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54 BIOFUTUR 320 • AVRIL 2011
transgéniques, ont ainsi passé avec succès les premiers
tests cliniques. C’est le cas de l’antithrombine III,
premier produit de ce type approuvé par l’Agence
européenne des médicaments en 2006 et la Food and
Drug Administration (FDA) américaine en 2009.
L es végétaux ne sont pas en reste. Depuis 1989 et la
première production expérimentale d’un anticorps
fonctionnel par une plante transgénique, plusieurs
centaines de publications scientifiques et une centaine
de familles de brevets concernent des composés
biopharmaceutiques produits par ce procédé dit de
« molecular farming »
(1,3) . Une douzaine de biomé-
dicaments sont aujourd’hui en phase clinique d’essais
et trois ont déjà reçu une autorisation de mise sur le
marché (AMM) pour une administration à l’homme
(tableau p. 60) . La maîtrise de la transgenèse végétale
a non seulement permis d’obtenir et de commercialiser,
à partir de 1996, des plantes agricoles tolérantes à
un herbicide et/ou résistantes à des insectes ravageurs,
mais elle a également offert une alternative à la
production de biomédicaments.
Diversité des systèmes de production
D e nombreux médicaments recombinants (anticorps,
vaccins, hormones...) ont été produits dans des plantes
transgéniques et stockés plus particulièrement dans
certains organes végétaux comme les graines (maïs,
riz...) ou les feuilles (tabac, luzerne…)
(figure ci-contre) .
En outre, les plantes offrent de nombreux comparti-
ments cellulaires de stockage des molécules recombi-
nantes, depuis leur système endomembranaire de
sécrétion (vacuoles, réticulum endoplasmique) jusqu’à
leur cytosol ou leurs chloroplastes. À l’instar de la
graine ou de la feuille, ces compartiments de la cellule
végétale représentent des systèmes d’expression
distincts, où la stabilité et les maturations post-
traductionnelles de la protéine d’intérêt s’expriment
différemment. Si certaines plantes transgéniques pro-
ductrices de médicaments sont cultivées en plein champ,
D
ès le début des années 1980, des protéines d’intérêt
thérapeutique difficiles à isoler ou trop complexes
pour être synthétisées sont produites en grande
quantité et dans des conditions parfaitement
contrôlées grâce à des organismes génétiquement modi-
fiés (OGM) : bactéries, levures ou cellules animales.
Le génie génétique révolutionne et enrichit rapidement
les méthodes de recherche et de production des médi-
caments. Ce n’est qu’en 1989, avec la production d’un
anticorps fonctionnel dans des plantes de tabac, que
les plantes génétiquement modifiées (PGM) entrent
dans la liste des OGM producteurs de biomédicaments
recombinants
(1) .
L es OGM classiquement utilisés permettent la pro-
duction de molécules thérapeutiques plus ou moins
complexes. La synthèse des composés les plus simples,
comme l’insuline destinée au traitement du diabète de
type I, est ainsi confiée à des bactéries ou à des levures
transgéniques. En revanche, des molécules plus
complexes, comme les anticorps, qui nécessitent pour
leur activité thérapeutique de nombreuses étapes de
maturation post-traductionnelle, sont produites le plus
souvent dans des cellules de mammifères comme les
cellules ovariennes de hamster chinois (CHO).
C es systèmes de bioproduction sont toutefois coûteux
pour l’industrie pharmaceutique et mal adaptés à la
croissance rapide de la demande en nouveaux bio-
médicaments. En particulier, les besoins en anticorps
recombinants destinés à l’immunothérapie des cancers
augmentent très rapidement et pourraient dépasser
prochainement la capacité de production des installa-
tions disposant de grands volumes de cellules de mam-
mifères cultivées en bioréacteurs. D’où l’intérêt de
l’industrie pharmaceutique pour de nouveaux systèmes
de production de biomédicaments, comme les plantes
ou les animaux transgéniques. De nombreuses pro-
téines thérapeutiques ont notamment été produites
chez des animaux transgéniques producteurs de lait,
ce dernier pouvant être une source industrielle de pro-
téines biologiquement actives
(2) . Plusieurs biomédi-
caments, produits dans le lait de chèvres ou de brebis
Produire rapidement et en quantité quasi-illimitée des médicaments en utilisant les plantes est
aujourd’hui possible. Le « molecular farming » permet désormais la synthèse de protéines
thérapeutiques moins chères et parfois plus efficaces que celles issues d’autres systèmes de
bioproduction couramment utilisés par l’industrie pharmaceutique.
