Génétique G É N É T I Q U E

G
É N É T I Q U E
Génétique
● F. Tesson*
Points forts
■ Des
méthodes alternatives permettant de déterminer
de façon exhaustive les gènes impliqués dans une
pathologie, que ces gènes soient déjà connus ou non,
sont developpées (banques d’EST, DNA chips) et déboucheront probablement sur une meilleure compréhension
de la physiopathologie des maladies cardiovasculaires.
■ Le gène de la lamine A/C, responsable de la myopathie
d’Emery-Dreifuss, qui est caractérisée par une myopathie à expression variable et des troubles de conduction
cardiaque évoluant vers une cardiomyopathie dilatée, a
été impliqué dans les cardiomyopathies dilatées, ce
qui met en lumière les difficultés de diagnostic dans
cette pathologie.
■ La
caractérisation fonctionnelle des mutations
(modèles animaux et cellulaires) et les études phénotype/génotype se poursuivent dans la cardiomyopathie hypertrophique. L’implication de l’actine cardiaque dans cette pathologie est confirmée.
■ Thérapie
génique : “We are not too far away from
being able to do something”, H.L. Sweeney.
MÉTHODES ALTERNATIVES DE DÉTERMINATION DES GÈNES
IMPLIQUÉS DANS LES MALADIES CARDIOVASCULAIRES
Syndrome
Phénotype
Gène causal
Génotype corrélé
Gène muté
Gènes candidats
Si l’on considère une maladie commune complexe, le développement de la maladie est dû à des changements quantitatifs induits
par les facteurs environnementaux et les facteurs génétiques. Pour
déterminer les gènes impliqués, C.C. Liew (Toronto) propose de
séquencer de façon exhaustive les ADN complémentaires issus
des ARN messagers exprimés dans les cellules et de réaliser ainsi
des banques d’EST (expressed sequenced tag). À l’heure actuelle,
il a été décrit, chez l’homme, 9 458 EST distinctes (B. Soares,
Iowa City), et, récemment, une initiative trans-NIH a entamé un
programme visant à obtenir les séquences in extenso de l’ensemble des ARN messagers humains. Cette stratégie permet à la
fois de mettre en évidence de nouveaux gènes et d’analyser l’expression des gènes dans une cellule donnée. Ainsi, C.C. Liew a
pu mettre en évidence 143 gènes impliqués dans l’insuffisance
cardiaque. Plus spécifiquement, 63 gènes semblent être d’excellents candidats dans l’hypertrophie cardiaque, en particulier les
gènes du génome mitochondrial, la bêta-cristalline, l’actine squelettique, le BNP, l’antigène CD 59 et la desmine, par exemple
(pour plus d’information : http://www.tcgu.med.utoronto.ca/).
Curieusement, assez peu de présentations faisaient référence à la
technique des DNA chips (Microarray), qui a pris récemment un
essor important. J. Bristow (San Francisco, 3362) a présenté l’application de cette technique à la recherche des gènes impliqués
dans l’hypertrophie cardiaque dans un modèle murin (hypertrophie induite par l’isoprotérénol). Les ADN complémentaires préparés à partir des ARN totaux extraits du VG ont été hybridés sur
une chip sur laquelle avaient été immobilisées 3 000 séquences
d’ADN. Les auteurs ont comparé les résultats d’hybridation obtenus à partir des ARM messagers extraits d’un VG normal et d’un
VG hypertrophié. Un résultat d’hybridation était considéré
comme significatif si une différence d’au moins 2 SD entre les
résultats obtenus chez l’animal témoin et l’animal traité était
observée. Cinquante et un clones ont ainsi pu être mis en évidence. Vingt-quatre montraient une augmentation et 27 une diminution. Seize étaient des EST impliquées dans le métabolisme
oxydatif, 14 des EST anonymes, 6 des facteurs de transcription,
5 des récepteurs... Pour confirmer l’implication de ces gènes dans
la réponse hypertrophique, 5 gènes candidats sont actuellement
analysés par surexpression chez la souris. J. Bristow estime qu’environ 50 % des gènes identifiés grâce à cette technique sont nouveaux (pour plus d’information : http://rubin.lbl.gov/).
