Universite de Sherbrooke Evaluation de traceurs pour cibler les recepteurs peptidiques

Universite de Sherbrooke
Evaluation de traceurs pour cibler les recepteurs peptidiques
surexprimes dans les cancers du sein
Redige par
Veronique Dumulon-Perreault
Departement de Medecine
Nucleaire et Radiobiologie
Memoire presente a la Faculte de
Medecine et des Sciences de la Sante
En vue de l'obtention du grade de
Maitre es Sciences (M.Sc.)
En Sciences des Radiations et Imagerie Biomedicale
Membresdujury:
Frar^ois Benard, co-directeur de maitrise, Dep. de Medecine Nucleaire et
Radiobiologie
Brigitte Guerin, co-directrice de maitrise, Dep. de Medecine Nucleaire et
Radiobiologie
Benoit Paquette, Dep. de Medecine Nucleaire et Radiobiologie
Danielle Jacques, Dep. d'anatomie et biologie cellulaire
26 aout 2009
1*1
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1*1
Canada
RESUME
Le cancer du sein est le cancer le plus repandu chez les Canadiennes. Grace aux
avancees technologiques et scientifiques, 1'incidence de ce cancer est stable depuis une
quinzaine d'annee et le taux de mortalite diminue. Le plus important dans le traitement du
cancer est un diagnostic precoce et un suivi de la therapie bien adapte au type de cancer.
La tomographie d'emission par positrons (TEP) permet de visualiser la distribution
spatiale et temporelle de molecules radiomarquees. Le principal traceur utilise en
oncologic, le 2-deoxy-2-[18]Fluoro-D-deoxyglucose (18[F]FDG), est un analogue du
glucose. II permet de visualiser les tumeurs et d'evaluer le metabolisme du glucose dans
les cellules. Par contre, il a une lacune importante : il n'est pas specifique aux cellules
cancereuses car il marque les cellules qui ont un metabolisme du glucose eleve. Malgre
cela, le FDG reste un traceur tres utilise. Cependant, le developpement de nouveaux
composes specifiques a certains recepteurs surexprimes dans differents types de cancer
reste une idee a exploiter afin d'ameliorer l'imagerie TEP.
Le neuropeptide Y (NPY) est un peptide de 36 acides amines qui est un
neurotransmetteur tres abondant dans le systeme nerveux central et peripherique. II a
plusieurs roles physiologiques importants. II est un stimulateur puissant de la prise de
nourriture, un anxiolytique et un puissant vasoconstricteur. Quatre types de recepteurs
humains ont ete clones, soient: Y1R, Y2R, Y4R et Y5R. Le recepteur Yl est present dans
85% des carcinomes mammaires primaires chez l'humain. Dans les tissus sains, le
recepteur Y2 est exprime de facon predominate tandis que sur les cellules cancereuses,
c'est l'expression du recepteur Yl qui predomine. Le ratio de l'expression Yl/Y2 pourrait
done etre exploite afin de detecter de facon plus precoce le cancer du sein.
La bombesine (BBN), un peptide de 14 acides amines, a ete decouvert chez la
grenouille Bombina Bombina. L'equivalent humain du BBN, le GRP possede 27 acides
amines. La bombesine se lie a 3 types de recepteurs humains dont le recepteur a relache
de gastrine (GRPR). II est surexprime dans 65% des cas de carcinomes canalaires in situ.
Le GRPR peut egalement etre utilise comme marqueur du caractere malin dans les cas de
cancer.
Un heterodimere est l'union de deux molecules differentes pour n'en former
qu'une seule. Du au fait que les recepteurs Yl et GRP ne sont pas surexprimes dans 100%
des cas de cancer du sein l'utilisation d'une seule molecule qui ciblerait a la fois les deux
recepteurs serait avantageuse pour l'imagerie du cancer du sein. Les avantages a
l'utilisation d'un heterodimere plutot qu'un melange de deux composes radioactifs sont:
une dose de radioactivite administree moins grande pour le meme resultat et les
interactions possibles entre les composes sont evitees. Puisque deux recepteurs
surexprimes dans les cas de cancer du sein sont vises du meme coup par le peptide, une
plus grande captation tumorale est attendue.
Des analogues du GRP ont deja ete l'objet d'etudes dans notre laboratoire. Ces
analogues ont ete developpes pour l'imagerie TEP du cancer de la prostate mais, ont
egalement fait l'objet d'experimentations sur des lignees cellulaires de cancer du sein
humain.
Le premier objectif de l'etude est de developper un peptide capable de lier
specifiquement le r6cepteur Yl du NPY dans les cas de cancer du sein. Le second objectif
est de developper un peptide heterodimere ciblant preferentiellement les recepteurs Yl et
GRP dans les cas de cancer du sein. Les peptides seront combines a un radio-isotope, le
64
Cu, afin de permettre l'imagerie TEP. Plusieurs techniques seront utilisees pour
caracteriser les differents peptides incluant des etudes de competition in vitro, de stabilite
plasmatique ainsi que de biodistribution. Afin d'evaluer tout le potentiel du traceur
heterodimere, une etude comparative entre ce dernier et les deux traceurs monomeres sera
presentee.
Mots-cles : Neuropeptide Y, bombesine, heterodimere peptidique, cancer du sein,
radiotraceur TEP
TABLE DES MATIERES
USTE DES ILLUSTRATIONS
V
LISTE DES TABLEAUX
VII
LISTE DES ABREVIATIONS
VIII
RESUME
XII
INTRODUCTION
1
1- Cancer
1
1.1- Cancer du sein
1
1.2- Cibles peptidiques du cancer
4
2-Neuropeptide Y (NPY)
5
2.1-Description duNPY
5
2.1.1-Recepteur Yl duNPY
6
2.1.2- Recepteur Y2 du NPY
8
2.1.3- Recepteur Y4 du NPY
9
2.1.4- Recepteur Y5 du NPY
9
2.2- Effets du NPY
10
2.2.1 - En general
10
2.2.2- Cancer
11
3- Bombesine
13
3.1- Description de la bombesine
13
3.2- Role de la bombesine
15
3.2.1-En general
15
3.2.2- Cancer
16
4- Heterodimere
17
4.1- Historique
17
II
5- Radiotraceurs
19
5.1- Principe general des radiotraceurs
19
5.2-Traceurs ciblant le recepteur Yl
22
5.3-Traceursciblant les recepteurs Yl et GRP
23
6- Imagerie TEP
25
6.1 - Principe general de l'imagerie TEP
25
6.2- Application de l'imagerie TEP
27
OBJECTIF DE L'ETUDE
29
MATERIEL ET METHODES
31
1 - Synthese des peptides
31
2- Marquage avec du 64Cu
32
3- Culture de cellules mammaires
33
4- Essais de competition in vitro
35
5- Essais in vivo
37
6- Essais de stabilite plasmatique
39
RESULTATS
40
1- Peptides ciblant le recepteur Yl
40
2-Peptides ciblant les recepteurs Yl etGRP
48
DISCUSSION
54
1- Peptides ciblant le recepteur Yl
54
2-Peptides ciblant les recepteurs Yl etGRP
62
III
CONCLUSION
70
PERSPECTIVES D'AVENIR
73
REMERCIEMENTS
76
BIBLIOGRAPHIE
77
ANNEXES
92
IV
LISTE DES ILLUSTRATIONS
Figure 1 : Representation du Neuropeptide Y
5
Figure 2 : Representation d'un recepteur a NPY avec ses sept domaines
transmembranaires
6
Figure 3 : Representation schematique de la liaison double possible avec un
heterodimere ciblant les recepteurs Yl et GRP
24
Figure 4 : Scanner TEP pour petits animaux
26
Figure 5 : Structure du 18F-FDG
27
Figure 6 : Cultures cellulaires de MCF-7 et T-47D
34
Figure 7 : Courbe de competition de differents peptides ciblant le recepteur Yl
deplacant le 125I-NPY sur les cellules MCF-7
41
Figure 8 : Histogramme du pourcentage de la dose injectee par gramme de tissu
pourle(64Cu/DOTA)Lys4-BVD15
43
Figure 9 : Histogramme du pourcentage de la dose injectee par gramme de tissu
pourle(64Cu/DOTA)-Aoc-BVD15
46
Figure 10 : Courbe de competition du DOTA-Heterodimere deplacant le
125
I-BBN sur les cellules T-47D
50
Figure 11 : Courbe de competition du DOTA-Heterodimere deplacant le
125
I-NPY sur les cellules MCF-7 et T-47D
51
Figure 12 : Histogramme du pourcentage de la dose injectee par gramme de tissu
pour le (64Cu/DOTA)-Heterodimere
53
Figure 13 : Structure duBVD 15
54
Figure 14 : Structure du DOTA-Aoc-BVD 15
55
Figure 15 : Structures duLys2-BVD 15 etdu Lys4-BVD 15
56
V
Figure 16 : Structure du (DOTA)Lys4-BVD 15
57
Figure 17 : Representation schematique de la conformation helico'idale du
(DOTA)Lys4-BVD15
61
Figure 18: Structure du DOTA-Aoc-BBN(6-14)
62
Figure 19 : Structure de PHeterodimere 1
62
Figure 20 : Structure de PHeterodimere 2
63
Figure 21 : Structure de PHeterodimere 3
64
Figure 22 : Structure de PHeterodimere 4
65
Figure 23 : Structure de PHeterodimere 5
66
Figure 24 : Structure du DOTA-Heterodimere
67
VI
Liste des tableaux
Tableau 1 : Cibles peptidiques surexprimees dans des cas de cancer (ligand naturel
et recepteurs associes)
4
Tableau 2 : Differents analogues de la bombesine ainsi que les
radiometaux servant a les marquer
14
Tableau 3 : Tableau des constantes d'inhibition (Ki) des peptides ciblant le
recepteur Yl
41
Tableau 4 : Resume des groupes pour les essais in vivo pour les
peptides visant le recepteur Y1
42
Tableau 5 : Distribution de (64Cu/DOTA)Lys4-BVD15 dans des souris balb/c nu/nu
femelles portant des tumeurs MCF-7 et T-47D
43
Tableau 6 : Ratios tumeur/muscle pour le (64Cu/DOTA)Lys4-BVD15
44
Tableau 7 : Distribution de (64Cu/DOTA)-Aoc-BVD15 dans des souris balb/c nu/nu
femelles portant des tumeurs MCF-7 et T-47D
45
Tableau 8 : Ratios tumeur/muscle pour le (64Cu/DOTA)-Aoc-BVD 15
46
Tableau 9 : Pourcentages de cuivre lie et libre lors des stabilites plasmatiques
47
Tableau 10 : Tableau des constantes d'inhibition (Kj) pour le segment ciblant
le recepteur Yl des peptides heterodimeres
49
Tableau 11 : Tableau des constantes d'inhibition (Kj) pour le segment ciblant
le recepteur GRP des peptides heterodimeres
49
Tableau 12 : Distribution de (64Cu/DOTA)-Heterodimere dans des souris balb/c nu/nu
femelles portant des tumeurs MCF-7 et T-47D
52
Tableau 13 : Ratios tumeur/muscle pour le (64Cu/DOTA)-Heterodimere
53
VII
LISTE DES ABREVIATIONS
ADN : acide desoxyribonucleique
a, alpha: Particule stable composee de 2 protons et de 2 neutrons etroitement lies,
analogue a un noyau d'helium 4 et emise au cours d'une disintegration
nucleaire
Aoc : espaceur de type aminooctanoyl
BB1 : recepteur de type 1 de la bombesine
BB2 : recepteur de type 2 de la bombesine
BB3 : recepteur de type 3 de la bombesine
BB4: recepteur de type 4 de la bombesine
BBN: bombesine
p+, beta +: particule beta plus ou positron, particule emise lors de la conversion
d'un neutron en proton
P-, beta -: particule beta moins, particule emise lors de la conversion d'un proton en
neutron
BRS-3: recepteur de type 3 humain de la bombesine
BSA : albumine serique bovine
n
C, carbone-11: isotope radioactif du carbone
CCK: cholecystokinine
CRF: facteur de relache de la corticotropine
64
Cu, cuivre-64: isotope radioactif du cuivre
Cu(II): etat d'oxydation stable du cuivre
DIEA: Diisopropylethylamine
DMF: Dimethylformamide
VIII
DOTA : acide 1,4,7, lQ-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetique
EGF: facteur de croissance de l'epithelium
ER+ : recepteur estrogene positif
FBS : serum foetal bovin
18
F-FDG : 2-deoxy-2-[18F]-fluoro-D-glucose
I8
F, fluor-18 : isotope radioactif du fluor
FGF: facteur de croissance des fibroblastes
Fmoc : Fluorenyl-methoxy-carbonyl
68
Ga, gallium-68: isotope radioactif du gallium
y, gamma: Rayonnement electromagnetique qui prend naissance a l'interieur du noyau
de l'atome
GLP: peptide ressemblant au glucagon
GRP: peptide liberant de la gastrine
GRPR: recepteur du peptide liberant de la gastrine
HATU: 2-(7-Aza-1 H-benzotriazole-1 -yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
hexafluorophosphate
124
I, iode-124: isotope radioactif de l'iode
125
I, iode-125: isotope radioactif de l'iode
IRM: Imagerie par resonance magnetique
keV: kilo electronvolt, unite de mesure d'energie
kDa: kilo Dalton, unite de mesure standard pour la masse des atomes
KJ: constante d'inhibition
13
N, azote-13: isotope radioactif de 1'azote
64
Ni, nickel-64: isotope radioactif du nickel
NK: neurokinine
IX
NMBR: recepteur de la neuromedine-B
NOTA: acide l,4,7-triazacyclononane-l,4,7-triacetique
NPY: neuropeptide Y
NPY Y1R : recepteur Yl du NPY
NPY Y2R : recepteur Y2 du NPY
NPY Y4R : recepteur Y4 du NPY
NPY Y5R : recepteur Y5 du NPY
NPY Y6R : recepteur Y6 du NPY, present seulement chez la souris
NT: neurotensine
PADA : acide 2-picolylamine-N,N-diacetique
PBS : tampon isotonique, tampon phosphate salin
PP : polypeptide pancreatique
PYY : peptide YY
RGD : peptide ayant une sequence arginine-glycine-aspartate
RMN : Resonance magnetique nucleaire
SarAr: 1 -JV-(4-aminobenzyl)-3,6,10,13,16,19-hexaazabicyclo
[6.6.6]eicosane-l,8-diamine
Sst2 : Recepteur de sous-type 2 de la somatostatine
Sst3 : Recepteur de sous-type 3 de la somatostatine
TEM: tomographic par emission mono photonique
SPPS: synthese de peptide en phase solide
99m
Tc: technetium-99m: isotope radioactive du technetium
TEP: tomographie d'emission de positron
TFA: acide trifluoroacetique
TIPS: triisopropyltrimethylsilane
X
VEGF: facteur de croissance de l'endothelium vasculaire
VIP: peptide intestinal vasoactif
64
Zn, zinc-64: isotope radioactif du zinc
XI
INTRODUCTION
1. Cancer
Le cancer est l'une des maladies les plus meurtrieres de notre temps. C'est une
maladie qui prend naissance dans les cellules du corps. Les cellules saines sont regies par
des genes qui leur dictent leur fonctionnement. Les cellules cancereuses proliferent de
facon anarchique et ne repondent plus aux signaux du corps leur disant de s'arreter ou
d'entrer en apoptose. Ces cellules peuvent former des metastases et envahir les tissus
voisins et done de se repandre ailleurs dans le corps. II existe plusieurs types de cancer qui
sont plus ou moins agressifs. L'application du traitement depend du grade (agressivite)
du cancer qui est mesure par la presence ou non de metastases et leur localisation dans le
corps. De nos jours, plusieurs types de cancer sont curables mais dans tous les cas, un
diagnostic precoce et un traitement approprie sont essentiels. La recherche sur le cancer
est done tres importante pour mieux comprendre et combattre cette pathologie
(Association Canadienne du Cancer).
1.1 Cancer du sein
Avec les estimations de 22 400 nouveaux cas diagnostiques en 2008, le cancer du
sein est classifie comme etant le plus repandu chez les Canadiennes selon l'Association
Canadienne du Cancer. Chez les hommes, le nombre de nouveaux diagnostics est de 170
pour 2008. Heureusement, grace aux avancees technologiques et scientifiques, l'incidence
de ce type de cancer s'est stabilised depuis 1993, et le taux de mortalite a legerement
diminue (Association Canadienne du Cancer).
1
Les femmes ont une incidence de cancer du sein plus elevee par rapport aux
hommes car elles possedent une quantite de tissu mammaire plus importante. Ce tissu est
divise en plusieurs parties, soient les glandes mammaires (lobules), les canaux
galactophores, le tissu graisseux et le tissu conjonctif. Pres des seins se situent des canaux
lymphatiques qui peuvent etre impliques dans l'extension locale du cancer initial en
acheminant les metastases vers les ganglions lymphatiques. Plusieurs facteurs de risque
peuvent entrainer une hausse de la probabilite de developper un cancer du sein. lis
peuvent 6tre de nature genetique (hereditaire), environnementale et meme socioeconomique (Association Canadienne du Cancer).
Une des manieres, sinon la meilleure, pour accroitre les chances de reussite du
traitement du cancer du sein est la detection precoce. Elle peut se faire soit par la
mammographie de depistage ou par l'examen clinique des seins et l'autopalpation. Le
diagnostic comprend trois phases: la mammographie diagnostique, l'echographie des
seins et la biopsie. La tomographic d'emission par positrons (TEP), une technique
d'imagerie tres puissante et non-invasive, peut aussi etre utilisee dans le but de poser un
diagnostic precis dans les cas de cancer du sein en plus de pouvoir determiner le stade de
la tumeur et voir si le cancer s'est propage dans d'autres regions du corps via des
metastases (Association Canadienne du Cancer).
