Université de Sherbrooke Détection, annotation fonctionnelle et régulation des isoformes de

Université de Sherbrooke
Détection, annotation fonctionnelle et régulation des isoformes de
l'épissage alternatif associées au cancer de l’ovaire
Par
Jean-Philippe Brosseau
Département de biochimie
Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé
en vue de l’obtention du grade de philosophiae doctor (Ph.D.) en biochimie
Sherbrooke, Québec, Canada
décembre, 2012
Membres du jury d’évaluation
Jean-Pierre Perreault, biochimie
Sherif Abou Elela, microbiologie
Nathalie Rivard, anatomie et biologie cellulaire
Rodney Ouellette, biochimie
Anne-Marie Mes Masson, Centre de recherche CHUM et Institut du cancer de Montréal
Jean-Philippe Brosseau, 2012
1+1
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RÉSUMÉ
Détection, annotation fonctionnelle et régulation des isoformes de
l'épissage alternatif impliquées dans le cancer de l'ovaire
Par
Jean-Philippe Brosseau
Département de biochimie
Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention
du diplôme de philosophiae doctor (Ph.D.) en biochimie, Faculté de médecine et des
sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4
L’expression des gènes modifiés contribue à l’initiation et la progression du cancer.
Malheureusement, les recherches actuelles s’attardent essentiellement à l’expression
globale des gènes sans tenir compte des différentes isoformes des ARNm résultant de
l’épissage alternatif, codant potentiellement pour des protéines de fonctions différentes. En
effet, la haute similitude et la complexité des isoformes ARNm rendent la discrimination
des isoformes laborieuse, raisons pour lesquelles l’épissage alternatif est historiquement
étudié gène par gène. C’est la raison pour laquelle nous avons développé une méthodologie
à haut débit pour la quantification des isoformes d’ARNm. Basé sur cette technique, cette
thèse présente une série d’évidences qui appuie l’hypothèse selon laquelle certaines
iso formes d’ARNm sont nécessaires à la tumorigénèse. Précédemment, des études
bioinformatiques à grande échelle ainsi que des validations expérimentales à petite échelle
ont révélé la présence d’isoformes spécifiques à certains types de cancers. Toutefois, ces
conclusions ont été tirées à partir de tumeurs dont le contenu cellulaire est hétérogène. Or,
il est bien connu que les niveaux des iso formes d’ARNm diffèrent largement en fonction du
type cellulaire et il est possible que les différences observées dans des tumeurs entières
soient des artéfacts résultant de la complexité cellulaire des tissus comparés. En nous
basant sur le cancer de l’ovaire comme modèle, nos préparations homogènes de différents
types cellulaires nous ont permis de révéler la présence d’isoformes associées au cancer
indépendamment de l’hétérogénéité des tumeurs. Étonnamment, les changements les plus
intéressants ne se retrouvent pas dans les cellules cancéreuses à proprement dites, mais dans
les cellules « normales » en bordure de la tumeur. Notre analyse des facteurs de régulation
de ces isoformes nous a permis d’affirmer que ces changements ne sont pas dûs à un
dérèglement anarchique des cellules cancéreuses, mais découlent plutôt d’un programme
destiné à avantager les cellules cancéreuses. Pour évaluer la fonction des isoformes
d’ARNm, nous avons généralisé des outils moléculaires permettant de reprogrammer
spécifiquement l’expression d’isoformes de gènes cible dans des lignées cellulaires
cancéreuses. Ainsi, le criblage systématique d ’isoformes d’ARNm de gènes cibles associés
au cancer a permis de révéler leur caractère pro-cancer dans des essais in vitro. L ’ensemble
de ces travaux démontrent la contribution des isoformes d’épissage dans le développement
des tumeurs solides.
Mots-clés: Cancer de l’ovaire, PCR en temps réel à haut débit, analyse de l’ARN, siRNA,
microdissection au laser, épissage alternatif, microenvironnement.
SUMMARY
Detection, functional annotation and regulation
of splicing isoforms in ovarian cancer
By
Jean-Philippe Brosseau
Département de biochimie
Thesis presented to the Faculté de médecine et des sciences de la santé for the
obtention of the title of philosophiae doctor (Ph.D.) in biochemistry, Faculté de médecine et
des sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4
Cancer cells modify their gene expression pattern to promote tumor growth. Unfortunately,
current research focuses almost exclusively on global gene expression changes, without
taking into account the fact that the majority of genes produce multiple alternative splicing
variants, which potentially code for proteins of different functions In fact, the main reason
splicing isoforms are still studied on a gene by gene basis is because the high sequence
similarity and complexity of mRNA isoforms make it very difficult to detect and quantify
them. To overcome this difficulty, we developed a high-throughput methodology to
accurately quantify splicing isoforms. This methodology has been applied in this thesis to
generate evidence supporting a causal role for splicing isoforms in the tumorigenesis of
solid tumors. A few years ago, genome-wide bioinformatics predictions, and some
experimental validations in human tissues, suggested the existence of cancer-specific
splicing isoforms. However, these conclusions may be simply explained by the cellular
heterogeneity of tumor. In fact, it is well established that alternative splicing is a cell typespecific process. To address this, we microdissected cancer tissues and demonstrated that
some splicing isoforms are truly cancer-associated and independent of tumor cell type
content. Surprisingly, the most interesting changes were found in the “normal” stromal
cells surrounding the tumor and not within the cancer cells. Our analysis of splicing-factor
expression changes using the same tissue set allowed us to confirm that these splicing shifts
were not a random process, but rather part of a defined splicing program promoting tumor
development. To evaluate the functional contribution of splicing isoforms, we developed
molecular tools that modulate splicing of endogenous targets in cancer cell lines. We used
these tools to decipher the pro-cancer properties of cancer-associated splicing isoforms
using in vitro assays. Overall, this work demonstrated the contribution of splicing isoforms
in solid tumor development.
Keywords: Ovarian cancer, high-throughput real-time PCR, TOSS, siRNA, laser
microdissection, alternative splicing, microenvironment.
iv
TABLE DES MATIÈRES
RÉSUMÉ...................................................................................................................................................ii
SUMMARY............................................................................................................................................ iii
TABLE DES MATIÈRES.......................................................................................................................iv
LISTE DES TABLEAUX......................................................................................................................vii
LISTE DES FIGURES............................................................................................................................ ix
LISTE DES ABRÉVIATIONS............................................................................................................. xii
INTRODUCTION................................................................................................................................. 16
1 Le Cancer............................................................................................................................................ 16
1.1 Généralités.......................................................................................................................................16
1.1.1 Définitions.....................................................................................................................................16
1.1.2 Statistiques.....................................................................................................................................17
1.1.3 Facteurs de risque.........................................................................................................................17
1.2 Modélisation de la cancérogenèse.................................................................................................. 18
1.2.1 Cancérogènes................................................................................................................................ 18
1.2.2 Oncogènes.....................................................................................................................................18
1.2.4 Progression séquentielle de la cancérogenèse........................................................................... 20
1.2.3 Gènes suppresseurs de tumeurs...................................................................................................23
1.2.5 Rôle du microenvironnement de la tumeur..................................................................................25
1.2.6 La transition épithéliale-mésenchymale et mésenchymale-épithéliale.......................................27
1.2.7 Origines des CAFs....................................................................................................................... 32
1.3 Cancer de l ’ovaire...........................................................................................................................33
2 Epissage des ARNm ............................................................................................................................39
2.1 Épissage constitutif..........................................................................................................................39
2.2 Épissage alternatif.......................................................................................................................... 44
2.2. / Type d ’événements d ’épis sage alternatif.....................................................................................44
2.2.2 Mécanisme de régulation............................................................................................................. 45
2.2.2.1 Mécanisme de régulation classique.......................................................................................... 45
2.2.2.2 Expression tissu-spécifique de facteurs d ’épissage................................................................. 48
2.2.3 Rôle dans la cancérogenèse.......................................................................................................49
V
2.2.3.1 Dérégulation des isoformes...................................................................................................... 49
2.2.3.2 Dérégulation des facteurs d ’épissage....................................................................................... 50
2.2.3.3 Relation de cause à effet............................................................................................................50
3 Quantification de l ’ARNm.................................................................................................................. 54
3.1 Méthodologies de quantification des isoformes alternativement épissés..................................... 54
3.2 Utilisation d ’échantillon clinique fix é .............................................................................................56
3.3 Microdissection au laser et amplification d ’ARN.......................................................................... 58
4 Méthodes pour reprogrammer l ’épissage alternatif des cellules cancéreuses................................ 59
4.1 Antisens............................................................................................................................................ 59
4.2 Modulateur artificiel de l ’épissage alternatif.................................................................................62
4.3 siRNAs isoforme-spécifique.............................................................................................................66
OBJECTIFS DE CETTE THÈSE DE DOCTORAT........................................................................... 70
MÉTHODOLOGIES ET RÉSULTATS...............................................................................................71
Chapitre 1............................................................................................................................................... 71
Avant-propos..........................................................................................................................................71
Mise en contexte.................................................................................................................................... 72
Résumé....................................................................................................................................................72
Article 1: High-throughput quantification o f splicing isoforms..........................................................74
Chapitre 2............................................................................................................................................... 97
Avant-propos..........................................................................................................................................97
Mise en contexte.................................................................................................................................... 98
Méthodologies........................................................................................................................................99
Résultats : Développement d ’outils moléculaires isoforme-spécifiques...........................................103
Chapitre 3 ............................................................................................................................................. 142
Avant-propos......................................................
142
Mise en contexte.................................................................................................................................. 143
Résumé................................................................................................................................................. 148
Article 2: Alternative splicing ofSYK regulates mitosis and cell survival....................................... 149
Chapitre 4 .............................................................................................................................................187
Avant-propos....................................................................................................................................... 187
Mise en contexte.................................................................................................................................. 187
Résumé
188
Article 3: Programmed modulation o f alternative splicing in the tumor microenvironment...........189
DISCUSSION.......................................................................................................................................240
1 Quantification de séquences hautement similaires......................................................................... 241
1.1 Quantification de l ’expression globale et isoforme-spécifique sur une même plateforme
241
1.2 Quantification transcrit-spécifique...............................................................................................243
1.3 Application des règles de dessin d ’amorce-jonction pour d ’autres cas de séquences très
semblables............................................................................................................................................ 244
2 Nouvelles stratégies pour la modulation de l ’AS de cibles endogènes......................................... 247
2.1 Modulation d ’ASEs simples par les TOSS....................................................................................247
2.2 Modulation d ’ASEs complexes par les TOSS...............................................................................248
2.3 Nouvelles stratégies pour stimuler l ’inclusion d ’exon.................................................................252
3 Impact fonctionnel des isoformes de l ’épissage alternatif dans la cancérogenèse....................... 253
3.1 Impact fonctionnel des isoformes de Tépissage alternatif de gènes associés au cancer........... 253
3.2 Cibles potentielles pour le TO SS..................................................................................................260
3.3 Impact fonctionnel du programme RBFOX2 et QKI dans la cancérogenèse.............................261
4 Potentiel clinique des signatures moléculaires obtenues par microdissection..............................265
CONCLUSIONS................................................................................................................................. 267
REMERCIEMENTS............................................................................................................................269
LISTE DES PUBLICATIONS............................................................................................................271
ANNEXES...........................................................................................................................................286
Annexe 1 Base de données de TOSS...................................................................................................286
Annexe 2 Étude de spécificité des siRNAs spécifiques à l ’isoforme court....................................... 286
Annexe 3 Tableau S I-17 du chapitre 4 ...............................................................................................293
LISTE DES TABLEAUX
Introduction
Tableau 1 Prédispositions héréditaires liées à des gènes suppresseurs de tumeurs............. 25
Chapitre 1
Tableau 1 Comparison between the specificity of the boundary-spanning primers carrying
different 3’end mismatches...................................................................................................... 83
Tableau 2 Summary of the primer design data generated by RASE.....................................85
Tableau 3 Experimental validation of RASE designed primers............................................87
Chapitre 2
Tableau 1 Effet de la portion « tail » du TOSS..................................................................... 121
Tableau 2 Effet de la position du TOSS par rapport au site 5’ d’épissage......................... 123
Tableau 3 Taux de succès des TOSS..................................................................................... 141
Chapitre 3
Tableau 1 Relation fonctionnelle entre les iso formes de l’AS et influence théorique des
outils moléculaires sur le phénotype...................................................................................... 144
Tableau 2 Comparaison des effets de modulateurs d'AS et de répression iso formespécifique du gène BCL2L1 sur l'induction d’apoptose dans des cellules cancéreuses
humaines..................................................................................................................................146
Chapitre 4
Tableau SI Description of the cancer epithelial signature (CES) alternative splicing events
(ASEs).....................................................................................................................................235
Tableau S2 Description of the cancer stromal signature (CSS) alternative splicing events
(ASEs).....................................................................................................................................235
Tableau S3 Description of the common RBFOX2 and QKI splicing targets associated with
the tumor microenvironment..................................................................................................235
Tableau S4 Expression patterns of cancer-associated splicing factors................................ 236
Tableau S5 Validation of the splicing factors knockdown...................................................236
Tableau S6 The expression of splicing factors associated with mesenchymal-to-epithelial
transition (MET) are not systematically modified in cancer tissues....................................236
Tableau S7 List of EMT associated alternative splicing events that are preferentially
expressed in tumor tissues......................................................................................................236
Tableau S8 Identification of RBFOX2 and QKI common splicing targets.........................237
Tableau S9 RBFOX2 and QKI preferentially regulate the expression of mesenchymalenriched exons........................................................................................................................ 237
Tableau S 10 Splicing pattern of RBFOX2 and QKI splicing targets in cancer tissues...... 237
Tableau SI 1 QKI-6 and QKI-7 splicing pattern in undissected tissues...............................237
Tableau S12 QKI relative global expression in undissected tissues.................................... 237
Tableau S13 Clinical data of tissues used for laser capture microdissection (LCM) samples.
.................................................................................................................................................238
Tableau S14 Global expression levels of established epithelial and stromal markers in
normal and cancer tissues.......................................................................................................238
Tableau S15 Clinical data associated with the undissected serous ovarian tumors used in
this study................................................................................................................................. 238
Tableau S16 Clinical data associated with the undissected ductal breast tumors used in this
study........................................................................................................................................ 238
Tableau S17 List of siRNAs used for the knockdown of splicing factors...........................238
Discussion
Tableau 1 Stratégies de dessin d’amorce allèle-spécifique.................................................. 245
Tableau 2 Exemples de gènes associés au cancer ayant été ciblés avec des modulateurs
d’AS (SSO, TOSS ou TOES) dans des cellules cancéreuses humaines.............................. 254
Tableau 3 Exemples de gènes associés au cancer et ciblés avec des siRNAs isoformespécifîques dans des cellules cancéreuses humaines............................................................ 256
LISTE DES FIGURES
Introduction
Figure 1 Mécanismes d'activation des oncogènes...................................................................20
Figure 2 Progression séquentielle de la cancérogenèse.......................................................... 23
Figure 3 Interactions hétérotypiques entre les cellules épithéliales cancéreuses et les
cellules stromales du microenvironnement..............................................................................27
Figure 4 Rôle de l’EMT/MET dans le développement normal.............................................. 28
Figure 5 Schématisation des étapes de l’EMT........................................................................ 30
Figure 6 Facteurs de transcription impliqués dans l’EMT/MET............................................31
Figure 7 Rôle de l’EMT/MET dans la cancérogenèse............................................................ 32
Figure 8 Progression séquentielle du cancer de l'ovaire......................................................... 36
Figure 9 Origine du cancer de l’ovaire.................................................................................... 38
Figure 10 Unité génique........................................................................................................... 39
Figure 11 Réaction d’épissage................................................................................................. 41
Figure 12 Séquences consensus impliquées lors de l’épissage.............................................. 41
Figure 13 Cycle d’assemblage du spücéosome.......................................................................43
Figure 14 Type d’événements d’épissage alternatif............................................................... 45
Figure 15 Mécanismes de régulation de l’épissage alternatif par des facteurs d’épissage. .47
Figure 16 L’épissage alternatif est omniprésent dans les gènes liés aucancer.......................53
Figure 17 Stratégies de détection pour la quantification des isoformes alternativement
épissés........................................................................................................................................55
Figure 18 Contraintes de dessin d’amorces en endpoint PCR dues à l’utilisation
d’échantillon clinique fixé........................................................................................................58
Figure 19 Mécanismes d’action des antisens.......................................................................... 60
Figure 20 Structure des principaux analogues de nucléosides............................................... 62
Figure 21 Mécanismes d’action des SSOs.............................................................................. 65
Figure 22 Anatomie d’un TOSS.............................................................................................. 66
Figure 23 Mécanisme d’action des siRNAs............................................................................ 67
Figure 24 Utilisation de siRNAs spécifiques à l’isoforme court (siRNA court)...................69
Chapitre 1
Figure 1 Problems associated with the detection of alternative splicingisoforms................. 77
Figure 2 Systematic tiling of BSPs across an exon-exon junction.........................................80
Figure 3 Strategy for automated selection of high fidelity splice sensitivePCR primers.... 85
Figure SI BSP specificity in typical qRT-PCR experiment...................................................81
Figure S2 Evaluation of BSP’s maximal 3’ end Tm............................................................... 82
X
Chapitre 2
Figure 1 Effet de Al_Bclx4 sur la modulation de l’épissage de BCL2L1 in ceilulo ..........104
Figure 2 Blocage de la transcription inverse par les oligonucléotides 2’OMe.................... 105
Figure 3 Le traitement au Trizol® enlève le TOSS d’un extrait d’ARN total.....................107
Figure 4 Le Trizol® permet d’enlever la composante artéfactuelle.....................................109
Figure 5 Estimation de la réelle proportion de la composante artéfactuelle in ceilulo........ 111
Figure 6 Confirmation du réel effet modulateur du TOSS in ceilulo par PCR en temps réel.
