Classification moléculaire des tumeurs thyroïdiennes : intérêts et limites de l’approche transcriptomique

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Cancers de la thyroïde :
aspects innovants
dossier
thématique
Classification moléculaire des tumeurs
thyroïdiennes : intérêts et limites
de l’approche transcriptomique
Molecular classification of thyroid tumors: advantages and limitations
of the transcriptomic approach
Frédérique Savagner*
»»Le transcriptome permet d’avoir une vision globale des fonctions
dérégulées dans une classe tumorale.
P o i nt s f o rt s
»»L’analyse du transcriptome permet d’identifier les processus
tumoraux initiaux, mais aussi les réactions du tissu environnant
(infiltrats lymphocytaires).
»»Il existe une meilleure corrélation entre le statut mutationnel et
le transcriptome d’une tumeur qu’entre le statut mutationnel et
l’histologie de cette tumeur.
»»L’identification de biomarqueurs spécifiques de classe n’est
pertinente que si le transcriptome de l’ensemble des classes
pathologiques de l’organe est exploré.
Lorsque l’on examine la classification histologique des
tumeurs thyroïdiennes (OMS, 2004), il apparaît pourtant
que des marqueurs biologiques ayant éventuellement
une valeur pronostique pour les classes intermédiaires
sont encore manquants (1). Ainsi, la nouvelle classe
des tumeurs de potentiel de malignité incertain
(TPMI) entretient le flou quant à l’évolution clinique.
De même, la distinction de certains variants histologiques ne semble pas avoir de valeur pronostique. Mais
la principale difficulté de la classification histologique
des tumeurs thyroïdiennes différenciées provient des
tumeurs folliculaires bénignes (FTA) et malignes (FTC) et
de la grande variabilité interobservateur pour affirmer
l’invasion capsulaire et vasculaire (2).
»»Le profil d’expression de biomarqueurs ciblés présente un réel
potentiel diagnostique pour les classes intermédiaires de pathologies.
Mots-clés : Transcriptome – Tumeurs thyroïdiennes – Classification –
Biomarqueurs.
Keywords: Transcriptome – Thyroid tumors – Classification – Biomarkers.
L’
* Inserm UMR694,
CHU d’Angers.
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analyse moléculaire de la physiopathologie
d’un organe ou d’un tissu a été longtemps
limitée à l’étude de quelques gènes candidats.
Depuis le milieu des années 1990, les outils moléculaires développés permettent de mesurer l’expression
de plusieurs milliers de gènes en même temps, et ce
de façon maintenant tout à fait fiable et standardisée.
Appliquée à l’étude des tumeurs, cette technologie a
pour ambition de préciser les mécanismes physiopathologiques et d’identifier des marqueurs diagnostiques ou pronostiques ainsi que de potentielles cibles
thérapeutiques. Elle est très peu utilisée dans un but
de reclassification moléculaire en complément de la
classification histologique.
L’approche transcriptomique
Les microarrays, ou puces à ADN, servent à détecter et à
quantifier plusieurs milliers d’acides nucléiques (ARNm)
extraits d’un échantillon biologique et qui constituent
le transcriptome de l’échantillon. L’analyse bio-informatique des données du transcriptome de plusieurs
échantillons va permettre leur regroupement selon la
similarité des profils d’expression. Selon les méthodes,
les regroupements peuvent être indépendants (classification non supervisée), ou au contraire contraints par
les classes histologiques (classification supervisée). Ces
2 méthodes sont complémentaires dans leur approche :
d’une part, confirmer la pertinence d’une classe par sa
présence en classification non supervisée ; d’autre part,
apprécier la proximité de différentes classes par une
approche supervisée. Ces approches permettent également d’identifier de nouvelles classes ou d’apporter des
éléments de reclassification pour des classes considérées comme atypiques. Elles vont permettre d’identifier
des gènes corégulés (cluster de gènes) associés à une
fonction et/ou à une classe histologique donnée. Au
travers de ces fonctions et de ces gènes corégulés, les
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Classification moléculaire des tumeurs thyroïdiennes
biomarqueurs de chaque classe sont recherchés. Pour
autant, une même fonction peut être dérégulée dans
plusieurs classes de pathologies.