2
Une fois le diagnostic donne, les options diverses par rapport aux possibilites de
traitement du cancer du sein sont nombreuses. Les principales sont bien entendu la
chirurgie, la radiotherapie et la chimiotherapie. Selon la nature du cancer, des methodes
alternatives comme l'immunotherapie et l'hormonotherapie peuvent etre utilisees. Le plan
de traitement depend du type de cancer, des caracteristiques de celui-ci, du stade
devolution, de la situation personnelle du patient et de ses desirs. Le traitement peut avoir
plusieurs buts. Premierement, il peut etre fait en prevention afin de bloquer le
developpement eventuel de cellules cancereuses ou pour eliminer les cellules
precancereuses avant leur evolution. Deuxiemement, il peut etre administre comme
traitement principal pour une guerison du patient. Le troisieme but possible est la maitrise
de la tumeur afin qu'elle ne progresse pas et ne se propage pas. Finalement, lorsque la
guerison n'est pas possible, il reste les mesures palliatives qui ont pour but de reduire
temporairement la taille de la tumeur, diminuer les symptomes et ameliorer la qualite de
vie du patient (Association Canadienne du Cancer).
3
1.2 Cibles peptidiques du cancer
A la surface des cellules se trouvent plusieurs recepteurs differents. Les cellules
cancereuses quant a elles, peuvent surexprimer certains de ces recepteurs. Ces derniers
peuvent devenir des cibles de choix dans le developpement de nouvelles molecules pour
traiter et imager de facon specifique les tumeurs. Le tableau 1 resume quelques cibles
peptidiques potentielles qui sont surexprimees dans des cas de cancer (WEINER et
THAKUR, 2002); (REUBI, MACKE et KRENNING, 2005).
Tableau 1- Cibles peptidiques surexprimees dans des cas de cancer (ligand naturel
et recepteurs associes)
Ligand
Somatostatine
VPAC
GRP
NPY
integrines
CCK2
EGF
NT-1
CRF
GLP
NK-1
VEGF
FGF
Recepteur peptidique
SSTR
VIP
GRPR/ recepteur a neuromedine B
recepteurs du NPY
integrines
recepteur CCK-B/gastrine
EGF-R
NT-R
CRF-R
GLP-R
NK-1 R
VEGF-R
FGF-R
2. Neuropeptide Y
2.1 Description du NPY
La famille du neuropeptide Y (Figure 1) comporte trois membres soient: le
neuropeptide Y, le peptide YY et le polypeptide pancreatique (PP). Ces trois membres
possedent 36 residus amines et agissent sur des recepteurs couples aux proteines G
(LARHAMMAR, 1996). Ce peptide a tout d'abord ete isole a partir d'un homogenat de
cerveau de pore (TATEMOTO et al, 1982). Le NPY est le neuropeptide le plus abondant
dans le systeme nerveux central et periphenque (BALASUBRAMANIAM et al, 1990). II
a ete demontre que le NPY est present dans les nerfs sympathiques innervant le coeur et
les vaisseaux sanguins (SHERIFF et BALASUBRAMANIAM, 1992).
Figure 1- Representation du Neuropeptide Y.
Image tiree de : http://en.wikipedia.org/wiki/Neuropeptide_y
5
Le NPY se lie au recepteur du m6me nom (Figure 2). L'6quipe de Wahlestedt
(WAHLESTEDT, YANAIHARA et HAKANSON, 1986) fut la premiere a proposer
l'existence de plusieurs types de recepteur au NPY en 1986. II existe 5 types de recepteurs
au NPY soient: Y1R, Y2R, Y4R, Y5R et Y6R present seulement chez la souris (LIN,
BOEY et HERZOG, 2004).
Figure 2- Representation d'un recepteur a NPY avec ses sept domaines
transmembranaires
Image tiree de : http://www.medfarm.neuro.uu.se/larhammar.html
2.1.1 Le recepteur Yl du NPY
C'est en 1990 que le recepteur de type Yl a et6 clone" de l'ADN complementaire
de rat ou il a d'abord et£ rapport^ comme un recepteur orphelin (EVA et al., 1990). Le
clonage du recepteur humain du NPY Yl a &6 realise 2 ans plus tard soit en 1992. Le
gene codant pour le recepteur se situe sur le chromosome 4 en position q. Le recepteur est
une glycoprot6ine de 70kDa qui comporte 384 acides amines et qui fait partie de la
superfamille de recepteurs couples aux proteines G (SHEIKH et WILLIAMS, 1990). Le
recepteur Yl humain a trois variantes qui sont dues a l'epissage d'une zone en 5' du gene
menant a plusieurs promoteurs qui pourraient etre tissus specifique dans le patron
d'expression (WAN et LAU, 1995); (MICHEL et al, 1998). Differents clones d'ADNc
6
encodant pour le recepteur NPY Yl ont ete isoles (BALL, SHINE et HERZOG, 1995) et
contiendraient des sequences differentes en 5'. Au moins 3 formes transcrites du recepteur
seraient generees a partir de l'epissage alternatif de trois exons en 5'. Dans les regions
promotrices des differentes formes, on peut retrouver des sites de liaison pour certains
facteurs de transcription tels que AP-1, AP-2 et
NF-KB.
Le fait que la transcription du
gene du recepteur NPY Yl soit realisee sous le controle de trois promoteurs differents
actives de facon tissu-specifique, jouerait un role important dans la regulation de
l'expression du NPY Y1R et de ses fonctions dans les differentes reponses physiologiques
(BALL, SHINE et HERZOG, 1995).
II a ete propose que ce sous-type de recepteur doit requerir le NPY complet pour
son activation (WAN et LAU, 1995). Cependant, des etudes recentes ont demontre qu'il
etait possible de reduire la chaine Af-terminale et maintenir une bonne affinite au recepteur
(DANIELS et al, 1995); (ZWANZIGER et al, 2008). Les trois ligands de la famille du
neuropeptide Y peuvent se Her au recepteur de type Yl mais avec des affinites differentes.
Celui ayant la meilleure affinite est le NPY, suivi par le PYY et loin derriere se trouve le
PP (WAN et LAU, 1995); (MICHEL et al, 1998).
Le recepteur Yl est localise dans les lits vasculaires et plusieurs lignees de
neuroblastomes expriment ce recepteur. II est exprime dans 85% des carcinomes
mammaires primaires chez l'humain (REUBI et al, 2001).
7
2.1.2 Le recepteur Y2 du NPY
C'est en 1995 que le recepteur NPY Y2 a ete clone a partir de cellules humaines
SMS-KAN et ensuite de la librairie d'ADN complementaire de cerveau humain. Le
recepteur Y2 est une glycoproteine de 50kDa qui appartient a la superfamille de
recepteurs couples aux proteines G (WAN et LAU, 1995); (SHEIKH et WILLIAMS,
1990); (MICHEL et al„ 1998).
Ce type de recepteur au NPY peut etre active par le NPY et le PYY dans leur
forme complete ou sous forme de long fragment C-terminal (TV-terminal tronque). Le
recepteur interagit principalement avec le cote C-terminal du NPY. Les ligands NPY et
PYY ont des affinites comparables pour le recepteur Y2 et le PP s'y lie tres faiblement
(WAN et LAU, 1995); (MICHEL et ah, 1998).
Le recepteur Y2 se retrouve seulement dans les tissus sains (AMLAL et ah, 2006).
Le recepteur NPY Y2 est situe dans les nerfs peripheriques du cote post synaptique mais
surtout du cote pre synaptique, supprimant la relache de neurotransmetteurs tels la
noradrenaline et la norepinephrine. La majorite des recepteurs NPY dans le systeme
nerveux central de rat serait de type Y2 et localisee en forte densite dans l'hippocampe. II
y aurait tres peu de recepteurs Y2 dans les tissus peripheriques. Egalement, plusieurs
lignees cellulaires de neuroblastomes humains expriment ce recepteur (WAN et LAU,
1995); (MICHEL et ah, 1998).
8
2.1.3 Le recepteur Y4 du NPY
Le recepteur Y4 a ete clone initialement de la librairie genomique de l'humain.
Les etudes demontrent que le ligand primaire endogene du recepteur Y4 serait le PP. Le
meilleur ligand en termes d'affinite est sans conteste le PP humain, suivi de pres par le PP
du rat et, loin derriere, le PYY et le NPY (MICHEL et al, 1998); (GREGOR et al, 1996).
Ce sous-type de recepteur est exprime dans le colon, le petit intestin et la prostate. Le
recepteur Y4 est egalement present dans le foie, la glande thyroi'de, les intestins le cerveau
et les muscles squelettiques (BARD et al, 1995). II est absent ou tres peu exprime dans
les autres tissus peripheriques ainsi que dans le systeme nerveux central (MICHEL et al,
1998).
2.1.4 Le recepteur Y5 du NPY
En 1996, le clonage d'ADN complementaire d'hypothalamus de rat et d'humain
qui encode pour une proteine de 445 ou 456 acides amines selon les rapports a ete realise.
Le gene correspondant vient du chromosome 4 en position q comme pour le recepteur Yl
mais dans une orientation opposee ce qui suggere une co-regulation des deux recepteurs.
Le NPY, le PYY et le PP ont sensiblement la meme affmite pour ce recepteur. Le
recepteur Y5 est present dans plusieurs regions du cerveau de rat dont celles qui sont
reconnues pour jouer un role dans la regulation de la prise de nourriture. (MICHEL et al,
1998)
9
2.2 Effets du NPY
2.2.1 En general
Le NPY a ete rapporte comme etant le plus puisant peptide vasoconstricteur isole
jusqu'a maintenant (BALASUBRAMANIAM et al, 1990); (ZUKOWSKA et al, 2003).
En plus de la vasoconstriction, le NPY inhibe la relache de la noradrenaline. La force
contractile de muscles cardiaques isoles a ete inhibee par le neuropeptide Y. En general,
Pactivite
de
l'adenylate
cyclase
est
egalement
inhibee
par
le
NPY
(BALASUBRAMANIAM et al, 1990). L'implication du NPY a aussi ete demontree dans
le controle de la prise de nourriture (CATZEFLIS et al, 1993) surtout des carbohydrates
(HEILIG et al, 1995). Egalement, le NPY est implique dans le comportement sexuel et
les fonctions reproductrices (CATZEFLIS et al, 1993). De plus, le NPY joue un role dans
l'homeostasie energetique (LIN et al, 2004); (CATZEFLIS et al, 1993), dans la
regulation de la secretion hypophysaire (CATZEFLIS et al, 1993); (PARKER et al,
1996) et dans le rythme circadien (LIN et al, 2004). L'administration de NPY a pour
effet de reduire l'anxiete causee experimentalement (HEILIG, 1995) et hausse la retention
de la memoire (LIN et al, 2004). De recentes etudes sur des agonistes et antagonistes
selectifs revelent que ce seraient les sous-types de recepteurs Yl et Y5 qui seraient
impliques dans la hausse de l'apport alimentaire due au NPY (BALASUBRAMANIAM,
2002). Le NPY central aurait plusieurs effets sur le comportement allant de l'anxiete a la
depression en passant par la memoire. Egalement, selon des etudes, le NPY augmenterait
le traitement de la memoire et la retention d'informations dans plusieurs tests de
comportement (BALASUBRAMANIAM, 2002).
10
2.2.2 Cancer
II a ete rapporte que le PYY diminue la croissance de carcinomes pancreatiques
canalaires chez l'humain. Par contre, le mecanisme par lequel ces effets sont produits
n'est pas tres clair. De plus, le recepteur Yl est present dans 85% des tumeurs primaires
des patients atteints de cancer du sein et dans 100% des metastases presentes aux nodules
lymphatiques. On retrouve recepteur Yl dans les lignees cellulaires MCF-7 et T-47D de
cancer du sein humain (AMLAL et al, 2006). Dans le tissu mammaire sain, le recepteur
Y2 est predominant. Le ratio de 1'expression Y1/Y2 pourrait done etre exploite pour une
detection precoce du cancer du sein.
L'equipe de Amlal a egalement demontre que l'expression du recepteur Yl est
augmentee conjointement avec celle de Pestrogene dans les lignees cellulaires ER+
(AMLAL et al, 2006). Les travaux realises par l'equipe de Ruscica (RUSCICA et al,
2006) sur differentes lignees de cancer de la prostate chez l'humain (LN-CaP, DU145 et
PC-3) suggerent que la croissance de ces cellules seraient regulees par l'activation du
recepteur Yl. La presence de recepteur Yl a aussi ete rapportee dans des tumeurs
ovariennes (KORNER et al, 2004), surrenales (KORNER et al, 2004) et quelques
carcinomes et nephroblastomes (KORNER et al, 2005). L'equipe de Langer (2001) a
marque avec succes deux analogue du NPY (un long et un tronque) avec du99mTc pour un
usage potentiel en imagerie. En utilisant l'acide 2-picolylamine-N,N-diacetique (PADA)
comme chelateur, il a obtenu des composes stables avec soit une liaison non selective
(liaison Yl et Y2) ou une liaison selective pour le recepteur Y2. La stabilite plasmatique
est meilleure pour Panalogue non tronque puisqu'ils n'ont observe aucune degradation
apres 1 heure tandis que l'analogue tronque a une demi-vie plasmatique d'environ 24.7
minutes. Lors des experiences de liaison, l'equipe a demontre que l'analogue complet
11
avait une bonne affinite pour le recepteur Yl mais une meilleure affinite a ete observee
pour le recepteur Y2. Les essais in vivo sous forme de biodistributions ont ete realises
avec l'analogue tronque du NPY. L'equipe de Langer a observe une clairance sanguine
rapide et il semble que la voie d'elimination du produit serait la voie hepatobiliaire et
urinaire. Par contre, lorsque le blocage specifique avec l'analogue non radioactif, utilise
en co-injection, a ete tente, aucune difference n'a ete observee. Par contre, l'equipe de
Langer n'a pas utilise de modele tumoral lors des experimentations in vivo. Suite a ces
tous ces travaux, le recepteur Yl peut etre considere comme une cible pour une detection
precoce du cancer du sein.
12
3. Bombesine
3.1 Description de la Bombesine
La bombesine (BBN) est un peptide compose de 14 acides amines. Le groupe
d'Anastasi (1971) l'a isole pour la premiere fois de la peau d'une grenouille originaire
d'Europe, la Bombina Bombina. Le peptide se retrouve principalement dans le tractus
gastro-intestinal et dans le systeme nerveux central ou il est stocke dans des vesicules. II
est egalement possible de trouver de la bombesine dans certaines cellules neuronales et
neuroendocrines (MOODY et al, 1983). La famille des recepteurs a la bombesine
comporte jusqu'a present 4 membres soient les types 1 a 4 aussi BB1, BB2, BB3 et BB4
(NAGALLAe/a/., 1995).
L'humain possede un peptide equivalent a la bombesine qui se nomme peptide
liberant de la gastrine (GRP) qui comporte 27 acides amines. L'humain n'exprime que le
GRP et possede trois sous-types decouverts a ce jour. Le recepteur du peptide liberant de
la gastrine (GRPR) se retrouve dans le tractus gastro-intestinal, de Poesophage au rectum,
et dans le pancreas (XIAO et al., 2001). Les deux autres types de recepteurs au GRP sont
le recepteur neuromedine B (NMBR) qui se retrouve dans la muscularis mucosa de
Poesophage et finalement, le recepteur de type 3 humain de la bombesine (BRS-3) qui est
present dans les cellules pulmonaires et dans les testicules (FATHI et al, 1993);
(HALMOS et al, 1995). Le ligand naturel et le recepteur portent le meme nom a une
Pexception du ligand naturel du BRS-3 n'est pas decouvert a ce jour (MAINA et al,
2005); (CARLTON et al, 2008).
13
Tout comme les recepteurs au NPY, les recepteurs de la famille de la bombesine
font partie de la superfamille des recepteurs a sept domaines transmembranaires couples
aux proteines G. lis induisent done une transduction du signal via plusieurs voies ce qui
implique, entre autre, une mobilisation rapide du calcium intracellulaire (APRIKIAN et
al, 1996).
Le type de recepteur le plus etudie par sa grande surexpression dans le cancer de la
prostate malin est le type GRPR (PLONOWSKI et al, 2000); (MAINA et al, 2005). Le
tableau 2 presente divers analogues de la bombesine avec quelques metaux radioactifs qui
servent a les marquer pour l'imagerie ou le traitement du cancer (ZHANG et al., 2007);
(SCHUHMACHER J et al., 2005); (SMITH, VOLKERT et HOFFMAN, 2005);
(CESCATO et al., 2008); (NOCK et al., 2003); (ABD-ELGALIEL et al., 2008). En
condition normale, le GRPR se retrouve dans le pancreas (XIAO et al, 2001). II peut etre
associe a l'agressivite de la tumeur ainsi qu'a la transformation neoplasique des cellules
(MARKWALDER et REUBI, 1999).
Tableau 2- Differents analogues de la bombesine ainsi que les
radiometaux servant a les marquer
DOTA PESIN
DOTA-[Lys3]BBN
DOTA-BBN(7-14)
DOTA-BBN(6-14)
AMBA
Demobesinl
Demobesin4
Bomproamide
eW6
W"Lu
64
64
64
Cu
Cu,
177
Cu,
68
177
Lu
99m
Lu
Ga
Tc
99mTc
l11
ln
14
3.2 Role de la Bombesine
3.2.1 En general
En plus d'etre implique dans plusieurs fonctions telles la thermoregulation, la
chimiotaxie, la contraction de certains muscles lisses, 1'augmentation de la satiete et de
l'excretion d'enzymes pancreatiques, la bombesine joue un role dans la croissance de
cellules saines et certains types de cellules cancereuses (MANTEY et al, 1993);
(DESCHODT-LANCKMAN et al, 1976). II a ete prouve que le BBN diminue l'apport
alimentaire. Ces effets sont observes chez plusieurs especes allant du poisson rouge a
l'humain. Les peptides de la famille du bombesin seraient considered comme des
mediateurs physiologiques de la satiete (MOODY et MERALI, 2004). Une alteration des
niveaux de GRPR dans le systeme nerveux central humain est proposee pour jouer un r61e
dans l'anorexie, la boulimie nerveuse et les desordres de l'humeur (MOODY et MERALI,
2004). Dans le tractus gastro-intestinal, il agit en tant qu'hormone paracrine ainsi qu'en
tant que facteur de croissance dans le developpement des poumons (NAGALLA et al.,
1995). Le GRP est egalement capable de stimuler le relachement de plusieurs autres
hormones gastro-intestinal tels que Pinsuline, le glucagon, certains peptides
polypancreatiques, la cholecystokinine, la somatostaine, la motiline, les polypeptides
insulinotropique dependant du glucose, les polypeptides vasoactifs intestinal ainsi que
l'enteroglucagon (PRESTON et al., 1996), (YEGEN, 2003). Au niveau du cerveau, le
bombesin est implique dans 1'activation des axes hypothalamo-adreno-pituitaire et
cerebro-gastrique ainsi que dans la regulation des cycles eveil-sommeil et de la faim
(SCOPINARO et al., 2002).
