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Synthèse supportée Solid Phase Synthesis, SPS Limiter l’utilisation de solvants ou d’agents de séparation Synthèse en solution / sur support Phase homogène (contact favorisé) Chaleur transférée par dispersion aux molécules en solution Synthèse sur grande échelle possible Possibilité de purification des composés à chaque étape éliminer les produits secondaires Possibilité d’analyse des composés à chaque étape Purification nécessaire (extraction, chromatographie) Automatisation difficile Synthèse en solution / sur support Réaction intramoléculaire solution Support Synthèse supportée ? X: site de fixation P: groupe protecteur P1 X Support solide insoluble Y P2 soluble P1 Réaction P2 Déprotection X’ P2 P3 Réaction Y’ soluble Coupure du support P3 P2 Facilité de purification (lavage et filtration) Utilisation d’un excès de réactifs Nécessité de Réactions très efficaces 99% Synthèse de peptides / synthèse combinatoire et parallèle sur support Synthèse sur support / Réacteur ! Agitation (suspension ou dépôt) ! Choix des solvants Synthèse de peptides sur support Merrifield, 1963 O ancrage du premier acide aminé OH O déprotection NO H 2N O couplage du deuxième acide aminé protégé OH O déprotection NO H2N répétition des cycles de couplages et de déprotection N- O H2N clivage de la résine et déprotection des chaînes latérales O H2N OH peptide protégé immobilisé sur la résine peptide libre Synthèse de peptides sur support Stratégie Fmoc/tBu: déprotection N : pipéridine résine et GP acido-sensibles, TFA Stratégie Boc/Bzl : déprotection N : TFA résine et GP acido-sensibles, HF Synthèse parallèle supportée 1 bille 1 molécule P P P 2) + P 1) - P 2) + Y A P P A B 1) - P 2) + a Y Y B 1) - P 2) + b Y 2) + a Y 2) + b a b a b A A B B Y Synthèse parallèle supportée One-bead one-molecule Synthèse sur support / Robot Gain de temps / Multiplier les composés Synthèse sur support / Suivi des réactions Synthèse supportée / en solution Phase homogène (contact favorisé) Chaleur transférée par dispersion aux molécules en solution Synthèse sur grande échelle possible Possibilité de purification des composés à chaque étape (éliminer les produits secondaires) Possibilité d’analyse des composés à chaque étape Suivi des réactions possibles sur support "off bead / on bead methods" Mass spectroscopy Colorimetric detections Gel-phase NMR (19F, 31P, 15N / 2H et 13C) FTIR, single bead technique Résine / site de coupure P1 Y X P1 Déprotection X’ P2 P2 P2 Réaction P3 Y’ Coupure du support Réaction soluble P3 P2 Lien avec la résine stable (réaction et déprotection) Lien facile à couper / Intégrité du produit libéré Résine et Linker Le Linker augmente l’accessibilité Coupure du linker X Le choix du support et du linker = clé de la SPS Gonflement / solvant DMF, CH2Cl2 / MeOH swelling Nbr de sites de fixation loading Conditions de coupure Acide, base, h enzyme # Types de linker Protecting group, traceless, cyclization, safety-catch, and Photoreactive types Résine Billes (beads) entre 10-200 m de diamétre mesh/ m Polymère organique amorphe Utilisation de résine synthétique en SPS Filtration possible / Difficulté de transvasement Supports les plus utilisés: Polystyrène (PS) / polyéthylèneglycol (PEG) Tentagel (TG) / PEGA (polyéthylène glycol-polyacrylamide) Polystyrène (PS) 1er support développé Polymérisation de 1% à 2% de divinylbenzene avec le styrène Divinylbenzene permet de greffer par le suite d’autres fonctions Polystyrène (PS) Bon marché / Loading important: 0.5-1.5 mmol/g Résistance mécanique (agitation and vortex) / Température PS 2% Pas de limitation de la taille des molécules (peptide 100mère) 200-400 mesh (73-37 m) ou 100-200 mesh (150-75 m) 99% des sites à l’intérieur de la résine Importance de la nature du solvant Polymère hydrophobe solvants non polaires solvants polaires comme alcools Macroporous structure (MP) PS with high cross linking over 20% Propriétés différentes du polystyrène (PS) MP a une structure rigide dont la forme n’est pas affectée par les solvants Utilisation d’autres solvants possibles / PS Limitation de taille dans la synthèse de macromolécules peptides 8-10 mères MP est fragile mécaniquement Loading assez élevé (0.5-0.8 mmol/g) Polyéthylèneglycol (PEG) To overcome the solvent limitation in PS, polyethyleneglycol (PEG) resin is developed. As PEG is dissolved in polar solvent including water, the reaction condition