................................................................................................................................................. 113
Figure 7 Effets des TOSS sur les isoformes de CASP8 et CASP10 au niveau protéique.. 113
Figure 8 Modulation de type A et de type B..........................................................................114
Figure 9 Marche à suivre permettant la validation des TOSS à haut débit.......................... 117
Figure 10 Effet de la modification de la chimie de la portion « tail ».................................. 120
Figure 11 Modulation de l’alt3’ de DRF1..............................................................................125
Figure 12 Modulation de l’événement d’épissage alternatif complexe (exon cassette et alt5')
de NUP98................................................................................................................................ 128
Figure 13 Modulation de l’événement d’épissage alternatif complexe (cassette et alt3') de
TOPBP1.................................................................................................................................. 129
Figure 14 Modulation de l’événement d’épissagealternatif complexe (exon cassette, alt3' et
rétention d'intron) de FN1.......................................................................................................131
Figure 15 Impact de la chimie du TOES sur la modulation de l’AS....................................134
Figure 16 Autres stratégies favorisant l’inclusion de l’exon alternatif................................136
Chapitre 3
Figure 1 Strategy for functional annotation of cancer-associated alternative splicing events
(ASEs)..................................................................................................................................... 155
Figure 2 Targeting of SYK, MCL-1 or FN1-EDB alternatively sphced isoforms induces
apoptosis..................................................................................................................................158
Figure 3 SYK alternative splicing regulates cell cycle progression and mitosis.................164
Figure 4 SYK(L) promotes malignancy and anchorage-independent growth..................... 168
Figure 5 A model depicting the different functions of the SYK(L) pro-survival isoform. 173
Figure SI FASE (Platform for High-Content Functional Analysis of Alternative Splicing
Events) screen pipeline........................................................................................................... 154
Figure S2 ISI design rules...................................................................................................... 156
Figure S3 FASE screen quality control..................................................................................157
Figure S4 Western validation for MCL-1 and SYK..............................................................161
Figure S5 SYK phenotype validation in other cell lines.......................................................165
Figure S6 MAPK isoforms essential for cell viability.......................................................... 170
Figure S7 hnRNP-K controls SYK, MCL-1 and FN1 alternative splicing ratios (a) and is
essential for SKOV3ipl cell survival (b)...............................................................................176
Figure S8 Alternative splicing regulation of EGF/MAPK signaling................................... 177
Figure S9 Data analysis flowchart displaying all the data processing, normalization and
bioinformatic and statistical analysis steps for theFASE high-content screen................... 183
Chapitre 4
Figure 1 Laser capture microdissection (LCM) of normal and cancer ovarian tissues
194
Figure 2 Splicing of a subset of mesenchymal-enriched exons is repressed in the ovarian
tumor microenvironment........................................................................................................ 199
Figure 3 The expression of cancer-associated splicing isoforms is regulated by a small
group of splicing factors.........................................................................................................204
Figure 4 The expression of splicing factors associated with mesenchymal- to- epithelial
transition (MET) are not systematically modified in cancer tissues.................................... 208
Figure 5 RBFOX2 and QKI regulate the expression of commonepithelial splicing isoforms
in the tumor microenvironment..............................................................................................211
Figure 6 The common RBFOX2 and QKI splicing targets are deregulated in both ovarian
and breast cancer.....................................................................................................................215
Figure S 1 Comparison between the splicing patterns obtained in undissected and dissected
ovarian cancer and Fallopian tube mirror image samples.....................................................196
Figure S2 Mesenchymal-enriched exons are preferentially regulated in the tumor
microenvironment...................................................................................................................201
Figure S3 Monitoring the splicing pattern of ASEs associated with whole tumors in
dissected tissues...................................................................................................................... 216
Figure S4 Evaluation of the reliability of the formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE)
based RNA expression assays by quantitative RT-PCR.......................................................233
Figure S5 Comparison between quantitative and end-point PCR using amplified and non­
amplified RNA extracted from fresh and fixed tissues.........................................................234
Discussion
Figure 1 Fréquence et mésappariement de l'amorce allèle-spécifique sur l’allèle de type
sauvage selon le type de SNP................................................................................................ 246
Figure 2 Mécanismes d’action des ESS selon le modèle de Wang et collaborateurs (2006).
.................................................................................................................................................248
Figure 3 Nouveaux dessins de TOSS.................................................................................... 251
Figure 4 Impact du programme RBFOX2 et QKI sur les fibroblastes normaux.................264
LISTE DES ABRÉVIATIONS
2’Fluoro arabinose............................................................................................................. FANA
2’Ométhyl......................................................................................................................... 2’OMe
3’ splice site............................................................................................................................3’ss
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid..................................................... HEPES
5’ splice site............................................................................................................................5’ss
Acide désoxyribonucléique.................................................................................................ADN
Activateur centromérique.......................................................................................................CH
Adenomatosis polyposis coli................................................................................................APC
ADN complémentaire........................................................................................................cDNA
Alpha smooth muscle actin...............................................................................................aSMA
Alternatif 3'............................................................................................................................ alt3'
Alternatif 5'............................................................................................................................ alt5'
Alternative splicing event.....................................................................................................ASE
Alternative splicing................................................................................................................. AS
Alternatively included region................................................................................................AIR
American type culture collection...................................................................................... ATCC
Antisens................................................................................................................................ ASO
Application programming interface...................................................................................... API
Atypical proliferative serous tumor.................................................................................. APST
Basal carcinoma cell line.....................................................................................................BCC
B-cell leukemia/lymphoma..................................................................................................BCL
Bone morphogenic 7 .........................................................................................................BMP7
Boundary-spanning primer...................................................................................................BSP
Branch point site...................................................................................................................BPS
Breakpoint cluster region.....................................................................................................BCR
Breast cancer, early onset................................................................................................ BRCA
c-abl oncogene 1................................................................................................................ABL1
Cadhérine-E....................................................................................................................... CDH1
Cancer stem cells.................................................................................................................CSC
Cancer-associated fibroblast................................................................................................CAF
Cleavage and polyadenylation specificity factor............................................................. CPSF
Comprehensive peri archive network...............................................................................CP AN
CUG-BP and ETR3-like factors........................................................................................... Celf
Cycle threshold........................................................................................................................ Ct
Déoxynucléoside triphosphate........................................................................................... dNTP
Désoxyribonucléase..........................................................................................................DNase
Downstream constitutive sequence..................................................................................... DCS
Dystrophie musculaire de Duchenne................................................................................. DMD
Epidermal growth factor...................................................................................................... EGF
Epithelial to mesenchymal transition................................................................................. EMT
Epithelial-specific regulatory protein..................................................................................Esrp
Exonic splicing enhancers................................................................................................... ESE
Exonic splicing silencers..................................................................................................... ESE
Exon-specific splicing enhancement by small chineric effectors........................... ESSENCE
Expressed sequence tags......................................................................................................EST
Fallopian tube epithelial cells...............................................................................................FTE
Federal Drug Administration...............................................................................................FDA
Fibroblast activation protein................................................................................................FAP
Fibroblast growth factor receptor 2 ................................................................................. FGFR2
Fibronectin 1......................................................................................................................... FN1
Fluorescence-activating cell sorting................................................................................. FACS
Formalin-fixed, paraffin-embbeded.................................................................................. FFPE
General transcription factor IIB........................................................................................ TFIIB
General transcription factor IID........................................................................................ TFIID
Grade 1 tumors........................................................................................................................ G1
Grade 3 tumors........................................................................................................................ G3
Harvey rat sarcoma viral oncogene ho mo log...................................................................HRAS
Hématoxylène et éosine.......................................................................................................H&E
Hepatocyte growth factor.................................................................................................... HGF
Heterogenous nuclear ribonucleoprotein......................................................................... hnRNP
Heure...........................................................................................................................................h
Housekeeping gene.............................................................................................................HKG
Hydroxyl en 2'.................................................................................................................... 2’OH
Induced pluripotent stem cell............................................................................................. iPSC
Inhibitory concentration.......................................................................................................... IC
Intronic splicing enhancer.....................................................................................................ISE
Intronic splicing silencer........................................................................................................ISS
Isoform-specific inhibitor.......................................................................................................ISI
Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog..................................................................KRAS
Laser capture microdissection........................................................................................... LCM
Leucémie myéloide chronique........................................................................................... CML
Lipofectamine 2000................................................................................................................LF
Locked nucleic acid.............................................................................................................LNA
Long-specific primer pair.................................................................................................. LSPP
Low malignant potential......................................................................................................LMP
Matrix metalloproteases.................................................................................................... MMP
Mesenchymal to epithelial transition.................................................................................MET
Methylphosphonate................................................................................................................MP
Micro RNA......................................................................................................................miRNA
Micropapillary serous carcinoma..................................................................................... MPSC
Minute.................................................................................................................................... min
Mispriming in 3’................................................................................................................MP 3’
Mispriming in 5’................................................................................................................MP 5’
Mitogen-activated protein kinase.................................................................................... MAPK
murine sarcoma viral oncogene homo log B1..................................................................BRAF
Muse leblind-like.................................................................................................................Mbnl
Mutant viable de Quaking......................................................................................................qkv
Myelocytomatosis viral oncogene homolog......................................................................MYC
Myeloid cell leukemia sequence 1................................................................................... MCL1
National Center for biotechnology information............................................................... NCBI
xiv
Neuroblastoma viral oncogene homolog......................................................................... NRAS
Neuro-oncological ventral antigen..................................................................................... Nova
No reverse transcription
no RT
Non transfecté........................................................................................................................ NT
Non-sense mediated decay.................................................................................................NMD
Nuclear localization signal...................................................................................................NLS
Nucléotides................................................................................................................................nt
Ovarian serous high grade.................................................................................................OSHG
Ovarian surface epithelium...................................................................................................OSE
Paire de base............................................................................................................................. bp
Peptide nucleic acid..............................................................................................................PNA
Percent of splicing index................................................................................................... \|/, psi
phosphatase and tensin ho mo log...................................................................................... PTEN
Phosphate buffer solution.................................................................................................D-PBS
Phosphorothioate..................................................................................................................... PS
Platelet-derived growth factor.......................................................................................... PDGF
Platform for high-content functional analysis of alternative splicing events................. FASE
Polymerase chain reaction....................................................................................................PCR
Polypyrimidine tract binding protein................................................................................ PTBP
Polypyrimidine tract.............................................................................................................PPT
Real-time P C R .................................................................................................................Q-PCR
Real-time PCR Annotation of Splicing Events............................................................... RASE
Retinoblastoma 1..................................................................................................................RB1
Ribonucléase.....................................................................................................................RN ase
Ribonucleic acid..................................................................................................................RNA
RNA binding protein, fox homo log..............................................................................RBFOX
RNA integrity number..........................................................................................................RIN
RNA interference...............................................................................................................RNAi
RNA recognition motif.......................................................................................................RRM
RNA-induced silencing complex....................................................................................... RISC
Rotation par minute...............................................................................................................rpm
Seconde................................................................................................................................... sec
Secreted protein, acidic, cysteine-rich...........................................................................SPARC
Serial analysis of gene expression................................................................................... SAGE
Serine/arginine-rich splicing factor kinase 1................................................................. SRPK1
Serous tubal intraepithélial carcinoma...............................................................................STIC
Short-specific primer pair................................................................................................... SSPP
Single nucleotide polymorphism......................................................................................... SNP
siRNA contrôle.......................................................................................................... Ctrl siRNA
Small interfering RNA......................................................................................................siRNA
Small nuclear ribonucleoprotein...................................................................................... snRNP
Small nuclear RNA..........................................................................................................snRNA
Sodium dodécyl sulfate....................................................................................................... SDS
Sous-unité de 35kDa de U2AF.....................................................................................U2AF35
Sous-unité de 65kDa de U2AF.....................................................................................U2AF65
Spinal muscular atrophy.................................................................................................... SMA
Spleen tyrosine kinase........................................................................................................ SYK
XV
Splice-switching oligonucleotide.........................................................................................SSO
Splicing factor 1.................................................................................................................... SF1
Splicing factor 2.................................................................................................................... SF2
Splicing regulatory element..................................................................................................SRE
Src homology 2..................................................................................................................... SH2
Substitution nucléophilique de type 2.................................................................................. Sn2
Targeted oligonucleotide enhancer of splicing.................................................................TOES
Targeted oligonucleotide silencer of splicing...................................................................TOSS
TATA binding protein..........................................................................................................TBP
Telomerase reverse transcriptase...................................................................................... TERT
Température de fusion............................................................................................................tm
Température pièce.................................................................................................................. t.p.
TOSS contrôle.............................................................................................................Ctrl TOSS
Tris-EDTA.............................................................................................................................. TE
Tumor growth factor beta................................................................................................. TGFp
Tumor protein p53..............................................................................................................TP53
Tumor suppressor gene........................................................................................................TSG
U2 auxilary factor..............................................................................................................U2AF
Universal human reference RNA..................................................................................... UHRR
Untranslated region.............................................................................................................UTR
Upstream constitutive sequence.......................................................................................... UCS
Vascular endothelial growth factor..................................................................................VEGF
Wingless-type MMTV integration site family, member 4 .............................................WNT4
16
INTRODUCTION
I Le Cancer
1.1 Généralités
1.1.1 Définitions
Le cancer est défini comme un groupe de maladies diverses, chacune d’elles impliquant une
croissance cellulaire non régulée. Les mutations sont des lésions génétiques sous-jacentes
qui peuvent contribuer au cancer. La plupart de ces mutations surviennent au cours de la vie
d’un individu, c'est-à-dire qu’elles n’étaient pas présentes à la naissance, et qu’elles ne
seront pas transmises à la descendance (à moins que celles-ci soient présentes dans une
lignée germinale). Une faible proportion de la population possède des défauts génétiques
héréditaires qui la prédispose au cancer (Futreal et al., 2004).
Peu importe l’origine de ces mutations, les différents cancers sont d’abord classifiés selon
leur type cellulaire d’origine. La plupart des cancers (90%) sont issus de dérèglements des
cellules épithéliales (des adénocarcinomes). Selon les statistiques canadiennes sur le cancer
(2012), les cancers des poumons et les cancers colorectaux sont les plus fréquemment
diagnostiqués, suivis du cancer du sein. Les leucémies (cellules du système sanguin), les
lymphomes (cellules du système immunitaire) ou les sarcomes (cellules mésenchymales)
regroupent une faible proportion de cas (10%) (Santarius et al., 2010). Ensuite, une
classification histologique des cellules est faite selon l’indice de prolifération, la grosseur
des noyaux et l’aspect plus ou moins différencié: le grade. Les cellules cancéreuses de haut
grade se multiplient rapidement (prolifération active), tendent à ne plus ressembler à leur
type cellulaire d’origine (dé-différentiation) et présentent des défauts chromosomiques et
des noyaux difformes (aneuploïdes). De plus, une tumeur maligne est composée de cellules
cancéreuses qui s’infiltrent dans les tissus avoisinants, alors qu’il n’y a pas de cellules
cancéreuses dans une tumeur bénigne et que celles-ci n’infiltrent pas les tissus avoisinants.
Ces analyses sont effectuées par un pathologiste et nécessitent un échantillon de la tumeur.
17
Bien souvent, celui-ci est prélevé sous forme de biopsie, mais il peut arriver qu’il soit
récupéré uniquement lors de la chirurgie (cancer de l’ovaire). Une dernière classification se
fait en fonction de la migration de la tumeur vers d’autres niches au sein du corps: le stade.
Une tumeur métastatique de stade élevé signifie que des cellules cancéreuses primaires se
sont implantées et ont formé un nouveau foyer dans au moins un autre organe. Cette
conclusion est forgée suite à l’examen de radiographie, scanner et/ou lors de la chirurgie
afin d’enlever la masse de cellules cancéreuses. Toutes ces analyses permettent d’orienter
grossièrement le traitement et le pronostic du patient, c'est-à-dire le progrès de sa maladie
ou de sa survie.
1.1.2 Statistiques
Malgré toutes les récentes percées scientifiques, le cancer demeure une cause de décès
majeure. Selon Statistiques Canada, 1 homme sur 3,5 et 1 femme sur 4,2 mourront du
cancer. La première cause de décès par cancer tant chez la femme que chez l’homme est le
cancer du poumon (26,3% et 28,3%, respectivement). Vient ensuite le cancer du côlon et
rectum (12,4%) et de la prostate (11,1%) chez l’homme. Chez la femme, le cancer du sein
vient au 2e rang (15,1%) et celui du côlon et du rectum au 3e rang (11,8%). L’incidence de
décès par cancer n’est pas nécessairement le reflet du nombre de cas diagnostiqués. En fait,
les cancers les plus fréquents sont ceux de la prostate (28,6%) chez l'homme et du sein
(27,8%) chez la femme. À l’opposé, le cancer de l’ovaire est un de ceux dont l’incidence
est faible, mais dont le taux de mortalité est élevé. Pour l'année 2010 au Canada seulement,
cela a été estimé à 1750 décès pour 2600 diagnostics.