15
3.2.2 Cancer
Les peptides de la famille GRP sont impliques dans plusieurs cancers humain dont
le poumon, le sein, le colon et la prostate (ZHANG et al, 2006). La densite des GRPR est
bien differenciee entre un carcinome prostatique et une hyperplasie de la prostate. II
pourrait done etre un indicateur d'evenements moleculaires qui ont lieu durant la
carcinogenese de la prostate et aiderait a differencier une hyperplasie d'une neoplasie de
prostate (CHEN, 2004). La presence de recepteurs GRPR a ete confirmee dans le cancer
du sein (PAGANI et al, 1991); (HALMOS et al, 1995) (GUGGER et REUBI, 1999) et
dans d'autres types de cancers (MOODY et al, 1983) (REUBI et al, 2002). II est
surexprime dans 65% des carcinomes canalaires in situ et 68% des formes invasives de
ces carcinomes. 100 % des metastases de ganglions lymphatiques expriment le GRPR
chez des patients avec des carcinomes mammaires GRPR positifs.
L'interaction entre le GRP et son recepteur comme voie de signalisation autocrine
pour stimuler la proliferation a ete rapportee dans plusieurs carcinomes humains. Le GRP
influence la croissance et l'invasivite du cancer de la prostate in vitro. Une autre etude a
montre que la secretion in vivo du GRP pourrait etre responsable de la progression de
tumeurs androgene-independantes par la transactivation et 1'augmentation des recepteurs
a facteurs de croissance epidermaux. Le GRPR a ete demontre comme mitogene, ce qui
pourrait inferer un phenotype malin et etre utilise comme marqueur pour le suivi au
traitement (PARRY, ANDREWS et ROGERS, 2007). Suite a ces etudes, le recepteur
GRPR pourrait etre une cible de choix pour la detection du cancer du sein.
16
4. Heterodimere
4.1 Historique
Plusieurs recepteurs de peptides exprimes dans les cancers humains peuvent etre
cibles avec des ligands radiomarques pour le diagnostic ou la therapie. Le meilleur
exemple est le recepteur a la somatostatine. Le succes de l'imagerie et de la radiotherapie
est de loin superieur pour des tumeurs qui surexpriment les recepteurs a la somatostatine.
Malheureusement, plusieurs types de cellules cancereuses n'expriment pas une forte
densite de recepteurs a la somatostatine mais plutot une grande heterogeneite de soustypes d'autres families de recepteurs. Par exemple, les cellules de cancer du sein
surexpriment d'autres recepteurs peptidiques comme le GRPR et le recepteur Yl du NPY.
Individuellement, aucun de ces peptides n'est exprime dans 100% des cas en quantite
suffisante et avec assez d'homogeneite pour permettre leur identification et determiner la
meilleure therapie a adopter. Le groupe de Reubi (REUBI, GUGGER et WASER, 2002) a
etudie plusieurs types de cancer du sein provenant de 77 patients. lis ont verifie la
quantite et Phomogeneite de differents recepteurs peptidiques presents sur ces tumeurs.
lis en sont venus a la conclusion que l'utilisation d'un cocktail de peptides GRP et NPY
serait optimale pour l'imagerie et le traitement du cancer du sein.
Au lieu d'utiliser un melange de plusieurs peptides, nous proposons l'utilisation
d'une seule molecule composee des deux peptides pour pouvoir cibler les recepteurs GRP
et Yl L'idee de cibler differents recepteurs simultanement comme strategie dans le
developpement et la decouverte de drogue est un concept assez recent (MAMMEN et al,
1998); (HANDL et al, 2004); (MORPHY et RANKOVIC, 2005). Nous esperons que le
fait de cibler deux differentes populations de recepteurs simultanement va mener a
17
l'obtention d'un traceur diagnostique plus performant par rapport aux traceurs diriges
contre un seul type de recepteur. Puisque les peptides homodimeres radio-marques offrent
une meilleure captation tumorale compare aux peptides monovalents (LIU et EDWARDS,
2001) (LIU et ah, 2001); (HARRIS et al., 2007) et puisque la polyvalence est responsable
de ces effets, nous esperons des effets comparables pour nos heterodimeres. Une
explication a cela est l'effet statistique; le detachement du ligand a double action de son
recepteur est plus facilement suivi par son rattachement s'il existe plusieurs copies de
recepteurs a lier (Y1R et/ou GRPR) pres de lui.
L'equipe de Li (2008) a travaille sur le developpement d'un heterodimere
peptidique qui pourrait etre utilise entre autre pour l'imagerie TEP du cancer de la
prostate. Les deux peptides utilises sont le BBN et un peptide ayant une sequence
arginine-glycine-aspartate (RGD) qui se lie a l'integrine avp3. Les cellules du cancer de la
prostate androgene-independante expriment le recepteur GRP et l'integrine av(33 a leur
surface dans les memes proportions. L'equipe a verifie Phypothese selon laquelle le fait
de creer un ligand reconnaissant les deux recepteurs serait plus avantageux qu'une sonde
ne se liant qu'a Pun d'entre eux. Le developpement du nouveau heterodimere peptidique
a ete un succes et Pexperimentation a ete realisee sur la lignee cellulaire PC-3 (cancer de
la prostate androgene-independante). Bien que cette etude a ete effectuee sur un melange
inseparable d'heterodimeres, les resultats ont donne une interaction plus qu'additive pour
Pheterodimere in vivo comparativement aux peptides monomeres. L'effet synergique
observe pour le GRPR et l'integrine serait peut-etre applicable a d'autres peptides visant
d'autres recepteurs.
18
5. Radiotraceurs
5.1 Principe general des radiotraceurs
Un radiotraceur, aussi appele radiopharmaceutique, est un compose radioactif
utilise pour diagnostiquer et/ou traiter de facon therapeutique des maladies humaines. En
medecine nucleaire, 95% des radiopharmaceutiques sont utilises a des fins diagnostiques.
L'effet pharmacologique induit par le produit est minimal car il est utilise en quantite
infime. La difference entre un radiopharmaceutique et un produit radiochimique est qu'un
radiopharmaceutique peut etre administre a l'humain car il est sterile et sans pyrogenes.
Un
radiopharmaceutique
se
doit
d'etre
securitaire
et
non
toxique.
Les
radiopharmaceutiques sont composes d'un radio-isotope et d'un pharmaceutique. II y a
deux choses qu'il faut tenir en compte dans le choix de l'isotope: les rayonnements
doivent etre facilement detectables par les instruments et la dose administree au patient
doit etre minimale (SAHA, 2004).
Pour qu'un radiopharmaceutique soit ideal comme outil diagnostique, il doit
remplir plusieurs criteres. Entre autre, il doit etre facilement disponible, c'est-a-dire qu'il
est facile a produire, peu cher et disponible dans n'importe quel amenagement de
medecine nucleaire. II doit aussi avoir une courte demi-vie effective. De plus, remission
du radio-isotope ne doit pas etre du type a ou 0- mais bien de type P+ ou y car les
emissions a et (3- causent plus de dommages aux tissus normaux environnants que les
emissions y. Finalement, le ratio tissu cible/tissu non-cible doit etre eleve (SAHA, 2004).
19
Plusieurs facteurs entrent en ligne de compte pour developper un bon radiotraceur. Entre autre, la charge de la molecule, sa taille, son attachement aux proteines
plasmatiques et sa solubilite dans une solution physiologique peuvent alterer la clairance
et la distribution des radiopharmaceutiques dans l'organisme. II faut aussi verifier la
stabilite du produit in vitro et in vivo ainsi que sa biodistribution (SAHA, 2004). Pour
qu'un radiopharmaceutique soit utilise in vivo, il doit rencontrer certains pre-requis. Son
affinite pour le recepteur doit etre forte et il doit s'agir le plus possible d'un agoniste pour
favoriser son internalisation. Egalement, la complexation du radio-metal doit se faire a
plus de 99.5% et le produit doit etre stable en conditions physiologiques (HEPPELER et
al, 2000).
II y a eu une forte croissance dans le developpement de peptides radio-marques en
tant que radiopharmaceutiques pour le diagnostic et les applications therapeutiques en
oncologic Les peptides ont plusieurs avantages qui les distinguent des proteines et des
anticorps pour l'imagerie de recepteurs et le ciblage de tumeurs. Ces avantages incluent:
une petite taille, une preparation et le marquage faciles, la possibility d'y attacher un
chelateur, une clairance rapide du sang et des tissus non-cibles, un meilleur ratio
tumeur/bruit de fond, une faible toxicite et une faible immunogenic ite (OKARVI, 1999).
Un des peptides radiopharmaceutiques qui a connu du succes est le
m
In-DTPA-
pentetreotide, un radio-peptide developpe pour l'imagerie avec la tomographie par
emission mono-photonique (TEM) et qui se lie aux recepteurs a somatostatine presents
sur plusieurs tumeurs neuroendocrines. Des peptides similaires ont ete developpes pour
l'imagerie TEP avec du 64Cu ou 68Ga afin d'ameliorer l'efficacite diagnostique de cette
approche en ayant l'avantage de la haute resolution spatiale et la bonne sensibilite du TEP
compare au TEM.
20
Le cuivre-64 ( Cu) est le radio-isotope qui sera utilise pour le developpement de
nos radiotraceurs. L'energie de son positron (0.653 MeV), comparable a celle du F-18
(0.633 MeV), est ideale pour assurer une resolution spatiale optimale en imagerie TEP. II
emet des p+ a 19%, des P- a 40% et fait de la capture electronique avec emission
d'electrons Auger a 41%. Sa demi-vie de 12.8 heures est ideale pour l'imagerie TEP et
permet son utilisation en therapie (HEPPLER et ah, 2000). Le
64
Cu est produit selon la
reaction 64Ni(p,n) 64Cu par bombardement avec des protons sur la cible solide enrichie en
64
Ni. Le 64Cu decroit par emission p en 64Zn qui est un isotope stable ou en 64Ni par
emission p+ et capture electronique. Le Cu(II) forme une classe stable de chelates avec un
chelateur azamacrocyclique comme les cyclenes et les sarcofands tels NOTA, DOTA et
SarAr (PRASANPHANICH et ah, 2007); (BLOWER et ah, 1996); (DI BARTOLO et ah,
2006). Des etudes demontrent que la taille des macrocycles parents a un effet significatif
sur la stabilite in vivo des conjugues marques au 64Cu (BOEWELL et ah, 2004). Puisque
les chelateurs DOTA sont disponibles commercialement, ceux-ci ont ete choisis en
premier pour faire l'optimisation du design de nos peptides radiopharmaceutiques pour le
marquage au 64Cu. L'incorporation du chelateur avec son radio-metal au pharmaceutique
ne doit pas modifier a la baisse son affinite de liaison et sa performance in vivo. Un
espaceur est souvent utilise et doit prevenir l'interaction sterique du chelateur qui contient
le radio-metal avec la region du peptide qui lie le recepteur. La structure et la composition
de l'espaceur peuvent varier pour faciliter la clairance du produit des tissus non-cibles et
du sang (HOFFMAN, QUINN et VOLKERT, 2001).
21
5.2 Traceurs ciblant le recepteur Y l
Le peptide utilise comme produit de depart pour le design du radiotraceur ciblant
le recepteur Yl repose sur la sequence du peptide propose par l'equipe de Daniels, le
BVD15 (DANIELS et al, 2005). Ce dernier, ayant la sequence [Pro30, Tyr32,
Leu34]NPY(28-36), est compose des acides amines 28 a 36 du NPY De plus, il y a eu des
substitutions des acides amines aux positions 30, 32, et 34 par une proline, une tyrosine, et
une leucine, respectivement. II est a noter que le BVD15 possede une affinite pour les
recepteurs Yl, Y2 et Y4 (1/2/1).
Nous avons effectue plusieurs modifications structurales pour integrer un chelateur
sur la molecule afin d'incorporer un cuivre-64 pour son utilisation en imagerie TEP du
cancer du sein et possiblement pour le traitement de ces tumeurs.
Le BVD15 est un antagoniste du recepteur Yl (DANIELS et al, 2005). Au niveau
cellulaire, les antagonistes ne sont pas ou peu internalises dans la tumeur contrairement
aux agonistes. Jusqu'a maintenant, pour avoir une therapie radionucleique ou une
imagerie (TEP,SPECT, etc.) optimale, les scientifiques en etaient a un consensus voulant
que seuls les produits avec une forte internalisation etaient previlegies. Des recherches en
pharmacologie moleculaire ont prouve que l'internalisation efficace etait faite
majoritairement par des agonistes (CESCATO et al, 2006). Recemment, l'equipe de Ginj
a demontre qu'un antagoniste du recepteur de la somatostatine qui internalise faiblement
dans la tumeur se comporte bien, meme mieux, lors de la captation tumorale in vivo chez
l'animal que l'agoniste correspondant qui lui, internalise enormement (GINJ et al, 2006).
Les observations ont ete faites avec un produit liant le sst2 et le sst3. lis ont emis
l'hypothese que, puisque l'antagoniste etait meilleur sur deux recepteurs couples aux
proteines G differents, il pourrait en etre de meme pour d'autres types de recepteurs
22
couples aux proteines G. L'equipe de Cescato a compare un agoniste et un antagoniste du
recepteur GRP comme agent ciblant les tumeurs. L'antagoniste du recepteur GRP, le
Domesin 1, a montre une tres faible internalisation compare a l'agoniste, le Domesin 4.
Malgre cela, la captation tumorale in vivo sur la lignee cellulaire de cancer de la prostate
PC-3 etait de loin superieure pour l'antagoniste meme 24 heures post-injection
(CESCATO et ah, 2008). II est done possible de dire que le choix d'antagonistes plutot
que d'agonistes ne s'applique pas uniquement aux recepteurs de somatostatine mais
potentiellement a beaucoup d'autres recepteurs couples aux proteines G.
5.3 Traceurs ciblant les recepteurs Y l et GRP
Pour la conception d'un heterodimere peptidique capable de se lier a la fois aux
recepteurs GRP et Yl (Figure 3), nous avons utilise deux peptides monomeres : le BVD
15 et le [D-TyApAla11, Thi13, Nle14]BBN(6-14) (ci-apres appele BBN(6-14)). Plusieurs
types d'arrangements peptidiques peuvent etre utilises pour relier les deux peptides : tetea-queue, tete-a-tete, queue-a-queue. Par exemple, Parrangement tete-a-queue relie la
partie C-terminale d'un peptide a la partie Af-terminale de l'autre. Un peptide peut
egalement etre attache via un espaceur a la chaine laterale de l'autre peptide, ce qui laisse
plus d'extremites libres pour l'interaction avec le recepteur. Nous avons etudie plusieurs
arrangements peptidiques afin d'obtenir la combinaison optimale ou les deux segments
peptidiques se lient avec une forte affinite a leur recepteurs respectifs. Pour une etude
comparative,
nous
avons
egalement
synthetise
le
DOTA-Aoc-[D-Tyr6,|3-
Ala",Thi13,Nle14]BBN(6-14). Ce compose a une excellente affinite in vitro pour le
recepteur GRP lorsqu'il est teste sur des cellules tumorales, les valeurs de Kj etant de
231.60 nM and 16.21 nM pour les cellules PC-3 et T-47D respectivement.
23
Figure 3- Representation sch6matique de la liaison double possible avec un heterodimere
ciblant les r&epteurs Yl et GRP
24
6. Imagerie TEP
6.1 Principe general de l'imagerie TEP
La TEP est une technique d'imagerie moteculaire qui utilise des isotopes 6mettant
des positrons (p+), permettant alors de visualiser la distribution spatiale et temporale des
molecules radiomarquees qui interagissent avec divers processus biologiques de
1'organisme (CHERRY et GAMBHIR, 2001); (PHELPS, 2000). Les isotopes &nettant
des P+ sont produits a l'aide d'un cyclotron alors que des protons ou deuterons entrent en
collision avec une cible specifique d'etements stables. Lors de la disintegration d'un
radioisotope resultant, un positron et un neutrino sont emis. Apres injection du
radiotraceur, la distance parcourue par le positron est tres faible (de l'ordre du dixieme de
millimetre). Lorsque le positron entre en collision avec un electron, il est annihile et deux
photons d'une 6nergie de 511 keV chacun sont emis a 180° l'un de l'autre. L'energie des
photons, ou rayons gamma, est independante de 1'isotope utilise" ce qui veut dire que deux
isotopes differents ne peuvent pas etre images en meme temps puisque les detecteurs ne
feront pas de distinction entre les deux. La detection des deux gammas par des detecteurs
opposes situes sur un anneau du tomographe (Figure 4) est simultanee. II est ensuite
possible d'analyser les ev6nements recueillis avec des techniques de reconstruction et
d'evaluer la distribution du radiotraceur a l'interieur de 1'organisme, ce qui requite en des
images TEP (CHERRY et GAMBHIR, 2001); (LECOMTE et al, 2002).
