu’au séchage de l’eau distillée. Pour l’identification des germes, la coloration des Gram est l’étape clé dans notre travail, cette étape de l’examen directe est essentiel pour apprécier la présence et a morphologie des germes et permet de classer les bactéries en deux grandes catégories : -Les bactéries « Gram positif » : qui gardent leur coloration violette après décoloration par l’alcool. 31 PARTIE II Travail Expérimental -Les bactéries « Gram négatif » : qui décolorées par alcool, sont teintées par la fuchsine et apparaissent roses. b) Identification par galerie biochimique classique : Cette méthode comporte une série d’étapes, se succédant le plus souvent dans un ordre déterminé : les résultats obtenus au cours de chaque étape permettent l’orientation des démarches ultérieures. -Caractères culturaux sur les milieux d’isolement usuels. -Etude de la respiration. Recherche du type respiratoire : -On utilise le milieu gélose viande-foie qu’on régénère pendant 30 minutes au bain Marie. -Après refroidissement à 40°C, on ensemence les tubes par piqûre centrale à l’aide d’une -pipette Pasteur et l’on remonte par des stries circulaires : -Une croissance sur toute la hauteur du tube les bactéries aéro-anaérobies -Une croissance en haut du tube pour les bactéries aérobies strictes. Recherche de la catalase : La catalase (Ferro porphyrine de poids moléculaire élevé) à la propriété de décomposer l’eau oxygénée avec dégagement d’oxygène. C’est l’action directe de l’enzyme qui est mise en évidence dans la masse bactérienne. On prend une goutte d’eau oxygénée (H2O2) à 10 volumes qu’on dépose sur une lame avec une colonie bien distincte de culture jeune de 24H, le dégagement immédiat de bulles d’oxygène exprime la présence d’une catalase. H2O2 H2O + ½ O2 Recherche de l’oxydase : Le test d’oxydase est l’étape clé dans cette identification et cela afin de différencier deux grands groupes de bactéries : les Entérobactéries et les Pseudomonas. L’oxydase des autochromes assure la fixation de l’oxygène moléculaire sur les cytochromes réduits, ainsi : -Si le test est positif, il y’a apparition d’une coloration violette au niveau du disque qui est due à la formation d’indophénol. Ce résultat nous oriente vers la famille des Pseudomonadaceae. -Si le test est négatif, cela nous oriente vers les entérobactéries. 32 PARTIE II Travail Expérimental Recherche de la Coagulase : -Coagulase libre C’est une protéine qui prouve qu’il y a coagulation du plasma humain, elle n’est sécrétée que par les staphylocoques pathogènes (S.aureus), La détection de cette coagulase s’effectue en ajoutant dans un tube à hémolyse 0,5 ml de plasma humain et 0,5 ml d’une culture de staphylocoques de 24h, le mélange est incubé à 37° pendant 4 à 24h. Un test positif se traduit par la formation d’n coagulum. -Coagulation liée C’est une coagulase insoluble appelée clumping factorielle se lie au fibrinogène, elle est mise en évidence sur lame par contact de la souche avec des hématies de mouton. Un résultat positif se manifeste par l’apparition d’une agglutination 5 à 20 secondes plus tard. La production de pigments : Inoculer un tube de milieu King A et un autre de King B en faisant un strie médiane à la surface de la gélose avec une culture prise dans un bouillon ou d’une gélose, puis incuber à 30°C pendant 1 à 4 jours. -Le milieu King A Permet de mettre en évidence la pyocyanine produite par le Pseudomonas aeruginosa (qui colore le milieu de culture en bleu et vert). -Le milieu King B Permet de mettre en évidence le pyoverdine produite par le bacille pyocyanique et autres Pseudomonas (qui colorent le milieu de culture en vert fluorescent). Test du citrate de Simmons : L’utilisation du citrate comme seule source de carbone est mise en évidence par la réalisation d’n ensemencement en surface sur le milieu citrate de Simmons. Après