1.1.3 Facteurs de risque
On entend souvent parler que des aliments ou des habitudes de vie sont susceptibles de
donner le cancer ou encore, d’en retarder son apparition. Qu’en est-il vraiment? Les deux
facteurs de risque qui sont hors de notre contrôle sont l’âge et les prédispositions
héréditaires. En dehors de cela, certains facteurs environnementaux et l’adoption de saines
habitudes de vie influencent le risque de cancer. Le tabagisme est responsable de 85% des
cancers du poumon, mais également de 30% de tous les décès par cancer.
18
1.2 Modélisation de la cancérogenèse
1.2.1 Cancérogènes
L’histoire nous a fait connaître son lot de composés réputés comme carcinogéniques. En
1775, un chirurgien de Londres, Percival Pott, a rapporté un nombre élevé de cancers du
scrotum chez des hommes de 20 à 50 ans. Après enquête, le dénominateur commun entre
ces hommes était leur travail de ramoneur pendant leur jeunesse. L’hypothèse du Dr Pott
condamnait le contact de la suie et du goudron avec les plis de peau recouvrant les
testicules. Cette hypothèse sera en fait confirmée beaucoup plus tard lorsque K.
Yamagisawa en badigeonnera des oreilles de lapins. Le chlorure de vinyle (angiosarcome
du foie), le diéthylstilbestrol (carcinome vaginal), et l’amiante (mésothéliome) ne sont que
d’autres exemples de composés carcinogènes découverts fortuitement, sans compter pour
certains scientifiques ou mineurs, l’exposition à la radioactivité.
En parallèle, des études intensives ont décrit le cancer comme une maladie infectieuse.
Vers 1950, une panoplie de virus a été répertoriée comme causant des cancers, surtout des
leucémies et des sarcomes, chez le poulet, la souris, le rat et le chat. Tout ceci représente
des avancées majeures dans la compréhension du cancer, mais la plupart de ces exemples
ne représentent pas les adénocarcinomes habituellement retrouvés chez l’humain. En date
de 2008, seulement six virus ont été formellement associés à la formation de cancer humain
(Martin and Gutkind, 2008). Quatre d’entre eux causent des cancers de cellules épithéliales
(Martin and Gutkind, 2008). Au total, il est estimé que 10 à 15% des cancers humains ont
une origine virale (Parkin, 2006).
1.2.2 Oncogènes
Dans les années 1970, l’échec évident d’associer tous les cancers humains à une infection
virale poussent les chercheurs à regarder ailleurs, soit le génome des cellules humaines. La
nouvelle hypothèse suggérée propose que le contact prolongé avec des composés chimiques
ou des radiations entraîne la mutation de gènes impliqués dans le contrôle de la
prolifération cellulaire. La course aux oncogènes, gènes qui jouent un rôle dans les cellules
19
normales, mais participent à la prolifération anormale, lorsque mutés, est alors lancée. Les
résultats sont frappants: plusieurs gènes autrefois découverts dans les génomes viraux se
retrouvent en fait dans les cellules humaines normales, mais sous une forme mutée. Le gène
est alors nommé proto-oncogène avant la mutation, et oncogène une fois la mutation subite
(Tabin et al., 1982).
Ces mutations à l'origine du cancer peuvent être aussi simples et localisées qu’un
changement impliquant une seule paire de bases (bp) pour une autre. Ceci peut générer un
changement d’acide aminé dans la protéine finale comme c ’est le cas pour Kirsten rat
sarcoma viral oncogene homolog (KRAS), ce qu’on appelle une mutation faux-sens (Tabin
et al., 1982) (Fig. 1A). En revanche, une mutation non-sens fait apparaître un codon-stop
prématurément, entraînant la production d’une protéine tronquée en C-terminal. À
l’extrémité du spectre, un bloc allant de quelques-unes à plusieurs millions de bp
(amplification, délétion, translocation) peut être muté. Bien que plusieurs gènes puissent se
retrouver dans un bloc de mutation, tous ne sont pas nécessairement impliqués dans la
cancérogenèse. La translocation chromosomale est la mutation la plus fréquemment
rencontrée parmi les gènes reliés au cancer (Futreal et al., 2004). Celle-ci a pour effet de
créer des gènes chimériques ou d’exposer un gène à de nouvelles séquences régulatrices
comme c’est le cas pour myelocytomatosis viral oncogene homolog (MYC) dans plusieurs
leucémies myéloïdes, altérant ainsi son expression (Fig. 1B). Dans le cas de la leucémie
myéloïde chronique (CML), la translocation d’une portion du chromosome 22 au
chromosome 9, produit un gène chimérique entre le «break point cluster region (BCR) et cabl oncogene 1, non-receptor tyrosine kinase (ABL1)», activant ce dernier oncogène
(Rowley, 1973, Stam et a i, 1985) (Fig. 1C). De plus, cette tyrosine kinase est cruciale pour
le développement de la CML puisque l’imatinib, un inhibiteur d’Abl, diminue la
progression de la maladie (Druker et al., 2001). Par contre, il est rare qu’un seul événement
soit suffisant pour causer le cancer.
20
A
B
C
Figure 1 Mécanismes d'activation des oncogènes.
A) Changement structurel. Les mutations du gène KRAS observées dans les cancers
humains induisent un changement conformationnel de la protéine, la rendant
constitutivement active dû à l’inactivation de l'activité GTPase. Image tirée de Scheffzek
(1997). B) Exposition à des séquences régulatrices. Dans les cellules normales, le gène
MYC et le locus de 1’immunoglobulin heavy chain incluant l’activateur centromérique (CH)
sont situés sur les chromosomes 8 et 14, respectivement. La translocation de MYC sur le
chromosome 14 juxtapose celui-ci au CH et conséquemment permet sa surexpression.
Image tirée de Kuehl and Bergsagel (2002). C) Gène chimérique. Une schématisation
montre une portion du chromosome 22 transloquée au chromosome 9, produisant un gène
chimérique (BCR-ABL1) qui permet d’activer l’oncogène Abl. Image tirée de
w ww.cancer. go v.
1.2.4 Progression séquentielle de la cancérogenèse
Dès 1954, Armitage et Doll avaient élaboré un modèle mathématique corrélant l'incidence
de cancer en fonction de l'âge. De façon indirecte, et sans même discuter du concept de
mutation, leurs conclusions supportent la progression du cancer en plusieurs étapes soit
environ six (Armitage and Doll, 1954). Comme il est estimé que les mutations surviennent
normalement à une fréquence d’une fois toutes les 2,5 X 10'8 bp ou 175 mutations par
génome diploïde (Nachman and Crowell, 2000), il est par contre difficile d’imaginer que
plusieurs mutations puissent s’accumuler à l’intérieur d’une même cellule. De plus, la
cellule atteinte doit posséder des capacités de prolifération accrue.
La théorie de l’évolution clonale des cellules cancéreuses soutient qu’il est possible
d’arriver à un nombre suffisamment grand de cellules pour qu’il soit probable que la
deuxième mutation ait lieu dans une cellule déjà porteuse de la Ire mutation, et ainsi de
suite. Sans préciser de mutation en particulier, l’auteur Peter Nowell suggère que celle-ci
21
doit promouvoir une prolifération intense au point de dominer la population : une
expansion clonale (Nowell, 1976). Ceci explique notamment « l’homogénéité » relative des
aberrations chromosomiques au sein de la tumeur.
Une autre théorie en vigueur, le « mutator phenotype », fait appel à l’instabilité génomique
pour expliquer le fort taux de mutation des cellules cancéreuses. Par le biais de divers
mécanismes, Laurence Loeb propose qu’un état d’instabilité génomique doive se produire
dans les premiers événements conduisant à la formation multiétapes d’un cancer (Loeb,
1991). Effectivement, de nombreuses mutations ont été répertoriées dans des gènes de
réparation de l’ADN pour plusieurs cancers héréditaires. Par contre, peu de mutations ont
été retrouvées dans ces mêmes gènes dans les cas de cancer sporadique. Pour expliquer
cette situation, Halazenotis et collaborateurs (2008) émettent la théorie selon laquelle
certains oncogènes seraient à l’origine de défauts de réplication et des bris subséquents de
l’ADN. Les nombreux bris dans l’ADN produits par l’arrêt de la fourche de réplication
activeraient p53, signalant ainsi l’apoptose ou la sénescence des cellules, ce qui mettrait un
frein temporaire à la progression du cancer. Une mutation du gène TP53 parviendrait
définitivement à surmonter cette barrière et permettrait d’expliquer deux caractéristiques
propres à pratiquement tous les cancers épithéliaux: l’instabilité génomique et la fréquence
de mutation élevée du gène TP53 (Halazonetis et al., 2008). Alternativement, la théorie de
la progression prétumorale mise de l'avant par Calabrese et collaborateurs (2004) énonce
que les cellules normales pourraient accumuler des mutations bien avant l'apparition d'un
changement phénotypique, ce qui aurait pour effet d'être indépendant d'un taux élevé de
mutations.
Outre l’instabilité génomique, Hanahan et Weinberg font le constat de six caractéristiques
partagées par la vaste majorité des cancers, les fameux « Hallmarks of Cancer » (Hanahan
and Weinberg, 2000). Afin de progresser, toute tumeur doit se rendre insensible aux
signaux anti-croissance et parvenir à une prolifération soutenue. Elle doit également résister
à l’apoptose et la sénescence, en plus de promouvoir l’angiogenèse et l’invasion. À noter
que les auteurs ne mettent pas l’emphase sur un ordre à suivre en particulier (Hanahan and
Weinberg, 2000). Ces différentes caractéristiques ont récemment été mises au goût du jour
22
en y incluant notamment la résistance au système immunitaire et la reprogrammation du
métabolisme énergétique (Hanahan and Weinberg, 2011).
De par l’abondance et l’accessibilité anatomique qu’offrent les cas de cancer du côlon,
ceux-ci en font d’excellents modèles pour les cancers épithéliaux. Au début des années
1990, Fearon et Vogelstein proposent ce qui deviendra le modèle de la séquence adénome à
carcinome (Fearon and Vogelstein, 1990). Ils proposent que chacune des mutations
favorisant la progression du cancer du côlon (adenomatous polyposis coli (APC), KRAS,
TP53) corresponde en fait à une des quatre à six étapes limitantes prédites par la théorie
d’Armitage et Doll. Ils insistent toutefois sur le total plutôt que l’ordre des mutations
(Fearon and Vogelstein, 1990).
Hallmark
Insensfffvfty Self-sufficient
in growth
t o anti-growth
signals
signais
Phenotypical Resistance Upregulstion
Limitless
'splication
Abnormally
high glucose
uptake
î
Upregutation
Upreguiatioo
to anoiscis of growth
ind contact factors or
mutation
inhibit!
■
M
--braai
B arrier
a
Resistance tr
invasion and
acid-mediated
m étastasés
j with sustained
toxicity
angiogenesis
increased
Vhwf and
M.MP production
■>
K oerpiasia
Aooptosis
with loss
o f basem ent
membrane
contact
inadequate
growth
promotion
senescence
Hypoxia
Acidosis
b c h a e rn ia
23
Figure 2 Progression séquentielle de la cancérogenèse.
Les intermédiaires de la séquence adénome à carcinome ainsi que les différentes barrières
empêchant leur progression sont représentées. La hauteur des flèches les joignant est
proportionnelle à la prolifération croissante des cellules de plus en plus malignes. Les
stratégies employées pour contrer les barrières sont le reflet des « Hallmarks of Cancer »
proposés par Hanahan et Weinberg (2000). Image tirée de Gatenby and Gillies (2008).
À ce jour, la séquence adénome à carcinome a été décrite pour la plupart des cancers
épithéliaux et fait référence à l’acquisition de phénotypes et de changements de
morphologie qui transforment peu à peu les cellules épithéliales en tumeur maligne (Fig. 2).
L'instabilité génomique est omniprésente et certains traits caractéristiques « Hallmarks of
Cancer » y sont systématiquement retrouvés. Est-il possible que les mutations décrites dans
la séquence adénome à carcinome de Fearon et Vogelstein (1990) correspondent en fait aux
différents « Hallmarks of cancer » décrit par Hanahan et Weinberg (2000) ? Selon Gatenby
et Gillies (2008), les différents intermédiaires de la séquence adénome à carcinome sont en
fait le reflet de mutation conférant au moins un « Hallmark of cancer ». Plus encore, ces
mutations doivent subvenir dans un ordre bien déterminé afin de surmonter les mécanismes
physiologiques (barrières) permettant de freiner/éliminer la progression tumorale. En
d’autres termes, les cellules possédant des mutations affectant la croissance due à
l’inhibition de contact seront beaucoup plus susceptibles de proliférer et produire
l’expansion clonale initiale que les mutations affectant l’angiogenèse. De plus, les
événements mutationnels par lesquels s’effectuera la transformation des cellules peuvent
être accomplis par un grand nombre de combinaisons relativement équivalentes
phénotypiquement parlant. Ce concept d’équivalence fonctionnelle permet de reconnaitre
que le gain d’une caractéristique propre au cancer « hallmark of cancer » par une cellule
peut être attribuable à diverses mutations (Gatenby and Gillies, 2008).
1.2.3 Gènes suppresseurs de tumeurs
Les mutations n’apparaissent pas toutes au cours du temps. Certains individus naissent avec
des prédispositions héréditaires et ces mutations se retrouvent dans toutes les cellules de
leur corps. L’étude de la génétique des cancers héréditaires a elle aussi largement contribué
à l’amélioration de la modélisation de la cancérogenèse. La curiosité scientifique d’Alfred
G. Knudson a été piquée lorsqu’il s’est intéressé au rétinoblastome, un cancer des
24
rétinoblastes pouvant se manifester chez les enfants de moins de deux ans. Bien que 40%
des cas soient reliés à une mutation héréditaire, celle-ci n'est pas suffisante pour causer le
cancer (Knudson, 1971). Selon ses calculs, il prédit que la formation de rétinoblastome
requiert deux mutations, soit deux somatiques dans les cas non héréditaires; soit une
somatique et une dans la lignée germinale dans les cas héréditaires (Hethcote and Knudson,
1978). C’est que nos gènes sont en deux exemplaires (allèles), l’un provenant de la
contribution paternelle et l’autre maternelle. Dans ces cas, le phénotype serait donc lié à la
perte de fonction des deux allèles, et non à un gain de fonction comme les oncogènes,
modèle qui est maintenant connu sous le nom de « Two-hit hypothesis » (Nordling, 1953).
Ces gènes sont importants pour le maintien de la prolifération normale des cellules et de la
réparation de l’acide désoxyribonucléique (ADN) et sont collectivement nommés gènes
suppresseurs de tumeurs (tumor suppressor genes, TSG). Dépendamment de leurs
fonctions, on peut les sous-diviser en deux catégories: Les « gatekeepers » (ex: tumor
protein p53 (TP53), Retinoblastoma (RB1)) inactivent directement la transformation ou
promeuvent la mort cellulaire et les « caretakers » (ex: breast cancer 1 and 2, early onset,
BRCA1-2) voient à la stabilité du génome (Tableau 1). La plupart des mutations
héréditaires n’impliquent donc pas des oncogènes, probablement parce que celles-ci sont
létales. En effet, 90% des mutations dans les cellules germinales sont récessives (Futreal et
al., 2004) alors que 90% des mutations somatiques sont dominantes, c'est-à-dire que la
mutation d’un seul allèle contribue à la tumorigenèse. À ce jour, près de 2% des gènes
humains seraient impliqués dans le processus de tumorigenèse (Santarius et al., 2010).
Malgré tout, rares sont les cancers ne nécessitant que deux mutations pour générer une
masse tumorale importante.
25
Tableau 1 Prédispositions héréditaires liées à des gènes suppresseurs de tumeurs.
Les principaux TSGs ainsi que la condition pathologique souvent associée et susceptible de
se développer pour les indivic us porteurs d’une mutation héréditaire (www.cancer.eovf
Gène(s) porteur(s) de la
Condition pathologique souvent associée
mutation héréditaire
RB1
TP53
APC
MLH1, MSH2, MSH6,
WT1
BRCA1, BRCA2
VHL
PTEN
Rétinoblastome
Syndrome de Li-Fraumeni (plusieurs types de cancers)
Polypes adénomateuses
Syndrome de Lynch (Cancer du côlon sans polypes)
Tumeur de Wilm (Néphroblastome)
Cancer du sein et de l’ovaire
Maladie de Von Hippel-Lindau (Hémangioblastome)
Syndrome de Cowden (Hamartome)
1.2.5 Rôle du microenvironnement de la tumeur
Les recherches centrées sur les cellules cancéreuses et leur génome ont permis de découvrir
les oncogènes et les TSGs et jusqu'à un certain point à modéliser la cancérogenèse. En
parallèle, une série d’évidences confirme l’apport non négügeable des cellules d’apparence
normale avoisinant la tumeur: le microenvironnement de la tumeur. En plus d'une matrice
extracellulaire spécifique, ce dernier comprend des cellules du système immunitaire et des
cellules mésenchymales (endothéliales et fibroblastes). Elles sont collectivement appelées
cellules stromales. On parle de stroma activé, de desmoplasie ou plus souvent de «cancerassociated fibroblasts» (CAFs) lorsque l’on réfère au stroma présentant de l’inflammation
aux abords d’une plaie ou d’une tumeur. La matrice extracellulaire est caractérisée par un
dépôt important de collagène de type I.