Transcriptome et anomalies moléculaires
des tumeurs thyroïdiennes
Les cancers papillaires sont fortement associés aux
réarrangements Ret/PTC et aux mutations du gène
B-Raf, alors que les tumeurs folliculaires présentent,
pour partie, des anomalies dans les gènes Ras ou
PPARγ/Pax8. Les études du transcriptome de différentes
tumeurs thyroïdiennes dont le statut mutationnel est
connu montrent que ce statut est mieux corrélé au
profil d’expression qu’à la morphologie des tumeurs.
Les voies précoces de tumorigenèse peuvent donc être
mieux cernées par une approche transcriptomique. Les
2 études de Giordano et al. sont sur ce point instructives
(3, 4). La première étude portant sur la classification
des cancers papillaires (PTC) avec réarrangements
Ret/PTC1 ou 3, mutations B-Raf ou N-, K- ou H-Ras
montre que, si la plupart des profils transcriptionnels
des cancers papillaires présentent des caractéristiques
moléculaires communes associées à la voie Ret/Ras/
Raf/MAPK, chaque type de mutation est lié à un profil
transcriptionnel spécifique. Le réarrangement Ret/PTC3
est quant à lui associé à un profil d’activation de la voie
PI3Kinase et non à celle des MAPK. La deuxième étude
portant sur le transcriptome des cancers folliculaires
avec réarrangement PPARγ/Pax8 montre que la voie
PPARα est activée en parallèle de la voie PPARγ. Cette
voie PPARγ est alors corrélée à la surexpression de gènes
associés à la voie EGFR. Ces 2 approches soulignent
l’intérêt thérapeutique d’une meilleure connaissance
des voies de tumorigenèse thyroïdienne, puisque les
thérapeutiques ciblées seront alors différentes selon la
mutation dominante retrouvée (figure 1).
autant, la comparaison de 2 classes, quelle que soit la
question posée, n’est pas suffisante pour affirmer la
spécificité de biomarqueurs.
Classes intermédiaires
Si l’on considère la notion de continuum dans les
tumeurs thyroïdiennes folliculaires, l’apport de la technologie des puces à ADN semble pourtant à même,
de par sa sensibilité, d’identifier les modifications
précoces de l’expression de gènes impliqués dans
un état de prémalignité. Deux études se sont pour le
moment penchées sur la reclassification moléculaire
des TPMI (5, 6). Leur classification par profil d’expression n’est cependant pertinente que si les classes différentielles de ces tumeurs sont explorées en parallèle,
comme les FTA, les FTC peu invasifs, mais aussi les
variants folliculaires des cancers papillaires. Dans ces
2 études basées sur des échantillons représentatifs
des 4 classes nodulaires d’intérêt mais aussi de classes
non nodulaires témoins, les auteurs montrent que le
profil d’expression permet d’améliorer la classification des TPMI. Les profils d’expression sont corrélés à
l’analyse immunohistologique (score), celle-ci restant
malheureusement toujours dépendante du pathologiste référent (figure 2, p. 218).