Modèles expérimentaux
Animaux transgéniques
La médecine moléculaire (d’après C.C. Liew)
* Laboratoire de génétique, CHU Pitié-Salpêtrière, Paris.
La Lettre du Cardiologue - n° 323 - janvier 2000
NOUVELLES PERSPECTIVES POUR L’ÉTUDE DE LA GÉNÉTIQUE DES CARDIOMYOPATHIES DILATÉES
L’an passé (1552, Circulation 1998) et cette année (Paris, 2006
et 3255), D. Duboc et G. Bonne ont presenté, lors du congrès de
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l’AHA, une famille avec une maladie d’Emery-Dreifuss dans
laquelle, sur 17 individus malades, seuls 5 présentaient un phénotype Emery-Dreifuss complet (symptômes musculaires squelettiques, défaut de conduction cardiaque, arythmies ventriculaires évoluant vers une cardiomyopathie sévère). Les 12 autres
individus avaient exclusivement les manifestations cardiaques de
la maladie. Le gène responsable de cette pathologie a été identifié dans cette famille ainsi que dans d’autres familles présentant
une maladie d’Emery-Dreifuss de phénotype complet : il s’agit
du gène de la lamine A/C (situé en 1q11-23), un composant de la
lamina nucléaire situé sur la face interne de l’enveloppe nucléaire
(Bonne et coll. Nature Genet 1999 ; 21 : 285). Cette année,
C.E. Seidman (Boston) a présenté des mutations dans ce gène
comme responsables de formes de cardiomyopathies dilatées avec
troubles de conduction dans quatre grandes familles. Son équipe
avait mis en évidence, en 1994, la première localisation chromosomique relative à une cardiomyopathie survenant après un
défaut de conduction en 1p1-q1 (Kass et coll. Nature Genet 1994 ;
7 : 546). Lors de sa présentation, C.E. Seidman n’a pas mentionné
de recherche de symptômes musculaires. Ces résultats mettent
en lumière les difficultés de diagnostic chez les patients présentant une cardiomyopathie dilatée non pure. C.E. Seidman a reçu
cette année le “Basic Research Price” pour l’ensemble de ses travaux sur la génétique des cardiomyopathies.
Transmission
Autosomique
dominante
Phénotype associé
Locus
Gène
Forme pure
1q32
?
Forme pure
2q31
?
Forme pure
2q35
Desmine
Forme pure
9q13-22
?
Forme pure
15q14
Actine cardiaque
Défaut de conduction + arythmies
1p1-q1
?
Défaut de conduction + arythmies
2q14-22
?
Défaut de conduction + arythmies
3p22
?
Défaut de conduction + arythmies
6q23
?
10q21-23
?
?
?
Prolapsus valvulaire mitral
Autosomique récessive
Liée à l’X
Mitochondriale
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Au mois d’octobre 1999, un nouveau locus en 2q14-22 avait été
associé à des formes de cardiomyopathie dilatée avec troubles de
conduction accompagnés d’arythmies par une équipe de Berlin
(Jung et coll. Am J Hum Genet 1999 ; 65 : 1068). Cette localisation a été confirmée par une équipe américaine (D. Dreher, Chicago, 1121). Les résultats de lod score obtenus dans cette famille
permettent de réduire l’intervalle contenant le gène d’intérêt de
24 à 13 cM. Dans le cas des cardiomyopathies dilatées à transmission autosomique dominante, c’est la première fois qu’une
localisation chromosomique est confirmée par une équipe indépendante (si l’on excepte le gène de la lamine A/C).