Les CAFs sont très semblables aux myofibroblastes retrouvés au site d’inflammation d’une
plaie, à la différence importante que les CAFs n’induisent pas la guérison de la « blessure »
et ne se résorbent pas (Dvorak, 1986). Contrairement aux myofibroblastes, les CAFs
possèdent une « lamina » et sont dotés de myofilaments. On peut également les identifier
grâce à l'expression de certains marqueurs comme l'alpha smooth muscle actin (a-SMA), la
vimentin et l’exon EDA de la fibronectin (Eyden, 2009). À noter que les termes
myofibroblastes et CAFs sont interchangés dans la littérature scientifique en désignant de
façon erronée la même entité (Eyden, 2009). La présence de certains de ces marqueurs de
26
CAFs corrèle significativement avec un pronostic défavorable dans les cas de cancer du
pancréas et du poumon, suggérant que les CAFs participent à la progression, l’agressivité
et/ou la résistance aux traitements des cellules cancéreuses (Infante et al., 2007, Takahashi
et al., 2011).
Pour démontrer plus directement les effets pro-tumorigéniques des CAFs, les groupes de
Tlsty et Cunha ont administré un mélange de CAFs et de cellules épithéliales de prostate
humaine ou un mélange similaire avec des fibroblastes normaux à une souris
immunodéficiente. Seule la préparation de CAFs était en mesure de stimuler la formation
de tumeur (Olumi et al., 1999). Une expérience semblable avec des CAFs issus de
microenvironnements de cancer du sein et des ügnées cellulaires épithéliales de cancer du
sein a non seulement corroboré l’étude établie sur la prostate, mais a également permis de
mettre en valeur le pouvoir pro-angiogénique des CAFs (Orimo et al., 2005). Les CAFs ont
des capacités contractiles accrues, promeuvent l’angiogenèse et stimulent la croissance des
cellules épithéliales via la sécrétion de cytokines et de facteurs de croissance tels que le
«vascular endothelial growth factor» (VEGF). De façon paracrine, les cellules cancéreuses
sécrètent des facteurs de croissance comme le «tumor growth factor beta » (TGF-P) et le
« platelet-derived growth factor» (PDGF) qui transforment le stroma. À leur tour, les CAFs
sécrètent des facteurs de croissance afin de soutenir la prolifération de la tumeur. De plus,
les « matrix metalloproteases-2, 3 et 9 » (MMP-2, MMP-3 et MMP-9) sont sécrétées et
façonnent la matrice extracellulaire (Kalluri and Zeisberg, 2006) (Fig. 3).
27
Invasion,
proliferate*!
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P r o t o ® » inhibili
Figure 3 Interactions hétérotypiques entre les cellules épithéliales cancéreuses et les
cellules stromales du microenvironnement.
Les cellules cancéreuses activent les fibroblastes par le biais de la sécrétion de facteurs de
croissance. À leur tour, ceux-ci supportent la croissance de la tumeur en relâchant des
facteurs pro-prolifération et pro-angiogéniques. Ensemble, ils reconditionnent le
microenvironnement en remodelant la matrice extracellulaire par le biais de protéases.
Image tirée de Mueller et Fusenig (2004).
1.2.6 La transition épithéliale-mésenchymale et mésenchymale-épithéliale
Outre les interactions paracrines entre les cellules stromales et épithéliales, les cellules
épithéliales présentent une plasticité leur permettant d’adopter des caractéristiques
mésenchymales de façon réversible. C’est ce qu’on appelle la transition épithélialemésenchymale (EMT) et son inverse, la transition mésenchymale-épithéliale (MET). En
plusieurs occasions au cours du développement normal de l’embryon, une suite finement
coordonnée de ces transitions sont nécessaires, notamment pour générer les valves du cœur
et les néphrons du rein (Fig. 4). Suivant une première EMT, le mésoderme se condense
pour former des structures épithéliales temporaires, dont la splanchnopleure. Ce dernier se
différencie
en
cellules
mésenchymales
précurseurs
des
cellules
du
système
hématopoïétique. Une troisième EMT est nécessaire pour former les valves cardiaques (Fig.
4A). La formation du néphron est l’exemple où la MET est la mieux étudiée jusqu’à
présent. Les cellules mésenchymales pluripotentes bordant le bourgeon urétéral proviennent
28
d’une première EMT. Celles-ci s’agrègent et se différencient en cellules épithéliales en
formant d’abord une sphère via une signalisation dépendante de « wingless-type MMTV
integration site family, member 4» (WNT4), puis un corps en forme de « S » dont une
portion poursuivra la différenciation jusqu’au néphron (Faa et ai, 2012) (Fig. 4B).
5am*lopJeuf®
Sptortonnopleure
9
An g to b last
(blood v e sse ls)
H aem atopoietic
progenitors
Endocardial
progenitors
Endocardium
OT
A
Cardiac
-
**
*
.....
4^
EndotNIfcirri
Lét Cushion
fm#s*nchyrm#
..r
Cardiac
y«lv«t
Figure 4 Rôle de l’EMT/MET dans le développement normal.
Développement des valves cardiaques. Les cellules épithéliales du somatopleure et
splanchnopleure subissent une EMT générant des cellules mésenchymales qui
différencieront en angiobiastes. Une seconde EMT est nécessaire afin de générer le tissu
mésenchymateux lâche, qui est au cœur de la chambre artérielle (outflow tract (OT)) et du
canal atrioventriculaire (AV), et qui servira de précurseur aux valves cardiaques. Image
adaptée de Thiery (2009). B) Représentation schématique de la transition mésenchymaleépithéliale lors du développement du néphron. Les cellules du cap mésenchymateux se
transforment progressivement en cellules épithéliales (glomérule) en passant par les
intermédiaires suivants : la vésicule rénale, le corps en forme de virgule, le corps en forme
de « S ». Image tirée de Faa (2012).
29
Pour compléter l’EMT avec succès, la cellule épithéliale doit subir plusieurs changements
importants (Fig 5). Premièrement, les jonctions serrées qui favorisent le rapprochement des
cellules épithéliales au niveau apical doivent être démantelées. Deuxièmement, la polarité
de la cellule se résout par endocytose des jonctions adhérentes. Troisièmement, il est
suggéré que la constriction de la zone apicale, que ce soit au niveau de la circonférence ou
directement à travers la cellule tient heu de force motrice. Quatrièmement, le désencrage de
la couche basale s’effectue grâce à des protéases qui façonnent la matrice extracellulaire.
Cinquièmement, les nouvelles cellules mésenchymales doivent migrer de la structure
épithéliale, se frayer un chemin à travers la matrice extracellulaire et résister à l’apoptose
(Shook and Keller, 2003).
Pour orchestrer cette batterie de changements, plusieurs stimuli permettant d’observer
l’EMT in vitro ont été répertoriés, un des plus utilisés étant le TGF-(3. Ce facteur se lie à
des récepteurs membranaires de type tyrosine kinase et signale principalement via les
effecteurs SMAD (Tian and Schiemann, 2009). Peu importe le type de stimuli, tous
semblent ultimement converger vers un petit groupe de facteurs de transcription:
Goosecoid, Snail et Twist. La surexpression individuelle de ces trois facteurs récapitule
l’EMT dans les cellules humaines mammaires épithéliales du cancer du sein (HMLE). Par
ricochet, ils augmentent l’expression d’un deuxième sous-groupe de facteurs de
transcription (Zebl-2 et FOXC2) (Orimo et a i, 2005). L’une des cibles communes dont
l’expression est régulée négativement par ces facteurs de transcription est la Cadhérine-E
(CDH1), une composante typique des jonctions cellulaires épithéliales (Fig. 6 ).
L’EMT n’intervient pas que dans le développement normal, mais également en condition
pathologique. Par exemple, une brèche de l’épiderme stimule également le programme
EMT des kératinocytes. Une fois la cascade de coagulation activée, les kératinocytes en
bordure de la blessure migrent vers la cavité à ré-épithélialiser. En parallèle, des
fibroblastes « s’activent » et exploitent leur capacité de contractions accrues afin de
diminuer la taille de la plaie (Fig 7A) (Nakamura and Tokura, 2011).
30
Figure 5 Schématisation des étapes de l’EMT.
Étapes de transition dans la conversion d’une cellule épithéliale et une cellule
mésenchymale. A) Les jonctions serrées qui favorisent le rapprochement des cellules
épithéliales au niveau apical sont démantelées. B) La polarité de la cellule se résout par
endocytose des jonctions adhérentes. C) Il y a constriction de la zone apicale, qui tient lieu
de force motrice. D) Le désencrage de la couche basale s’effectue grâce à des protéases qui
façonnent la matrice extracellulaire. E) Les nouvelles cellules mésenchymales migrent de la
structure épithéliale et se frayent un chemin à travers la matrice extracellulaire. Image
adaptée de Shook and Keller (2003).
31
UnldtntHM
miRNAa?
I— rniR-200 family
— I and miR-209
sacs &ss
Epithelial
phenotype
Figure 6 Facteurs de transcription impliqués dans PEMT/MET.
Les facteurs de transcription comme Snail et Slug (SNAI2), Zebl et Zeb2 répriment
directement l’activité du promoteur de E-cadherin alors que Twist, Goosecoid et Foxc2
agissent indirectement. Image tirée de (Thiery et al., 2009).
Les facteurs de croissance sécrétés par le microenvironnement de la tumeur permettent
d'induire un caractère mésenchymal aux cellules épithéliales. Les jonctions serrées
caractéristiques des cellules épithéliales sont relâchées et la polarité apicale-basale est
abolie. Ainsi, les récepteurs de la membrane basolatérale autrefois restreints aux signaux
provenant du stroma sont maintenant soumis à l’action autocrine de facteurs de croissance
(Wells et al., 2011). Ces stimulations entraînent des changements morphologiques
permettant aux cellules cancéreuses d’envahir les tissus avoisinants. Les cellules qui
réussissent à implanter un nouveau foyer de cellules cancéreuses (métastase) retournent à
leur aspect épithélial d’origine en passant par une MET (Fig. 7B). La principale différence
entre l’EMT de type I (développement normal) vis-à-vis celle de type II (réparation des
tissus) et III (cancérogenèse) concerne le microenvironnement (CAFs et dépôt de collagène
de type I).
Les caractéristiques de plasticité des cellules cancéreuses épithéliales ne se limitent pas
qu’au caractère pro-migratoire; l’EMT permet également de générer des cellules ayant des
propriétés qui s'apparentent aux cellules souches (cancer stem cells, CSC) (Polyak and
Weinberg, 2009). Pour ajouter à la complexité, la reprogrammation in vitro des fibroblastes
en cellules souches induites pluripotentes (induced pluripotent stem cells, iPSC) est
32
stimulée par le «bone morphogenic 7» (BMP7) et nécessite un intermédiaire épithélial
(donc une MET) (Li et a i, 2010, Samavarchi-Tehrani et a i, 2010). Ces résultats permettent
de relancer le débat sur l'origine des CSCs. Il est probable que seule une sous-population de
cellules possède les propriétés fonctionnelles des CSCs. Alternativement, toutes les cellules
cancéreuses pourraient être fonctionnellement équivalentes, mais présenteraient des
comportements différents en fonction du microenvironnement auquel elles sont exposés.
Demi*
Me*
extrocetMar-
rrwtrôc
Fiferoblwt*
Ccitogenà _
«iasfin fibre*
Figure 7 Rôle de l’EMT/MET dans la cancérogenèse.
A) Réparation d’une plaie superficielle de la peau. Des kératinocytes migrent vers la plaie à
cicatriser tandis que des fibroblastes activés rapprochent les deux extrémités de la plaie.
Image tirée de (http://www.hcc.uce.ac.uk/phvsioioav/woundhealing.htm). B) Invasion et métastase.
Des cellules épithéliales cancéreuses subissent une EMT et atteignent un site secondaire via
la circulation sanguine. Celles-ci subissent une MET afin de retrouver leurs capacités de
prolifération et d’adhésion. Image tirée de (Polyak and Weinberg, 2009).
1.2.7 Origines des CAFs
Il est généralement admis que la plupart des myofibroblastes lors de fibroses ou de
processus de réparation des tissus sont issus de la prolifération active des fibroblastes
résidents ou de cellules souches mésenchymales. Or, des études permettant de suivre
l’évolution de type cellulaire choisi a permis de révéler la contribution non négligeable des
cellules endothéliales et des cellules épithéliales. Ainsi, une fraction des myofibroblastes
proviennent de cellules épithéliales par le biais de l’EMT lors de fibrose des poumons et de
l’intestin (Quaggin and Kapus, 2011). Plus précisément, il s’agirait d’une transition
épithélial-fibroblaste-myofibroblaste dont seuls quelques fibroblastes seraient en mesure de
33
compléter en exprimant a-SMA (Quaggin and Kapus, 2011). Comme les myofibroblastes
et les CAFs sont très similaires, il est tentant de spéculer sur la contribution des cellules
épithéliales cancéreuses comme source de CAFs. Ceci fait actuellement l’objet de débat
(Cirri and Chiarugi, 2011).
Concernant la cancérogenèse, les premières études de séquençage ont rapporté des
mutations des gènes TP53 et «phosphatase and tensin homolog» (PTEN) dont le patron est
mutuellement exclusif dans le stroma et les cellules épithéliales du cancer du sein, ce qui
remet en doute l’implication de l’EMT (Kurose et al., 2002). Au contraire, une étude sur le
cancer de l’ovaire a révélé un fort pourcentage de mutations dans le stroma activé identique
à celles retrouvées dans les cellules épithéliales cancéreuses, appuyant l'implication de
l'EMT comme source de CAFs (Tuhkanen et al., 2006). Par contre, une étude plus récente
et réaüsée sur un plus grand nombre de patientes n’a pas été en mesure de démontrer de
mutations tant dans le stroma de cancer du sein que de l’ovaire (Qiu et al., 2008). En fait,
l’absence de mutations somatiques dans l’ADN des CAFs concorde bien avec leurs effets
non tumorigéniques. Mais alors, comment expliquer que les CAFs, qui se développent sous
l’influence de cellules cancéreuses, puissent maintenir indépendamment leur phénotype
jusqu’à dix passages cellulaires (Olumi et a l, 1999)7 II est possible qu’une partie de la
réponse se retrouve au sein de modifications épigénétiques (Hu et al., 2005).
1.3 Cancer de l ’ovaire
Typiquement, la patiente atteinte du cancer de l’ovaire est ménopausée et âgée d’environ 60
ans lors du diagnostic initial. Elle présente des symptômes vagues s’apparentant à des
troubles digestifs bénins. Il est possible qu’elle se plaigne de constipation ou d’urination
fréquente due à une pression de la masse cancéreuse sur le rectum ou la vessie,
respectivement. Dans les cas d’un cancer de stade avancé, la cavité abdominale peut se
remplir de liquide (ascites) et de masses, et peut aller jusqu’à l’épanchement pleural. Si des
ganglions métastatiques sont présents, ceux-ci peuvent être palpables au niveau inguinal,
supraclaviculaire ou axillaire. Ces symptômes non spécifiques se manifestent généralement
très tard dans la progression de la maladie, d’où le surnom de « tueur silencieux ». Un
34
échantillon issu de
la chirurgie est requis pour poser le diagnostic définitif
(www.cancer.ca).
Lors de la progression du cancer, les cellules cancéreuses épithéliales deviennent
généralement moins différenciées. On a longtemps cru que le cancer de l’ovaire faisait
exception à cette règle puisque les cellules cancéreuses examinées ressemblent en fait à des
cellules spécialisées de tissus normaux (Auersperg et a l, 2001) (Fig. 8 ). Plus précisément,
il peut s’agir de tissu normal de la trompe de Fallope (séreux), de l’endométrium
(endométrioïde), du système gastro-intestinal (mucineux), du col de l’utérus ou du vagin
(cellule claire) ou finalement de la vessie (Brenner) (Bast et al., 2009, Kurman and Shih,
2010). Chacun de ces histotypes, reconnu par l’Organisation Mondiale de la Santé, est
subdivisé en trois catégories soit bénin, malin et à faible taux de malignicité (aussi appelé
low malignant potential, LMP).
La théorie sur les cellules d'origine du cancer de l'ovaire prônée jusqu'à tout récemment met
logiquement de l'avant les cellules épithéliales en surface de l'ovaire (ovarian surface
epithelium, OSE). Lors de l’ovulation, les cellules épithéliales en surface sont intemalisées
et endommagées, provoquant un risque accru de mutations lors de la réparation
subséquente. En accord avec cette théorie, les femmes ayant eu de multiples grossesses, des
périodes d’allaitement prolongées ou recours aux contraceptifs oraux sont moins à risque
d’être diagnostiquées du cancer de l’ovaire (Landen et al., 2008). En ce sens, les femmes
ayant subi un plus grand nombre de cycles ovulatoires ont plus de chance de développer un
cancer de l’ovaire (Fathalla, 1971). Par contre, ceci n’explique pas pourquoi les
contraceptifs de progestérone (qui n’inhibent pas l’ovulation) sont aussi efficaces que les
contraceptifs qui inhibent l’ovulation (Risch, 1998). De plus, les femmes ayant le syndrome
polykystique (moins de cycle ovulatoire) sont plus à risque de cancer de l’ovaire
(Schildkraut et al., 1996). Cette apparente discordance de l’hypothèse de l’ovulation
incessante peut être expliquée par une susceptibilité accrue aux mutations lors de processus
inflammatoires.