25
Figure 4- Scanner TEP pour petits animaux
Image tir6e de : http://www.rscv.org/Phenotypage/LaboTEP.asp
Plusieurs isotopes produisent des positrons lors de leur disintegration. Les plus
utilises lors de l'imagerie TEP sont le fluor-18, l'azote-13, le carbone-11, le cuivre-64, le
cuivre-62 et l'iode-124. Ces isotopes ont une demi-vie variant entre 4.17 jours (1-124) et
10 minutes (N-13) (CHERRY et GAMBHIR, 2001). L'utilisation de 1'imagerie TEP peut
se faire de deux manieres difftrentes. Premierement, il est possible de faire de l'imagerie
dite statique, c'est-a-dire que l'acquisition des images est faite sur un sujet immobile. Le
type d'image produite est en trois dimensions. Deuxiemement, une image de style
dynamique peut etre produite pour voir ('accumulation dans le temps du radiotraceur dans
Porganisme.
La forme d'imagerie r£alis6e avec la TEP est dite fonctionnelle et non anatomique.
Ce sont les processus biologiques a Pinterieur de Porganisme qui sont visualises a Pinstar
d'imagerie anatomique telle que l'imagerie par resonance magnetique (IRM) qui image
des structures comme des os, le coeur, etc.
26
6.2 Application de l'imagerie TEP
L'imagerie TEP possede plusieurs applications aussi bien en recherche qu'en
clinique. Le radiotraceur le plus utilise en clinique est le 2-deoxy-2-[18]Fluoro-Ddeoxyglucose (18[F]FDG) (Figure 5) qui est un analogue du glucose. II est utilise, entre
autre, pour visualiser differents types de cellules cancereuses. Son utilisation repose sur le
fait que le glucose est une source d'energie importante pour les cellules et que les cellules
cancereuses ont un metabolisme du glucose plus eleve que les cellules saines. Un manque
de specificite est associe a cette approche. Le 18[F]FDG permet de detecter seulement les
cellules cancereuses qui presentent une augmentation de leur metabolisme glucidique.
HO -^\~~~^/^
°v
18F
18
FDG
Figure 5- Structure du 18F-FDG
Lorsque combinee a differents modeles mathematiques, la TEP permet de
determiner l'apport des cellules en oxygene ou en glucose (BENTZEN et al, 2003). A la
suite d'un infarctus, la TEP permet egalement de determiner la perfusion sanguine
(CROTEAU et al, 2003). Comme autre type de traceur, il y a l'acetoacetate marque au
carbone-11 qui a fait l'objet d'une etude pour son utilisation en tant que traceur pour
determiner l'apport en corps cetoniques de tumeurs de la prostate (AUTHIER et al,
2008). Plusieurs autres traceurs sont utilises dans l'imagerie TEP tels le FLT pour
mesurer la synthese d'ADN, le NH3 pour visualiser la perfusion myocardique, le FCH
27
pour imager le cancer de la prostate et le FES qui cible les r6cepteurs hormonaux du
cancer du sein. Outre le domaine oncologique, l'imagerie TEP est aussi utilisee dans
plusieurs autres spheres de la medecine diagnostique. Par exemple, il a ete demontre que
dans la maladie d'Alzheimer, les fonctions cognitives sont alterees. L'imagerie TEP a ete
utilisee pour verifier la progression de la deterioration des fonctions cognitives en
imageant la combustion du glucose ou la vascularisation cerebrale (SALMON et ah,
2008). Plusieurs dizaines de radiotraceurs cerebraux sont disponibles. Un de ceux-ci, le
medicament Raclopride, est utilise couple au carbone-11 pour imager les recepteurs a
dopamine dans le cerveau lors de problemes psychotiques tels que la schizophrenic II y
aurait des evidences cliniques qui prouveraient qu'il y a une reponse anormale de
dopamine lors d'un stress (SOLIMAN etal, 2008).
28
OBJECTIF DE L'ETUDE
L'imagerie TEP occupe une place de tout premier plan dans le domaine
biomedical et son impact s'accroit rapidement dans le diagnostic et, plus recemment, dans
la therapie. L'imagerie TEP du cancer n'est presentement pas sans faille. Les
radiotraceurs utilises de nos jours pour ce type d'imagerie, tel le 18F-FDG, permettent de
visualiser l'activite metabolique cellulaire. Presentement, l'imagerie TEP au 18F-FDG se
base sur le principe que l'activite metabolique des cellules cancereuses est plus elevee que
celle les cellules saines et que, par consequent, elles vont capter plus de FDG.
Malheureusement, ce ne sont pas tous les types de cellules cancereuses qui ont un
metabolisme du glucose eleve et l'agressivite de la tumeur ne peut pas etre determinee.
L'imagerie des cellules cancereuses au niveau du sein serait plus efficace s'il etait
possible, avec des traceurs hautement specifiques, de cibler des recepteurs surexprimes a
la surface des cellules cancereuses.
29
L'objectif de cette etude est de developper et d'evaluer deux traceurs peptidiques,
specifiques a des marqueurs de cellules cancereuses au niveau du sein, pour l'imagerie
TEP. Plusieurs techniques seront utilisees pour caracteriser les differents peptides. Afin de
determiner l'affinite des peptides des etudes de competition in vitro seront faite. Des
etudes de stabilite plasmatique ainsi que de biodistribution seront conjointement
executees pour valider Pintegrite et la specificite de liaison des peptides. Le premier
peptide, le 64Cu(DOTA)Lys4-BVD15, est un analogue du neuropeptide Y qui se lie
preferentiellement au recepteur Yl surexprime a la surface des cellules de cancer du sein.
Le deuxieme traceur utilise est un heterodimere compose des segments peptidiques
analogues au NPY et a la bombesine qui cible le recepteur du peptide relachant la gastrine
(GRPR) surexprime a la surface des cellules de cancer du sein et de la prostate. Les
traceurs heterodimeres utilises pour l'imagerie TEP du cancer du sein pourraient offrir
une plus grande captation et retention a la tumeur. En ciblant le recepteur a la bombesine
(le GRPR), il serait egalement possible de predire l'agressivite de la tumeur puisque
l'expression de ce recepteur est associee a une tumeur agressive.
30
MATERIEL ET METHODES
1. Synthese des peptides
Les peptides ont ete synthetases et marques par Pequipe du Pr Brigitte Guerin
comprenant: Marie-Claude Tremblay, Samia Ait-Mohand et Mme Guerin elle-meme. Les
peptides amindes sont prepares par synthese de peptides en phase solide Fmoc (SPPS) sur
un systeme de synthese de peptides a debit continu Pioneer™ avec une resine
NovaSyn®TGR. Un exces de 2 fois d'acides amines proteges avec le Fmoc sur une resine
est utilise pour le couplage. Les acides amines proteges sont actives pour le couplage avec
une quantite equimolaire de HATU et 2 equivalents de DIEA. La deprotection Fmoc est
faite dans 20% piperidine dans du DMF. Apres la deprotection de l'acide amine en Nterminal, un espaceur protege en JV-terminal par un Fmoc et un chelateur de cuivre sont
introduit sur la resine lorsque requis. Le clivage du peptide de la resine peut se faire en
utilisant une solution de TFA : eau : TIPS (95% :2.5% :2.5%). Quand le DOTA fait
partie du peptide, le TIPS de la solution de clivage est remplace par du thioanisole. La
purification du peptide est faite par chromatographie Flash sur un systeme Biotage SP4
utilisant une colonne Cig. L'identification des peptides est etablie en mesurant leur valeur
respective de masse/charge (m/z) avec un spectrometre de masse MALDI en utilisant
Micromass TofSpec 2F.
31
2. Marquage avec du
Cu
Le 64Cu a une energie de positron similaire au 18F et a une demi-vie de 12.7
heures. Notre cyclotron a ete le premier au Canada a fournir ce radio-isotope de facon
routiniere pour la recherche, utilisant un systeme de cibles developpe en collaboration
avec TRIUMPH (ZEISLER et al., 2003). Le cuivre-64 est prepare avec un cyclotron TR19 (Advanced Cyclotron Systems, Richmond, BC, Canada) avec la reaction 64Ni(p,n)64Cu
en utilisant une cible de 64Ni electroplaquee sur un disque solide de rhodium (22mm de
diametre, 1mm d'epaisseur). Le 64Ni est achete d'Isoflex (San Fransisco, CA). Le 64CuCl2
est recupere de la cible selon la methode de McCarthy (MCCARTHY et al., 1997) et
converti en 64Cu-acetate en dissolvant le 64CuCl2 ans 1ml d'acetate d'ammonium (0.1M ;
pH 5.5), suivi par une evaporation a sec. Les peptides lies au DOTA sont marques avec le
64
Cu en suivant la methode de Chen (CHEN et al., 2004). Le 64Cu-acetate est ajoute au
peptide (0.5ug/mCi de 64Cu) dans un tampon 0.1N de NaOAc a 50°C pour 1 heure. Le
[64Cu]-DOTA-peptide est purifie utilisant un systeme de chromatographic Water 600 avec
une colonne C]8 Spherisorb ODS2 I0\i (10 X 250mm). Le gradient utilise est compose de
5% a 70% CH3CN (0.1% TFA) dans l'eau (0.1% TFA) durant 40 minutes. Les solvants
sont evapores et l'activite est reconstituee avec 10% d'intralipide dans du PBS et passe
dans un filtre Millipore 0.22um dans une fiole sterile multidose pour les etudes in vitro et
animales. L'activite specifique des peptides marques variait de 1200 Ci/mmol a 4000
Ci/mmol.
32
3. Culture de cellules mammaires
Deux lignees cellulaires de cancer du sein humain et une de cancer de la prostate
humain sont utilisees. La premiere, la lignee MCF-7 (Figure 6a), provient d'un
adenocarcinome mammaire humain tandis que la deuxieme, la lignee T-47D (Figure 6b),
provient d'un carcinome canalaire mammaire humain. La troisieme, la lignee PC-3, est
une lignee d'adenocarcinome de la prostate humain. Toutes les lignees proviennent de
American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Les trois lignees
cellulaires sont maintenues dans leur milieu de culture respectif, soit du DMEM pour les
MCF-7, du RPMI pour les T-47D et du HAM'S F12 pour les PC-3, supplements avec
10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1 U/ml penicilline G, l^g/ml streptomycine et 2 |ig/ml
amphotericine B, le tout a 37 °C avec 5% de CO2. La composition des milieux de culture
est presentee en annexe (annexe 4).
33
a)
ATCC Number: HTB-22
Designation:
MCF-7
s
ISSSSI
Hiah Densttv
b)
ATCC Number: HTB-133
Designation:
T-47D
mm
LOW Density
m
Scats Bar = !0O|jm
Figure 6- Cultures cellulaires de MCF-7 (a) et de T-47D (b)
Images tiree de : ATCC.org
34
4. Essais de competition in vitro
Afin de determiner l'affinite des differents peptides envers les recepteurs Yl et
GRP, des etudes de competition sur cellules cancereuses sont effectuees. L'affinite pourra
etre verifiee en calculant les valeurs de constante d'inhibition des differents peptides.
Environ deux a trois jours avant 1'experimentation, les cellules sont ensemencees dans des
plaques de 24 puits a raison de 75 000 cellules par puits et cultivees ainsi avec le milieu
de culture approprie. Une heure avant l'experience, le milieu de culture est retire et
remplace par 400ul d'un milieu de reaction compose de RPMI supplemente avec 4,8
mg/ml d'HEPES, 1 U/ml penicilline G, lug/ml streptomycine, et 2mg/ml BSA. Par la
suite, les ligands (radioactifs et non-radioactifs) sont ajoutes a raison de 50ul chacun par
puits pour un volume total de 500ul par puits. La concentration du ligand radioactif est
maintenue constante tandis que celle du ligand non-radioactif est croissante. Une
competition controle avec le ligand naturel des recepteurs est toujours effectuee en
parallele pour verifier la validite des resultats finaux. Les plaques sont placees dans un
bain agitateur a 37 °C pendant 40 minutes. Par la suite, pour retirer les ligands non lies
aux recepteurs, le milieu est retire et les cellules sont lavees trois fois avec du PBS a
temperature piece. Les cellules sont ensuite decollees en utilisant 500 ul de
trypsine/EDTA par puits. Les cellules sont recoltees et placees dans des tubes en
polystyrene et la radioactivite restante est comptee dans un compteur gamma (Cobra II
auto-gamma counter, Packard, MN, USA).
1 2S
Lorsque les analogues du BVD15 sont testes, le ligand radioactif utilise est le
I-
NPY (Perkin-Elmer Life science Products, Boston, MA, USA) et le ligand naturel utilise
pour la courbe standard est le NPY (Calbiochem, Gibbstown, NJ, USA). La concentration
finale du 125I-NPY dans le puits est de l'ordre de 1x10"" M. Les concentrations de ligand
35
non-radioactif varient de lxlO"13 M a lxlO"5 M et sont obtenues par dilutions en serie a
partir d'une solution mere 1 mM. Lorsque les heterodimeres sont testes, il faut faire les
essais de competition pour chaque peptide present sur la molecule. Les details pour le
segment ciblant les recepteurs Yl sont les memes que pour les analogues du BVD15
decrit ci-haut. Pour le segment ciblant les recepteurs GRP, le ligand radioactif utilise est
le ,25I-BBN (Perkin-Elmer Life science Products, Boston, MA, USA) et le ligand naturel
est le BBN (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, USA). La concentration finale du
125
I-BBN
dans les puits est de l'ordre de lxlO"12 M. Les concentrations de ligand non-radioactif
varient de lxlO"14 M a lxlO"6 M et sont obtenues par dilutions en serie a partir de la
solution mere a 1 mM.
Les resultats sont ensuite compiles avec le logiciel GraphPad Prism 5 (Graph-Pad
Software, San Diego, CA, USA) et une courbe de competition est generee. Le EC50 est
calcule par le logiciel et est utilise pour determiner la valeur de la constante de
dissociation (Kj) (equation 1) qui est, par la suite, utilisee pour calculer la constante
d'inhibition (Kj) a partir de 1'equation 2 suivante :
Kd = EC50 - [ligand radioactif]
'
+
(1)
[radioligand]
K~d
La valeur du Kj represente Paffinite d'un ligand pour un recepteur. Plus la valeur du Kj est
elevee, plus faible est l'affinite.
36
5. Essais in vivo
Afin de valider que la specificite de la liaison des peptides marques au Cu aux
cellules tumorales est toujours presente in vivo, des etudes de biodistribution sont
realisees. Les lignees cellulaires MCF-7 et T-47D sont implantees a raison de lOxlO6
cellules chacune de facon sous-cutane sur les hanches de souris. Le type de souris utilise
est balb/c nu/nu femelle. Ces souris sont immuno-supprimees, ce qui permet
1'implantation de cellules cancereuses issues de lignees humaines. Afin de faciliter le
developpement des tumeurs provenant de cellules ER+ dans Panimal, des pastilles
d'estradiol ont ete inserees sous-cutane trois jours avant l'injection des cellules. Les
tumeurs prennent environ 5-6 semaines pour atteindre le diametre requis pour les essais,
soit 5 mm. Au debut de l'experience, les animaux sont anesthesies avec un melange
d'isoflurane et oxygene a 2 % et 1.5 L/min respectivement. Les souris sont canulees via la
veine caudale pour l'injection du produit radioactif. Lorsqu'il s'agit d'un groupe de souris
co-injectees, une quantite preetablie de peptide non-radioactif est injectee en meme temps
que le radiotraceur. Le produit marque au Cu-64 formule avec 10% intralipide dans le
PBS a pH 6 est injecte a raison de 5-10 uCi par souris et le volume d'injection ne doit pas
depasser 200 u.1. Lorsque necessaire, le produit est dilue dans du PBS pour atteindre le
volume requis. Les souris sont retournees dans leur cage durant 60 ou 120 minutes afin
que le produit diffuse dans l'organisme et atteint Pequilibre. Les animaux sont anesthesies
de nouveau pour effectuer le prelevement sanguin a partir de la veine femorale. Par la
suite, l'euthanasie est pratiquee par inhalation de CO2. La dissection est effectuee et 18
organes, incluant les deux tumeurs, sont recueillis et places dans des tubes pre-peses. Ces
tubes sont peses de nouveau et places dans le compteur gamma (Cobra II auto-gamma
counter, Packard, MN, USA) pour calculer la radioactivite presente dans chaque organe.
Les resultats sont compiles et presentes sous forme de pourcentage de dose injectee par
37
gramme de tissu (% d.i./g). Les ratios organes cible-non cible (tumeur-muscle) peuvent
egalement etre calcules.
Lors des essais in vivo pour le (64Cu/DOTA)Lys4-BVD15, les groupes recevant
une co-injection sont injectes avec 0.5 mg ou 1 mg par souris de Lys4-BVD15, un
analogue du BVD15 ayant une tres bonne affinite pour les recepteurs Yl in vitro, le Kj
etant de 7 ± 3 nM. Pour obtenir une bonne co-injection, la quantite administree doit
representer entre 100 X et 1000 X la valeur du Ki du produit. Dans ce cas-ci, la quantite
represente environ 117 X le Ki du Lys4-BVD15. Lors des essais in vivo avec le
64
Cu/DOTA-Heterodimere, un groupe de co-injections a ete fait. Les souris ont ete co-
injectees avec un melange de Lys4-BVD15 et BBN 1 mg/kg chacun pour bloquer les
recepteurs Yl et GRP en meme temps. Le temps d'attente pour tous les groupes du
(64Cu/DOTA)-Heterodimere a ete de 60 minutes.