Soigner par les plantes
(1) Hiatt A et al. (1989)
Nature 342, 76-8
(2) Houdebine L-M
(2006) Biofutur 264, 32-7
(3) Faye L, Gomord V
(2010) Plant Biotechnol J 8,
525-8
Bioproduction
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BIOFUTUR 320 • AVRIL 2011 55
Loïc Faye
ANGANY Genetics, Seine Biopolis, 70, route de Lyons, 76000 Rouen
[email protected]
la culture en serre et celle de cellules végétales en
fermenteur permettent de contrôler l’environnement
et la reproductibilité des conditions de production.
Graines…
L es plantes stockent naturellement des molécules de
réserve dans leurs graines. Utiliser ce système naturel
pour accumuler des protéines à forte valeur ajoutée
offre l’avantage d’une grande stabilité et d’une forte
concentration du produit cible. Des entreprises de
biotechnologie l’ont bien compris et produisent des
biomédicaments dans les graines de plantes trans-
géniques. La société américaine Ventria Biosciences,
par exemple, a développé la production de lacto-
ferrine (glycoprotéine bactéricide) et de lysozyme
humains dans la graine de riz (dans une zone sans
riziculture alimentaire). Un facteur de croissance et
des cytokines humaines sont également produits
dans l’orge, sous serres, par la société islandaise
ORF Genetics. Citons encore le facteur intrinsèque
*1
humain recombinant produit par l’entreprise danoise
Cobento Biotech dans des graines d’Arabidopsis
thaliana.
L a production dans les graines est particulièrement
compétitive pour des applications qui nécessitent de
grandes quantités de biomédicaments. C’est ce qui a
poussé la société canadienne SemBioSys à développer
un procédé de production d’une insuline humaine
recombinante dans les graines de carthame
*2 . Même
avec des taux d’expression relativement faibles, trois
entreprises agricoles utilisant un tel système de
production végétale pourraient couvrir à elles seules
la demande globale en insuline. Ce type de production
est en effet très rentable puisque 100 hectares de
cultures suffisent à produire 200 à 400 kg de protéine.
A utre avantage de la production de biomédicaments
dans les graines, la possibilité de séparer les phases de
production, d’extraction et de purification en raison
des capacités naturelles de stockage et de conservation
des graines. Un anticorps peut ainsi rester stable
pendant trois ans dans des graines de maïs stockées
à température ambiante
(4) .
*1Ou facteur de Castle.
Glycoprotéine stoma-
cale indispensable à
l’absorption de la vita-
mine B12 (cobalamine)
impliquée dans la
production des
neuromédiateurs.
*2Famille de plantes
méditerranéennes
proches du chardon
(4) Baez J et al. (2000)
BioPharm 3, 50-4
Production de biomédicaments après transformation génétique
Après clonage d’un ADN
complémentaire (ADNc) codant
la protéine thérapeutique (ici
un anticorps), cet ADNc est sous-
cloné dans un vecteur d’expres-
sion. Celui-ci sert à la transforma-
tion de la bactérie Agrobacterium
tumefaciens . Lors de la coculture
de l’agrobactérie transformée avec
des fragments de tissus végétaux,
l’ADNc est transféré dans le
génome de cellules végétales qui
seront multipliées sur un milieu de
culture (photo). Ces cellules sont
utilisées directement pour
la production du biomédicament
dans des fermenteurs. Elles
permettent également de régénérer
des plantes transgéniques
cultivées pour la production
de biomédicaments dans leurs
graines ou leurs feuilles. Six à huit
mois sont nécessaires pour la
production d’un biomédicament
suivant ces stratégies.