incubation pendent 1 à 5 jours, une réaction positive se traduit par une alcalinisation du milieu en le faisant virer au bleu. Test mannitol mobilité : Le test permet de tester d’une part la dégradation du mannitol et d’autre part la mobilité de la souche. Le milieu mannitol-mobilité contient le rouge de phénol comme indicateur coloré de pH, l’ensemencement est réalisé par piqûre centrale. La dégradation du mannitol se traduit par une acidification du milieu qui fait virer l’indicateur de pH au jaune, ce changement de couleur permet également de localiser les bactéries dans le tube et de ce fait évaluer indirectement leur pouvoir d’envahissement et par conséquent leur mobilité. 33 PARTIE II Travail Expérimental Recherche des produits de fermentation du glucose : Le milieu utilisé est le milieu Clarke et Lobs, on ensemence 5 ml de ce milieu avec le germe à étudier. Incuber à 37°C pendant 24h puis additionner les réactifs de Vosages Proskauer. -Si la souche étudiée produit de l’acétone, la présence de ce métabolisme se manifeste par l’apparition d’une coloration rose en surface, pouvant diffuser dans le milieu. Test des trois sucres à identifier : (Milieu TSI) On réalise un ensemencement par stries sur la pente et par piqûre centrale dans le culot. Le milieu permet de tester avec ou sans production de gaz, l’utilisation du glucose, saccharose et lactose par le virage du rouge de phénol au jaune et la production d’H2S par la souche qui se traduit par un dépôt noire de fer, la lecture se fait au bout de 24h d’incubation à 37°C. Recherche de la production d’indole : Ajouter quelques gouttes du réactif de Kovacs, après 24h, à une suspension dense en milieu urée-indole. La présence d’indole révèle la dégradation du tryptophane se traduisant par l’apparition d’un anneau rouge en surface. Recherche de l’uréase et du tryptophane désaminase : A partir d’une culture pure, on ensemence une colonie sur le milieu urée-indole, puis on incube à 37°C pendant 18h. La présence de l’uréase se traduit par une alcalinisation du milieu d’où une coloration rose-rouge. La désamination du tryptophane se manifeste par une coloration brune après l’adjonction de perchlorure de fer. 34 PARTIE II Travail Expérimental Résultats et discussion 1. Résultat : On a réalisé 16 Prélèvements, 9 dans le service d’hémodialyse, 7 dans le service de réanimation : sol, lavabo, appareil de dialyse Tableau 03 : Répartition des germes selon le Gram. Souche Gram + Gram Totale Nombre des souches 13/25 12/25 25 Pourcentage 52% 48% 100% Gram + 13/25 48% Gram - 12/25 52% Figure 10 : Répartition des germes selon le Gram On signale la prédominance des bactéries à Gram positif avec un taux des (52%) par rapport aux bactéries Gram positif (48%). Tableau 04 : Répartition des prélèvements effectués dans le service de Réanimation Lit Nombre Nombre des Pourcentage % de souches Gram(-) Gram (+) souches Gram(-) Gram(+) 04 01 03 12.5% 37.5% Chariot 02 00 02 00.00% 25% Tablier Total 02 08 01 02 01 06 12.5% 25% Nature de prélèvement Surface Site de prélèvement 35 12.5% 75% PARTIE II Travail Expérimental Tableau 05 : Répartition des prélèvements effectués dans le service d’hémodialyse Nature de prélèvement Surface Site de prélèvement Nombre Nombre des des souches souches Gram(-) Gram(+) Mur Armoire Lavabo Chariot Appareil Total 02 05 03 05 02 17 01 02 02 02 02 09 01 03 01 03 00 08 Pourcentage % Gram(-) Gram (+) 5.88% 11.76% 11.76% 11.76% 11.76% 52.92% 5.88% 17.64% 5.88% 17.64% 00.00% 47.04% 2. Discussions Du 15 mars 2015 au 30 avril 2015, un total de 16 prélèvements a été effectué dans les services : d’hémodialyse et de réanimation, à l’hôpital Mohamed Boudiaf-Ouargla et cela en période d’aménagement, touchant différentes surfaces : sol, mur, lavabo, armoire, chariot, appareil de dialyse, lit et blouse afin d’avoir une appréciation générale