Une nouvelle forme de cardiomyopathie dilatée familiale associée
à une surdité a été décrite dans deux familles (J. Schoenberger,
Boston, 3261). La perte d’audition débute avant la cardiomyopathie (première et deuxième décennies versus troisième et quatrième
décennies) et aucun individu ne présente uniquement les symptômes cardiaques. Les individus de ces familles peuvent donc être
identifiés comme à risque de développer une cardiomyopathie sur
la base de leur défaut auditif. Cette donnée est d’autant plus importante que 6 des 16 patients présentant une cardiomyopathie dilatée en sont décédés ; deux patients ont bénéficié d’une transplantation cardiaque et un patient est en attente de transplantation.
L’anomalie génétique à l’origine de la maladie est située en 6q2324, et le gène correspondant est en cours d’investigation.
?
Forme pure ± élévation des CPK
?
Xp21
Locus chromosomiques et gènes impliqués
dans les formes monogéniques de cardiomyopathies
dilatées (pour les formes non pures,
le phénotype associé est précisé).
Dystrophine
Génome mitochondrial
La Lettre du Cardiologue - n° 323 - janvier 2000
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(d’après L.A. Leiwand)
ciation apparente entre le degré d’hypertrophie et la sévérité de
la maladie, l’équipe de L.A. Leinwand et J.C. Tardiff (Boulder,
1006 et 2599) a créé une souris transgénique exprimant l’analogue de la mutation humaine R92Q de la troponine T à l’état
hétérozygote (les souris homozygotes pour la mutation meurent
8 heures après la naissance). De la même manière que chez les
patients présentant une cardiomyopathie hypertrophique, les
cœurs de ces souris présentent une hypercontractilité et une dysfonction diastolique. De plus, ces souris ont une intolérance à
l’effort, avec mort subite au cours des exercices, qui les désigne
comme d’excellents modèles d’étude des cardiomyopathies dilatées résultant de mutations dans la troponine T. De nombreux
autres modèles animaux ont été créés (alpha Tropomyosine/rat,
M.K. Spindler, Wuerzburg, 1399 ; Troponine I/souris, J. James,
Cincinnati, 1439, par exemple).
En ce qui concerne le gène de la protéine C cardiaque, les mutations associées conduisent potentiellement à une protéine tronquée du côté C terminal à laquelle il manque les domaines de liaison majeurs à la myosine et à la titine. J. Flavigny (Paris, 1007)
a analysé l’expression de différents mutants du gène de la protéine C cardiaque conduisant soit à la formation de protéines tronquées (trois constructions différentes), soit à la formation d’une
protéine dans laquelle un acide aminé a été substitué (E542Q).
Quelques cellules exprimant la protéine tronquée présentent une
incorporation dans la bande A du sarcomère (10 %), alors que,
dans la plupart des cellules, les auteurs observent une incorporation diffuse avec ou sans altération de l’organisation myofibrillaire. La protéine mutante (E542Q) s’incorpore dans la bande A
du sarcomère comme la protéine sauvage. Ces données suggèrent que le domaine C terminal de la protéine C cardiaque contient
un site de liaison à la myosine, qui serait responsable de l’incorporation des mutants dans la bande A. L’incorporation diffuse
serait due à l’instabilité de ces protéines, résultant de la faible
affinité du domaine C terminal pour la myosine. Cela suggère
que les mutants tronqués peuvent, au moins en partie, agir en tant
que polypeptides poisons sur l’architecture myofibrillaire.
Il semble cependant qu’il soit faux de schématiser, et que le pronostic dépende davantage de la mutation elle-même que du gène
impliqué. J.M. Langlard (Nantes, 4317) a fait état de la recherche
des mutations présentes dans 8 familles (204 individus). L’auteur
a trouvé quatre mutations dans le gène de la chaîne lourde de la
myosine bêta (Asn232Ser, Arg453Cys, Asn479Ser, Gly768Arg)
et deux dans le gène de la protéine C cardiaque (mutation dans
un site donneur d’épissage, exon 6 et DelC447, exon 15) [67 individus porteurs de mutations]. Les mutations dans le gène de la
chaîne lourde de la myosine bêta sont associées à une sévérité
variable, alors que les mutations dans le gène de la protéine C
cardiaque ont une pénétrance élevée et un meilleur pronostic. Il
est à noter que le pourcentage de porteurs sains est très élevé, quel
que soit le gène considéré : 43 % (23/54) pour les mutations dans
le gène de la chaîne lourde de la myosine bêta et 46 % (6/13) pour
le gène de la protéine C cardiaque.