38
6. Essais de stabilite plasmatique
Afin de verifier la stabilite du complexe DOTA/64Cu ainsi que la stabilite du
peptide en presence des enzymes plasmatiques, des etudes de stabilite plasmatique sont
pratiquees. Les essais de stabilite plasmatiques sont realises dans du plasma de souris. Le
jour de l'experience, le sang d'une souris est preleve et place dans un tube. Le sang est
centrifuge 5 minutes a 13 000 rpm et ensuite le plasma est retire et place dans un tube
propre. Pour l'experience, le peptide marque au Cu-64 est formule seulement dans le
PBS. Dans un tube, 135|il de plasma est melange avec 15|xl de produit radioactif (2-3
mCi) et le tout est incube a 37°C pendant 1 heure. Par la suite, la reaction est arretee en
ajoutant au melange 150ul d'acetonitrile 75% dans l'eau. Le tube est vortexe et centrifuge
a 13 000 rpm a 4°C pour 20 minutes. Le surnageant est recupere et analyse par HPLC sur
un Water 600 en utilisant les conditions de purification des peptides radiomarques
decrites ci-haut.
39
RESULTATS
1. Peptides ciblant le recepteur Y l
Pour parvenir au peptide d'interet marque au 64Cu pour les etudes in vivo et de
stabilite plasmatique, plusieurs produits ont dus etre prepares et testes pour optimiser le
design afin d'avoir le compose avec la meilleure affinite possible pour le recepteur. Le
peptide de depart qui a servi de prototype pour cette etude est le BVD15 (Figure 13),
decouvert par l'equipe de Daniels (DANIELS et al, 1995). Nous avons re-synthetise ce
compose et des essais de competitions ont ete faits sur ce peptide afin de s'assurer de son
affinite pour le recepteur d'interet, le recepteur Yl. Par la suite, quelques autres peptides
ont ete synthetises et leur affinite pour le recepteur Yl a ete verifiee in vitro. Les essais
ont ete realises sur les lignees cellulaires de cancer du sein humain MCF-7 et T-47D. Les
resultats sont presentes dans le tableau 3 et des exemples de courbes obtenues lors de ces
experiences sont presentes a la Figure 7.
40
1000-
- • - NPY
- * • BVD15
800-
- * - Lys4-BVD15
600-
• * • Lys 2 -BV015
-4- DOTA-AOC-BVD15
400-
- • - (DOTA)Lys4-BVD15
200T—
4
-12
-12
-10
-8
T
-6
-4
Log de la concentration de competiteur
Figure 7- Courbes de competition de differents peptides ciblant le recepteur Yl deplacant
le ?25I-NPY sur des cellules MCF-7
Tableau 3- Tableau des constantes d'inhibition (Kj) des peptides ciblant recepteur Yl
Produit
NPY
BVD15
DOTA-AOC-BVD15
Lvs2-BVD15
Lvs4-BVD15
(DOTA)Lys4-BVD15
Lign6e cellulaire
MCF-7
T-47D
MCF-7
MCF-7
MCF-7
MCF-7
MCF-7
T-47D
3,1
3,07
39,21
4507,47
127,92
6,95
62,88
532,17
(nM)
±
±
1
±
±±
1
±
1,75
2,98
33,8
1752,74
64,38
2,91
25,44
324,71
II est possible d'observer que le BVD15 a une affinity d'environ 10 fois infeiieure
au ligand naturel, le NPY. Le DOTA-Aoc-BVD15, quant a lui, obtient un Kj de 4507.47 ±
1752.74 nM. Les alternatives Lys2-BVD15 et Lys4-BVD15 ont de bons Ks mais le Lys4BVD15 est meilleur avec un Kj de 6.95 ± 2.91 nM. Le dernier peptide, le (DOTA)Lys4BVD15 ofrre de bons resultats sur les deux lignees mais preftrentiellement sur les MCF7. Sur la lignde T-47D, la valeur de Kj est environ 8 fois plus 61ev6e.
41
Pour les essais de biodistribution in vivo, quatre groupes ont ete faits (Tableau 4)
et le tableau 5 montre les valeurs des pourcentages de la dose injectee par gramme de
tissu (% d.i/g). Ces memes resultats sont aussi presentes sous forme d'histogramme a la
Figure 8. Le premier groupe a un temps d'attente avant la dissection de 1 heure et le
deuxieme de 2 heures. Le troisieme groupe a une co-injection de 0.5 mg/souris de Lys4BVD15 et le dernier, une co-injection de 1 mg/souris du meme produit. Les deux derniers
groupes ont un temps d'attente de 1 heure.
Tableau 4- Resume des groupes pour les essais in vivo pour les
peptides visant le recepteur Yl
Condition
Temps
Nombre de souris
(64Qj/DOTA)Lys4-BVD15
non co-injectees
non co-injectees
co-injectees 0,5 mg par souris
oo-injectees 1 mg par souris
1 heure
2 heures
1 heure
1 heure
7
3
3
4
("Cu/DOTAJ-Aoc-BVDIS
non co-injectees
1 heure
3
Produit
42
Tableau 5- Distribution de (^Cu/DOTA^ys^BVDlS dans des souris balb/c nu/nu
femelles portant des tumeurs MCF-7 et T-47D (%DI/g de tissu)
Non co-injecte
1 heure
Moyenne ± ET
n=7
1,32
±
0,65
2,34
±
1.28
1,81
±
0.60
0,98
1,88
±
0,27
0,81
±
4,72
9.09
±
0,42
1,23
±
0,27
0,99
±
8,63
±
2,99
1,24
±
0,40
0,57
1.86
±
1,61
±
0,35"
0,56
1,43
. ±
0,41
±
0,33
0,04
0,12
±
Organes
sang
plasma
ovaire
uterus
gras
rein
rate
pancreas
foie
cceur
poumon
MCF-7
T47D
muscle
cerveau
Non co-injecte
2heures
Moyenne ± ET
n=3
0,96
±
0.10
1,55
±
0,16
2,48
t
2,03
2.73
±
3.11
1,25
±
1,36
4,84
±
0,77
1,36
±
0.42
1,25
1
0,81
7,47
±
1,45
1,07
±
0,20
1,67
±
0,55
0,97
±
0,06
0,86
±
0,36
0,29
±
0,17
0,08
±
0,03
Co-injecte 0,5mg/souris
1 heure
Moyenne ± ET
n=3
1,81
±
0,76
3,61
±
2,45*
2,33
±
1,85
2,77
±
1.94
1,20
±
0,74
48,52
±
47,36
1,53
±
0,35
1,14
±
0,46
8,52
±
2,54
1,48
±
0.47
2,02
±
0,66
0,83
±
0,12**
2,55
±
1,26c"
0,94
±
0.69
0,14
±
0,07
Co-injecte Img/souris
1 heure
Moyenne ± ET
n=4
3,78
±
1,40
5,26
±
4,05
4,78
±
2,11
3.61
±
1,54
2,53
±
2,04
27,77
±
12,01"
2,12
±
0,62
2,09
±
0,60
10,57
±
2,99
2,33
±
0,70
3,44
±
1,01
1,79
±
0,61""*
2,12
±
0,41""
1,40
±
0,32
0,21
±
0,04
B
n=6
*n=2
c
n=4
"n=3
** Les valeurs des co-injections ont donne des resultats de Test t non significatifs (P>0,05)
$ La valeur de la co-injection a donne un resultat de Test t significatif (P<0,05)
1 heure
2 heures
co-injectees 0.5mg/souris
ESI co-injection 1mg/souris
Figure 8- Histogramme du pourcentage de la dose injectee par gramme de tissu pour
le /64,
rCu/TJOTA)Lys-BVD15
43
Lors des biodistributions, il est possible d'observer que la tumeur MCF-7 a une
diminution de la captation avec une co-injection de 0.5 mg/souris. Tous les autres
organes, incluant la tumeur T-47D, ont une plus grande captation du peptide marque avec
les deux co-injections.
Les ratios tumeur/muscle ont ete calcules a partir des pourcentages de dose
injectee par gramme de tissu (% d.i/g) et sont presentes dans le tableau 6. Lors des essais
in vivo pour le (64Cu/DOTA)Lys4-BVD15, seulement les valeurs pour la co-injection a 0.5
mg de Lys4-BVD15 par souris ont ete calculees.
Tableau 6- Ratios tumeur/muscle pour le (64Cu/DOTA)Lys4-BVD15
1 heure
2 heures
1 heure co-injectees 0,5mg/souris
3,89
3,4
0,88
MCF-7
±
3,18
±
2,07
±
0,66
3,45
3,02
2,71
T-47D
±
±
±
3,03
2,22
2,39
Pour les ratios, en tenant compte des ecarts-types, il n'y a aucune diminution
observee entre les differentes conditions.
Des tests in vivo ont ete realises pour verifier si la biodistribution du produit etait
due reellement a la liaison specifique au recepteur cible. Le peptide utilise, le
(64Cu/DOTA)-Aoc-BVD15, a revele une tres faible affinite pour le recepteur Yl lors des
tests in vitro, de l'ordre de 4507.47 ± 1752.74 nM (Tableau 3). Ce peptide est utilise
comme controle negatif dans cette etude et permettra d'evaluer la captation nonspecifique du (64Cu/DOTA)Lys4-BVD15 dans les organes. II s'agit d'un peptide avec un
44
poids moleculaire et une sequence en acide amines semblable a celle du
(64Cu/DOTA)Lys4-BVD15. Les resultats des pourcentages de la dose injectee par gramme
de tissu (% d.i/g) sont presentes au tableau 7 et egalement, les resultats pour des organes
d'interet sont presentes sous forme d'histogramme a la figure 9. Les ratios tumeur/muscle
calcules a partir des valeurs du tableau 7 sont presentes au tableau 8.
Tableau 7- Distribution de ( Cu/DOTA)-Aoc-BVD15 dans des souris balb/c nu/nu
femelles portant des tumeurs MCF-7 et T-47D (%DI/g de tissu)
Organe
sang
plasma
ovaire
uterus
gras
rein
rate
pancreas
foie
coeur
poumon
MCF-7
T47D
muscle
cerveau
Non co-injecte
1 heure
Moyenne ± ET
n=3
1,23
±
0,54
1,73
±
0,80
3,78
±
0,33
1,62
±
0,36
0,74
±
0,16
8,21
±
3,31
2,18
±
0,86
1,56
±
0,29
11,16
+
3,90
2,05
±
0,54
2,93
±
0,62
1,18
±
0,17
1,47
±
0,20
0,69
±
0,02
0,17
±
0,06
45
20-i
15•2*
5 10-
rn m m
f^lffl
*V* •
&
^
Figure 9- Histogramme du pourcentage de la dose injected par gramme de tissu pour
le ("Cu/DOTAJ-Aoc- BVD15
Les valeurs lors de la biodistribution du M,
( Cu/DOTA)-Aoc-BVD15 d6montre une
captation semblable a celles de la condition
1 heure non co-injectee du
(64Cu/DOTA)Lys4-BVD15.
Tableau 8- Ratios tumeur/muscle pour le (64Cu/DOTA)-Aoc-BVD15
1 heure
1,72
MCF-7
±
0,25
2,14
T-47D
±
0,29
En tenant compte des ecarts-types, les ratios sont semblables a ceux du
(64Cu/DOTA)Lys4-BVD15
La stabilite plasmatique de la liaison DOTA-cuivre a ete verifiee en premier lieu
pour le (64Cu/DOTA)Lys4-BVD15 et ensuite pour le (64Cu/DOTA)-Aoc-BVD15. Les
resultats sont presentes dans le tableau 9. Pour le (64Cu/DOTA)Lys4-BVD15, le
pourcentage de cuivre libre dans la solution apres 1 heure d'incubation est de 85% et
seulement 5% du cuivre est lie au peptide. Pour ce qui est du (64Cu/DOTA)-Aoc-BVD15,
le pourcentage de cuivre libre est de seulement 2% et le cuivre est lie au peptide a 92%
apres 1 heure.
Tableau 9- Pourcentages de cuivre lie et libre lors des stabilites plasmatiques
Peptides radiomarquees au 64 Cu
64
Cu/DOTA-Aoc-BBN(6-14)
(64Cu/DOTA)Lys4-BVD15
64
Cu/DOTA-Aoc-BVD15
64
( Cu/DOTA)Heterodimere
Temps (h)
1
1
1
1
% 64Cu
0
85
2
5
libre
% 64Cu
lie peptide
100
5
92
95
% 64Cu
autre
0
10
6
0
47
2. Peptides ciblant les recepteurs Y l et GRP
Lors de l'optimisation du design du traceur capable de lier les recepteurs Yl et
GRP surexprimes dans les cas de cancer du sein, plusieurs heterodimeres peptidiques ont
ete synthetises. Pour chaque nouveau peptide synthetise, des tests de liaisons ont ete
effectues pour s'assurer de Paffinite des deux segments peptidiques a leur recepteur
respectif. Les noms de ces heterodimeres etant complexes, ils sont presentes dans les
tableaux 10 et 11 mais, ulterieurement, ce sont les appellations courantes qui seront
utilisees, elles aussi presentees dans les memes tableaux. Comme l'optimisation du design
de Pheterodimere s'est fait parallelement a l'optimisation du design du traceur pour les
recepteurs Yl, les peptides qui ont permis de donner le coup d'envoi pour la synthese des
heterodimeres ont ete le BVD15 (DANIELS et al., 1995) et le DOTA-Aoc-BBN(6-14)
(Figure 18). Ce traceur lie au cuivre-64 a fait l'objet d'un projet de maitrise pour sa
liaison au recepteur GRP dans le cancer du sein et de la prostate (DUBUC et al., 2008).
Les deux peptides de depart ont ete testes in vitro lors de tests de competition sur des
cellules exprimant leur recepteur cible, soient les MCF-7 et T-47D pour le BVD15 et
seulement les T-47D pour le DOTA-Aoc-BBN(6-14). Les memes tests ont ete faits en
parallele avec les ligands naturels des recepteurs (NPY ou BBN) pour s'assurer de la
validite des resultats. Tous les resultats sont presentes dans les tableaux 10 et 11.
48
Tableau 10- Tableau des constantes d'inhibition (Ki) pour le segment ciblant le recepteur
Yl des peptides heterodimeres
Appellation
Produit
(DOTA)Lys4-BVD15
Heterodimere 2
Heterodimere 3
Heterodimere 4
[D-Tyr6,pAlal1,Thi13,Nle14]BBN(6-14)-(CH2)7-BVD15
BVD-15-(CH2)7-[D-Tyr0,bAla1l,Thi1J,Nle14]BBN(6-14)
BVD-15-Gly-Lys(D0TA)-Gly-[D-Tyr°,bAla",Thi,o,Nle 1BBN(6-14)
(DOTA)Lys4-BVD15/BBN(6-14)
[([Ahx3,Ahx5,D-Tyr6,|3Ala11,Thi13,Nle14]
Heterodimere 5
14«Glu"lBVD15
[([Ahx3,(DOTA)Lys4,Gly5,D-Tyr6,bAla11 ,Thi13,Nle14]
DOTA-Heterodimere
14))Glu4]BVD15
1378,32
45613,12
5423,87
1,75
2,98
25,44
324,71
249,85
1531,25
73295,35
1687,3
MCF-7
44,8
±
27,4
MCF-7
T-47D
105,6
2092,57
±
±
921,54
MCF-7
T-47D
MCF-7
T-47D
MCF-7
MCF-7
MCF-7
MCF-7
NPY
Heterodimere 1
Ki
(nM)
±
±
±
±
±
±
±
±
Lignee cellulaire
BBN(6BBN(6-
3,1
3,07
62,88
532,17
383,5
Le meilleur heterodimere est PHeterodimere 5 qui a donne de bons resultats pour
le segment ciblant le recepteur Yl avec un Kj de 44.8 ± 27.4 nM. Le DOTA-Heterodimere
quant a lui a donne egalement de bons resultats sur les MCF-7, mais des valeurs un peu
plus elevees sur les T-47D.
Tableau 11- Tableau des constantes d'inhibition (Ki) pour le segment ciblant le recepteur
GRP des peptides heterodimeres
Appellation
Produit
Lignee cellulaire
Ki
(nM)
BBN
T-47D
0,61
±
DOTA-Aoc-BBN(6-14)
T-47D
10,8
±
4,5
Heterodimere 1
[D-TyrB,bAlall,Thi1J,Nle"]BBN(6-14)-(CH2)7-BVD15
PC-3
2783,96
3846,37
Heterodimere 2
BVD15-(CH2)7-[D-TyrB,bAla1i,Thil3,Nlel4]BBN(6-14)
PC-3
5,19
±
+
T-47D
1,05
±
T-47D
0,82
±
Heterodimere 5
[([Ahx3,Ahx5,D-Tyr6,pAla11,Thi13,Nle14]
BBN(6-14V)Glu4lBVD15
[([Ahx ,(D0TA)Lys4,Glyb,D-Tyr°,pAla",Thi,0,Nle"']
0,57
4,2
J
DOTA-Heterodimere
BBN(6-14))Glu"lBVD15
0,07
Pour le segment ciblant le recepteur GRP, encore une fois, PHeterodimere 5 a fait
bonne figure ainsi que le DOTA-Heterodimere avec des valeurs de K, de 1.05 et 0.82 ±
0.07 nM respectivement.
49
Des essais de comp&iton ont egalement 6t€ realises sur les diflSrents
heterodimeres en competitionnant les deux segments (BVD15 et BBN(6-14))
ind^pendamment en utilisant soft le
125
I-NPY ou le
125
I-BBN respectivement. Des
exemples de courbes obtenues lors de ces essais sont pr6sent£s aux figures 10 et 11.
2000-1
•••
BBN
- * • DOTA-Heterodimere
1500-1
§. 1000o
500-
-16
-14
-12
-10
-8
T
-6
-4
Log de la concentration de competiteur
Figure 10- Courbes de competition du DOTA-H&eiodimere d£placant le 125I-BBN sur des
cellules T-47D
T
50
a)
2000'
1500-
NPY
DOTA-Heterodimere
§. 1000H
500-I
-4
-14
-12
-10
-8
-6
Log de la concentration de competiteur
b)
550-.