de l’écologie hospitalière propre à chaque service concernée par notre étude Les résultats de l’isolement place les Staphylocoques en tête des germes qui colonisent l’environnement hospitalier plus précisément les SCN. A la différence de S.aureus, S.epidermidis peut adhérer à des polymères inertes sans interaction intermédiaire avec des molécules de l’hôte (Maira-Litran et al., 2002) ce qui peut expliquer la prédominance. Mettre vos résultats Une molécule de polysaccharide capsulaire, appelé polysaccharide adhésine, semble influer sur l’attachement à la surface nue. Lorsque la surface est recouverte d’une couche de protéines, S.epidermidis interagit avec lui grâce à des molécules de surface différentes (Vuong et al., 2000). À la lecture de nos résultats nous constatons que les bacilles à Gram positif (Bacillus sp) sont présents dans la majorité des prélèvements et par conséquent leur présence pourrait constituer un marqueur d’efficacité de la technique pour mettre en évidence les bactéries à partir des surfaces. En effet, ces bactéries omniprésentes dans notre environnement semblent être peu accessibles au bionettoyage, probablement par leur capacité à sporuler, et seront donc quasi constamment retrouvées dans l’environnement. La mise en évidence des Staphylocoques issues des flores cutanées humaines constitue par leur présence un bon reflet de l’activité humaine dans les locaux. 36 PARTIE II Travail Expérimental Notre étude montre l’importance d’effectuer des prélèvements bactériologiques, ils ont un intérêt pédagogique indéniable pour faire prendre conscience de la contamination bactérienne ou fongique des surfaces. Ils permettent de rechercher un réservoir microbien à l’origine de cas groupés d’infection ou d’épidémie, même s’il est souvent difficile de conclure quant au rôle de l’environnement dans la genèse de l’infection. Enfin, les prélèvements microbiens des surfaces peuvent permettre d’évaluer l’impact de nouvelles mesures de nettoyage, de désinfection ou d’hygiène des mains par exemple (CDC, 2003) 37 CONCLUSION Conclusion Ce travail nous a permis de montrer que sur un totale de 16 prélèvements effectués dans les services de réanimation et d’hémodialyse du CHU de Ouargla, 13 étaient positifs. Ces résultats nous permettent d’évaluer et d’approcher la définition de critère de qualité d’un service de soins. La surveillance de la qualité d’hygiène et d’asepsie de l’environnement hospitalier reste un objectif prioritaire des services à grand risque afin de croitre la crédibilité de la structure hospitalière et de diminuer les infections nosocomiales. Après analyse bactériologiques des différents prélèvements réalisés, 13 souches de Staphylocoques ont été isolées, suivi de Nessiria sp et des bacilles Gram +. Il est nécessaire de poursuivre les recherches pour élucider la nature et la physiologie des microbes sur les surfaces de l'hôpital, en particulier la prévalence et la composition des biofilms qui informera sur de nouvelles approches pour le nettoyage et la désinfection de l'hôpital, y compris les surfaces nouvelles qui réduisent la fixation microbienne et améliorent le détachement microbien, et les méthodes pour augmenter l'activité des biocides contre les microbes attachés aux surfaces tels que les bactériophages et des peptides antimicrobiens. Une observation rigoureuse des règles d’hygiène et d’aseptise, le facteur décisif est le personnel de l’hôpital, l’infection n’est pas maîtrisée par de folle dépenses ni par un liquide magique ; mais elle peut l’être par les personnes qui mettent en œuvres une méthode, impliquant connaissance, habilitée application, patience, effort et attention opiniâtre aux détails de l’hygiène hospitalière. 