Dans une minorité de cas, un certain nombre de sous-type séreux, mucineux, endométrioïde
et à cellules claires suivent une progression selon la séquence classique adénome à
35
carcinome. La progression selon cette séquence proviendrait des OSEs qui s’invagineraient
pour former un kyste d’inclusion. Celui-ci donnerait lieu à une lésion précurseur nommée
«atypical proliferative serous tumor» (APST) aussi appelée LMP. Celle-ci se développe de
façon non-invasive avec une architecture de type micropapillaire pour donner lieu au
précurseur «micropapillary serous carcinoma» (MPSC), et finalement aboutir en
adénocarcinome séreux de bas grade (Fig. 8 ). Cette voie de faible grade (ou type I) est
caractérisée par une sur-activation de la voie des «mitogen-activated protein kinases»
(MAPK) suite à des mutations somatiques mutuellement exclusives dans les oncogènes
KRAS, v-raf murine «sarcoma viral oncogene homo log B1 (BRAF) ou v-erb-b2
erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2» (ERBB2) (Kurman and Shih, 2008).
Comme ces cellules prolifèrent plutôt lentement, les chimiothérapies conventionnelles sont
généralement inefficaces. En revanche, la prise en charge de la patiente par salpingooophorectomie (ablation de l’ovaire et de la trompe de Fallope) est une mesure efficace
(Trope et a i, 2009).
Le type II (voie de haut grade), particulièrement le sous-type séreux (ovarian serous high
grade, OSHG), est le plus fréquent (75%). La quasi-totalité des cas possèdent des mutations
dans le gène TP53. Contrairement à d’autres cancers épithéliaux, les cellules d’origine de la
maladie demeurent à ce jour mal définies. Une certaine proportion de tumeurs pourrait
provenir de kyste d’inclusion, mais la majorité serait issue des cellules épithéliales de la
trompe de Fallope ou encore du péritoine. Les lésions précurseurs (serous tubal
intraepithélial carcinoma, STIC) comporteraient des mutations dans le gène TP53 et
mèneraient à la formation de OSHG. En fait, la tumeur de haut grade prolifère très
rapidement et semble apparaître de novo. Conséquemment, la détection précoce du cancer
ovarien de type II est à toute fin pratique inexistante et la majorité des cancers sont
diagnostiqués en stage avancé. Dans ces cas, le traitement de première ligne consiste à une
cytoréduction de la tumeur suivi d’une chimiothérapie au taxane et platine, bien que la
chimiothérapie néoadjuvante soit également pratiquée (Chi and Schwartz, 2008).
36
KRAS ”!U!
APST
APST
MPSC
MPSC
I
High-grade
serous CA
(grade 3)
High-grade
serous CA
(grade 2)
High-grade
serous CA
(grade 3)
Mutations
Mutations
Wild-type
Wild-type
Wild-type
Wild-type
Mutations
Mutations
Molecular
genetic
changes
Low-grade
serous CA
(grade 1 )
KRAS/BRAF
TP53
KRAS M
BRAF *
Ovarian surface inclusions
Peritoneum
Fallopian tube
T
"
Type I
Type II
Figure 8 Progression séquentielle du cancer de l'ovaire.
Classification des cancers de l’ovaire en deux sous-types selon Kurman et Shih (2008).
Tirée de (Kurman and Shih, 2008).
Des mutations somatiques du “gatekeeper ” p53 sont retrouvées dans la quasi-totalité des
cas (Ahmed et al., 2010). Malgré tout, la majorité des cancers de l'ovaire ne sont pas reliés
à des causes héréditaires bien que les défauts génétiques d'origine familiale dans des gènes
de réparation de l'ADN, augmentent considérablement le risque de cancer du sein et de
l'ovaire (BRCA1: 40-50%, BRCA2: 20-30%) (Prat et al., 2005). En ce sens, une chirurgie
préventive est recommandée afin de diminuer ce risque. C'est d'ailleurs lors de l'inspection
soigneuse de ces tissus “normaux” que des lésions ont été observées pour la première fois
dans les cellules épithéliales de la trompe de Fallope (Fallopian tube epithelial cells, FTE)
(Colgan et al., 2001; Medeiros et al., 2006). En outre, l'examen moléculaire de tissus pairés
provenant de FTE et de OSHG révèle des mutations identiques du gène TP53 (Callahan et
al., 2007). Il est important de mentionner que l’origine embryonnaire des FTEs est de type
Mullerian (contrairement à mésothéliale pour l'OSE), ce qui cadre mieux avec les
caractéristiques que présentent les différents sous-types histologiques du cancer de l'ovaire.
37
Faisant face à la cavité pelvienne, l’ovaire détient une situation anatomique particulière
(Fig. 9). Celle-ci est située dans le tiers inférieur du tronc et regroupe les organes logés à
l'intérieur des os du pelvis. Elle comprend ceux du système reproducteur tel l'utérus, les
trompes de Fallope et les ovaires, ainsi que le petit intestin, la vessie et le rectum La cavité
abdominale est logée entre la cavité thoracique et la cavité pelvienne. La plupart des
organes de l'abdomen sont recouverts d'une mince couche de tissu séreux nommé péritoine.
À noter que les ovaires sont à découverts vis-à-vis les organes de la cavité pelvienne. Le
site métastatique de la plupart des cellules cancéreuses ovariennes est l’omentum; un large
coussin adipeux (approximativement 12 x 12 cm) situé entre l’estomac et le petit intestin
(Doig and Monaghan, 2006). Alternativement, le péritoine constitue un site d’attachement
fréquent (Doig and Monaghan, 2006). Fait intéressant, 50% des cas de cancers séreux
d’origine pelvienne de haut stage possèdent également des lésions dans les trompes de
Fallope (Levanon et a l, 2010). Inversement, de récentes études indiquent que dans certains
cas, ce que l’on croyait être un cancer de l’ovaire primaire est en fait originaire du pelvis et
atteint l’ovaire de façon secondaire (Kurman and Shih, 2010). L’ensemble de ces résultats
ébranlent les fondements et forcent les chercheurs à réévaluer leurs classifications et
hypothèses de recherche. En bref, le cancer de l’ovaire est maintenant perçu comme une
multitude de type de cancers n’originant pas nécessairement de l’ovaire mais qui y
aboutissent ultimement (Vaughan et al., 2011). Conséquemment, ceci compromet un grand
nombre d’études où les cellules épithéliales de l'ovaire (ou pire l’ovaire entier) ont été
utilisées comme cellules normales de référence (Zom et al., 2003).
38
Stomach
Fallopian
tube
Colon
! AppendixRetrograde ^
menstruation
Uterus
Mucinous invasive
Endometrioid
Clear cell
High-grade serous
Figure 9 Origine du cancer de l’ovaire.
L’ovaire est perçu comme un site métastatique pour plusieurs cancers du système
reproducteur ou gastro-intestinal. Des coupes histologiques colorées à l'hématoxylène et
l’éosine (H&E) représentent les principaux sous-types histologiques du cancer de l’ovaire :
séreux, endométrfode, cellules claires et mucineuses. L’hématoxylène colore en mauve les
cellules épithéliales alors que les cellules stromales apparaissent dans des teintes de rose
sous l’effet de l’éosine. Tirée de (Vaughan et a i, 2011).
39
2 Épissage des ARNm
2.1 Épissage constitutif
Jusqu’à présent, la notion de gène a été discutée sans introduire et détailler le dogme de la
biologie moléculaire moderne qui le sous-tend : Les gènes représentent l'information de
référence, l’acide ribonucléique (ARN) le message et la protéine la fonction. Il y a donc
transcription de l’ADN en ARNm puis traduction de celui-ci en protéine. La transcription
de gènes s'effectue lorsque les facteurs généraux de transcription TBP (TATA binding
protein), TFIID et TFIIB (transcription factor IID et IIB, respectivement) reconnaissent une
séquence promotrice de la transcription (typiquement une séquence TATA) située 30
nucléotides (nt) en amont du site de début de la transcription sur l’un des deux brins de
l’ADN. Ensuite, l’ARN polymérase II et d'autres facteurs de transcription s’assemblent au
promoteur et la transcription en ARN débute.
Gène
(5’UTR)
Début de
transcription
Début de
traduction
(3’UTR)
Fin de
traduction
Fin de
transcription
r
-30 nt
H
Séquence
TATA
-60 nt ~100 nt,
Signai de
Signal de
polyadénylation clivage
Séquence
U ouG /U
Figure 10 Unité génique.
Le début d’un gène est marqué par la présence d’une séquence promotrice (habituellement
une séquence TATA) et autres séquences régulatrices (non-montrées). La portion transcrite
inclut le 5’UTR, 3’UTR, les exons et les introns. Le gène moyen possède environ 8 exons
dont la plupart sont de moins de 200 nt et sont séparés par des introns 10 fois plus grands.
La fin de la transcription coïncide avec une séquence riche en U ou G/U. À noter que la
queue polyA en 3’ et la coiffe en 5’ ne sont pas encodées dans le génome et sont ajoutées
lors du processus de maturation du pré-ARNm.
40
Celle-ci transcrit jusqu’à quelques centaines de nucléotides après avoir atteint une séquence
riche en U ou G/U située à 30 nt en aval du signal de clivage et 40 à 60 nt en aval du signal
de polyadénylation (Fig. 10).
De façon co-transcriptionnelle, ce pré-ARNm subit plusieurs étapes de maturation.
L’extrémité 5’ de l’ARN est coiffée suivant trois étapes enzymatiques successives.
D’abord, une ARN triphosphatase enlève le phosphate en gamma du premier nucléotide du
pré-ARNm. Puis, une ARN guanyltransférase couple un guanosine-5'-monophosphate au
pré-ARNm. Finalement, un groupement méthyl est introduit en position 7 de la guanine par
une guanine-7-méthyltransférase pour générer une coiffe de type m7G(5')ppp(5')N. À
l’extrémité 3’, la protéine «cleavage and polyadénylation specificity factor» (CPSF)
reconnait le signal de polyadénylation et clive le pré-ARNm 10 à 30 nt plus loin. Ensuite,
une polyA polymérase indépendante de la matrice ADN ajoute environ 200 adénines,
formant ainsi une queue polyA (Lutz, 2008). Le processus de maturation doit également
enlever les séquences ne faisant pas partie de l’ARNm mature (intron, intervening
sequences) pour conserver uniquement les portions codant pour une séquence protéique
(exons, expressed sequences) et les séquences non-traduites flanquantes en 5’ et 3’
(untranslated region, UTR). Un gène moyen possède environ 8 exons dont la plupart sont
de moins de 200 nt et sont séparés par des introns 10 fois plus grands (Lander et a l, 2001).
L’excision d’un intron et le couplage subséquent des deux exons flanquants se nomment
épissage. Si on résume cette réaction d’un point de vue chimique, il s’agit d’une double
trans-estérification impliquant une adénine du point de branchement (branch point site,
BPS) située à environ 30 nt en amont du site d’épissage 3’ (3’ splice site, 3’ss). Celle-ci
procède à une substitution nucléophilique de type 2 (S n2) via l'hydroxyl en 2' (2 ’OH) sur le
phosphate à la jonction du site d’épissage 5’ (5’ splice site, 5’ss), relâchant ainsi la portion
3’ du pré-ARNm. Le groupement hydroxyl du phosphate en 3' attaque le phosphate du 3’ss,
produisant un ARNm épissé et libérant l’intron sous forme de lasso (Fig. 11).
41
ARNm
Pré-ARNm
Figure 11 Réaction d’épissage.
L’épissage nécessite deux trans-estérifications afin d’obtenir un ARN épissé et l’intron
résiduel sous forme de lasso. Lors de la première étape, l’adénine du BPS procède à une
attaque nucléophilique via le 2’OH sur le phosphate à la jonction du 5 ’ss, relâchant ainsi la
portion 3’ de l’exon en 5’. Lors de la deuxième étape, le groupement 3’OH de celui-ci
attaque le phosphate du 3’ss, produisant un ARNm épissé et libérant l’intron sous forme de
lasso.
L’épissage est réalisé par le splicéosome, une machinerie complexe regroupant cinq petits
ARN nucléaires (snRNA, small nuclear RNA) et une centaine de protéines. Les snRNAs
U l, U2, U4 et U5 possèdent une couronne heptamérique de protéines Sm communes (B/B \
D l, D2, D3, E, F et G) et sont également liés par une batterie de protéines spécifiques à
chacun (Patel and Bellini, 2008). Seul le snRNA U6 est entouré de protéines Sm-like. Les
petits ARN nucléaires complexés de protéines Sm ou Sm-like prennent alors le nom de
snRNP (small nuclear ribonucleoprotein) et sont des éléments essentiels du splicéosome.
Certaines composantes du splicéosome sont en mesure de reconnaitre les séquences
consensus qui délimitent les jonctions exon/intron, intron/exon ainsi que le BPS (Fig. 12).
fsnRN g>
(S F l} ^ U2AF^5 ^
GURAGU....YNYURACYYYYYYYYYA(
\
i
5’ss
BPS
| ~ 1000 nt y
\
PPT
- 30 nt
\3’ss
|
Figure 12 Séquences consensus impliquées lors de Pépissage.
Les séquences consensus du 5’ss, du BPS, du PPT et du 3’ss sont représentées. Le 5’ss est
initialement reconnu par Ul snRNP; le BPS par SFl; le PPT par U2AF65 et les deux
derniers nucléotides de l’intron par U2AF35.
42
Initialement, le 5’ss CI AAGGUR AGU (la région intronique est soulignée) est lié par la
portion 5’ du snRNA Ul de façon ATP-indépendante et stabilisé par des protéines
membres de la famille SR (S pour sérine, R pour arginine). Subséquemment, le BPS
YNYURAC (en gras l’adénine directement impliquée dans l’épissage) est lié par le splicing
factor 1 (SF1), la séquence de polypyrimidine (polypyrimidine tract, PPT) par la sous-unité
de 65 kDa de U2 auxilary factor (U2AF65) et les deux derniers nucléotides AG de l’intron
par la sous-unité de 35 kDa de U2AF (U2AF35). Ceci forme ce que l’on appelle le
complexe E et permet de définir les exons (voir figure 13). Ensuite, le snRNP U2 s’apparie
de façon ATP-dépendante avec le BPS et déplace SF1. Cette dernière protéine est
remplacée par SF3bl4a, et ensemble, mènent au complexe A. Ici, les snRNPs Ul et U2
doivent faire contact « à travers l’intron », passant de la définition de l’exon à la définition
de l’intron. Puis, les snRNPs U4, U5 et U6 se pré-assemblent avant de faire contact et créer
le complexe B. À ce stade, le splicéosome n’est pas encore catalytiquement actif et doit
relarguer les snRNPs Ul et U4 et procéder à des changements conformationnels majeurs
pour en arriver au complexe B* (* pour splicéosome activé). La première Sn2 peut alors
s’effectuer et mener au complexe C. Suite à quelques réarrangements au niveau du réseau
d’interactions ARN-protéine, les deux exons sont joints, les snRNPs U2, U5 et U6 sont
dissociés et l’intron est relâché. Les snRNPs U peuvent alors être recyclés pour un prochain
cycle d’assemblage. À noter qu’il existe un système parallèle nommé splicéosome mineur
qui permet l’épissage des ARNm dont les séquences consensus du 5’ss, BPS et 3’ss sont
G/ATATCCTTT. TTTTCCTTAACT et CAG, respectivement (Patel and Steitz, 2003). À
l’exception du snRNP U5, les autres snRNPs U impliqués (U ll, U12, U4atac et U 6 atac)
sont spécifiques à ce système mineur.
E complex
U1
n ! 'C 'n
GU
□ +
2nd step
-AfCZ
U2
A com plex
U1
C com plex
U5
U2
U6
U4/U6
/
V U5
1 st step
B complex
B* complex
\U 5
U4/U6 Y ’ j
U6
OH i?
U2
ilZ Z Z Z J
U1
U4
Figure 13 Cycle d ’assemblage du splicéosome.
Le complexe E est formé lorsque U 1 snRNP reconnaît le 5'ss. Ensuite, U2snRNP se lie
au BPS et mène au complexe A. Les tri-snRNP U4/U5/U6 font contact avec Ul et U2,
formant le complexe B. À ce stade, le splicéosome n'est pas encore catalytiquement actif et
doit relarguer Ul et U4 snRNP pour en arriver au complexe B* (splicéosome
activé). La première SN2 s'effectue menant au complexe C. Suivant quelques
réarrangements au niveau du réseau d'interaction RNA-protéine, les deux exons sont joints,
les snRNPs U2, U5 et U6 sont dissociés et l’intron est relâché. Les U snRNPs peuvent
alors être recyclés pour un prochain cycle d'assemblage. Image tirée de Krummel
( 2 0 1 0 ).