Nombre d’échantillons et taille des classes
Comme toute approche de classification, la recherche
de biomarqueurs pertinents par l’analyse du transcriptome nécessite que la spécificité de ces biomarqueurs soit vérifiée au travers de l’ensemble des classes
pathologiques d’un organe donné. Si la classification
Cible thérapeutique des FTC
PPARγ/Pax8 positifs (interactome
des gènes surexprimés)
Classification moléculaire des tumeurs
différenciées
BRAF
S’agit-il d’identifier le caractère bénin ou malin d’une
tumeur ou de prouver la pertinence de la classe histologique ? La plupart des études explorent 2 classes de
tumeurs (malignes/bénignes) ou une classe tumorale
par rapport au tissu sain environnant. L’objectif de ces
études est soit l’identification d’un ou de plusieurs biomarqueurs de la classe pathologique (comparaison au
tissu sain) soit l’identification de marqueurs de malignité
(comparaison de classes bénignes et malignes). Pour
NRG1
EPHA2
Ret
Ret/PTC3
RAS
PI3Kinase
Inhibiteurs de la
BRAF
tyrosine kinases/EGFR
EGFR
PTK2
Cibles thérapeutiques des PTC
Ret/PTC, BRAF et Ras positifs
SOS1
Inhibiteurs de la
tyrosine kinases/EGFR
Inhibiteurs de la
sérine-thréonine kinases
MAPK
Figure 1. Cibles thérapeutiques identifiées par analyse du transcriptome et de l’interactome
des cancers folliculaires (FTC) et papillaires (PTC).
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aspects innovants
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Profil
14
Score
12
10
0,1
8
0,08
6
0,06
4
0,04
2
0,02
Score du pathologiste
Profil d’expression moyen
0,14
0,12
thématique
0
0
1
– 0,02
– 0,04
2
3
4
5
6
7
8
9
10
–2
–4
Numéro des TPMI
Figure 2. Corrélation entre le profil d’expression moyen des 10 tumeurs de potentiel de malignité
incertain (TPMI) et le score du pathologiste établi par combinaison de marqueurs immunohistologiques (HBME-1, galectine 3, CK-19 et TPO) et de caractéristiques histologiques (nucléaires,
cytoplasmiques, invasions capsulaires et vasculaires). Coefficient de corrélation Spearman = 0,71.
– 0,2
TPMI
FTA
microfolliculaires
Corrélation
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Groupe
de pathologies
Bénignes
FTA, thyroïdite,
Basedow…
Malignes
Riches
FTC, PTC, en mitochondries
TPMI
Tumeurs
oncocytaires
Figure 3. Classification supervisée des échantillons issus de 12 classes de pathologies thyroïdiennes
et de tissus sains selon leur profil d’expression moyen (transcriptome de plusieurs milliers de gènes).
L’arbre, ou dendrogramme, illustre la distance entre les classes de pathologies thyroïdiennes. La
robustesse de la classification est illustrée par les 3 cercles noirs sur les arbres. Deux groupes de
tumeurs se distinguent du groupe bénin : les tumeurs de potentiel de malignité incertain (TPMI)
et les adénomes d’architecture microfolliculaire (FTA microfolliculaires).
moléculaire met en évidence des événements précoces de tumorigenèse, elle n’en demeure pas moins
une technique qui permet aussi de visualiser des événements annexes de type réaction du tissu environnemental (infiltrats), qu’il faudra alors identifier pour
extraire la signature spécifique du processus tumoral
engagé dans la classe histologiquement définie. Peu
218
d’études ont comparé plus de 4 classes de pathologies
thyroïdiennes au cours d’une même analyse (4, 7-10).
À ce jour, une seule étude a dépassé les 10 classes ou
sous-classes histologiques explorées conjointement
(8). Cette unité technique et temporelle a permis d’être
pertinent dans la sélection de biomarqueurs réellement spécifiques de chaque classe. Une méta-analyse
impliquant 5 autres jeux de données de transcriptome
disponibles dans les bases de données publiques et
permettant de “cross-valider” les marqueurs les plus
pertinents pour les classes communes à ces différentes
études a permis de montrer que plus de 52 % des marqueurs sélectionnés par cross-validation étaient communs à au moins 2 des classes ou sous-classes définies
dans la première étude (12 classes). Elle montre aussi
que l’identification du profil d’expression des variants
oncocytaires des tumeurs folliculaires permet une
meilleure classification des tumeurs (figure 3). En
effet, la signature mitochondriale de ces variants est
parfois présente dans d’autres classes de tumeurs et
peut masquer la signature pertinente de ces classes
au même titre qu’une signature “non spécifique” de
type lymphocytaire.
