JP Hugnot
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Cellules souches et réparation du système nerveux JP Hugnot MCU Université Montpellier 2 INSERM U1051 -INM Complexité du système nerveux Image de fiber tracking Un cerveau humain a 20 ans contient 176 000 km de fibres myélinisée 10000 types de neurones 1011 neurones 1012 cellules gliales Neurones (10 11 dans cerveau humain) neurotransmetteurs caractéristiques électrophysiologiques interneurones + neurones avec projection morphologies (interneurones, pyramidaux,... Des centaines de types différents L’invention du neurone: 400 millions d’années ? Astrocytes Oligodendrocytes Self-renewal of adult organs Intestine: 3 to 5 days Skin: 4 weeks Blood Red blood cells: 200 billions /d Neutrophiles 40 billions /d Platelet 200 billions /d Every year, we produce new cells equalling our body weight Cellules souches dans le cerveau des mammifères? Nous naissons avec un nombre fini de cellules nerveuses qui décroit avec l’age. Tout meurt dans le cerveau, rien ne régénère Ramon y Cajal 1902 La datation au 14Carbone des neurones montre que le stock de neurones n’est pas renouvelé au cours de l’existence Essais atomiques Les neurones du cerveau ont la quantité de 14C d’avant les essais atomiques Exception à la règle Une nouvelle Complexité: les cellules souches et progénitrices adultes Les Neurogénèses Adultes Neurosphere assay Une découverte féminine ! Identification of Neural stem cells with the Neurosphere assay differentiation Self renewing Neurones AstrocytesOligodendrocyte Formation of multipotent and self-renewal neurospheres at clonal density NEUROSPHERES OLIGODENDROCYTES ASTROCYTES NEURONES Le lignage neural Cellules souches neurales bFGFR bFGF R EGF R Glia restricted progenitor (GRP) CD44+ OPC NPC (oligodendrocyte progenitor (neuronal cell) progenitor cells) Neuroblast A2B5Ran2 + Astrocytes type I Oligodendrocytes Neurones Les cellules souches neurales chez l’adulte Chez les mammifères 1992: détection in vitro d’une cellule souche neurale adulte chez la souris 1999: détection in vitro d’une cellule souche neurale adulte chez l ’humain (age 15-87 ans) Neurones Astrocytes Oligodendrocytes Présence de cellules souches dans des régions dites niches La zone sous ventriculaire formation d’interneurones du bulbe olfactif la région sous callosale formation d’oligodendrocytes adultes Canal central de la moelle épinière l’hippocampe formation de nouveaux neurones pour l’hippocampe Pathways involved in self-renewal of stem cells Schematic of the ventricular–subventricular zone (V–SVZ) organization. Astroglial B1 cells, V–SVZ NSCs (dark blue), give rise to activated B1 cells (B1a, light blue) that actively divide 10 and 11. Activated B1 cells generate the transit-amplifying C cells (green) which, after three rounds of divisions, give rise to A cells, the migrating neuroblasts [12]. Note that B1 cells contact the ventricle with an apical process. This adult VZ is also populated by ependymal cells, multiciliated cells that together with the apical endings of B1 cells from pinwheel structures on the surface [3]. Coursing along this ventricular surface is a rich network of serotonergic axons (5HT, bright green) [44]. The basal processes of B1 cells have endings on blood vessels. Choline acetyltransferase (ChAT)-positive neurons found in the region have endings in the SVZ (olive brown) [51]. Dopaminergic terminals (DAt, purple) are also observed in this region. Figure and legend taken from Lim DA, AlvarezBuylla A. Adult neural stem cells stake their ground. Trends in neurosciences [Internet]. 2014 Oct [cited 2014 Oct 9];37(10):563–571. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25223700 PMID: 25223700 La quête pour les Marqueurs des cellules souches neurales adultes • CD133, CD15, Sox2, Nestin, ……… • Aucun ne permet de détecter à coup sur une cellule souche. • Seule une combinaison et une analyse fonctionnelle in vitro (neurosphères, …) ou in vivo (étude de lignage) permet d’évaluer si une cellule est souche on non Neurogénèse dans la zone sous ventriculaire chez les rongeurs Periglomerular neuron Stem cell Granule neuron Neuronal Astrocyte progenitors Rostral Migratory Stream SVZ humaine Sanai, Nature, 2004 Un courant de migration rostral dévié Curtis, Science, 2007 Neurogénèse dans le gyrus denté de l’hippocampe Chez l’humain Neurogénèse dans l’hippocampe 700 nouveaux neurones dans chaque hippocampe chaque jour Quels rôle pour les neurogénèses adultes ? The new neurons produced in the SVZ participate in functional olfactory synaptic circuitry olfactory memory formation odorant discrimination social interactions Ming GL, Song H. 2011, Neuron 70: 687 – 702. Rôle de la neurogénèse dans la zone sous-ventriculaire chez les rongeurs: Implication