44
2.2 Épissage alternatif
2.2.1 Type d ’événements d'épissage alternatif
L’épissage d’un pré-ARNm peut également être régulé. C'est-à-dire que sous certaines
conditions, la séquence de l’intron à enlever, et donc celles des deux exons à joindre, ne
sont pas reconnues fidèlement. Ainsi, il est possible de produire plusieurs ARNms matures
distincts à partir d’un même produit de gène. C’est ce qu’on appelle l’épissage alternatif
(alternative splicing, AS). En fait, l’AS n’est pas une exception à la règle, mais plutôt la
norme chez l’humain: plus de 90% des gènes sont épissés alternativement (Wang et al.,
2008). Tel qu’il a été illustré à la figure 14, deux 5’ss peuvent être en compétition pour un
même 3’ss ou inversement, deux 3’ss pour un même 5’ss. C’est ce qu’on appelle un
événement d’épissage alternatif (alternative splicing event, ASE) de type alternatif 5’ (alt5\
Fig. 14A) et alternatif 3’ (alt3\ Fig. 14B), respectivement. Le ASE le plus fréquent est
l’exclusion complète de l’exon (Fig. 14C). Il existe également des cas où une série d’exons
est exclue en bloc (exclusion d’exon multiple, Fig. 14D) ou incluse de façon mutuellement
exclusive (Fig. 14E).
L’AS peut également être couplé à d’autres mécanismes de régulation de l’ARNm comme
la polyadénylation (Lutz, 2008) (Fig. 14F). L’ARNm résultant exhibe une région 3’UTR
différente sujette à une régulation via des facteurs de liaison à l’ARN ou de petits ARN
non-codants. La dégradation spécifique via la voie «non-sense mediated decay» (NMD) est
un mécanisme efficace de contrôle de la quantité d’ARNms que produit le gène (Garneau et
al., 2007) (Fig. 14G). Cela se produit lorsqu'un codon stop est introduit trop tôt dans
l’ARNm par rapport au dernier exon. Il est prédit qu’environ le tiers des isoformes sont
sujet au NMD (Lewis et al., 2003). Le gène moyen possède donc plusieurs ARNms
isoformes, dont la majorité sont susceptibles d’être traduites en protéines différentes
pouvant résulter en des fonctions différentes. À noter que même si l’ASE se situe à
l’extérieur de la portion codante, n’affectant donc en rien la séquence protéique finale, les
portions UTR comprennent des séquences régulatrices de l’expression génique (Hughes,
2006). Bien que la notion de promoteur alternatif soit parfois incluse parmi les types
possibles d’AS, il ne s’agit pas d’AS à proprement dit. L’AS produit deux ARNms ou plus
45
à partir du même pré-ARNm alors que l’initiation de transcription alternative produit deux
pré-ARNms ou plus (Fig. 14H).
_J
B
F
H
Figure 14 Type d’événements d’épissage alternatif.
A) Alt5\ B) A lt3\ C) Exon cassette. D) Exons multiples. E) Exons mutuellement exclusifs.
F) ASE couplé à la polyadénylation alternative. G) ASE couplé au NMD. H) Transcription
alternative.
2.2.2 Mécanisme de régulation
2.2.2.1 Mécanisme de régulation classique
Les séquences consensus décrites à la section 2.1 définissant le 5’ss, le 3’ss, le BPS et la
PPT sont communes aux exons constitutifs et alternatifs. Par contre, leurs forces relatives,
c'est-à-dire leur Fidélité face à la séquence consensus diffèrent et permettent de les
classifier: les exons constitutifs possèdent des sites forts et les exons alternatifs des sites
faibles. Des analyses bioinformatiques comparant les séquences des exons constitutifs visà-vis des introns et des exons avec sites faibles (Fairbrother et a i, 2002), ou vis-à-vis des
pseudo-exons et des séquences 5’UTR de gènes sans intron (Zhang and Chasin, 2004) ont
46
révélé des motifs enrichis dans les exons alternatifs. Il apparaît que ceux-ci ont pour effet
de promouvoir l’inclusion de l’exon et se nomment «exonic splicing enhancers »(ESEs).
La plupart des ESEs sont üés par des protéines de la famille SR. Ces protéines possèdent
des domaines de liaison à l’ARN de type RNA recognition motif (RRM) en N-terminal
ainsi que des domaines riches en arginine et sérine (domaine RS) en C-terminal. Ces
domaines RS servent de module d’interaction protéine-protéine afin de recruter des
composantes du splicéosome aux 5’ss ou 3’ss faibles (Graveley, 2000) (Fig. 15A). À
l’opposé, les «heterogenous nuclear ribonucleoproteins» (hnRNPs) représentent une famille
de facteurs d’épissage qui favorise généralement l’exclusion de l’exon en liant des «exonic
splicing silencers» (ESSs). Ils opèrent en formant des multimères le long des exons (Zhu et
al., 2001), en bloquant le recrutement du snRNP U (Tange et al., 2001) ou en détournant
l’exon alternatif (looping out) loin du splicéosome (Martinez-Contreras et a l, 2006) (Fig
15B-D).
47
c
F
êT
h&— è m / /
Figure 15 Mécanismes de régulation de Fépissage alternatif par des facteurs
d’épissage.
A) Les protéines SR reconnaissent des ESEs et favorisent l’inclusion d’exon en recrutant
les snRNPs Ul ou U2 au 5’ss ou 3’ss, respectivement. B) La polymérisation (3’ vers 5’)
des hnRNPs le long de l’exon favorise l’exclusion de l’exon en bloquant l’accès des
protéines SR aux ESEs. C) Les hnRNPs se lient à des ISSs et interfèrent avec la définition
de l’intron, favorisant l’exclusion de l’exon. D) Les hnRNPs peuvent favoriser l’exclusion
en rapprochant les exons éloignés. E) La somme totale des protéines SR vs hnRNPs dicte le
sort de l’exon alternatif: Un surplus de hnRNPs favorise l’exclusion et vice versa pour les
protéines SR. F) Les facteurs d’épissage exprimés de façon tissu-spécifique comme
RBFOX2 et Noval favorisent habituellement l’inclusion d’exon lorsqu’ils se lient en aval
du 5’ ss alors qu’ils favorisent l’exclusion lorsqu’ils se lient en amont du 3’ ss alternatif.
Les facteurs d'épissage de ces deux familles peuvent s'antagoniser fonctionnellement (Fig.
15E). Les plus étudiés sont les protéines «splicing factor 2» (SF2) et hnRNPAl (Mayeda
and Krainer, 1992, Eperon et al., 2000). L’affinité de Ul snRNP pour un 5’ss peut être
modulée in vitro à la hausse ou à la baisse lorsque SF2 ou hnRNPAl, respectivement, est
majoritaire. Comme la liaison du snRNP Ul pour le 5’ss en aval est proportionnelle à son
épissage, la simple variation du ratio entre les deux protéines suffit à influencer le destin de
plusieurs pré-ARNms (Caceres et al., 1994). U existe également des séquences régulatrices
introniques (intronic splicing enhancer, ISE; intronic splicing silencer, ISS) liées par des
membres de la famille SR et des hnRNPs. Curieusement, la plupart des hnRNPs se liant
dans l’intron en aval de l’ASE favorisent l’inclusion d’exon alors que la liaison de
protéines SR à des séquences introniques favorise l’exclusion. Ces fonctions à priori
contradictoires peuvent être réconciliées si l’on considère que les hnRNPs permettent de
48
définir les régions introniques et les protéines SR les régions exoniques. D'autres exemples
d’antagonismes fonctionnels ont été répertoriés, notamment mettant en cause les effets
répresseurs de la «polypyrimidine tract binding protein l» (PTBP1) et activateurs de
«CUG-BP and ETR3-like factors» (CELF) et pouvant agir avec (Zhang et al., 2002,
Gromak et al., 2003) ou sans (Charlet-B et al., 2002) compétition directe pour un site de
liaison.
2.2.2.2 Expression tissu-spécifique de facteurs d ’épissage
Afin de mieux comprendre les séquences régulatrices de l'épissage (splicing regulatory
elements, SREs) introniques, plusieurs groupes de recherche ont examiné les séquences
introniques aux abords des ASEs et en arrivent à la même conclusion: la séquence
UGCAUG est la plus conservée (Yeo et al., 2007, Voelker and Berglund, 2007). Cette
séquence ARN est bien connue pour lier les facteurs d’épissage RNA «binding protein,
fox-1,2 homo log» (RBFOX1-2) (Auweter et a l, 2006), dont l’expression est restreinte à
quelques types tissulaires (RBFOX1: cardiaque, musculaire et neuronale; RBFOX2:
cardiaque, musculaire et ovarien) (Kuroyanagi, 2009). Les mécanismes permettant à ces
facteurs de réguler l’AS sont encore mal compris. Par contre, de récentes études à grande
échelle entreposent par notre groupe de recherche (Venables et al., 2009) et d’autres
groupes (Castle et al., 2008, Zhang et al., 2008) ont permis de mettre en lumière un
principe général: la séquence UGCAUG se retrouvant en amont d’un ASE favorise
l’exclusion (ISS) alors qu’elle favorise l’inclusion (ISE) lorsque positionnée en aval de
l’ASE.
L’expression de plusieurs autres facteurs d’épissage est également limitée à un petit groupe
de tissus (Chen and Manley, 2009). C’est le cas notamment de NOVA1-2 (neurooncological ventral antigen 1 and 2 ) qui sont exprimés uniquement dans le système
nerveux. De façon intéressante, les séquences de liaison pour les familles muscleblind-like
(Mbnl), Celf (Kalsotra et al., 2008), epithelial-specific regulatory protein (Esrp) (Warzecha
et al., 2010) et Nova (Zhang et a l, 2010) sont également majoritairement introniques. Plus
49
encore, leur influence sur la décision d’épissage semble suivre la tendance décrite pour
RBFOX1-2 (Fig. 15F).
2.2.3 Rôle dans la cancérogenèse
2.2.3.1 Dérégulation des isoformes
Mis à part des exemples ponctuels, le premier indice d’un lien plus généralisé entre l’AS et
le cancer provient de l’analyse «d’expressed sequence tags» (ESTs). Les ESTs sont
produits à partir du séquençage de librairies d’ADN complémentaire (cDNA). Plusieurs
groupes de recherche, dont Wang et collaborateurs (2003) ont classifié les milliers de
sources de cDNA comme étant « normal » ou « cancer » pour leur permettre d’associer
statistiquement certains isoformes au cancer (revue par Xing 2007). Quelques années plus
tard, des micropuces à ADN spécifiques aux isoformes alternativement épissés révèlent la
présence d’isoformes associés aux cellules cancéreuses, notamment de celles de lymphome
Hodgkinien (Relogio et al., 2005), de prostate (Zhang et al., 2006) et du côlon (Gardina et
a l, 2006). Tout ceci démontre bien le dérèglement de l’AS dans les tissus cancéreux. Une
des applications directes est d’exploiter ces isoformes comme biomarqueurs, que ce soit
sous forme de test diagnostique ou pronostique (Brinkman, 2004).
Il y a de cela près de 20 ans, une étude a indiqué que 15% des mutations modifient les
séquences consensus du 5’ss ou du 3’ss (Krawczak et al., 1992). Il est fort probable que
cette étude sous-estime l’impact réel des mutations sur l’AS puisque ceci ne tient pas
compte des mutations dans les SREs (ESEs, ESSs, ISEs et ISSs). En fait, la plupart des
analyses sont limitées aux ARNms matures et ne tiennent pas compte des séquences
introniques. Une analyse probabiliste chiffre maintenant à 60% la proportion de mutation
ayant un impact sur l’AS (Lopez-Bigas et al., 2006). Certains des gènes atteints sont des
TSGs et quelques-uns sont revus dans l’ouvrage de Srebrow et Komblihtt (2006) ainsi que
Brown et Pettigrew (2008). De plus, un certain nombre de gènes reüés au cancer (63 sur
487 gènes en date du 15 mars 2012, http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic) ont
certaines de leurs mutations somatiques qui affectent directement l’épissage. Fait
50
intéressant, aucune mutation affectant un ESS n’a été répertoriée (Pettigrew and Brown,
2008) alors que ceux affectant des ESEs sont communes. Par contre, le patron d’expression
d’isoformes de certains gènes dans les tissus cancéreux n’est pas forcément la cause d’une
mutation directe. L’hypothèse la plus probable demeure un débalancement des facteurs
affectant l’épissage en trans.
2.23.2 Dérégulation des facteurs d ’épissage
En plus de la dérégulation des isoformes observée dans différents types de cancers, une
autre série d’évidences vient de l’analyse des facteurs d’épissage agissant en trans. Une
analyse bioinformatique rétrospective sur des données issues de «serial analysis of gene
expression» (SAGE) et de micropuce à ADN permet de noter la surexpression de plusieurs
facteurs d’épissage dans le cancer du sein, de la prostate, du côlon et du cerveau
(Kirschbaum-Slager et al., 2004). Parmi l’ensemble des gènes relié au cancer et comportant
des mutations somatiques, au moins 19 ont des domaines de liaison à l’ARN ou un rôle au
niveau de la maturation de l’ARNm, (Skotheim and Nees, 2007). En fait, toute action
permettant de moduler la concentration ou l’activité de facteurs d’épissage clé au site
d’action est susceptible d’affecter l’AS de ses exons cibles. Par exemple, la surexpression
d'un facteur de transcription comme Myc active la transcription de gènes codant pour des
facteurs d’épissage (dont PTBP1, hnRNPAl et 2) qui à leur tour, régulent l’AS d’exon
cible dans les glioblastomes (David et al., 2010). De façon générale, les domaines RS des
facteurs d’épissage doivent être phosphorylés afin de préserver leur localisation nucléaire
(Gui et al., 1994, Yeakley et al., 1999, Blaustein et al., 2005). L’état de phosphorylation
des protéines SR est finement régulé par la «serine/arginine-rich splicing factor kinase 1»
(SRPK1), elle-même surexprimée dans les cancers du sein, de la prostate et du côlon
(Hayes et al., 2007).
2.2.3.3 Relation de cause à effet
Bien que le dérèglement de certains facteurs d'épissage et de plusieurs isoformes soit
évident, ceci ne conlère en rien un lien de cause à effet entre eux, et encore moins une
51
évidence comme quoi l’AS participe à la progression tumorale. En réponse indirecte à cette
dernière question, plusieurs gènes reliés au cancer expriment des isoformes alternativement
épissés dont la fonction est en lien avec la cancérogenèse. En fait, chacun des six
« Hallmark of Cancer » de Hanahan et Weinberg (Hanahan and Weinberg, 2000) est
représenté par au moins un exemple dans la littérature (Fig. 16). À plus large échelle, des
prédictions bioinformatiques appuient l'impact de l'AS sur la fonction protéique (Artandi
and DePinho, 2010) mais les démonstrations de leur impact sur la cancérogenèse in vivo
tardent. Reste que la démonstration ultime est d’exploiter le défaut dans l’épissage (facteur
d’épissage ou isoforme) pour éliminer les cellules cancéreuses sans affecter les cellules
normales.
De façon intéressante, l’AS touche chacun des six « Hallmark of Cancer » de Hanahan et
Weinberg (Hanahan and Weinberg, 2000). Auto-suffisance des signaux de croissance: La
famille des gènes Ras (KRAS, Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog (HRAS),
neuroblastoma RAS viral oncogene homolog (NRAS)) est la cible de plusieurs mutations,
dont une dans un intron du gène HRAS qui a pour effet d’abolir un 5’ss (Cohen et al.,
1989). L’isoforme court de HRAS, (p21) possède des capacités accrues de prolifération
comparativement à l’isoforme de pleine longueur (pl9) (Cohen and Levinson, 1988). En
fait, l’exon IDX présente un codon stop dans le cadre de lecture et la quantité de cette
isoforme est conséquemment régulée par la voie NMD (Barbier et al., 2007). Résistance
aux signaux suppresseurs de croissance: Rbl est un régulateur clé de la progression du
cycle cellulaire. En état hypophosphorylé, il se he au facteur de transcription E2F causant la
répression de son activité transcriptionnelle. Un nombre important de mutations dans les
sites d’épissage de Rbl a été répertorié et corrèle avec la sévérité du phénotype. La plupart
de celle-ci introduit un codon stop prématurément et diminue conséquemment le niveau
d’expression de ce gatekeeper (Lohmann and Gallie, 2004). Invasion et métastase: La
protéine transmembranaire CD44 subit de l’AS dans la majorité de ses exons codant,
résultant en de multiples isoformes. L’isoforme incluant l’exon 6 est requise pour
l’activation du récepteur Met via la formation d’un complexe ternaire avec le ügand
«hepatocyte growth factor» (HGF) (Orian-Rousseau et al., 2002), une voie de signalisation
impliquée dans l’invasion et la métastase (Cecchi et al., 2010). De plus, un siRNA
52
spécifique à l’exon 5 réduit substantiellement l’invasion des cellules HeLa dans un essai in
vitro (Cheng and Sharp, 2006). Acquisition de l’immortalité: Les cellules humaines
normales possèdent un pouvoir de réplication limité. C’est qu’à chacune des rondes de
réplication de l’ADN, les extrémités des chromosomes (télomères) diminuent jusqu'à un
point où les cellules cessent de proliférer et entrent en sénescence (Artandi and DePinho,
2010). Le gène encodant la sous-unité catalytique de la télomérase (telomerase reverse
transcriptase, TERT) est réactivé dans plusieurs types de cancers, permettant de maintenir
une taille adéquate des télomères et conséquemment l’immortalité. En condition normale,
les lymphocytes produisent un nombre substantiel d’isoformes du gène TERT qui régulent
négativement la faible activité basale associée à son transcrit de pleine longueur. Lors de la
lymphomagenèse, il a été proposé que l’AS permet de diminuer l’expression de ces
transcrits inhibiteurs via la voie NMD (Amor et al., 2010). Induction d’angiogenèse: Le
gène VEGF est un important régulateur de l’angiogenèse. Il est épissé alternativement de
façon complexe dans sa portion 3’ pour générer les isoformes VEGF121 à VEGF206- C’est
l’utilisation d ’un 3’ss distal plutôt que proximal qui lui confère ses propriétés antiangiogéniques (Harper and Bates, 2008). Résistance à l’apoptose: Le gène BCL2L1 (Bclx) possède deux 5‘ss en compétition sur l’exon 2 pour générer deux isoformes: Bcl-xs
(isoforme court) et
B c 1-x l
(isoforme long). L ’expression de
B c I- x l
en lignée cellulaire
prévient la mort alors que l’expression de Bcl-xs seule est suffisante pour induire
l’apoptose (Boise et a i, 1993). Les propriétés antagonistiques des isoformes issus de TAS
ne sont pas une exception dans la famille Bel; plusieurs membres ont des effets similaires
dont «myeloid cell leukemia sequence 1» (MCL-1l/MCL-1s) et B-cell CLL/lymphoma 2
(BCL-2o/BCL-2p) (Akgul et a l, 2004).