Les méta-analyses regroupant les données de transcriptome issues de plusieurs études montrent malheureusement encore un intérêt limité en pathologie
thyroïdienne car, en dehors de la classe PTC, très peu
de variants de tumeurs folliculaires sont explorés et
leurs caractéristiques histologiques restent souvent
imprécises (11, 12).
Validation des biomarqueurs de classe
Si l’identification d’un seul biomarqueur d’une classe
donnée est utopique, plusieurs études proposent un
nombre restreint de marqueurs (3 à 10) qui permettent non pas de réaliser la bonne classification des
tumeurs étudiées mais d’en définir le potentiel malin
(9, 13-15). Ces marqueurs de malignité sont cependant
toujours définis en utilisant un nombre restreint de
classes. Une étude plus récente montre la nécessité
de 20 biomarqueurs pour la seule classification des
cancers papillaires (11). Les cancers papillaires représentent pourtant la classe la mieux caractérisée d’un
point de vue moléculaire. Il est important de constater que, en dehors des marqueurs identifiés pour la
classe des cancers papillaires, les différentes études
d’expression ne permettent actuellement pas d’identifier des marqueurs communs pour la classification
des tumeurs folliculaires.
Dans tous les cas, le nombre de marqueurs à sélectionner ne pourra être défini que si un nombre suffisant de
classes pathologiques est exploré. L’intérêt des clusters
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Classification moléculaire des tumeurs thyroïdiennes
de gènes repose sur le fait que la dérégulation de leur
expression est rapportée à une fonction. Il faut alors
plutôt s’orienter vers la recherche des meilleurs marqueurs de cette fonction spécifiquement dérégulée
dans la classe tumorale d’intérêt. Faut-il à tout prix
valider ces biomarqueurs au niveau protéique ? Tous
les biomarqueurs de la fonction dérégulée ne seront
pas aussi pertinents comme marqueurs protéiques
utilisables en immunohistochimie. Quel que soit le
tissu exploré, les variations du transcriptome et du
profil protéique sont discordantes dans 30 % des cas.
En dehors du problème de la disponibilité en anticorps
commerciaux, il faut donc aussi tenir compte des modifications traductionnelles de ces ARNm dérégulés. En
regard du nombre restreint de cas nécessitant une
classification moléculaire complémentaire à la classification histologique, il est peut-être plus judicieux de
réaliser une analyse d’expression ciblée plutôt que de
proposer un panel très vite contraignant de marqueurs
en immunohistochimie. L’intérêt du transcriptome
réside vraiment dans sa capacité à identifier puis à
explorer un panel de biomarqueurs, sans véritables
contraintes liées à la quantité de matériel biologique
ou au nombre de marqueurs à tester.
Conclusion
Si la sensibilité de l’outil d’analyse du transcriptome
a maintenant fait ses preuves et peut être appliquée
à l’exploration de quelques cellules (microdissection,
cytoponction), la pertinence des biomarqueurs identifiés dépend entièrement de l’échantillonnage des
tumeurs explorées. L’utilisation de nouvelles approches,
telles que l’étude des profils de microARN, sera confrontée au même problème d’échantillonnage. En dehors
de la classe des cancers papillaires, pour laquelle il y
a suffisamment d’études d’expression permettant de
converger vers une vingtaine de biomarqueurs réellement spécifiques, peu de marqueurs de classes folliculaires peuvent encore être proposés avec certitude.
Pour autant, l’information est sûrement pour partie déjà
présente, sous les dénominations “nodules chauds/
froids”, “tumeurs bénignes” sans autre précision, qui sont
très généralement les tissus “témoins” des études portant sur les cancers papillaires. L’intérêt de poursuivre
ces études réside dans la pertinence de l’identification
de biomarqueurs de groupes plus marginaux (TPMI,
adénomes microfolliculaires, tumeurs oncocytaires)
et de la révélation de leur valeur pronostique.
■
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