is similar to liquid phase reaction. After reaction, PEG is precipitated by non-polar solvent addition, and separated from other reagents or by-products by filtration. PEG is weak in mechanical shock and repeated precipitation-filtration will generate material loss, which will limit the multi-step automation. Tentagel (TG) To improve the defects of PS and PEG, while keeping their merits, a combined polymer tentagel (TG) was developed. TG is synthesized by reacting ethylene oxide on chlorobenzyl PS grafted PEF on PS backbone (usual ratio of PS:PEG is about 30:70) TG swells well even in aqueous solvent TG is resistant to high pressure and mechanical shock Access of reagent to the reaction site is easier than PS reaction rate of TG usually higher than that of PS "solutionlike" microenvironment The flaw is a low loading level (0.3 mmol/g), hygroscopic properties of the resins, and its high price. Tentagel (TG) On-bead reaction monitoring Structure determination by gel-phase 13C NMR Polyethylene glycol-polyacrylamide (PEGA) PEGA is composed of PEG crosslinked by acrylamide PEGA swells well in various solvents The reaction site can be accessible by up to 35kDa macromolecule PEGA can be ideal material for affinity purification of proteins or on-resin enzyme screening Swelling volume of resins in a series of solvents Resin Volume in various solvents (ml/g) Resin DMF THF MeOH toluene H2O CH2Cl2 PS 3 8 2 7 - 7 TG 5 6 4 5 4 5 PEGA 11 13 13 12 16 13 Quelques prix Merrifield resin, chlorométhylstyrène copolymère 5g, 30 euro L: 1.5-2 mmol/g Aminomethylated polystyrene 5g, 60 euro L: 1.2-1.6 mmol/g la version PEG (Novagel®) 5g 144 euro L: 0.6-0.9 mmol/g Wang resin 5g, 30-60 euro Cl L: 1.5-2 mmol/g H2N HO O Résine et Linker Le Linker augmente l’accessibilité Coupure du linker X Le choix du support et du linker = clé de la SPS Gonflement / solvant DMF, CH2Cl2 / MeOH swelling Nbr de sites de fixation loading Conditions de coupure Acide, base, h enzyme # Types de linker Protecting group, traceless, cyclization, safety-catch, and Photoreactive types Acid-labile linker The most widely used class of SP linkers / Building blocks used in SPS of peptides Stable to nonacidic conditions Scavengers The Wang linker is a very popular choice based on a p-alkoxybenzyl alcohol moiety 50 % TFA in CH2Cl2 / Carboxylic alcools or Alcohols SASRIN and HAL linkers Modifications of the Wang linker Super-acid-sensitive Resin, SASRIN O-methoxy group 1% TFA in CH2Cl2 / Carboxylic alcools or Alcohols Hypersensitive acid-labile Linker, HAL O-methoxy groups 0,1% TFA in CH2Cl2 ou 10% AcOH in CH2Cl2 / RCOOH or ROH PAL: the corresponding NH2 version SASRIN and HAL linkers Modifications of the Wang linker Super-acid-sensitive Resin, SASRIN O-methoxy group 1% TFA in CH2Cl2 / Carboxylic alcools or Alcohols Hypersensitive acid-labile Linker, HAL O-methoxy groups 0,1% TFA in CH2Cl2 ou 10% AcOH in CH2Cl2 / RCOOH or ROH PAL: the corresponding NH2 version amides ou sulfonamides Rink ester and Rink amid linkers Rink ester linker : Bis-benzylic hydroxyl function 0,2% TFA in CH2Cl2 ou 10% AcOH in CH2Cl2 / RCOOH or ROH Rink amide linker : 50% TFA in DCM / Amides or Sulfonamides Non-commercial acid-labile linkers ThP linker : from Merrifiel resin Alcohols, hydroxylamines and carboxylic acids N-Fmoc-amino-oxy-2-chlorotrityl linker : from 2-chlorotrityl resin Hydroxamic acids or peptidyl hydroxamic acids Base- or nucleophile-labile linkers Base-labile linkers are popular in oligonucleotide SPS Fluorene linker from aminomethyl PS resin 20 % morpholine in CH2Cl2 / Carboxylic alcools C-terminal Boc-protected amino acids Oxime linker : commercially available nucleophile-labile linker Peptide synthesis and SPS of small molecules as indoles Cleavage with amines (DCM at rt for 12h) to produce amides Cleavage with hydrazine (0.5M in CHCl3/MeOH for 10’) to produce hydrazides Silicon linker from Grignard reaction of a 4-bromoarylsilane with formyl PS resin Acids / Alcohols and amines (via acyl imidazole derivatives) Cleavage with TBAF in DMF for 3h at 60°C or with CsF in DMF for 18-24h at 90°C Photolabile linkers Photolabile linkers use light to break the bond between the elaborated compound and the linker O-nitrobenzyl bromide linker from aminomethyl PS resin h , 350nm, MeOH, 24h, rt Peptide / small organic molecules O-nitrobenzyl linker from aminomethyl PS resin Aldéhydes Thiazolidinones h , 350nm, 5% DMSO in aqueous