© ANGANY GENETICS
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Bioproduction
pour la production de biomédicaments dans des condi-
tions optimales de confinement des produits. Ceci
fut d’abord illustré par Dow AgroSciences, qui pro-
duit dans des cellules de tabac un vaccin protégeant
les volailles contre le virus de la maladie de Newcastle
*3 ,
approuvé par la FDA en janvier 2006. L’agence amé-
ricaine est également en passe de donner son accord
pour l’utilisation d’une glucocérébrosidase humaine
produite dans des cellules de carottes par la société
israélienne Protalix Biotherapeutics et destinée à
l’enzymothérapie substitutive des patients atteints de
la maladie de Gaucher de type I
(5) . Ce biomédicament,
produit par Pfizer et connu sous le nom de UPLYSO,
a obtenu une Autorisation temporaire d’utilisation
*4
en France en juillet 2010.
O utre l’aspect purement scientifique, c’est le faible coût
de ces systèmes d’expression végétaux qui les rend
avantageux. La glucocérébrosidase de Protalix est un
exemple des économies pour les systèmes de santé que
représente l’utilisation de biomédicaments produits chez
les plantes. Alors que le coût de Cerezyme, le même
traitement produit dans des cellules CHO par l’améri-
caine Genzyme, peut atteindre 200 000 euros par an
(coût de traitement par patient), UPLYSO coûte de
100 000 à 150 000 euros par an.
Produire plus et plus vite
L ’adoption des PGM pour la production de biomé-
dicaments a jusqu’ici été limitée en raison des faibles
rendements observés pour la majorité des protéines
thérapeutiques. Limitation levée par l’utilisation récente
de l’« expression transitoire » de gènes d’intérêt dans
des plantes qui permet d’atteindre des rendements très
élevés, de l’ordre de 25 à 50 % des protéines solubles.
Les plantes en question ne sont pas des PGM : le gène
ne s’intègre pas au génome des cellules dans lesquelles
il est introduit, il est simplement exprimé à partir d’un
vecteur – un virus spécialement conçu à cet effet, par
exemple – le temps de synthétiser la protéine théra-
peutique
(6) . Il s’agit donc ici d’une transfection et non
d’une transgenèse.
L ’émergence récente de pandémies grippales, comme
celles qui ont incriminé les virus H5N1 et H1N1, a mis
en avant un autre atout de l’expression transitoire :
la production en quantité de biomédicaments moins
d’une semaine après la transfection des plantes. Alors
que plusieurs mois ont été nécessaires pour produire
un vaccin par les systèmes traditionnels, la société cana-
dienne Medicago a injecté à des souris un vaccin confé-
rant une forte réaction immunitaire spécifique contre
le virus H1N1 seulement un mois après la publication
de la séquence du génome de celui-ci. Ce vaccin est pro-
duit par expression transitoire du tabac, sous la forme
de pseudoparticules virales
*5(7) . Ces résultats, et le
passage du candidat vaccin en phase II de tests cli-
niques, illustrent le potentiel de l’expression transitoire
pour la production de vaccins dans un contexte pan-
démique ou d’attaque bioterroriste.
D ’autres applications de cette technique sont en cours
*3Ou pseudo-peste
aviaire. Zoonose virale
proche de la grippe
aviaire.
*4En France, l’ATU permet
la mise à disposition
précoce d’un médica-
ment avant l’obtention
de l’AMM. Elle est
accordée dans des
situations prévues par
la loi, en particulier
pour le traitement de
maladies rares et quand
il n’existe pas de traite-
ment approprié dispo-
nible sur le marché.
Contrairement à un
essai clinique, elle n’a
pas pour objectif
d’apporter une réponse
sur l’efficacité du
médicament.
*5Particules mimant la
structure originale d’un
virus mais dénuées de
matériel génétique viral,
donc non infectieuses
et incapables de se
multiplier.
56 BIOFUTUR 320 • AVRIL 2011
(5) Shaaltiel Y et al. (2007)
Plant Biotechnol J 5, 579-90
(6) Marillonnet A et al.
(2004) Proc Natl Acad Sci
USA 101, 6852-7
(7) Landry N et al. (2010)
PLOS ONE 5(12),
doi:10.1371/journal.pone.00
15559
Pour la production de petits lots de biomédicaments par la technique de l’expression transitoire,
les agrobactéries sont injectées manuellement (à gauche). Des disques foliaires prélevés 6 à 10
jours plus tard servent à analyser les différents prototypes de biomédicaments (à droite).