Les patients présentant une mutation dans le gène de la troponine
T cardiaque expriment généralement une hypertrophie modérée,
voire nulle, mais montrent une fréquence élevée de morts subites.
Pour tenter de comprendre les bases moléculaires de cette disso-
En 1998, il avait été montré que des mutations faux sens dans le
gène de l’actine cardiaque étaient associées à la cardiomyopathie
dilatée (Olson et coll. Science 1998 ; 280 : 750). En 1999, Mogensen et coll. ont demontré que le gène de l’actine cardiaque était
également impliqué dans l’étiologie de la cardiomyopathie hypertrophique (J Clin Invest 1999 ; 103 : R39). Jusqu’à présent,
aucune autre étude n’a pu confirmer l’implication de l’actine cardiaque dans la cardiomyopathie dilatée. En revanche, quatre
autres mutations dans le gène de l’actine cardiaque ont été impliquées dans la cardiomyopathie hypertrophique (Pro164Ala et
Ala331Pro, T.M. Olson, Salt Lake City, 3256 ; Tyr168Cys et
Met305Leu, J. Mogensen, Aarhus, 3257). Ces mutations ont été
mises en évidence par criblage systématique (SSCP) de la
séquence codante du gène chez respectivement 372 et 220 patients.
Il est à noter que les mutations Pro164Ala et Ala331Pro n’ont pas
été retrouvées chez les parents des individus atteints, considérés
comme cas sporadiques, ce qui confirme que les cardiomyopathies sporadiques peuvent avoir une étiologie génétique. En
revanche, il est actuellement prématuré de préjuger du mécanisme
moléculaire à l’origine du développement d’une cardiomyopathie dilatée ou d’une cardiomyopathie hypertrophique sur la base
Dans les formes multifactorielles d’insuffisance cardiaque, le
polymorphisme Thr164Ile présent dans le récepteur bêta 2-adrénergique a été analysé sur une population de 15 patients présentant le génotype Thr164 et 15 patients appariés (classe fonctionnelle NYHA, sexe, origine ethnique, âge et étiologie de la
maladie) présentant le génotype Ile164 (L.E. Wagoner, Cincinnati, 1281). Les auteurs ont analysé la capacité d’exercice des
patients en fonction de leur génotype. Le polymorphisme, sur ce
groupe de patients, est associé à une altération de la capacité
d’exercice (p = 0,0001). In vitro, le couplage du récepteur variant
Ile164 à la protéine Gs est défectueux. Ce polymorphisme avait
déjà été associé à un mauvais pronostic dans une population de
259 patients (cardiomyopathie ischémique ou dilatée) par la
même équipe (Liggett et coll. J Clin Invest 1998 ; 102 : 1534).
MODÈLES FONCTIONNELS DES ALTÉRATIONS GÉNÉTIQUES
ET ANALYSES DE NOUVELLES MUTATIONS DANS LA CARDIOMYOPATHIE HYPERTROPHIQUE
La description des gènes et des mutations impliqués dans la cardiomyopathie hypertrophique a été largement réalisée. Cependant, les relations génotype/phénotype restent ambiguës. Cela est
dû en grande partie au fait qu’il est décrit environ une mutation
différente par famille analysée (mutations privées). Il est généralement admis que les mutations dans le gène de la protéine C
cardiaque sont associées à un meilleur pronostic que les mutations décrites dans les autres gènes impliqués dans la cardiomyopathie hypertrophique. D’autre part, les mutations dans le
gène de la troponine T cardiaque conduisent à un taux élevé de
mort subite.
bon
PRONOSTIC
mauvais
Protéine C cardiaque/Tropomyosine/Chaîne lourde de la myosine bêta/Troponine T
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de la mutation dans le gène de l’actine cardiaque, sans avoir réalisé d’études fonctionnelles pour appuyer les hypothèses formulées (J. Van Eyk, Kingston).