53
H-raa p19
H-raa p21: Pro-prolifération
Bd-xL: Pro-apoptotiqua
R kt: An ti-prolifé ration
Bd-xS: Anti-apoptotiqu#
Rbl : Pro-prolifération
CD44: Exons 5-10 Pro-m lgratolrta
■■WtfWUB
VEGF-A*,,: Pro-anglogéniqua
VEGFA^b: Anti-angiogénlqua
1
hTERT: Sénaacsnco
hTERT: Immortalité
Figure 16 L’épissage alternatif est omniprésent dans ies gènes liés au cancer.
Un exemple de gène dont la fonction des isoformes est en lien avec la cancérogenèse est
illustré à partir du schéma des six « Hallmarks of Cancer » (Hanahan and Weinberg,
2000).
54
3 Quantification de l ’ARNm
3.1 Méthodologies de quantification des isoformes alternativement épissés
Dans les années 1980, les isoformes issus de l’AS étaient principalement détectés par
hybridation de type Northern (Cheng and Sharp, 2006). Cette technique a l’avantage de
discerner les transcrits par leur poids moléculaire et permet leur quantification. Outre son
faible débit, son principal défaut est relié à sa sensibilité: des quantités d’ARN total de
l’ordre du microgramme sont nécessaires. Ce dernier aspect est amélioré si on applique le
protocole de la protection à la ribonucléase (RNase).
La méthode classique pour la détection d’isoformes de l’AS demeure le « endpoint PCR »
(Fig. 17A). C’est une méthode efficace et accessible à tous les laboratoires de biologie
moléculaire. Des amorces de réaction de polymérisation en chaîne (PCR) sens et antisens
sont dessinées sur les exons constitutifs flanquants l’ASE. La réaction PCR générera deux
produits PCR, chacun d’eux correspondant à une isoforme. Par convention, on appelle
isoforme long celle incluant la séquence alternative et isoforme court celle excluant la
séquence alternative. Ensuite, ces deux produits sont séparés sur gel d’agarose et les bandes
quantifiées au moyen de bromure d’éthidium. L’électrophorèse capillaire permet
d’augmenter substantiellement le débit de cette technique (Klinck et al., 2008). Le ratio des
isoformes est calculé en prenant la molarité du produit long sur la somme de la molarité des
produits longs et courts, ce que notre groupe de recherche a rebaptisé \|/ (percent of splicing
index, psi) (Klinck et al., 2008). Les deux principales limites de cette technique sont reliées
au pouvoir de résolution du gel et à la faible plage de valeur pour laquelle la méthode est
quantitative.
Bien que les premières études de profilage par micropuce à ADN aient été rapportées au
milieu des années 1990 (Schena et al., 1995), les défis techniques supplémentaires
qu’apporte l’étude de l’AS retardent la première publication à 2003 (Johnson et al., 2003).
Il n’est effectivement plus possible d’utiliser des librairies d'ADN complémentaires
(ADNc) de pleine longueur ou encore de courtes sondes d’oligonucléotides ciblant la
55
région 3’ des transcrits. Une des stratégies consiste à sonder toutes les jonctions exon-exon
(junction array) (Johnson et al., 2003). Dans ce cas, lorsque deux jonctions consécutives
donnent un signal très faible ou très fort, l’exon commun est soupçonné d’être alternatif
(exclusion ou inclusion, respectivement). Une deuxième stratégie promeut l’utilisation de
sondes exon-exon et de sondes exoniques (exon/junction array) (Pan et al., 2004). Dans
tous les cas, la haute similarité des jonctions favorise l’hybridation non-spécifique des
transcrits et les méthodes d’analyse ne parviennent pas toujours à quantifier la modulation
de l’AS (Cuperlovic-Culf et al., 2006) (Fig. 17B).
Ratio
d’Isoforme
PCR
B
Ratio
d’Isoforme
Exon array
Junction array
Exon/Junction array
PCR
PCR
.7 !
Niveau
absolu
de chaque
Isoforme
Figure 17 Stratégies de détection pour la quantification des isoformes alternativement
épissés.
A) Endpoint PCR. B) Micropuce à ADN. C) PCR en temps réel
Les trois méthodes les plus fréquemment utilisées sont le «endpoint» PCR, la PCR en
temps réel et les micropuces à ADN. Une des techniques couramment utilisée pour la
quantification de l’expression globale mais marginalement exploitée pour les isoformes est
l'amplification par PCR en temps réel. Cette fois-ci, il s’agit de positionner les amorces de
façon à générer une réaction PCR spécifique à chacune des isoformes (Fig. 17C). Pour
56
l’isoforme long, une des amorces est spécifique à l’ASE tandis que l’autre amorce est située
sur un exon constitutif. Dans le cas de l’isoforme court, la seule région unique est la
jonction exon-exon. Une des deux amorces doit obligatoirement chevaucher la jonction
exon-exon, l’amorce opposée s’hybridant sur une séquence commune aux deux isoformes.
Contrairement au «endpoint» PCR où la réaction est arrêtée après un certain nombre de
cycles (typiquement entre 25 et 35), les produits de PCR en temps réel sont amplifiés et
mesurés après chaque cycle. La quantification en temps réel est possible grâce à l’ajout
d’un agent intercalant de l’ADN double-brin, typiquement le SyBr Green qui est
fluorescent uniquement dans son état hé (Morrison et al., 1998). Alternativement, une
sonde de type Taqman™ peut être ajoutée entre les deux amorces (Morrison et al., 1998,
Heid et al., 1996). Dans ce cas, la fluorescence provient de la dégradation de la sonde via
l’activité 5’ —> 3’ exonucléase de la Taq polymérase. Si on met en graphique l’intensité de
fluorescence émise en fonction des cycles PCR, on aura une courbe présentant 4 phases : le
niveau de base (typiquement dans les 15 premiers cycles), l’amplification exponentielle (34 cycles suivant la première phase), la phase linéaire et la phase plateau indiquant la fin de
la réaction. (Fig. 17B, au centre). C’est la portion exponentielle qui est la plus reproductible
et qui sert de valeur de comparaison pour la quantification. Plus précisément, c’est le point
qui émerge de la ligne de base (cycle threshold, Ct). Pour des fins de normalisation, une
réaction PCR amplifiant un gène de référence (housekeeping gene, HKG) ne présentant que
très peu de variation entre les échantillons soumis est habituellement utilisée. L ’expression
relative à un échantillon non-traité est ensuite calculée selon la méthode du deltadeltaCt
(Livak and Schmittgen, 2001). Une version améliorée de cette formule prenant en compte
l’estimation de l’efficacité de chacune des paires d’amorces de PCR ainsi qu’une
normalisation par moyenne géométrique de plusieurs gènes de référence est aussi de plus
en plus utilisée (Hellemans et al., 2007).
3.2 Utilisation d'échantillon clinique fixé
La méthode la plus simple et la plus répandue pour la conservation des tissus est de les
fixer avec le formaldéhyde et de les enrouler dans la paraffine (formalin-fixed, paraffinembbeded, FFPE). L’utilisation de ces tissus pour des études d’expression génique est
57
longtemps demeurée controversée puisque l’ARN résultant est de très mauvaise qualité.
C’est que le traitement de fixation modifie les ribonucléotides en ajoutant des groupements
CH2-OH sur les bases azotées (principalement les adénines) et forme des liaisons
covalentes entre l’ARN et des protéines (Masuda et al., 1999). De plus l’ARN est
fragmenté en segments d’au plus 100 à 200 nt. Par contre, même si les temps de
«processing» (moment entre la chirurgie et l'immersion du tissu dans le formaldéhyde) et
de fixation ont un impact significatif sur la qualité de l’ARN (Chung et al., 2008), la
normaüsation par rapport à un HKG (PCR en temps réel) annule ces effets et permet une
quantification adéquate (Antonov et al., 2005). Pour maximiser le signal, l’étape de reverse
transcription doit s’effectuer avec des amorces dégénérées ou des gènes spécifiques (pas
seulement des oligonucléotides polydT) et les amplicons doivent être d’au plus 100 bp.
Cette dernière contrainte restreint la technique «endpoint» PCR en FFPE à des exons d ’au
plus 40 nt alors que le PCR en temps réel n'est que très peu affecté par la taille des exons.
En effet, la taille des deux amplicons d’une réaction «endpoint» PCR est dictée par la taille
de l’ASE (Fig. 18). De plus, le dessin doit respecter la limite supérieure de 100 bp et
inférieure d’au moins 60 bp (pour se différencier des amorces et dimères d’amorces), en
plus de générer des amplicons résolvables par électrophorèse capillaire (>15 bp). À noter
que très peu d’exemples exploitant le SyBR Green et de l'ARN provenant de FFPE ont été
rapportés (Rogerson et al., 2008). La technologie de micropuce à ADN a également été
utilisée avec succès, mais présentent un niveau de bruit de fond plus grand qu’avec
l’utilisation de tissus frais (Waldron et al., 2012).
58
Isoforme court
Isoforme long
35-60
12 0 ]
2 0 1 I | 2a
-<*
20:
I
►
20
Figure 18 Contraintes de dessin d’amorces en endpoint PCR dues à l’utilisation
d’échantillon clinique fixé.
Des amorces de endpoint PCR typique d’environ 20 nt amplifient un fragment PCR d ’un
minimum de 60 bp (isoforme court). Ceci laisse une plage de 20 nt entre les deux amorces.
Comme l’amplification de l’isoforme long (amplicon d’un maximum de 100 bp) s’effectue
avec les mêmes amorces PCR, cela permet l’amplification d’exon alternatif dont la taille est
limitée à 40 nt ou moins. De plus, le pouvoir résolutif de l’électrophorèse capillaire exige
une différence de taille d’amplicon d’au moins 15 bp.
3.3 Microdissection au laser et amplification d ’ARN
Pour isoler des populations de cellules homogènes, il est possible d’exploiter des
caractéristiques antigéniques, de taille ou de régularité de surface de cellules en suspension.
Cette technique, le fluorescence-activating cell sorting (FACS), est difficilement
transposable aux tissus soüdes, car les cellules sont prisonnières d’une matrice. Pour y
parvenir, de fines coupes de tissus (~5 |im) sont montées sur une lame flexible et
microdisséquées à l’aide d’un laser (laser capture microdissection, LCM). Cette technique a
été récemment appliquée pour isoler des cellules cancéreuses de tumeur de prostate
(Rogerson et al., 2008), de sein (Ma et al., 2003) et d’ovaire (Tone et al., 2008). Comme
les quantités d’ARN isolées suite au LCM sont minimes, l'ARN total doit presque
obligatoirement suivre un protocole d’amplification pour en augmenter la quantité. Le
protocole « Sigma whole transcriptome amplification » permet d'obtenir une amplification
uniforme du transcriptome (sans biais pour la région 3' du gène) en deux étapes. D'abord
des amorces dégénérées en 3' mais possédant une séquence universelle en 5' sont utilisées
afin de produire une librairie de courtes séquences d’ADN. Dans un deuxième temps, cette
librairie sert de matrice et est amplifiée à l'aide d'amorces de PCR dites universelles.
59
4 Méthodes pour reprogrammer / ’épissage alternatif des cellules cancéreuses
4.1 Antisens
Les premiers effets antisens ont été remarqués à la fin des années 1970 avec de courtes
séquences d’ADN s’hybridant aux séquences essentielles à la circularisation de l’ARN du
virus du sarcome de Rous (Stephenson and Zamecnik, 1978). Le mécanisme proposé est
l’arrêt de la traduction dû à un blocage du ribosome. À cette époque, les séquences de
cibles potentielles permettant d’exploiter le mécanisme antisens sont très limitées. De plus,
la synthèse d ’oligonucléotides de longueur suffisante pour permettre une hybridation à
37°C demeure difficile et l’entrée des oligonucléotides en cellules est encore vivement
débattue (Zamecnik, 1996). L’antisens est généralement positionné directement sur le
codon d’initiation de la traduction ou dans le 5’UTR près de la structure coiffe (Crooke,
1999) (Fig. 19A). Outre l’arrêt de la traduction, il est observé que certain antisens contribue
à une dégradation de l’ARNm cible. Comme la RNase H est une enzyme ubiquitaire qui
clive le brin ARN d’un duplex ADN:ARN, cela en fait un bon candidat pour expliquer les
effets de dégradation-spécifique de l’ARNm (Walder and Walder, 1988) (Fig. 19B).
60
ïffllT
traduction
Figure 19 Mécanismes d’action des antisens.
A) Blocage de la traduction. Un antisens typique de 18 à 25 nt de longueur est positionné
sur le codon d’initiation de la traduction ou près de la structure coiffe dans le 5’UTR de
l’ARNm. Celui-ci interfère avec le ribosome et diminue la traduction subséquente de la
protéine. À noter que l’antisens doit être modifié de façon appropriée. B) Clivage par la
RNase H. Un antisens, généralement situé dans la portion codante de l’ARNm, forme un
duplex ADN:ARN qui est reconnu par la RNase H. Le clivage du brin ARN et sa
dégradation subséquente permet de réprimer l’expression génique et par ricochet,
l'expression de la protéine correspondante.
L'ADN et particulièrement l'ARN simple brin sont sensibles aux nucléases endogènes. Fritz
Eckstein fut le premier à observer l’effet de résistance aux RNases qu’offrent les
nucléosides phosphorothioates (PS) (Eckstein, 1966). Comme la substitution d’un oxygène
pour un soufre se prête bien au schéma de synthèse des ADNs, les oligonucléotides PS
constituent la première génération d’oligonucléotides modifiés. De façon intéressante, le
duplex PS-ADN:ADN est une des rares modifications qui préserve la conformation
d’hélice ADN de type B, et donc la susceptibilité à la RNase H (Nakamura et al., 1991).
Par contre, un certain nombre d’inconvénients notamment la diminution de la température
de fusion du duplex, mais plus particulièrement la liaison à des protéines de façon nonspécifique vient ternir leur réputation. La deuxième génération d’oligonucléotides fait appel
à des modifications sur le 2’-OH. La modification de type 2’-0-alkyl par de gros
groupements offre une forte résistance aux RNases alors que de plus petits groupes
favorisent le caractère ARN (forme hélice de type A) et augmentent la force de liaison du
61
duplex (Manoharan, 1999). Tous ces types de modifications sont résistants à la RNase H.
La modification de type 2'Ométhyl (2’OMe) demeure un choix populaire et représente un
excellent compromis, balançant stabilité et affinité de liaison. Outre les modifications déjà
discutées, la figure 20 présente les principales modifications explorées jusqu‘à maintenant.
Ces modifications concernent les groupements phosphates liant les oligonucléotides entre
eux (phosphoramidate et methylphosphonate (MP)), des modifications du ribose (lock
nucleic acid (LNA), morpholino, 2’Fluoro arabinose (FANA)) ou une substitution complète
du squelette ribose phosphate (peptide nucleic acid). Comme la RNase H est en mesure de
cliver un duplex aussi petit que 4 bp (Donis-Keller, 1979), les extrémités de l’antisens
peuvent être constituées de nucléotides modifiés (excepté PS) alors que la région centrale
doit être laissée sans modifications (excepté PS). C’est ce qu’on appelle des antisens de
type «gapm er» (Leech et al., 2000). Le positionnement sur l'ARNm et la chimie de
l’oligonucléotide sont donc les deux facteurs les plus influents et dirigent le mécanisme
d’action de l’antisens. L’âge d’or des antisens culmine vers la fin des années 1990 et
coïncide avec l’approbation par la Federal Drug Administration (FDA) de Vitravene™, un
antisens traitant la rétinite induite par le cytomégalovirus. Depuis ce temps, plusieurs
antisens ont été analysés en phase clinique, mais leur approbation par la FDA tarde
(Rayburn and Zhang, 2008). Un grand nombre d’entre eux sont destinés à réduire l’ARNm
de gènes impliqués dans la cancérogenèse (TP53, HRAS, BRAF, VEGF, BCL2) (Rayburn
and Zhang, 2008). Les nouvelles technologies ARN comme les small interfering RNAs
(siRNAs) et plus récemment encore les microRNAs (miRNAs) ont contribué à diminuer
l’intérêt envers les antisens.