500-
NPY
DOTA-H§terodimere
450400350300<
250
-6
-4
-12
4
-10
-8
Log de la concentration de competiteur
Figure 11- Courbes de competition du DOTA-Heterodimere depla?ant le 125I-NPY sur
des cellules MCF-7 a) et des cellules T-47D b)
51
Une fois radiomarque, le ( Cu/DOTA)-Heterodimere a egalement ete teste en
biodistribution sur des souris balb/c nu/nu pourtant des tumeurs MCF-7 et T-47D. Un
groupe de 3 souris a ete injecte sans produit de blocage tandis qu'un second groupe a recu
une co-injection de 1 mg/kg de Lys4-BVD15 et de BBN. Les resultats de biodistribution
pour le ( Cu/DOTA)Heterodimere des deux groupes de souris sont presentes en % d.i/g
au tableau 12. Lors de cette experimentation, les deux groupes ont eu un temps
d'incubation de 1 heure seulement. Ce temps d'attente a ete determine lors des essais in
vivo du (DOTA)Lys4-BVD15. Les resultats d'organes cibles sont presentes sous forme
d'histogramme a la figure 12. Les ratios tumeur/muscle calcules a partir des valeurs du
tableau 12 sont presentes au tableau 13.
Tableau 12- Distribution de ( Cu/DOTA)Heterodimere dans des souris balb/c nu/nu
femelles portant des tumeurs MCF-7 et T-47D (%DI/g de tissu)
Non co-injecte
Organe
1 heure
Moyenne ± ET
n=3
1,37
±
0,71
1,74
±
1,12
1,98
±
0,49
0,83
±
0,69
1,2
±
0,69
5,85
±
5,98
6,26
+
7,05
4,2
±
2,48
17,2
+
3,84
7,04
±
9,57
2,41
±
1,02
0,88
±
0,42
3,96
±
2,77
0,52
±
0,07
0,16
±
0,08
sang
plasma
ovaire
uterus
gras
rein
rate
pancreas
foie
cceur
poumon
MCF-7
T47D
muscle
cerveau
co-injecte Lys4-BVD15 et
BBN 1 mg/kg
1 heure
Moyenne ± ET
n=3
1,05
±
0,14
1,57
±
0,43
2,1
±
0,24
1,13
±
0,05
0,64
±
0,11
7,35
+
1,02
2,24
+
0,61
1,16
±
0,31**
12,45
±
1,3
1,67
±
0,12
3,24
±
1,11
1,16
±
0,15**
1,32
±
0,31 a "
0,52
±
0,06
0,14
±
0,05
a
n=2
** Les valeurs des co-injections ont donne des
resultats de Test t non significatifs (P>0,05)
52
25n
20-1
15^
fe
•o
10H
•
1 heure
•
1 heure co-injectees
5H
r^T1^
r
^
I [*1 iSpl I p*!
^
<?
&
^
Figure 12- Histogramme du pourcentage de la dose injected par gramme de tissu pour
le (64Cu/DOTA)-H6t6rodimere
Lors des essais de biodistribution, aucune diminution dans la captation tumorale
ou pancreatique n'a ete observe.
Tableau 13- Ratios tumeur/muscle pour le (64Cu/DOTA)-H6ttrodimere
1 heure
1 heure co-injectees
1,68
2,23
MCF-7
±
±
0,83
0,17
7,61
2,54
T-47D
±
±
5,41
0,26
II n'y a aucune difference dans les ratios tumeur/muscle pour le peptide
,64,
rCu/DOTA)-Heterodimere.
Des essais de stability plasmatique ont egalement &6 r6alis6s sur le (^Cu/DOTA)Het6rodimere. Les resultats sont pr&entes au tableau 9. Lors de ces essais, nous avons pu
observer une retention de 95% du cuivre dans le chelateur. Seulement 5% du cuivre s'est
decomplexe" du DOTA.
53
DISCUSSION
1. Peptides ciblant le recepteur Y l
L'affinite du BVD15 pour le recepteur Yl est bonne rnais est environ 10 fois plus
faible que l'affinite du ligand naturel, le NPY qui a ete utilise comme controle dans toutes
les etudes. L'equipe de Balasubramaniam en 2001 (BALASUBRAMANIAM et al, 2001)
a fait des essais in vitro avec des analogues du NPY en verifiant l'affinite de ses
composes sur les differents recepteurs a NPY. Les trois monomeres ont eu une affinite
pour le recepteur NPY Yl entre 5 et 10 fois plus faible que le ligand naturel NPY. Ces
faits montrent que le BVD15 a du potentiel comme ligand du NPY Yl.
H
2N^NH
NH
Figure 13- Structure du BVD15
L'etape suivante etait d'ajouter au peptide le chelateur DOTA pour 1'incorporation
du Cu-64. Nous avons d'abord explore la possibility d'introduire le chelateur en position
jV-terminale du peptide en s'inspirant de nos travaux precedents sur le developpement de
traceurs DOTA-Bombesin marque au Cu-64 (DUBUC et al., 2008). De la raeme facon,
un espaceur de type aminooctanoyl (Aoc) est introduit entre le DOTA et le peptide pour
s'assurer que l'encombrement sterique du a la presence du DOTA ne vienne pas nuire a
54
l'activite du peptide. Le DQTA-Aoc-BVD15 (Figure 14) a done ete synthetise et teste in
vitro sur les MCF-7. Malheureusement, l'affinite du peptide a ete grandement diminuee
avec l'ajout du DOTA. La valeur de la constante d'inhibition est passee de 39.21 ± 33.80
nM pour le BVD15 a 4507.47 ± 1752.74 nM pour le DOTA-Aoc-BVD15 (Tableau 3). II
est done evident que le DOTA gene la liaison du ligand au recepteur lorsqu'il est place a
sa position W-terminale.
HN^NH2
H2N
HN
NH
NH
OH
OH
O^OHHO"\>
Figure 14- Structure du DOTA-Aoc-BVD15
A la lumiere de ces resultats, il a fallu penser a une alternative pour introduire le
DOTA sur le BVD15. Lors de l'elaboration d'antagonistes pour le recepteur Yl, l'equipe
de Daniels (Daniels et al., 1995) a demontre que les residus Asn2 et He4 du BVD10, un
ester methylique derive du BVD15, pouvaient etre remplaces par d'autres residus d'acides
amines sans trop affecter l'affinite du peptide. Done, l'isoleucine en position 4 (He4) a ete
remplacee par une lysine et ce nouveau peptide a ete teste. Les resultats ont ete tres
probants puisque la constante d'inhibition du Lys4-BVD15 (Figure 15b) est inferieure a
celle du BVD15 avec des valeurs de K, de 6.95 ± 2.91 nM et 39.21 ± 33.8 nM
respectivement. Comme autre alternative, le peptide avec une lysine en position 2 a
egalement ete synthetise. Le Kj du Lys2-BVD15 (Figure 15a) etait de loin superieur a
celuiduLys4-BVD15 avec une valeur de 127.92 ± 64.38 nM, demontrant sa moins grande
affinite pour le recepteur NPY Yl.
55
a)
H
HN^/NH2
2NN^NH
NH,
b)
NH
HN
2
NH 2
H2N
Y
NH
T
HNL
^,NH
O
OH
OH
Figure 15- Structures du Lys2-BVD15 (a) et du Lys4-BVD15 (b)
Base sur ces resultats, le peptide Lys4-BVD15 a ete conserve afin d'y introduire le
DOTA sur 1'amine terminale de la lysine. Le nouveau produit porte le nom de
(DOTA)Lys4-BVD15 (Figure 16) et a ete teste sur les deux lignees cellulaires exprimant
le recepteur Yl. La valeur du Kj pour la lignee MCF-7 est environ le double de celle pour
le BVD15 mais avec un ecart-type moindre, les valeurs de Kj pour le (DOTA)Lys4BVD15 et pour le BVD15 etant de 62.88 ± 25.44 nM et 39.21 ± 33.8 nM respectivement.
Sur les T-47D, la valeur de Ki pour le (DOTA)Lys4-BVD15 est de 532.17 ± 324.71 nM
tandis que celle pour le NPY est de 3.07 ± 2.98 nM.
56
HO
^-N
N-^
OH
0^°=^
OH~ ^NH
'
HN
YNH2
HI\L
H2
VNH
^NH
o
NH 2
:
^=o^
Figure 16- Structure du (DOTA)Lys4-BVD15
II est a noter qu'au niveau des deux lignees cellulaires etudiees, le Ki du NPY est
identique. Cependant les valeurs de Kj different beaucoup avec le (DOTA)Lys4BVD15
sur ces memes lignees cellulaires avec une affinite moindre (10X) sur les T-47D. Cette
difference d'affinite pour le (DOTA)Lys4BVD15 pourrait s'expliquer par une plus faible
selectivity de ce ligand. En effet, comme les deux lignees cellulaires sont differentes, elles
peuvent
exprimer
a leur surface
des recepteurs differents.
La liaison du
(DOTA)Lys4BVD15 a un recepteur distinct sur les T-47D conduirait a une plus faible
affinite de ce ligand pour les recepteurs Yl lors des etudes de competition. Si cela est le
cas, 1'etude de ce traceur in vivo peut quand meme etre interessante. La difference entre le
niveau d'expression des recepteurs Yl sur les MCF-7 compare a celui sur les T-47D peut
etre qualitativement verifiee. Lors des essais in vitro, un controle positif, ou il n'y a que le
ligand radioactif qui est ajoute dans le puits, est realise. Le nombre de comptes par minute
est de l'ordre de 1000 pour les MCF-7 et de l'ordre de 500 pour les T-47D. Le niveau
d'expression du recepteur Yl semble done etre deux fois superieur sur les MCF-7 que sur
les T-47D.
57
A la lumiere de ces resultats, il a ete decide d'aller de l'avant avec les
experimentations in vivo chez la souris avec le (64Cu/DOTA)Lys4-BVD15. Les resultats
montrent une captation tumorale de 1% a 2% sur les deux modeles tumoraux etudies,
soient les MCF-7 et les T-47D. La captation de chaque organe n'est pas differente entre
les temps d'attente de 1 ou 2 heures, le traceur s'accumulant principalement dans le foie
et les reins. Lors d'experiences ulterieures sur des peptides, il sera possible de ne faire
qu'un seul groupe de souris non co-injectees a 1 heure d'attente. Le probleme rencontre
lors des co-injections est que la captation tumorale ne diminue pas toujours avec Pajout
deLys4-BVD15 non radioactif lors de Pinjection. En effet, pratiquement tous les organes
incluant les tumeurs ont une captation plus elevee lors de la co-injection. L'hypothese
emise pour expliquer ces resultats est que la quantite de peptide non radioactif injectee
bloque tous les recepteurs, incluant ceux de la voie d'elimination du produit, ce qui
engendre une accumulation du produit radioactif dans tous les organes. La seule exception
est la tumeur MCF-7 co-injectee avec 0.5 mg/souris dont la captation a diminue de facon
significative (PO.05). Le fait de bloquer la voie d'elimination pourrait egalement
expliquer pourquoi il y a une captation plus importante lors de co-injection avec 1
mg/souris compare avec une co-injection de 0.5 mg/souris. Les voies d'elimination
saturee, il y a une plus grande quantite de peptide radioactif qui reste dans la circulation
sanguine et il y a done une plus grande probabilite qu'il se retrouve dans la tumeur ainsi
que dans les autres organes. II est a noter que presque tous les organes ont une captation
plus elevee avec la co-injection de 1 mg/souris compare avec celle de 0.5 mg/souris. Une
autre hypothese pour expliquer ce resultat est la possible instability du complexe DOTAcuivre qui laisserait beaucoup de cuivre libre circulant et ce serait ce cuivre qui serait
capte par la tumeur et mesure par la suite lors de la dissection.
58
II est possible de voir que les ratios tumeur/muscle pour la tumeur MCF-7 sont
semblables a 1 et 2 heures post-injection avec des valeurs de 3.89 ± 3.18 et 3.4 ± 2.7
respectivement. Lors de la co-injection, le ratio tumeur/muscle se situe a 0.88 ± 0.66.
Dans ce cas-ci, cette baisse de ratio tumeur/muscle s'explique par l'augmentation la
captation du muscle suite a la co-injection. II n'est pas possible de conclure que la coinjection est efficace sur ce type de tumeur puisque, comme il a ete mentionne,
pratiquement tous les organes, dont le muscle, avaient une captation plus elevee lors de la
co-injection. Si on se fie uniquement a la captation tumorale, la captation de la tumeur
MCF-7 a bel et bien ete bloquee mais lorsqu'on regarde les ratios, il n'y a aucun moyen de
conclure positivement du blocage. Pour la tumeur T-47D, les memes observations sont
faites pour les groupes 1 et 2 heures avec des valeurs de 3.45 ± 3.03 et 3.02 ± 2.22
respectivement. Lors du calcul de ratios des groupes co-injectes, la conclusion est
negative du point de vue du blocage.
II est possible de voir que la captation tumorale pour le (64Cu/DOTA)-Aoc-BVD15
ressemble beaucoup a celle du (64Cu/DOTA)Lys4-BVD15 avec des valeurs de l'ordre de
1% a 1.5%. Les ratios tumeur/muscle sont presentes dans le tableau 8 et donnent des
resultats semblables au (64Cu/DOTA)Lys4-BVD15. II y a done une captation tumorale qui
n'est pas due a Paffinite du peptide pour son recepteur. II faudra done verifier la presence
de cuivre libre dans la circulation sanguine qui pourrait se Her de facon non specifique
dans les tumeurs. Le (64Cu/DOTA)-Aoc-BVD15 est un compose plus stable avec
probablement moins de cuivre libre en circulation, ce qui expliquerait les ratios
tumeur/muscle plus faibles pour ce peptide.
59
Base sur ces resultats, la stabilite des differents traceurs peptidiques dans le plasma
a ete testee. La stabilite de la liaison DOTA-cuivre a ete verifiee en premier lieu pour le
(64Cu/DOTA)Lys4-BVD15. Avec une liaison de seulement 5% du cuivre avec le peptide
apres 1 heure, nous considerons que le complexe est done instable et nous croyons qu'il y
a formation d'un pont hydrogene entre le bras carboxylate du DOTA et la fonction
guanidium de l'arginine en position 8 pour expliquer l'instabilite du traceur
(64Cu/DOTA)Lys4-BVD15 (Figure 17).
La conformation du BVD15 a ete elucidee par RMN et dichro'isme circulaire par
Pequipe de Balasubramaniam en 2003. Comme l'affinite du BVD15 et du (DOTA)Lys4BVD15 sont semblables, il est possible d'affirmer que les conformations actives sont
semblables, soit en forme d'helice (Figure 14). Dans cette conformation, le DOTA en
position 4 sur le (DOTA)Lys4-BVD15 se retrouve pres d'un residu arginine en position 8.
II est possible qu'un pont hydrogene se forme entre un groupement carboxylate d'un bras
du DOTA et la fonction guanidium de l'arginine. II y aurait alors perte d'un bras du
DOTA pour stabiliser le cuivre a l'interieur. Pour verifier cette hypothese, le meme test a
ete realise sur le DOTA-Aoc-BVD15. Sur ce peptide, le DOTA se retrouve en position Nteminale au bout d'une chaine Aoc, bien loin d'un groupement potentiel pour la formation
d'un pont hydrogene. Avec une liaison de 92% du cuivre au peptide apres 1 heure,
Phypothese du pont hydrogene semble done valable pour expliquer l'instabilite du traceur
(64Cu/DOTA)Lys4-B VD15.
60
o
o
HI»T
HN
k
| Arg at position: i+4
1 Lys at position i
^.^,
J
3
* ^ * c ^ « « ^
•®- * o
* • *• a ©
13
^'fir©-©©
Figure 17- Representation schematique de la conformation helico'idale du traceur
64
Cu/DOTA)Lys4-BVD15
La presence de cuivre libre pourrait expliquer completement ou partiellement les r^sultats
obtenus. Ces resultats sont en accord avec certaines donnees techniques qui tendent a
demontrer l'accumulation de cuivre dans le foie. Par contre, une etude faite dans le cadre
d'un autre projet de maitrise presente une plus forte accumulation de cuivre libre dans le
foie que nos resultats avec des valeurs de %DI/g de tissu d'environ 30% pour le ^CuCh
(DUBUC era/., 2008).
61
2. Peptides ciblant les recepteurs Y l et GRP
OH
OyOH
o
;N
r ^
H
<J °PH
II
O
o
E
I
H
N.
O
O^ NH2
O^OH
Figure 18- Structure du DOTA-Aoc-BBN(6-14)
La valeur de Kj pour le BVD15 a ete consideree convenable pour poursuivre les
etudes lors du design d'un peptide liant le recepteur Yl. Le DOTA-Aoc-BBN(6-14)
(Figure 18) quant a lui a une tres bonne affinite avec une valeur de Kj de 10.8 ± 4.5 nM
compare a celle du BBN commercial a 0.61 ± 0.57 nM.
Les deux premiers heterodimeres ont ete synthetises en joignant le BBN (6-14) et
le BVD15 dans un arrangement en tete-a-queue. Pour Pheterodimere 1 (Figure 19), la
partie Af-terminale du BVD15 est liee a la partie C-terminale du BBN(6-14).
||
.OH
1
O
HN-\ J
NH 2
N
HN^NH2
H2N
AM
Figure 19- Structure de l'Heterodimere 1
62
L'heterodimere 2 (Figure 20) est compose de l'arrangement ou le segment TVterminal du BBN(6-14) est lie au segment C-terminal du BVD15. Les deux peptides ont
ete testes sur les MCF-7 pour leur liaison au recepteur Yl et les valeurs de Kj sont de
383.5 ± 248.85 nM et 1378.32 ± 1531.25 nM pour les Heterodimeres 1 et 2
respectivement. Les deux peptides ont egalement ete testes sur les PC-3, une lignee de
cancer de la prostate, pour leur liaison au recepteur GRPR et les valeurs de Kj sont de
2783.96 ± 3846.37 nM et 5.19 ± 4.2 nM pour les Heterodimeres 1 et 2 respectivement. A
la lumiere des resultats obtenus pour les Heterodimeres 1 et 2, il est evident que le
segment BBN(6-14) ne tolere pas de substitution en position C-terminale et que
l'introduction d'un segment peptidique en position ./V-terminale n'affecte en rien son
affinite au recepteur GRP.