… feuilles…
L es systèmes de production foliaires sont également
très utilisés car ils permettent une production rapide
en très grand volume. Les feuilles de plantes trans-
géniques, principalement du tabac, ont permis de
produire avec succès de nombreuses molécules
thérapeutiques. Une douzaine est en phase d’essais
cliniques et deux ont reçu une AMM pour une admi-
nistration à l’homme
(tableau p. 60) . Dans les feuilles,
les molécules d’intérêt sont essentiellement produites
et stockées dans les chloroplastes et le système de sécré-
tion. La transformation du génome du chloroplaste
offre de très hauts rendements de production, le
biomédicament pouvant représenter jusqu’à 70 % des
protéines solubles de la feuille. Cependant, l’origine
bactérienne de ce compartiment cellulaire ne permet
d’y produire que des molécules thérapeutiques simples.
La maturation des protéines y est en effet moins efficace
que dans le système de sécrétion des cellules foliaires,
dont la machinerie enzymatique très voisine de celle
des cellules de mammifères permet la production de
protéines complexes, mais au détriment du rendement,
qui dépasse rarement 1 à 2 % des protéines contenues
dans un extrait foliaire. La société américaine Planet
Biotechnology produit ainsi une immunoglobuline A
(IgA) composée de dix polypeptides dans le système
de sécrétion de plants de tabac. Commercialisée pour
une utilisation chez l’homme sous le nom de CaroRX,
cette IgA sécrétoire est destinée au traitement de la
carie dentaire.
… et bioréacteurs végétaux
S i la majorité des protéines recombinantes à usage
pharmaceutique disponibles sont produites par des
cellules de mammifères ou des bactéries dans des
bioréacteurs, les cultures de cellules végétales sont
également utilisées depuis plusieurs décennies pour
produire des métabolites secondaires thérapeutiques,
anticancéreux comme le paclitaxel ou antibactériens
comme la shikonine. Ces cellules font désormais figure
d’alternative avantageuse aux cellules de mammifères
© ANGANY GENETICS
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de développement. La société rouennaise Angany
Genetics utilise par exemple l’expression transitoire
chez le tabac pour produire des allergènes recombi-
nants destinés à la désensibilisation par voie orale
de patients allergiques aux acariens. Bayer Innovation
utilise également l’expression transitoire chez le tabac
pour produire des vaccins individualisés destinés au
traitement des lymphomes non hodgkiniens. Medi-
cago au Canada, Kentucky Bioprocessing aux États-
Unis… Plusieurs sites de bioproduction arborant le
label GMP (Good Manufacturing Practices) et utili-
sant l’expression transitoire chez le tabac sont déjà
opérationnels sur le continent nord américain. Un
projet d’installation est également en cours d’étude en
France. Ces unités de production sont organisées
autour de serres présentant un très haut niveau de confi-
nement. Avec la construction d’unités de production
à faible coût dont la capacité de production dépasse
la centaine de millions de doses de vaccin par an,
l’expression transitoire chez les plantes pourrait faire
évoluer rapidement les choix de l’industrie pharma-
ceutique en faveur de l’utilisation des plantes pour la
production de médicaments.
(8) Cabanes-Macheteau M
et al. (1999) Glycobiology 9,
365-72
(9) Gomord V et al. (2004)
Plant Biotechnol J 2, 83-100
(10) Gomord V et al. (2010)
Plant Biotechnol J 8, 564-87
*6Biomédicament qui a
prouvé sa similarité en
termes de qualité, de
sécurité et d’efficacité
par rapport à un médi-
cament de référence.
BIOFUTUR 320 • AVRIL 2011 57
Production de biomédicaments par expression transitoire
Dans la production par expression transitoire, Agrobacterium
tumefaciens est utilisée pour le transfert d’un ADNc codant le
biomédicament, mais le gène d’intérêt n’est pas intégré dans
le génome de la cellule végétale. On parle ici de transfection
et non de transgenèse. L’agrobacterie est transférée dans le
tissu foliaire par agro-infiltration selon deux procédés.