PERSPECTIVES EN THÉRAPIE GÉNIQUE
Après des débuts enthousiastes en 1993-1994, où l’on passait très
rapidement de quelques essais précliniques chez l’animal à des
essais cliniques pour des maladies aussi complexes que la mucoviscidose, qui ont abouti à des échecs, de nombreux groupes tentent à l’heure actuelle de résoudre les problèmes fondamentaux
posés par la thérapie génique, notamment : quel gène faut-il transfecter ? Quel vecteur utiliser ? Quel mode d’administration appliquer ? Pour répondre à la première question, l’avancée des études
génétiques combinée aux études des conséquences fonctionnelles
des mutations permet de mieux comprendre la physiopathologie
des maladies. En ce qui concerne les problèmes de faible efficacité de la transduction in vivo, d’expression transitoire du transgène (de l’ordre de deux semaines le plus souvent) et de défaut
de régulation de l’expression du transgène, les nouveaux vecteurs
disponibles (adénovirus, adeno-associated virus vectors ou AAV
et lentivirus), très efficaces, devraient permettre de réaliser des
progrès considérables. Les adénovirus infectent à la fois les cellules qui ont conservé la capacité de se répliquer et celles qui l’ont
perdue. Ils acceptent de larges inserts (promoteurs) et ne s’intègrent pas dans l’ADN de la cellule hôte. Des vecteurs tissu-spécifiques sont maintenant disponibles, mais leur expression reste
transitoire. Les adénovirus semblent plus appropriés pour traiter
un problème aigu, mais ils sont inappropriés pour un traitement
long. Les AVV ne présentent pas de protéines et sont par conséquent moins immunogènes et beaucoup moins pro-inflammatoires. Leur expression est efficace et stable dans les muscles
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squelettiques et cardiaques (8 semaines après injection directe
dans les cardiomyocytes – J.M. Leiden, Chicago) ; en revanche,
la taille de l’insert doit être inférieure à 4,6-4,7 kb.
Il existe déjà des exemples prometteurs, et J.M. Leiden a rappelé
le succès de la transfection de HGF sous échocardiographie dans
le cœur in vivo, qui entraîne une diminution significative de la
fibrose et de l’angiogenèse induite chez le hamster cardiomyopathe. Néanmoins, probablement à cause de la taille réduite de
la zone transfectée, il n’avait pu être mis en évidence d’amélioration de la fonction cardiaque, problème qui sera peut-être résolu
grâce à l’utilisation des nouveaux vecteurs.
W.J. Koch (Durham) a présenté ses résultats récents (Maurice et
coll. J Clin Invest 1999 ; 104 : 21) concernant la stratégie de thérapie génique employée pour l’insuffisance cardiaque. Les auteurs
ont administré, in vivo et en intracoronaire chez le lapin, un adénovirus contenant le gène du récepteur bêta 2-adrénergique
humain. La surexpression du récepteur bêta 2-adrénergique
entraîne, 7 et 21 jours après traitement, une augmentation des
fonctions hémodynamiques, ce qui suggère que le remplacement
du récepteur bêta 2-adrénergique par thérapie génique dans l’insuffisance cardiaque pourrait représenter une nouvelle thérapie
inotropique. La question qui reste posée est : “Quel est l’impact
de l’expression mosaïque des transgènes ?”. Il faut remarquer que,
jusqu’à présent, tous les essais conduits chez l’homme (VEGF,
FGF par exemple) ont été conçus pour évaluer en priorité la toxicité plutôt que l’effet ; en outre, ils étaient réalisés chez un petit
nombre de patients gravement atteints, ce qui rendait difficile
l’évaluation des effets du traitement (E.G. Nabel, Ann Arbor).
H.L. Sweeney (Philadelphie) est optimiste : “We are not too far
away from being able to do something”. Ce à quoi W.J. Koch
répond : “ Yes, but when ?”.
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La Lettre du Cardiologue - n° 323 - janvier 2000