H
o
2 N v^A,
o
r
°r °
HN
HN^NH2
/
H
NH
^
N
o
E
H
o
:x
Of
J
NH 2
I
;
H
J
!
J!
:
H
u
II
:
H2N^NH
Figure 20- Structure de PHeterodimere 2
Comme les resultats avec l'Heterodimere 2 ont ete tres variables, l'Heterodimere
3 (Figure 21), analogue de l'Heterodimere 2 auquel un DOTA est ajoute entre le BVD15
et le BBN(6-14), a ete synthetise et teste. Les resultats pour les tests de liaison avec les
recepteurs NPY Yl in vitro sur les MCF-7 ont ete concluants avec une valeur de Kj de
45613.12 ± 73295.35 nM, cette valeur de Ki est pres de 40 fois plus eleve que celle
63
obtenue pour PHeterodimere 2. Avec ces resultats, nous avons conclu que le BVD15
devait requerir sa partie C-terminale pour se Her de facon efficace a son recepteur.
Egalement, ces donnees suggerent que rencombrement sterique provoque par le DOTA
est enorme et n'est pas tolere en position C-terminale du BVD15. Le DOTA empeche
toute liaison au recepteur Yl lorsque Pheterodimere existe sous un arrangement tete-aqueue.
HO
^N
HO
N ^
OH
0=<
NH
^OH
I
W J
O
/
k
o
/
HN
HN^NH,
o
'
H N - \ /
I
^
o
NH
o
o
v
M
o
;
H
o
o
:
\_';
o
, N|U
H
r
k
N
H,N^NH
Figure 21- Structure de PHeterodimere 3
Parallelement, les experiences in vitro sur le (DOTA)Lys -BVD15 ont ete
realisees. Le design de PHeterodimere 4 (Figure 22) a done ete propose apres que le
(DOTA)Lys4-BVD15 ait demontre une tres bonne affinite pour les recepteurs Yl. Le
design de cet heterodimere repose sur la structure de PHeterodimere 2, sur laquelle le
BVD15 a ete substitue par (DOTA)Lys4-BVD15 qui est en position N-terminale du
segment BBN(6-14). Les valeurs de Kj sur les MCF-7 se sont ameliorees, avec une valeur
de Kj de 5423.87 ± 1687.3 nM. Malheureusement, la valeur de Kj etait tout de meme trop
elevee pour etre en mesure d'affirmer que le peptide avait assez d'affinite pour le
recepteur Yl.
64
,OH
O
IVVWW^VIW
HN
OH
NH
NH
.A.
AM
1
°
O
\_NH
°
.. -r-i
HO
^-N
^~N
N^
N,
o
OH
Figure 22- Structure de l'Heterodimere 4
Comme le BVD15 n^cessite absolument ses deux parties N- et C-terminales,
l'heterodimere ramifie 5 (Figure 23) a ete synthetise. II est synthetise en attachant le
segment BBN(6-14) au BVD15 a partir de sa chaine laterale en position 4 via deux
espaceurs amino hexanoyl (Ahx). Les resultats sur les MCF-7 ont ete surprenants avec
une valeur de Kj de seulement 44.8 ± 27.4 nM, ce qui est semblable a la valeur obtenue
precedemment avec le BVD15 seul (Tableau 3). Suite a cela, la portion du peptide liant le
GRPR a ete teste sur les T-47D. La aussi, les resultats ont ete positifs avec une valeur de
Kj avoisinant celle du ligand naturel, le BBN. Le Kj obtenu pour l'Heterodimere 5 est de
1.05 nM et celui du BBN est de 0.61 ± 0.57 nM. Tous ces resultats in vitro demontrent
que le nouvel heterodimere a une bonne affinite autant pour le recepteur Yl que pour le
recepteur GRP.
65
o
o
/ ^
o
:
HN^,NH2
-^O
^
o
H2N
HSL
o
=
o
k
Nh
-
;
NH
^NH
NH,
OH
OH
Figure 23- Structure de PHeterodimere 5
Le DOTA-Heterodimere (Figure 24) a ensuite ete synthetise en substituant les
espaceurs Ahx4Ahx5 par
le Ahx3(DOTA)Lys4-Gly5 a la chaine de ramification de
PHeterodimere 5. La partie de ce dernier peptide liant le recepteur Yl a ete teste in vitro
sur les deux lignees cellulaires (MCF-7 et T-47D). Des exemples de courbes obtenues lors
de ces experiences sont presentes aux figures 10 et 11. Les valeurs des Kj sont
respectivement de 105.6 nM et 2092.57 ± 921.54 nM pour les MCF-7 et T-47D. L'affinite
pour ce recepteur est done bonne sur les MCF-7 et acceptable sur les T-47D. Puisque les
T-47D possedent les deux recepteurs, il se peut que le Kj du DOTA-Heterodimere soit
surestime puisque la partie BBN(6-14) du peptide est plus active. En effet, la competition
pour la portion liant le GRPR a donne une valeur de Kj tres bonne sur les T-47D de 0.82 ±
0.07 nM. L'affinite pour le GRPR est done excellente. La variabilite des resultats entre les
deux lignees cellulaires n'est toutefois pas observee chez le controle fait avec le NPY qui
obtient un Kj de l'ordre de 3 nM pour les deux lignees. Comme pour le monomere
(DOTA)Lys4-BVD15, il se pourrait que le segment BVD15 de Pheterodimere ait une
affinite pour un recepteur surexprime a la surface des T-47D et qui ne se retrouve pas sur
les MCF-7. Egalement, les 3 sous-types du recepteur Yl dus a Pepissage alternatif ne se
66
retrouvent pas necessairement dans les memes concentrations sur les MCF-7 et les T-47D.
Ces deux hypotheses expliqueraient le fait que les valeurs de Kj soient plus elevees sur la
lignee cellulaire T-47D.
H
In.
I
jj,
J°
O^OH
O
°=
ft
f
H
°
"\
'
O
„ NH
N
O " ~NH2
0^-QH
H
HN
H2N
H
N
N
N
N
~H NA\ N=^ H\
^ N-V
H
J! =
H
n --v
A i^ H "\
n -^
i
CWOH
^ A
o "^,0^
,0
S
H1
2N^NH
,NH
Y
V Y W A
o x ^ o N^ o
NH2
'OH
OH
Figure 24- Structure du DOTA-Heterodimere
Ce dernier peptide bivalent est celui qui a ete utilise lors des essais in vivo sur les
souris nues. Dans le groupe qui n'a pas recu de co-injection, il est possible d'observer une
captation tumorale d'environ 1% pour la MCF-7 et de pres de 4% pour la T-47D. Avec
une co-injection diminu6e a 1 mg/kg de BBN et de Lys4-BVD15, la captation tumorale de
la tumeur MCF-7 n'a malheureusement pas diminuee et celle de la tumeur T-47D non
plus. La diminution de la captation par le pancreas n'est pas significative. Le pancreas est
un organe cible ou les recepteurs GRP sont tres presents. Le pancreas regorge de
recepteurs GRP et lorsque la co-injection au BBN est efficace, la captation du produit
radioactif par le pancreas diminue et est transferee vers le foie. II n'est malheureusement
pas possible de voir une diminution de la captation pancreatique entre les deux groupes.
La captation hepatique n'augmente pas non plus. II est a noter que la captation tumorale
67
avec les monomeres (DOTA)Lys4-BVD15 et BBN(6-14) (DUBUC et ah, 2008) n'a ete
concluante que pour les MCF-7 lors de la co-injection de 0.5 mg/souris avec le peptide
(DOTA)Lys4-BVD15.
Contrairement
au
(64Cu/DOTA)lys4BVD15,
le
traceur
(64Cu/DOTA)AocBBN(6-14) est stable dans le plasma de souris apres 1 h d'incubation a
37 °C (Tableau 9).
Les ratios tumeur/muscle pour le traceur (64Cu/DOTA)-Heterodimere, presentes au
tableau 13, montrent bien que le blocage des recepteurs de la tumeur T-47D n'est pas
present, en passant de 7.61 ± 5.41 a 2.54 ± 0.26. Pour la tumeur MCF-7, il est possible
d'observer la stagnation du ratio. La stabilite plasmatique a ete verifiee sur le DOTAHeterodimere et les resultats sont presentes dans le tableau 9. Apres 1 heure d'incubation
dans le plasma, le cuivre reste lie au peptide a 95% et est libre a 5%. Le complexe DOTAcuivre du DOTA-Heterodimere est done tres stable.
Des differences majeures de captation tumorale sont observees avec le traceur
64
Cu-DOTA-heterodimere
et les deux lignees cellulaires
MCF-7 et T-47D.
L'accumulation du traceur dans les MCF-7 etant beaucoup plus faible (Tableau 12), elle
pourrait s'expliquer soit par une faible stabilite in vivo du traceur ou par une participation
d'un seul peptide a la liaison, le segment BVD15 de Pheterodimere, ce qui ne serait pas
suffisant pour assurer une bonne captation tumorale. Bien que les etudes de stabilite nous
indiquent que le traceur est stable dans le plasma, la stabilite de l'heterodimere dans
1'animal n'est pas connue et devra etre determinee. De plus, nous savons que les
recepteurs GRP ne sont pas exprimes sur les MCF-7 (YANO, 1992) (DUBUC et al.,
2008) et que le traceur monomere (64Cu/DOTA)Aoc-BBN(6-14) n'a pas donne une bonne
captation tumorale malgre une accumulation importante dans le pancreas pouvant etre
68
bloquee, ce qui favorise notre deuxieme argument concernant la participation d'un seul
peptide a la liaison qui ne serait pas suffisante pour assurer une bonne captation tumorale
dans notre cas. Sur les T-47D, les resultats precedemment cites pour Pheterodimere sur sa
stabilite plasmatique ainsi que la captation tumorale appuie la deuxieme hypothese posee
a savoir qu'il n'y aurait qu'un seul des deux segments qui se lierait. Nous pouvons done
dire que nous sommes en faveur qu'une plus grande captation tumorale et retention a la
tumeur peuvent etre obtenue avec les traceurs peptides a double action.
69
CONCLUSION
Le moyen de detecter de facon efficace et non invasive de nombreux types de
tumeurs et de recidives est sans nul doute l'imagerie TEP. Le probleme principal est que
les traceurs utilises ne sont pas tres specifiques et occasionne parfois une baisse dans
l'efficacite de la detection. II est done necessaire de developper de nouvelles molecules
qui seraient specifiques a des recepteurs surexprimes dans les cas de cancer. Les
recepteurs Yl et GRP sont de ces recepteurs qui se retrouvent en tres grande
concentration a la surface des cellules du cancer du sein. Marquer des molecules liant
specifiquement ces recepteurs avec un isotope radioactif serait une avancee importante
dans Pamelioration de l'efficacite de l'imagerie TEP. De plus, le recepteur GRP est un
indice de l'agressivite de la tumeur alors en plus de visualiser l'endroit ou se trouve la
tumeur, il sera possible de predire de facon qualitative l'agressivite de la tumeur dans les
cas de cancer du sein.
Lors de cette etude, le design de deux molecules a ete realise afin de repondre a ce
besoin, le (DOTA)Lys4-BVD15 et le DOTA-Heterodimere. La premiere molecule lie
preferentiellement le recepteur Yl a la surface des cellules de cancer du sein. Le design de
cette molecule a ete long et fastidieux. II a fallu experimenter environ 5 molecules
differentes in vitro avant d'obtenir le peptide final, le (DOTA)Lys4-BVD15. Le deuxieme
peptide developpe a demande egalement beaucoup de temps pour 1'amelioration du
design. Plusieurs derives ont ete synthetises et les differents peptides resultants ont ete
testes in vitro avant d'obtenir le design optimal du DOTA-Heterodimere. Les deux
peptides finaux ont donne tous deux de bons resultats in vitro sur les deux lignees de
cancer du sein humain retenus pour 1'etude, les MCF-7 et T-47D. Afin de verifier
70
1'impact in vivo de ces composes, un modele murin a ete developpe utilisant les memes
lignees cellulaires humaines que lors des tests in vitro.
Les resultats in vivo du (DOTA)Lys4-BVD15 ont ete plutot decevants.
L'accumulation attendue dans les tumeurs n'etait pas tres importante et, malgre la coinjection avec 0.5 mg/souris de Lys4-BVD15 non radioactif qui a suffi a limiter cette
captation sur les MCF-7, les ratios n'ont pas diminues avec la co-injection. La captation
de tous les autres organes ont meme augmente avec la co-injection. Quelques hypotheses
ont ete emises par rapport a ces resultats dont la quantite trop importante de produit nonradioactif qui saturerait toutes les voies metaboliques du peptide incluant la voie
d'elimination, ce qui laisse une grande quantite de peptide radioactif circulant dans le
systeme sanguin. L'autre hypothese etait la possible instabilite du complexe DOTAcuivre qui laisserait beaucoup de cuivre libre circulant et ce serait ce cuivre qui serait
capte par la tumeur et mesure par la suite lors de la dissection. Une etude de stabilite
plasmatique a ete realisee pour verifier cette derniere hypothese. Les resultats ont ete
surprenants mais eclairants sur la maniere d'ameliorer le design de la molecule.
Seulement 5% de cuivre-64 reste complexe au (DOTA)Lys4-BVD15 apres une lh
d'incubation dans le plasma de souris. Nous avons invoque la formation potentielle de
lien hydrogene entre un groupement carboxylate sur le DOTA et la fonction guanidinium
de l'Arg8, liberant du meme coup le cuivre emprisonne. L'accroissement de la longueur
de l'espaceur utilise pourrait empecher cette interaction non-desirable et ameliorer la
stabilite du complexe cuivre/DOTA en eloignant ce dernier du squelette peptidique. Les
resultats in vivo du DOTA-Heterodimere sont encourageants pour une des deux tumeurs,
la T-47D pour ce qui est de la captation sans co-injection. La co-injection avec des
ligands froids n'a par contre pas permis de diminuer la captation du traceur de cette
71
tumeur. Le fait que la tumeur MCF-7 ne capte pas Pheterodimere radio-marque pourrait
laisser croire a une meilleure affinite du segment BBN(6-14) pour son recepteur, le
GRPR, que le segment BVD15 pour le recepteur Yl.
72
PERSPECTIVES D'AVENIR
Avec toutes les donnees recueillies dans le cadre de cette etude, il a ete possible de
voir que le design de peptides pour cibler preferentiellement le recepteur Yl et/ou le
recepteur GRP etait possible. Les etudes futures sur ce type de molecule seront
nombreuses puisque les resultats sont prometteurs.
Lors des experiences in vitro, les valeurs de Kj recueillies n'etaient pas
necessairement tres reproductibles. Les ecart-types sont plutot grands et ce serait
probablement du au caractere biologique des cellules. Puisque les cellules sont des
matieres vivantes, l'expression des differents recepteurs n'est pas toujours exactement la
meme. Le fait d'avoir plus ou moins de recepteurs presents a la surface des cellules
influence la valeur du Kj lors des tests de competition. Une facon de remedier a cette
problematique serait d'utiliser des cellules transferees stables qui expriment de facon
preferentielle le ou les recepteur(s) d'interet. Egalement, lors des tests sur les
heterodimeres, en utilisant ces lignees il sera plus facile d'attribuer les resultats a la
liaison d'un recepteur en particulier puisqu'il serait le seul a etre surexprime.
Le (DOTA)Lys4-BVD15 necessite quelques ajustements au niveau du design pour
eloigner le DOTA du squelette peptidique pour dviter toute interaction nuisible a la
stabilite de la liaison cuivre-DOTA. L'utilisation d'autres chelateurs tels le NOTA ou la
sarcophagine pourrait etre une alternative interessante pour ameliorer la stabilite du
complexe. La modification de peptides afin de permettre le marquage au
18
F est
egalement envisagee pour diminuer les risques d'encombrement sterique et les
interactions dus au chelateur. Egalement, lorsque la stabilite du radiotraceur peptidique
73
sera amelioree, la question de la co-injection sera a revoir puisqu'il est clair que la
quantite administree par souris est trop importante et masque les resultats en saturant tous
les sites de liaison.
Pour ce qui est du DOTA-Heterodimere, deux groupes supplementaires de souris
sont a prevoir pour finaliser l'etude. II sera bien de verifier Taction de la co-injection de
BBN et Lys4-BVD15 de facon separee. En inhibant un seul des deux recepteurs d'interet,
il sera possible de savoir si une extremite du peptide est plus active que l'autre.
Comme il a ete mentionne precedemment, le BVD15, utilise pour le design du
(DOTA)Lys4-BVD15 et du DOTA-Heterodimere, a une affmite non seulement pour le
recepteur Yl mais egalement pour les recepteurs Y2 et Y4. Afin de determiner la
selectivity de nos nouveaux traceurs vis-a-vis les recepteurs NPY, des cellules
transferees avec les recepteurs d'interet (NPY Y2) seront utilisees pour les essais in vitro
de competition.
Ces radiotraceurs peptidiques, en plus d'etre utilises pour l'imagerie TEP,
pourraient ultimement devenir des outils pour le traitement du cancer du sein. Le cuivre64 est utilise dans le traitement de tumeurs grace aux radiations beta emises par cet
isotope.
74
Les peptides developpes lors de cette etude pourraient, dans un avenir rapproche,
devenir des agents pour d'autres modalites d'imagerie. Avec une amelioration du design,
ils pourraient devenir des outils d'imagerie par fluorescence qui est de plus en plus
etudiee et qui utilise la lumiere comme moyen de detection. En couplant les peptides avec
des molecules telles l'Alexa Fluor, ou le Bodipy, cette modalite d'imagerie serait
accessible. Par contre, la penetrance tissulaire de ce type d'imagerie est moins grande que
celle de l'imagerie TEP done il y aurait une limitation quant a la profondeur maximale oil
la tumeur pourrait se situer. Egalement, l'imagerie par resonance magnetique (IRJV1) peut
etre envisageable en couplant le peptide avec un agent de contraste tel le gadolinium a
l'aide du DOTA. La limitation de ce type d'imagerie repose dans sa faible sensibilite qui
est 100X a 1000X plus faible.