Pour la production de petits lots de biomédicament destinés
au criblage de prototypes, les agrobactéries sont injectées
manuellement grâce à une seringue appliquée contre
l’épiderme de la face inférieure de la feuille. Des disques
foliaires prélevés dans les feuilles 6 à 10 jours après
l’agro-infiltration sont utilisés pour l’analyse des différents
prototypes de biomédicaments (photo p.56). Cette étape de
criblage permet de définir le vecteur d’expression qui sera
utilisé pour l’obtention d’un biomédicament de qualité
optimale. Le même procédé est utilisé pour la production à
grande échelle en condition GMP ( Good Manufacturing
Practices ). L’agro-infiltration s’effectue alors sous vide,
dans des enceintes contenant plusieurs litres d’une culture
d’agrobactéries et où plusieurs dizaines de plantes sont
infiltrées simultanément. Ces plantes sont ensuite remises
en culture pendant 6 à 10 jours avant la purification du
biomédicament à partir des extraits foliaires.
Du biosimilaire au biobetter
L a machinerie de maturation des protéines des plantes
étant très voisine de celle des mammifères, on peut lui
faire produire des molécules complexes biologique-
ment actives et utilisables en thérapie. Toutefois, certains
mécanismes de maturation, en particulier la N-glyco-
sylation, ne sont pas exactement identiques d’un règne
à l’autre. Il a ainsi été montré, dix ans après la synthèse
du premier du genre dans un plant de tabac, qu’un anti-
corps produit dans une plante présente une glycosyla-
tion typiquement végétale, suffisante pour son activité
mais immunogène chez les mammifères
(8,9) . La
recherche s’est alors très activement penchée sur la
question, avec pour résultat majeur la production dans
plusieurs systèmes d’expression végétaux d’anticorps
à la glycosylation parfaitement humanisée
(10) . L’ingé-
nierie de la N-glycosylation, et plus globalement des
maturations protéiques, permet aujourd’hui d’utiliser
les plantes pour la production massive et à un faible
coût de médicaments biosimilaires
*6 . Parmi les exemples
notables, on peut citer le trastuzumab, un anticorps
monoclonal destiné au traitement du cancer du sein,
© ANGANY GENETICS
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Système végétal d'expression Produit Application/traitement Compagnie Essais cliniques
Tabac transgénique (feuille)
Guy's 13 SIgA (CaroRx)
(Anticorps)
Carie dentaire Planet Biotechnology Inc.
Phase II terminée. Approuvé
pour l'Union Européenne
RhinoRx (Anticorps)
Prophylaxie du rhinovirus Phase II
2G12 IgG (Anticorps) Prophylaxie du VIH Pharma-Planta consortium Phase I (début Q2 2009)
Culture cellulaire de carotte
transgénique
Glucocérébrosidase
(Enzyme thérapeutique)
Maladie de Gaucher
Protalix
Essais en phase III terminés en
sept 2009, ATU en juillet 2010
Acétylcholestérase (PRX6105)
(Enzyme thérapeutique) Défenses naturelles Phase I (mars 2010)
Pomme de terre transgénique
(tubercule)
Antigène de surface du virus
de l'hépatite B (Vaccin) Hépatite B Groupe du Pr Arntzen,
Arizona State University Phase I
Protéine de capside du virus
Norwalk (Vaccin) Gastroentérite virale
Nicotiana benthamiana
(transitoire, feuille)
Vaccins contre les grippes
pandémiques et saisonnières
(pseudo-particules virales)
Risques de transmission
de la grippe Medicago Inc. Phase I terminée (déc. 2009) Phase II Q4 2010
IgG personnalisées (Vaccin) Lymphomes
non-hodgkiniens Bayer Innovation Phase I (déc 2009)
Maïs transgénique (graine)
Lipase gastrique (Enzyme
thérapeutique)
Mucoviscidose, pancréatite
Meristem therapeutics
Phase II
Lactoferrine (Nutrition) Infections gastro-
intestinales infantiles Phase I
Lentille d’eau transgénique Interferon alpha-2b (Cytokine)
Hépatite C Biolex Therapeutics Phase III (2011)
Carthame transgénique (graine)
Insuline (SBS-1000)
(Protéine thérapeutique)
Diabète SemBioSys Phase I/II terminée Q1 2009
Arabidopsis thaliana transgénique
(graine)
Facteur intrinsèque humain
(Nutrition)
Déficience en vitamine B12 Cobento Biotech SA Phase II terminée. En vente dans
l'Union Européenne
Laitue transgénique (feuille) Antigène de surface du virus
de l'hépatite B (Vaccin) Hépatite B Thomas Jefferson University Polish NAS Phase I
Epinard (transitoire, feuille) Glycoprotéine du virus
de la rage (Vaccin) Rage Groupe du Pr Yusibov, Fraunhofer, USA Phase I
Bioproduction
58 BIOFUTUR 320 • AVRIL 2011
récemment produit par expression transitoire dans
le tabac
(11) . Cet anticorps présente la même structure
et une activité biologique similaire au trastuzumab
produit dans des cellules CHO et commercialisé par
l’industriel suisse Roche sous le nom d’Herceptin.