buffer, 3h, rt Biological test facilitated Safety-catch linkers, SC linkers Some linkers are totally stable during the synthetic method and only become labile after a process known as activation SC linkers are popular and allow the support and release of many different functionalities Kenner sulfonamide-based SC linker Attachement of carboxylic acids to the sulfonamide function Activation with diazomethane N-methylacylsulfonamide (ou N-cyanomethyl*) cleaved by nucleophiles * Amines amides NH3-dioxane amides Hydrazine-MeOH hydrazides NaOH 0.5N carboxylic acids Phenol sulfide SC linker from Merrifield resin Attachement of carboxylic acids or aminoacids (! Cys) Activation via oxydation of the sulfur atom with H2O2 Reactivity of the linker towards amines increases Amines amides Imidazole hydroxy sulfide SC linker from hydrophilic PS resin Attachement of carboxylic acids or Fmoc-protected aminoacids Activation and deprotection : TFA treatment / neutralisation at pH7 with aqueous buffer Intramolecular attack of the imidazole ring (as TFA salt) Acetal linker from hydroxy PS resin and 2-nitro-5-methoxytoluene Activation by acetal hydrolysis acylindole derivatives amines amides MeOH esters NaOH carboxylic acids Traceless linkers, TL No necessity of having a functional group in the final compound through which it is attached to the resin Traceless linkers do not leave a residual functional group deriving from the cleavage reaction The linkers are usually substituted with a hydrogen during the cleavage but some alternative quenchers have also been used Silicon-based TL linker from aminomethyl PS resin Synthesis of 1,4-benzodiazepines X=Si, Cleavage by protodesilylation (HF) X=Ge, more labile TL (TFA, Me2S, water) Hydroxymethyl resin-supported regenerated Michael (REM) linker Secondary amines Tertiary amines by Hoffman elimination Phosphorus-based TL linker from triphenylphosphine resin Various chemical functionalities indole Alkene via Wittig Quinodimethane linker from hydroxymethyl PS resin and anthranilic acid Hetero-Diels-Alder reactions six-membered heterocycles Cleavage with Lewis acid-nucleophile cocktails in DCM Selenium linker from Merrifield resin and potassium selenocyanate Synlett 1999, 1760-1762. Cyclative Cleavage, CC SPS produces an advanced intermediate that undergoes cyclization with concomitant release of the final cyclized product. Cyclative Cleavage, CC Cyclative Cleavage, CC Enzymatic Cleavage Coupure du support enzyme 37°C, pH 5-8 Conditions douces et sélectives de coupure / acides Synthèse supportée de molécules fragiles oligosaccharides, oligonucleotides, bioconjugués … R. Reents et al., Biocatalysis in polymer-supported synthesis: EnzymeLabile Linker Groups. Adv. Synth. Catal. 2001, 6-7, 343. Enzymes utilisés Lipase hydrolyse des esters Penicilline acylase catalyse l’hydrolyse de phénylacetamide Enzymatic Cleavage Lipase linker 4-acyloxybenzyloxy reconnu par la lipase La coupure enzymatique génère un phénolate qui se fragmente pour donner une quinone Spécificité de l’enzyme ester / amide (quinone piégée par l’eau ou un nucléophile introduit dans le cocktail de coupure) Composés libérés sous forme : Amines via uréthanes Alcools via carbonates Acides carboxyliques via esters Enzymatic Cleavage synthèse de tétrahydro-béta-carbolines Lipase 1) estérification de l’alcool benzylique par Tryptophane 2) N-déprotection (- Boc) 1) et 2) 3) 3) Formation d’imines avec aldéhydes aromatiques ou aliphatiques 4) Cyclisation spontanée des imines 5) Coupure enzymatique / chimique Rdts globaux de 70-80% 4) 5) Enzymatic Cleavage Penicilline acylase Site de l’enzyme Site de réaction Couplage via alcool ou amine du 1er maillon synthétique et réaction Hydrolyse enzymatique Réarrangement : largage de la molécule synthétisée Hémi-acétal formé se fragmente spontanément en milieu aqueux Molécule synthétisée * Enzymatic Cleavage Penicilline acylase / "safety-catch linker " Cyclisation intramoléculaire de l’intermédiaire formé par coupure enzymatique et relargage du composé cible Conclusion Choix du linker, de la résine / Conditions de coupure, de réaction / Produits synthétisés 1960, Résine de Merrifield 1990, Synthèse parallèle supportée Librairie de molécules (étapes de synthèse et de purification robotisées) Tests biochimiques sur support Combiner les avantages de la Synthèse sur support avec ceux de la Synthèse en solution ?? Réactifs supportés Bibliographie