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J.Bacteriol., 46:39-56 ANNEXES ANNEXE I Composition des milieux utilisés Sérum physiologique Chlorure de Sodium Eau distillée qsp 9g 1000 ml Milieu de croissance et d’isolement : Bouillon nutritif : en g/l (Glossaire des milieux ,2002) Peptone Extrait de bœuf Eau distillée 5,0g 3,0g 1.0l pH : 6.8 Gélose Chapman : en g/l (glossaire des milieux ; 2002) Peptone Extrait de viande Mannitol NaCI Agar Rouge de phénol 11 1 10 75 15 0,025 pH : 7.4 Gélose au sang : et à l’azide de sodium (Marchal,1982) Poly peptone Extrait de viande de bœuf Chlorure de sodium Azide de sodium Gélose 10 3 5 0,2 15 pH : 7.2 Gélose Mc Conkey : (en g/L) (Marchal, Bourdon, Richard, 1982) Peptone caséine Peptone de viande Lactose Sels biliaires NaCl Rouge neutre Cristal violet Agar pH : 7.1 17 3 10 1,5 5 0,03 0,001 13,5 ANNEXE I Milieux urée — indole : (diagnostics pasteur, 1987) Le milieu est utilisé pour l'identification de l'activité uréasique. Tryptophane Phosphate mono potassique Phosphate dipotassique Chlorure de sodium Urée Alcool à 5% Rouge de phénol Eau distillée qsp 3g 1g 1g 5g 20g 10ml 2,5ml 1000ml Le milieu est commercialisé par l'institut Pasteur d'Alger. Gélose viande - foie en (g/I) : (Marchal, 1982) Base viande — foie Glucose Agar pH: 7.4-7.6 Milieu de King A : 30 2 6 (Marchal, 1982) Peptone de gélatine 20 Glycérol 10 Sulfate de potassium anhydre 10 Chlorure de magnésium anhydre 1,4 Gélose (Agar) 15 pH: 7.2 Milieu de King B : (Marchal, 1982) Proteose peptone n°3 Polypeptone (BBL) 20 Glycerol 10 Phosphate bi potassique anhydre 1.5 Sulfate de magnésium (7 H20) 1.5 Gélose (Agar) 15 pH : 7.2 Gélose au citrate de simmons en (g/I) : (Glossaire des milieux, 2002) Chlorure de sodium 5,0g Sulfate de magnésium (Mg S04, 7 H2O) 0,2g Phosphate d'ammonium (NH4, H2PO4) 1,0g Phosphate dipotassique (K2, HPO4) 1,0g Citrate de Sodium (Na3C6 H5 07, 2H20) 2,0g Bleu de bromothymol 0,8g Gélose 15,0g Eau distillée 1,0lg pH : 6,8 ±0,2 ANNEXE I Milieu mannitol - mobilité en (g/I) : (Marchal, 1982) Peptone trypsique de viande Agar Mannitol KNO3 Gouge de phénol à 1% 20g 4g 2g 1g 4ml pH : 7,6 - 7,8 Bouillon de Môller en (g/I) : (Marchal, 1982) Peptone papsique de viande Extrait de viande Bromocresol pourpre Ronge de crésol Glucose Pyridoxal pH : 6 5 5 0,01 0,005 0,5 0,005 Milieu de Clark et lubs : Peptone trypsique ou polypeptone Glucose Phosphate bi potassique pH : 7 5à7 5 5 Gélose glucose - lactose - saccharose — H2S: (Marchal, 1982) Ou gélose aux trois sucres et au fer, ou TSI Extrait de viande de bœuf Extrait de levure Peptone Chlorure de sodium Citrate terrique Thiosulfate de sodium Lactose Glucose Saccharose Rouge de phénol Agar pH : 7.4 3g 3g 20g 5g 0.3g 0.3g 10g 1g 10g 0.05g 12g Gélose nutritive (en g/1) (glossaire des milieux 2002) Peptone 5.0 g Extrait de bœuf 3.0 g Gélose 15.0 g Eau distillée 1.0 l pH : 6,8 ±0,2 ANNEXE II Résultats de l'identification des micro-organismes dans le service de Réanimation et Hémodialyse CHU d’Ouargla : Tableau 06 : Résultat de l'identification des 13 souches de Staphylococcus isolées à partir des surfaces Souche Tests Coagulase Réanimation S1 - S2 - S3 - S4 - Hémodialyse S5 - S6 - S7 - libre S8 S9 S10 - - - Catalase Fermentation du mannitol + + + + + + + + + + + - + + + + - + + + Tableau 07 : Souche et leur indice Souches Indice de la souche S1 Armoire Hémo Rp4 S2 Chariot Hémo Rp5 G S3 Chariot Hémo Rp5 P S4 Mur Hémo S5 Chariot Réa G S6 Chariot Réa P S7 Lit 03 Réa S8 Lit 03 Réa Rp2 S9 Tablier Réa Rp4 S10 Lit 05 Réa ANNEXE II Tableau 08 : sites de prélèvements dans les services d’hémodialyse et de réanimation Hémodialyse service site de prélèvement résultat de la culture nombre des souches Lavabo culture polymicrobienne 3 Armoire culture polymicrobienne 5 Chariot culture polymicrobienne 5 Appareil de dialyse culture polymicrobienne culture stérile 2 culture polymicrobienne 2 Mur Mur culture stérile culture polymicrobienne / 2 Plateau culture polymicrobienne 3 + Champignon Radiographie culture polymicrobienne Lavabo Lit n°03 culture stérile culture polymicrobienne culture polymicrobienne culture polymicrobienne 3 + Champignon / 2 Sol avant le nettoyage Sol après le nettoyage Réanimation Tablier Chariot / 2 5 + Champignon Lit n°05 culture polymicrobienne 2 Sol Culture polymicrobienne 2 + Champignon ANNEXE III Photos réalisées Photo 01 : Aspect des colonies des Staphylococcus sur milieu Chapman. Photo 02 : Aspect des colonies de Staphylococcus sur milieu gélose au sang. ANNEXE III Photo 03 : Aspect des colonies de Bacillus Sp sur milieu gélose au sang ANNEXE III Photo 04 : Coloration de Gram (objectif x100) Photo 05 : production de catalase par Cocci Gram positif Photo 06 : Observation du test coagulase libr Résumé : Pendant longtemps les bactéries ont été étudiées sous forme planctonique en culture liquide en tant que cellules libres, alors que paradoxalement dans la nature la majorité d’entre elles se trouvent sous forme du biofilm. Les biofilms sont retrouvés dans l’environnement hospitalier et colonisant le matériel médical, les surfaces humides, sèches au niveau des matelas, du sol des blouses …... La lutte contre cette forme de vie est difficile, car les bactéries organisées de cette façon résistent aux antibiotiques et aux antiseptiques classiques. Une des clefs de cette redoutable caractéristique tient aux systèmes de communication utilisés par les micro- organismes des biofilms. Les bactériologistes mettent peu à peu au jour les mécanismes moléculaires de ces biofilms, et comprennent comment, de l'organisation elle-même, naît la résistance des micro-organismes. Avec ces mécanismes élucidés, ils pourront concevoir des substances, à usage thérapeutique ou industriel, qui interféreront avec les signaux de transmission et limiteront les dégâts dus à ces biofilms. Mots clé : biofilm, agent infectieux, environnement hospitalier, surface, contamination, désinfection. :ملخص يف حني أن املفارقة يف طبيعة الغالبية مهنم يف،لفرتة طويةل اكنت دراسة البكترياي يف شلك العوالق يف وسط زراعي سائل كخالاي احلرة ... املزئر، والرتبة، والسطح اجلافة يف الفراش، والرطب، مت العثور عىل الغش ية احليوية يف بيئة املستشفى وتس تعمر املعدات الطبية.شلك بيوفيمل . لن البكترياي اليت نظمت يف هذه الطريقة يه مقاومة للمضادات احليوية واملطهرات التقليدية،ماكحفة هذا الشلك من أشاكل احلياة صعب علامء املكروبيولوجيا يقومون.ومن السامت الرئيس ية لهذا هائل حتمل أنظمة االتصاالت اليت تس تخدهما الاكئنات احلية ادلقيقة من الغش ية احليوية وبفضل هذه الآليات. تودل مقاومة الاكئنات ادلقيقة، وفهم كيف من تنظميها اذلايت،تدرجييا ابلكشف عن الآليات اجلزيئية لهذه الغش ية احليوية ميكهنا أن تطور موادا لالس تخدام العاليج أو الصناعي اليت من شناها أن تتدالل م ارسال اشارات واحلد من الرضار النامجة عن مثل هذه،املوحضة .الغش ية احليوية التطهري، وتلوث السطح، بيئة املستشفى، وكيل املعدية، بيوفيمل:اللكمة املفتاحية Abstract: For a long time the bacteria were studied in planktonic form in liquid culture as free cells, while paradoxically in nature the majority of them are in the form of biofilm. Biofilms are found in the hospital environment and colonizing medical equipment, wet, dry surfaces at the mattress, soil, gowns... The fight against this form of life is difficult because the bacteria organized in this way are resistant to antibiotics and conventional antiseptics. A key feature of this formidable holds the communications systems used by microorganisms of biofilms. Bacteriologists are gradually uncover the molecular mechanisms of these biofilms, and understand how the organization itself, born the resistance of microorganisms. These mechanisms elucidated, they can develop substances for therapeutic or industrial use that will interfere with the transmission of signals and limit the damage from such biofilms. 29 Keyword : biofilm, infectious agent, hospital environment, surface contamination, disinfection.