L es plus récents développements du molecular farming
démontrent que les systèmes végétaux peuvent
répondre à des demandes encore non satisfaites de
l’industrie pharmaceutique. Car non content d’offrir
la possibilité de produire des biosimilaires, le mole-
cular farming permet aussi celle de biomédicaments
plus efficaces, dits « biobetters » *7 . Les maturations
protéiques spécifiques des plantes peuvent être, dans
certains cas, un atout pour la production de biobetters,
comme en témoigne la glucocérébrosidase humaine
recombinante produite par Protalix Biotherapeutics.
Contrairement à celle de Genzyme, produite dans des
cellules CHO, elle ne nécessite aucun remodelage in
vitro de sa glycosylation pour être efficace dans le
traitement de la maladie de Gaucher. L’efficacité d’un
biomédicament peut également être optimisée par
l’ingénierie métabolique du système de production,
en particulier de sa machinerie de glycosylation, pour
mieux répondre aux demandes de l’industrie
pharmaceutique. La plateforme d’Angany Genetics
associe ainsi, d’une part, la rapidité et les rendements
importants permis par l’expression transitoire chez
le tabac et, d’autre part, des techniques d’ingé-
nierie métabolique qui optimisent la qualité et
l’efficacité thérapeutique des biomédicaments
recombinants
(12,13) .
Un avenir végétal
A près plus de vingt ans de mise au point, les plantes
productrices de biomédicaments constituent mainte-
nant une alternative pratique aux systèmes standard
d’expression utilisés, depuis plusieurs décennies, par
l’industrie pharmaceutique. De nombreuses plateformes
végétales de bioproduction sont d’ores et déjà dispo-
nibles. Elles permettent la production en masse et à
bas coût de médicaments dans les graines ou les feuilles
de plantes transgéniques et dans des cellules végétales
cultivées en fermenteur. Elles permettent encore, grâce
à l’expression transitoire, la production en quelques
jours d’un très grand nombre de doses de vaccin. De
très nombreuses molécules complexes couvrant une
large gamme d’effets thérapeutiques peuvent y être
synthétisées, dont certaines viennent de faire leur
entrée sur le marché ou seront commercialisées très
prochainement.
!
Remerciements : L’auteur bénéficie du soutien financier de la communauté européenne
dans le cadre du réseau Molecular Farming : COST Action FA0804. Les Dr A.-C. Fitchette
et V. Gomord sont vivement remerciées pour leur contribution à la préparation de cet
article et plus particulièrement V.G. pour la réalisation des illustrations.
(11) Grohs B et al. (2010)
J Agric Food Chem 58,
10056-63
(12) Vezina L et al. (2009)
Plant Biotechnol J 7, 442-5
(13) Brevet
WO2008/056265
«
A set of sequences for
targeting, expression and
control of post translational
modification of recombinant
polypeptides
». Licence
exclusive d’exploitation
L10287-ANGANY Genetics
*7Alors que le biosimilaire
est une imitation aussi
efficace que le médi-
cament original, le
«
biobetter » contient
des améliorations
moléculaires lui confé-
rant, par exemple, une
meilleure efficacité ou
une sécurité renforcée.
Biomédicaments et vaccins produits dans les plantes et ayant franchi avec succès le cap des essais précliniques
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