dans la mémoire olfactive Des souris placées dans un environnement enrichi ont plus de jeunes neurones dans le bulbe olfactif Jeunes neurones standard enrichi Les performances de la mémoire olfactive sont 4 fois meilleures chez la souris élevées dans un environnement riche Temps en min Plus de mémoire La réduction de la neurogénèse de la SVZ diminue l’attirance pour les males dominants. Nature Neuroscience 10, 1003 1011 (2007) Neurogénèse de l’hippocampe et Mémoire Irradiation de l’hippocampe induit des défauts de rétention d’un apprentissage spatial. Acquisition Retention Control Irradiated Snyder et al., 2005 Neurogénèse et dépression •Atrophie préfrontale et hippocampique souvent observée dans la dépression Antidépresseurs • mode d’action: augmentation de la concentration de sérotonine (5HT) et/ou noradrelanine. • Effets cliniques observés seulement après 3-4 semaines. Différences avec anxiolitiques Les antidépresseurs augmentent la neurogénèse 11 et 28 jours après le traitement 70% (Prozac) 15% Les neurogénèses adultes sont modulables Effet de l’exercice et de l’environnement sur la neurogénèse hippocampique Nat Neurosci. 1999 Mar;2(3):266-70. Nature. 1997 Apr 3;386(6624):493-5. course Environnement enrichi Modulation de la neurogénèse de l’hippocampe chez les rongeurs Exercice Physique Stress Environnement stimulant Dépression Facteurs de croissance (FGF, VEGF,… Régime alimentaire Glutamate (récepteur Kaïnaite) Glutamate (récepteur NMDA) Hormones (oestrogènes, prolactine,…) Morphine, Héroïne Dopamine, Sérotonine Alcool Antidépresseurs Privation de sommeil DHEA Age 1-Thérapie cellulaire Remplacement cellulaire Protection cellulaire 2-Régeneration Cellules Souches Neurales 3-Cancers: Gliomes, Ependynomes 5-Vieillissement 4-Plasticité Une merveilleuse complexité mais difficile à réparer Les principales lésions du système nerveux La maladie d’Alzheimer: 750 000 cas 22000 nouveaux cas/an Les accidents vasculaires cérébraux La Maladie de Parkinson (neurones dopaminergiques de la substance noire) 100 000 personnes La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) (maladie de Charcot, ou maladie de Lou Gehrig, 8 000 personnes motoneurones Traumatismes craniens et médullaires 155 000 traumatisés en France, 12 000 nouveaux cas graves par an Pathologies Démyélinisantes La Sclérose en plaque (oligodendrocytes) 50 000 personnes Le Cerveau se répare tout seul: la plasticité Réorganisation du cerveau dans les tumeurs cérébrales Bourgeonnement des neurones abimés Régénération à partir des cellules souches neurales endogènes: quelques exemples Remplacement neuronal par des cellules souches neurales endogènes (Arvidsson, Nature Medecine, 2002) MCAO:middle cerebral artery occlusion, dégénération massive neurones du striatum et du cortex parietal Injection de BrdU Formation de jeunes neurones après lésion Nombre de Neurones Brdu+ NeuN BrdU controle lésé Migration de jeunes neurones de la zone sous ventriculaire vers les régions lésées Marquages doublecortine (jeunes neurones) controle lésé Les neurones néoformés expriment des marqueurs de neurones striataux: Meis2 et DARPP32 Mais …. entre 2 et 5 semaines, ces jeunes meurent. Seuls 0.2% des neurones morts sont remplacés Thérapies -pour amplifier ce phénomène régénératif -pour augmenter la survie des neurones néoformés et rendre l’environnement plus favorable (Facteurs neurotrophiques, ….) Regeneration des neurones pyramidaux CA1 de l’hippocampe par des précurseurs endogènes (Nakatomi, Cell, 2002) SCIP, NeuN (neurones) CA1 neurons Contrôle 17 jours Ischémié 28 jours Ischémié puis injection bFGF/EGF Cellules souches endogènes et Pathologies Modification de la SVZ dans la sclérose en plaque chez l’humain Increased cell density and proliferation in the SVZ of MS cases Nait-Oumesmar B et al. PNAS 2007;104:4694-4699 ©2007 by National Academy of Sciences Sclérose en plaque Régénération à partir des cellules souches endogènes Nait-Oumesmar B et al. PNAS 2007;104:4694-4699 ©2007 by National Academy of Sciences Migration des cellule souches endogènes lors des lésions de la moelle épinière Meletis et al PLoS Biol. 2008 Jul 22;6(7):e182 Thérapie cellulaire dans le système nerveux 1-Les sources de cellules souches pour production de neurones ou d’oligodendrocytes 2-le problème de la différenciation par défaut des cellules souches 3-Le problème de la diversité neuronale 1-Différentes Sources de cellules souches pour la production de neurones in vitro Cellules souches Embryonnaires ES Cellules souches Reprogrammées iPS Transplantation cellulaire neurones, cellules gliales 1-Différentes Sources de cellules souches pour la production de neurones in vitro Cellules souches Embryonnaires ES Cellules souches Reprogrammées iPS Concept général d’un remplacement cellulaire: Transplantation cellulaire à partir d’embryons Maladie de Parkinson: neurones immatures de la partie ventrale du mésencéphale embryonnaire Maladie de Huntington cellules de l’éminence ganglionnaire du foetus (7,5-9 semaines) Quantité limitée Standardisation Difficile Problèmes éthiques 2-le problème de la différenciation gliale par défaut des cellules souches Transplantation des cellules des neurosphères dans le système nerveux Régions Non Neurogéniques Cortex Striatum Cervelet Moelle Epinière Substance Noire Glie Très Peu de Neurones Solution 1: Meilleur contrôle de la différenciation des cellules souches neurales transplantées Glie Neurones neurotransmetteur type Mécanismes extrinsèques: exemple signaux Gliogéniques Astrocytes Cytokines de la famille de l’interleukine 6 • Leukemia inhibitory factors LIF • Ciliary Neurotrophic Factor CNTF •Cardiotrophin CT-1 •Interleukine 11 Bone Morphogenetic Proteins (famille TGF beta) • BMP 2, 4, 7, 11 Voie de signalisation Notch Lésion •BMPs •TNFa •Famille IL-6 (LIF, CNTF, ….) •Activation voie Notch Anti BMPs (Noggin,…) Anti TNF Gliose Glie Réactionnelle Greffe Solution 2 Greffe de cellules déjà engagées dans la différenciation au lieu de cellules souches Purification par FACS ou MACS contre antigène externe (PSA-NCAM) Différenciation Purification par FACS ou MACS Par expression d’une protéine fluorescente mise sous le contrôle d’un promoteur spécifique promoteur gfp Promoteurs neuronaux: a1 tubulin 3-Problème de la Diversité neuronale Identité neuronale acquise lors du développement sous l’effet de gradients de molécules morphogénétiques Sonic Hedgehog SHH Nécessité d’éduquer les cellules souches in vitro pour donner le type neuronal adéquat Exemples de thérapie génique de à partir de neurosphères •Amyotrophie musculaire spinale avec détresse respiratoire par atteinte diaphragmatique (SMARD pour Spinal Muscular Atrophy with Respiratory Distress) •maladie autosomique récessive •les motoneurones de la moelle épinière dégénèrent, insuffisance respiratoire précoce attribuée à une dysfonction du diaphragme Le pronostic vital est rapidement en jeu. •forme la plus courante est due à des mutations du gène IGHMBP2 qui code une protéine de liaison des immunoglobulines mu. Hum Mol Genet. 2006 Jan 15;15(2):167-87. Motoneurones Sonic Hedgehog Acide rétinoïque Histologie et tests Transplantation dans modèle animal controle traité non traité non traité non traité traité traité contrôle Maladie de Parkinson Perte de neurones dopaminergiques dans la substance noire Challenge actuel: Comprendre le développement des neurones dopaminergiques mésencéphaliques pour production à partir des cellules ES ou iPS 1-Différentes Sources de cellules souches pour la production de neurones in vitro Cellules souches Embryonnaires ES Cellules souches Reprogrammées iPS Traitement des lésions du cortex visuel par des neurones produits par des cellules souches embryonnaires Pr A Gaillard Unité mixte Inserm 1084, Université de Poitiers Fabrication d’organoides de cerveau humain in vitro Nature 501, 373–379 Nature 501, 373–379 1-Différentes Sources de cellules souches pour la production de neurones in vitro Cellules souches Embryonnaires ES Cellules souches Reprogrammées iPS Une source prometteuse: la reprogrammation cellulaire: les iPS Nouvelle Approche: La transdifferentiation cellulaire Regeneration through Reprogramming Adult Cell Identity in Vivo Derek K. Smith, Chun-Li Zhang The American Journal of Pathology DOI: 10.1016/j.ajpath.2015.02.025 Surexpression de facteurs de transcription du système nerveux sont capables de convertir des fibroblastes en neurones ou en astrocytes Le Stem Cell Business Le marché des cellules souches Le Stem Cell Tourisme Danger ! Injection de cellules de la muqueuse olfactive (nez) Formation d’une muqueuse du nez dans la moelle épinière !!! risque de cancérisation Journal of Neurosurgery: Spine Oct 2014 / Vol. 21 / No. 4 / Pages 618-622 The dark side of brain stem cells ? Adult Diffuse Gliomas Most frequent primary brain tumors 3000 new cases each year in France Diffuse Low-grade High-grade Slow-growing, survival ≈ 10 years Degeneration to Glioblastomas (Glioblastoma) Rapidly growing poor prognosis survival < 2 years Glioblastoma Stem Cells Astrocyte-like Neurospheres CD15, CD133 Multipotency GFAP Neuronal-like Tubb3 Oligodendrocyte-like Highly tumorigenic in nude mice Gal C Current cancer treatment Similar to the queen and workers in ant colony ? Origin of Glioblastoma Cancer Stem Cells (CSC) Mature Astrocytes or Oligodendrocytes Glioma cells Adult Glial Progenitor cells Immature glial cell features Adult Stem cells The main suspect NG2 glial cells –Oligodendrocyte Progenitor cells 3-5% of all brain cells Actively proliferating cells OPC NG2+ cells