75
REMERCIEMENTS
Je tiens tout d'abord a remercier mes directeurs de recherche, le Pr Francois
Benard et la Pre Brigitte Guerin, pour m'avoir permis de travailler sur ce projet stimulant
des la creation de celui-ci. Je leur suis egalement tres reconnaissante de m'avoir laisse
participer a des congres de grande envergure et ainsi de cotoyer de grand specialistes dans
le domaine de la medecine nucleaire et de la radiobiologie. Ce fut des experiences tres
gratifiantes.
Je tiens a remercier toute Pequipe de chimistes et personnel du cyclotron pour la
synthese et le marquage des peptides, Rejean Langlois, Marie-Claude Tremblay,
Merajuddin Khan et Samia Ait-Mohand. Merci aussi a tous les membres du departement
de medecine nucleaire et radiobiologie qui ont appuye de pres ou de loin mon projet. Un
grand merci tout particulierement a Celena Dubuc, Simon Authier, Melanie Archambault
et Etienne Croteau pour leur support et leur aide precieuse qui ont su apporter une
dimension speciale a mon travail.
Egalement, je veux remercier les membres de mon jury, Pr Francois Benard, Pre
Brigitte Guerin, Pr Benoit Paquette et Pre Danielle Jacques d'avoir accepte d'evaluer ce
travail.
Finalement, je tiens a remercier toute ma famille et mon copain qui m'ont supporte
et pousse a repousser mes limites et a ne jamais abandonner dans cette aventure.
Merci beaucoup a tous !!
Veronique
76
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ANNEXES
92
Annexe 1
Protocole experimental d'essai de competition de liaison
d'analogues du bombesin et NPY Yl a des recepteurs de
cancer du sein
1- Mettre dans des plaques de 24 puits les cellules tumorales de la lignee desiree (75 000
cellules par puits) et laisser crottre jusqu'a environ 70-80% de confluence.
2- Aspirer le milieu de culture cellulaire et le remplacer par 400|il de milieu de reaction
(RPMI a pH 7.4 contenant 4,8 mg/ml d'HEPES (10 ml pour 500ml de milieu), O.lug/ml
de Penicilline/Streptomycine (5ml pour 500ml de milieu) et 2mg/ml de BSA (lg pour
500ml de milieu)).
3- Ajouter 50ul de NPY ou de bombesin marque a PI-125 avec une concentration d'environ
1X10"" M pour le NPY et 1X10",2M pour le BBN et 50ul de NPY, bombesin ou de
peptide a tester non radioactif ayant une concentration variant delXlO" M a 1X10" M et
completer les volumes des petris pour avoir un volume final de 500ul si necessaire dans
chacun des puits.
4- Incuber les cellules a 37°C pendant 40min avec agitation.
5- Aspirer le milieu de reaction.
6- Laver les cellules 2X avec du PBS.
7- Mettre 500|il de trypsine dans les puits.
8- Recolter les cellules et placer le contenu de chaque puits dans un tube et compter dans le
compteur gamma « Cobra y-counter ».
9- Analyser les resultats obtenus avec GraphPRISM.
93
Annexe 2
Protocole experimental de biodistribution au Cu-64
1- Peser et identifier Panimal, mesurer les tumeurs.
2- Anesthesier Panimal sous isoflurane (2.0%, oxygene 1.5L/min).
3- Installer une canule dans la veine caudale.
4- Reconstituer le produit radioactif dans du PBS avec 10% d'intralipide
5- Preparer une seringue de 10(J.Ci de peptide marque au Cu-64 en completant le
volume a 0.1ml avec du PBS.
6- Injecter Panimal.
7- Faire un flush de 0.1ml avec de la saline.
8- Reveiller et garder Panimal dans sa cage derriere le mur de plomb pendant le
temps requis.
9- Sacrifier Panimal sous anesthesie par inhalation de CO2.
10- Proceder a la biodistribution.
11- Quantifier la radioactivite (en % de dose injectee accumule par gramme de tissu)
contenue dans chacun des organes obtenus de la biodistribution.
94
Annexe 3
Protocole experimental pour l'essai de stabilite in vitro
1- Prelever du sang de l'animal dans un tube
2- Centrifuger a 13 000 rpm pendant 5 minutes
3- Recuperer le plasma dans un nouveau tube
4- Placer 135ul de plasma dans un eppendorf
5- Ajouter 15ul d'une dilution du produit a tester pour avoir 3mCi final
6- Incuber a 37°C pour des temps variant entre 10 min et 24 heures
7- Arreter la reaction en ajoutant 150ul d'acetonitrile 75%
8- Vortexer
9- Centrifuger a 13 QOOrpm pour 20 minutes a 4°C
10- Transferer le surnageant dans un autre tube
11-Evaporer le surnageant jusqu'a sec
12-Resuspendre dans 50ul d'eau grade HPLC
95
Annexe 4
Composition des milieux de culture
RPMI 1640
Catalog No.
isn-rvw
350-015
350-005
350-010
350-020 350-025
350-030
IX, Liquid IX, Liquid IX, Liquid IX, Liquid IX, Liquid IX, Liquid IX, Liquid
RPMI 1640
InoisHmc Sato
CalNO^-Wrf)
KCI
MgS04 (anhydrous)
Nad
XazHftV
NattCO,
Amino Acids
L-AiginirK-HO
L-Asparasine-BjO
L-Aspanic add
L-Cysiine*2Ha
t-Qhmac acid
L~Ghitaovne
Glycine
L-HBtkfe* >
Hyciroay-L-proliae
L-feoteucine
L-Leucme
L-LysincBCl
L-MetbkmiiN
L-PheayhkDlne
L-Protine
L-Serme
L-Thrtomne
L-7ryploph*n
L-Tyro«mc-2Na-2HjO
iJAWine
Vitamins
Biotin
D-Celchao pantotbcDBfc
Choline chloride
Folk acid
Meoshol
Nicodnanode
Ptwo-Amawteiwotc acad
Pyridoxiae*HC1
Riboflavin
TTtuumne»HG
Vrtainin B|j
Other
D-Glucose
GluwhMBC (reduced)
HEPES
Phenol ied.Ni
Sodium Pyruvate
Add
NaHCQi
Powder (gVL)
7.3% Solution (mUL)
L-GEulamae
FOWds (cng/L)
2«hnM SoL («U1.|
Specifications
pH (ifter buffer)
mg/L
100.00
400 00
4880
SWOSO
800.70
2900.00
RPMI 1640
RPMI 1640
Big*.
rog/L
100.00
400.00
48.80
6000.00
800.70
iOO.OO
40000
4a so
600000
800.70
2000.00
200.00
56.82
20.00
6520
20.00
3ttU»
10.00'
1S.00
200.00
54.82
20.00
63.20
20.00
300.00
10.00
15.00
20:00
50.00
50.00
40.00
13.00
13.00
20.00
30.00
20.00
5.00
2843
JO-fiS
50.00
50.00
40.00
15.00
T530
" ~ 20.00"
30.00
20.00
5 OS
28.83
"iaod
0.M
025
3.00
IDS
35.00
1.09
\M
1.09
11.20
" T»"'-"'
Osmolality (mOsmftg)
G u n or powder required lo 1
prepare 11 (IX Solution)
0j005
2000.00
LS0
—
5.00
0.20
025
_..
iM
1.00
35.00
1.00
1.00
1.00
(1.20
~ l.TJO"
0.O05
200000
1.00
5958.00
5.00
RPMI 1640
RPMI 1640
RPMI 1640
ttlg/L
rog/L
100.00
400.00
48.80
6000.00
800.70
mg/L
100.00
400.00
' 48.80
6000.00
800.70
100.00
400.00
48.80
6000.00
800.70
....
2000.00
—
—
200.00
200.00
56.82
56.82
20.00
20.00
65.20
65.20
200.00
56.82
20.00
6320
20.00
300.00
10.00
15.00
20.00
50.00
50.00
40.00
15.00
15.00
20.00
30.00
200.00
56.82
20.00
65 JO
20.00
300.00
10.00
15.00
20.00
50.00
50.06
40.00
15.00
15.00
20.00
30.00
20.00
500
28.83
20.00
20.00
20.00
300.00
10.00
300.00
ISM ~
2036
50.00
10.00
15.00
20.00
50.00
SSM
50.00
40.00
15.00
"lloT
40.00
ssr
30J»
20.00
30.00
20JOO
2o:oo
15.00
15.00
5.00
5 00
2843
28.83
--
m M
"*
~~WaS—
5.00
2843
20.00
0.20
0.23
3.00
1.00
35.00
1.00
1.00
1.00
0.20
1.00
0.005
0.20
02*
3.00
1.00
33.00
1.00
1.00
1.00
0.20
1.00
0.003
2000.00
1.00
595100
5.00
2000.00
100
2000.00
Tifo'
—
500
110.00
—
020
0.25
lob
1.00
33.00
1.00
1.00
i.ob
0.20
too
0.005
020
023
3.00
1.00
33.00
1.00
1.00
1.00
920
1.00
0.005
RPMI 1640
rflgt
100.00
400 00
48.80
6000.00 "
800.70
2000.00
200.00
56.82
20.00
6320
20.00
—
"
10.00
15.00
20.00
30.00
50.00
40.00
15.00
15.00
20.00
30.00
20.00
5.00
28.83 "•••
20.60
0.20
023
lob
1.00
35.00
1.00
1.00
i.ob
0 20
1.00
O.003
2000.00
—
5.00
2000.00
1.00
354125
5.00
—
—
—
2.00
26.70
. 2.00
26.70
i.off
—
5.00
—
—
—
—
—
...
7.2 ± 0 2
ig 20-2S°C
290 ± 30
N/A
121 0.2
7.2 i 0.2
7 2 1 0.2
7.2 k 0 2
7.151 0.1
276 ± 30
N/A
290 ± 30
N/A
290 i 30
N/A
290 ± 30
N/A
276 i 30
N/A
7.15 ± 0.1
276 ± 30
N/A
300.00
1027
96
Ham's F-10 & F-12 Medium
Catalog No.
Inorganic Salts
CJECIJ (atdrydroits)
CuS0 4 (anhydrous)
F«S04-7HjO
KC1,
KHjPO,
MgSO„ (anhydrous)
318-050
218-050
318-010
218-010
IX, Liquid
IX, Liquu
Powder
Powder
Ham's F-10 Ham's F-10 Ham's F-l! Ham's F-12
mg/t
mg/I,
33.30
0.0016
33.30
0.0OI6
0.834
0.834
285.00
83.00
mg/L
33JO
mg/L
33JO
0.0016
0.834
0.0016
0.834
285.00
83.00
223.60
223.60
—
....
74.60
7230
7600.00
7220
ZnSOj'THjO
0.0288
0.0288
NaCl
NajHPO, (anhydrons)
•it
7400.00
153.70
NRHCO,
74.60
7400.00
153 70
1200.00
7600.00
14200
6.863
Amino Arids
L-A U3IIUI6
L-Ajgmioc-HCI
L-Asparsgjne-HjO
L-Aspartic acid
L-Cyjteios-HCl-HjO
L-Glufannc acid
L-Glctsmjne
Glycine
l.-Hishdine-HCI-HjO
L-lsolencine
L-Leucine
L-Lyane-HCI
L-Methicuina
L-Phenylokmoe
L-J>rolinc
L-Seriw
L-ThnsoKine
L-rryptoptan
L-Tyrnsiiie-2Nii''2H20
L-Valine
Vitamins
Bio4in
l>Calciuni pacUDthcmte
Qiohne Ehiorids
Folic acid
i-Inositol
Nicotinamide
FyridoxmcHCI
Riboflavin
TfugauncHCl
9.00
211 00
,
9.00
211.00
8.90
211.00
15.00
13.30
8.90
211.00
35.12
35.12
14.70
15.00
13.00
35.10
15.00
13.00
35.10
14.70
14.70
146.20
14.70
146.20
7.50
23.00
T!o~"
7.50
20.96
2.60
20.96
3.94
13.06
29.00
4.48
13.10
36.50
4.48
13.10
36.50
4.48
5.00
11.50
4.96
34 JO
4.96
34.50
10.50
3.57
1OJ0
11.90
0.60
2.61
3.50
0.60
2.61
3_50
2.04
7.84
11.70
10.50
11.90
2.04
M&U
0.024
0.715
0.715
0.0073
0.48
0.0073
0.48
0.698
132
0.698
13.96
1.30
13.96
1.30
18.02
14620
7.50
23.00
2.60
13.00
29.00
4.48
5.00
11.50
10 JO
3.57
0.541
0.615
0.206
0376
100
1
'
1.32
0.541
0.615
0.206
0:376
18.02
0.038
0.34
1.36
1.36
1802.00
1802.00
4.77'
0.21
4.77
0.088
1.20
0.16"
0.088
110.00
0.73
1100.00
4.77
Lipoic acid
Methyl lincotaie
0.20
0.20
....
—
Phenol red.Na
Pnarcscine-2HCI
120
1.20
Sodium Pyruvate
110 00
110.00
110.00
0.73
0.73
0.73"
—
1.20
16.0
Thymidine
Add
NaHC03
Powder i ^ t )
7.5% SoiuHsn (mUL)
Specifications
pH (after buffo)
Osaofoh'ly {BrOson/kg)
Grams of powderrequiredto
prepare 1L(1X Solution)
184
11.70
0.038
0.34
1100.00
4.77
—
3.94
0.037
1.36
Hypoxanthine, N«
146.20
0.037
0.062
1.00
1.36
Vitamin B Q
Other
D-Glncoss
15.00
13 JO
....
0.062
0-21
1.20
0.16
1.176
15.70
1 2 * 0.2
7.5 ± 6.5
12 t 02
7.5 ± US
290 ± 30
N/A
290 ± 30
290 1 30
9.82
N/A
290 ± 30
10.64
»
11
l
97
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM)
Catalog No.
Inorganic Salts
CaCI, (anhydrous)
FefNOVjjWHjb
KCI
MgSO( (aabydroug)
NaCl
NaHjPCyH,©
NaHCOj
Amino Acids
L-Argimoc-HCl
L-Cysttae»2HCI
L-Glutamine
Glycine
LHistidincHCI-HjO
L-Isoleucnie
L-Lenchte
L-Lynne-HCI
L-Melhtonbe
L Phenylalanine
L-Seriae
L-Threonine
L-Tryptoptan
L-Tyraiii»r2Nii«2H20
LValtoe
Vitamins
D-Calcium paaiotheraie
Choline chloride
Folic acid
i-Inoatol
Nicotinamide
Pyri*wine-HCl
Riboflavin
Thiamine*HCI
Other
D-GliKose
PtacoolraLNa
Sodium Pyruvate
HEPES
Add
NaHC03
Powder (g/L)
7.5% Solution (rnL/L)
L-dutambw
Powder (mg/L)
200IDM Sol (mL/L)
Specifications
pH {after buffer)
Osmolality (mOsm/kg)
Grams of powderrequiredto
prepare IL (1X Solution)
319-010
319-005
IX, Liquid IX, Liquid
DMEM
DMEM
319-015
319-025
319-030
319-035
1X, Liquid IX, Liquid IX, Liquid IX, Liquid
DMEM
DMEM
DMEM
DMEM
mg/L
mg/L
mg/L
200.00
0.10
400.00
97.70
6400.00
125.00
370OJO
200.00
0.10
400.00
97.70
6400.00
125.00
3700.00
200.00
42.00
104.80
104.80
146.20
30.00
66.00
42.00
95.20
16.00
103. W
94.00
84.00
62.57
584.00
30.00
42.00
104.80
104.80
146.20
30.00
66.00
42.00
95.20
16.00
103.79
94.00
8400
62.57
584.00
30.00
42.00
104.80
104.80
146.20
30.00
66.00
42.00
95.20
1600
103.79
94.00
4.00
4.00
4.00
7.20
4.00
4.00
0.40
4.00
4.00
4.00
4.00
7.20
4.00
4.00
0.40
4.00
4.00
4.00
4.00
7.20
4.00
4.00
0.40
4.00
4.00
4.00
4.00
7.20
4.00
4.00
0.40
4.00
4.00
4.00
•4.00
7J20
4.00
4.00
0.40
4.00
4.00
4.00
4.00
7.20
4.00
4.00
0.40
4.00
4500.00
15.00
110.00
4500.00
15.00
110.00
4500.00
15.00
4500.00
15.00
110.00
4500.00
lT.66
—
—
mg/L
200.00
0.10
400.00
97.70
6400.00
125.00
3700.00
84.00
62.57
584.00
16.06
mg/L
400X0
97.70
6400.00
125.00
3700.00
mg/L
200.00
0.10
400.00
97.70
640000
125.00
37066b
200.00
0.10
400.00
97.70
6400.00
125.00
3766.00
84.00
62.57
84.00
62.57
84.00
62.57
3000
42.00
104.80
104.80
146.20
30.00
66.00
42.00
95.20
16.00
103.79
94.00
30.00 ~
42.00
104.80
104.80
146.20
30.00
66.00
42.00
95.20
16.00
103779"
94.00
30.00
42.00
104.80
104.80
146.20
30.00
66.00
42.00
95.20
16.00
103.79
94.00
a.io
—
,
—
•
—
—
—
—
4500.00
15.00
11006
5958.00
—
—
—
_
—
—
—
—
—
584.00
20.00
584.00
20.00
584.00
20.00
7.2 i 0.2
335 ± 30
N/A
7.2 ± 0.2
335 ± 30
N/A
7.2 ± 0.2
335 ± 30
N/A
7.2 i 0.2
335 ± 30
N/A
7.2 ± 02
335 ± 30
N/A
7.2 ± 0.2
354 ± 10
N/A
98