62
o=p-s
Phosphorotluoate DMA
(PS)
O-
Méthylphosphonate
(MP)
N3*-P5’ Phosphoroa mickle
(NT'S
Locked nucleic acid
(LNA)
(2’0Me)
~Xf
B
cT^'O
i
0—p—O'
!
0.
:'-0-methvi RNA
N
o—p-o
?
= p -~ <
!
"o
o*\
<K
ÎM luoro-arabrao nucleic acid
(FANA)
Morpholino phasphorwamiciate
(MF)
Peptide nucleic acid
(PNA)
Figure 20 Structure des principaux analogues de nucleosides.
Des modifications impliquant la substitution d’un oxygène pour un soufre
(phosphorothioate), une amine (phosphoroamidate) ou un groupement méthyl
(méthylphosphonate) sur le groupement phosphate sont couramment employées pour
augmenter la résistance aux nucléases. Certaines modifications légères du ribose telles que
la protection du 2’OH par un méthyl (2’OMe) ou sa version cyclique pontant permettent
de stabiliser la conformation C3’-endo, favorable à la formation d’hélice de type A.
D'autres modifications telles l’utilisation du sucre arabinose (ANA, arabino nucleic
acid), d’une morpholine (morpholino) ou plus drastiquement la substitution du squelette
phosphoribose par un squelette peptidique (PNA, peptide nucleic acid) sont également
employées. Adaptée de Kurreck (2003).
4.2 Modulateur artificiel de Vépissage alternatif
Classiquement, l’AS est étudié in vitro à l’aide d ’extraits nucléaires. Cet extrait fournit les
facteurs d’épissage essentiels et peut être dépiété ou enrichi d’un ou plusieurs facteurs
d’épissage afin de mettre en valeur leurs rôles respectifs. Un segment du gène à l’étude
(appelé mini-gène : généralement deux 5’ss en compétition, un intron raccourci et un 3’ss
unique) est inséré dans un plasmide. Pour étudier le rôle des SRE, des portions exoniques et
introniques sont systématiquement omises, remplacées par d’autres SRE ou des séquences
contrôles. Les différentes constructions plasmidiques sont ensuite transcrites in vitro et
63
mises en présence de l’extrait nucléaire. Ainsi, plusieurs ESE et ESS ont pu être identifiés
et caractérisés dont les ASEs modèles de l’exon IIIb/c s du « fibroblast growth factor
receptor 2 » (FGFR2) (Seth et al., 2008), exon EDA et EDB de FN1 (Muro et a i, 1999) et
l’alt5’ de BCL2L1 (Garneau et al., 2005). En intégrant une séquence promotrice au lieu
d’une séquence de transcription in vitro, il est possible d’exprimer le transcrit en cellules.
De plus, il est possible de co-transfecter à la fois le mini-gène et des plasmides codant pour
des facteurs d’épissage d’intérêts et/ou des siRNAs. Par contre, le mini-gène n’est qu’une
version abrégée et il est loin de représenter l’ensemble des séquences régulatrices qui se
retrouvent parfois à plusieurs kb du site d’épissage.
Les antisens peuvent aussi agir directement sur le pré-ARNm endogène. L’utilisation de
lipides cationiques comme agent de transfection cellulaire permet leur accumulation
nucléaire (Bennett et a i, 1992). La P-thalassémie, une maladie génétique touchant le gène
de la P-globine, entraine un défaut de l’hémoglobine et se traduit par une anémie. De façon
intéressante, la majorité des mutations dans l’intron 2 de la (3-globine exposent un 3’ss
cryptique et produisent un nouveau 5’ss, favorisant l’inclusion d’un nouvel exon. Des
travaux ont démontré les capacités des antisens PS-2'OMe ciblant spécifiquement ces
transcrits mutés à rediriger l’AS vers les sites originaux (Dominski and Kole, 1993, Lacerra
et al., 2000). Les antisens exploitant ce mécanisme ont été rebaptisés SSO pour «spliceswitching oligonucleotides».
Les maladies neuromusculaires sont particulièrement touchées par des défauts de l'épissage
(Wood et al., 2010). Parmi celles-ci, l’atrophie musculaire spinale (spinal muscular
atrophy, SMA) et la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) sont les exemples les plus
étudiés. Dans le cas sévère de la DMD, ce sont des mutations non-sens causant la perte
totale de la protéine dystrophine qui sont en cause alors que la dystrophie musculaire de
Becker, forme plus légère de la maladie, génère des protéines tronquées retenant
partiellement la fonction (Muntoni et al., 2003). Ceci suggère que les patients atteints de
DMD bénéficieraient d’une stratégie favorisant l’exclusion d’exon permettant de restaurer
le cadre de lecture. En fait, la preuve de concept a été établie chez la souris et deux SSOs
sont présentement en étude clinique chez l’humain (Lu et al., 2011). Dans le cas de la
64
SMA, le gène SMN1 est normalement responsable de la production de la protéine SMN. La
sévérité de l'atrophie musculaire spinale (spinal muscular atrophy, SMA) corrèle avec le
niveau protéique de SMN. Théoriquement, le gène SMN2 pourrait substituer SMN1
puisqu’il est très similaire, mais une mutation d’un C pour un T dans l’exon alternatif 7
produit un nouveau stop codon dans l’exon 8. L ’ARNm résultant est ciblé par la voie NMD
et la quantité de protéine SMN est nettement diminuée. La stratégie consiste donc à cibler
l'exon 7 du gène SMN2 de façon à promouvoir son inclusion et ainsi restituer des taux
normaux de SMN.
Ces dernières stratégies ont demandé l’élaboration de règles pour le positionnement des
SSOs. Afin de promouvoir l’exclusion de l’exon, le SSO peut être situé à cheval sur la
jonction intron-exon (Fig. 21 A) ou exon-intron (Fig. 21B) de l’exon alternatif et interférer
avec l’assemblage de U2 snRNP ou U1 snRNP, respectivement. Il peut également cibler
une région complètement exonique (Fig. 21C) ou complètement intronique (Fig. 21D). Il
est alors postulé que le SSO masque un site ESE ou ISE, respectivement et interfère avec
des facteurs d’épissage. L’inverse est également possible, à savoir le blocage d’un ESS
(Fig. 21E) ou d’un ISS (Fig. 21F). Par contre, la prédiction bioinformatique des SREs
demeure difficile à ce jour. De plus, leur réelle contribution dans les effets de modulation
des SSOs est parfois difficile à dissocier de paramètres intrinsèques comme la longueur du
SSO et la température de fusion du duplex. Alternativement, il est possible que l’influence
du SSO se fasse sentir via le remodelage de la structure secondaire de l’ARNm (AartsmaRus et al., 2002). Bref, il est coutume de tester plusieurs SSOs afin d'en trouver un qui
module efficacement PAS (Aartsma-Rus et al., 2005).
65
A
m
-ff-wà—tzzzf—
B
11
c
_ _
" mâ—txzi—!■„"
D
-M -wêêêL _____ï —
lüfflL—-Jb b l-Æ .
\
E
F
/
■ !
- t t =
r ■■
m
—
f a ya
Figure 21 Mécanismes d’action des SSOs.
Afin de favoriser l’exclusion de l’exon, un SSO est positionné dans le but de masquer: A)
une jonction intron-exon, B) une jonction exon-intron, C) un ESE ou D) un ISE. Afin de
favoriser l’inclusion de l’exon, un SSO est positionné dans le but de masquer un E) ESS ou
F) ISS.
Conceptuellement, la stratégie du «targeted oligonucleotide silencer of splicing» (TOSS)
est attrayante. Il s’agit de promouvoir l’exclusion de l’exon alternatif en exhibant un ESS
de façon artificielle en s’appuyant sur la spécificité antisens (Villemaire et al., 2003). Le
TOSS est donc un oligonucléotide bifonctionnel possédant une portion antisens
complémentaire à l’exon alternatif ciblé et une portion non-hybridante reconnaissant la
protéine hnRNPAl (Fig. 22). Plus précisément, il s’agit de deux séquences de haute affinité
pour le facteur d’épissage ubiquitaire hnRNPAl (Burd and Dreyfuss, 1994). La preuve de
concept a été réalisée en ciblant le pré-ARNm endogène de BCL2L1 dans plusieurs lignées
cellulaires cancéreuses humaines. La généralité de ce concept (cible, type d’ASE) n’est
toutefois pas connu
66
Portion tail
reconnaissant
hnR N P A l
5’
3’- NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNQy
AGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAG
Portion
Antisens
Figure 22 Anatomie d’un TOSS.
Le TOSS est un oligonucléotide bifonctionnel dont tous les nucléotides ont subi des
modifications de type 2’OMe. Les 20 premiers nucléotides en 5’ comprennent deux sites de
haute affinité (surlignés) pour le facteur d’épissage hnRNPAl. Les 20 derniers nucléotides
constituent le domaine reconnaissant spécifiquement l’exon Ciblé.
4.3 siRNAs isoforme-spécifique
Les siRNAs sont une classe de petits ARNs régulateurs de l’expression génique. Ce sont
des duplex d’ARN d’environ 20 bp qui s’associent au RNA-induced silencing complex
(RISC) et permettent ultimement la dégradation spécifique d’ARNm cible (aussi appelée
RNA interference, RNAi). Une fois introduit dans le complexe, le brin dont l’extrémité 5’
est la plus instable thermodynamiquement est sélectionnée comme guide (antisens). Le brin
passager (sens) est alors clivé entre les nucléotides 10 et 11. Le complexe RISC ainsi
chargé induit le clivage de l’ARNm apparié en trans dans le cytoplasme. Le RISC relâché
peut à nouveau cliver un ARNm et ainsi permettre la répression efficace du gène (Fig. 23).
Initialement, la biogénèse des petits ARNs double-brins semblait provenir principalement
de sources d’ARN exogènes virales, suggérant un rôle prépondérant dans les mécanismes
de défense de l’hôte. Plus récemment, des sources endogènes de siRNAs ont été
découvertes chez les animaux (Okamura and Lai, 2008). Les composantes du RISC, soit
Dicer et les protéines Argonautes, ainsi que des partenaires d’interaction comme R2D2 se
retrouvent dans les cellules humaines somatiques et germinales.
67
\
" x îo o iy :
—
^
(
Pri-miRNA
Pre-miRNA
Nucleus
dsRNA
Cytoplasm
TmtwT'm
pæ miRNA
Dicer processing
and RiSC loading
SiRNA
I
>v
Î
X
*m#
f»
a.
£*
RISC passenger-strand
cleavage (siRNA) or
unwinding (miRNA)
<
CL
Z
oc
RISC activation
mRNA
ItOlmRNA
P 'b o a y
Figure 23 Mécanisme d’action des siRNAs.
Les siRNAs sont des petits ARNs double-brins d'environ 20 bp dont les extrémités
flanquantes en 3’ sont de 2 nt. Les siRNAs exogènes empruntent la voie des micro-ARNs
(miRNAs) pour dégrader spécifiquement des ARNms au cytoplasme. Les siRNAs sont
incorporés au complexe RISC. La complémentarité parfaite du duplex ARN:ARN est
reconnue et AG02 clive le brin sens de telle sorte que le brin antisens demeure dans le
complexe RISC. Celui-ci s'hybride alors sur sa cible et dirige le clivage de l'ARNm cible.
Le RISC relâché peut à nouveau cliver un ARNm et ainsi permettre la répression efficace
du gène. Tirée de (de Fougerolles et al., 2007).
Les règles de dessin de siRNA ciblant un exon alternatif sont les mêmes que ceux ciblant
un exon constitutif, excepté que la séquence est restreinte. La problématique entoure plutôt
le dessin de siRNA spécifique à l’isoforme court et s’apparente à la problématique associée
au dessin d’amorce-jonction: la seule séquence propice au dessin concerne la jonction
68
exon-exon unique à 1’isoforme court (Fig. 24A). Par contre, les requis conférant la
spécificité de la Taq polymérase et du complexe RISC diffèrent largement, affectant
conséquemment les règles de dessin. En général, la fenêtre de dessin d’un siRNA est
restreinte à la séquence comprise dans le cadre de lecture en omettant les jonctions, soit de
~ 200 à 10 000 nt (Birmingham et al., 2007). Des études ayant pour but de concevoir des
règles de dessin de siRNAs discriminant des séquences ne différant que par 1 nucléotide
ont révélé l’importance de l’intégrité d’une hélice ARN de type A pour le clivage de
l’ARNm cible. Ainsi les mésappariements les plus susceptibles de la distortionner, les
mésappariements purine:purine, sont effectivement les plus discriminants (Huang et al.,
2009, Schwarz et al., 2006). Outre l’identité de la paire de bases en mésappariement, la
position de celle-ci joue également un rôle clé. Un mésappariement impliquant l’une ou
l’autre des deux bases au site de clivage (position 10 et 11), la portion 3’ du brin guide ou
sa portion 5’ (seed) réduit drastiquement, de façon importante ou intermédiaire l’effet de
répression, respectivement (Fig. 24B). De plus, l’étude systématique de toutes les
combinaisons de double mésappariement pour un siRNA donné indique que 35% des
siRNAs procurent tout de même une répression de plus de 50% (Dahlgren et al., 2008). En
résumé, un seul mésappariement n’est pas suffisant pour empêcher l’action du RISC, à
moins que celui-ci soit en position 10 ou 11.
B
uRNAstructure
Doubl»
ovwtung
Double
oerhang
°
Cteivage
sit«
S«ed region
Passenger or
69
Figure 24 Utilisation de siRNAs spécifiques à l’isoforme court (siRNA court).
A) Cibler la jonction exon-exon unique à l’isoforme court avec un siRNA. B) Anatomie
d’un siRNA: Les siRNAs sont des petits ARN double-brins de 19 bp. Chaque brin
comporte une portion flanquante de 2 nt en 3’. La numérotation de la position se fait du 5’
(position 1) vers le 3’ (position 19) sur le brin antisens. La région « seed » s’étend de la
position 2 à 8 et confère la spécificité du siRNA. Les nucléotides 10 et 11 aux abords du
site de clivage doivent absolument être pairés pour que le clivage ait lieu.
Tout comme les antisens classiques (dépendants de la RNase H), une des applications
intéressantes des siRNAs demeure la possibilité de cibler théoriquement n’importe quel
ARNm et de mettre de l’avant des études fonctionnelles reliant la répression d’un gène et sa
fonction. Théoriquement, il est possible de disséquer la fonction potentielle de chacune des
isoformes d’un gène. Toutefois dans la majorité des études, le siRNA cible l'ensemble des
transcrits, ne permettant pas de révéler les potentielles caractéristiques propres à chaque
isoforme. Lorsqu'une seule des isoformes est ciblée, elle n'est que très rarement comparée
avec la répression spécifique d’une autre isoforme du même gène ou encore ciblant
globalement tous les transcrits du gène. Les modulateurs d’AS offrent la possibilité d ’aller
plus
loin en explorant la contribution d’un changement de ratio d’isoformes
indépendamment de l’impact sur l’expression globale.
70
OBJECTIFS DE CETTE THÈSE DE DOCTORAT
La cancérogenèse modifie l'expression et la maturation des ARNm, qui sont normalement
finement régulés par divers mécanismes, y compris Fépissage alternatif. Bien que plusieurs
exemples ponctuels de dérégulation d’isoforme de l’épissage aient été répertoriés,
l’ampleur de cette dérégulation et la fonction associée à ces isoformes demeure mal
comprise à ce jour. Nous émettons donc l’hypothèse selon laquelle certaines isoformes de
l’épissage alternatif ont des fonctions clés dans le processus de cancérogenèse. En
exploitant des échantillons humains provenant de tumeurs ovariennes et des répressions
transitoires par RNAi dans des lignées cancéreuses ovariennes, nous avons cherché à
comprendre l’impact de l’épissage alternatif dans le processus de cancérogenèse.
Pour déterminer le rôle des isoformes de l’épissage alternatif dans le cancer de l’ovaire,
nous avons d’abord développé des méthodologies générales et à haut débit permettant de 1)
quantifier les isoformes de l’épissage dans les tissus fixés et de 2) reprogrammer l’épissage
de gènes endogènes in cellulo. Puis, nous avons exploité ces méthodologies afin de 3)
déterminer la fonction anti-apoptotique d’isoformes associées au cancer de l’ovaire et de 4)
identifier un programme d’épissage dans le microenvironnement des tumeurs ovariennes.
71
MÉTHODOLOGIES ET RÉSULTATS
Chapitre 1
High-throughput quantification of splicing isoforms
Auteurs de l’article: Brosseau JP, Lucier JF, Lapointe E, Durand M, Gendron D, GervaisBird J, Tremblay K, Perreault JP et Elela SA.
Statut de l’article: Publié, RNA2010;16(2):442-9
Avant-propos
Figure 1. JPB et JFL ont élaboré la figure A à D. JFL a produit les résultats en E
Figure 2. JPB et DG ont effectué les expériences PCR. JPB a analysé les résultats. JPB et
JFL ont produit la figure
Figure 3. JFL (95%) et JGB (5%) ont conçu l’algorithme de prédiction RASE. JPB et JFL a
dessiné la figure.
Table 1. JPB et MD ont effectué les expériences PCR. JPB a analysé les résultats.
Table 2. JFL a produit les résultats
Table 3. JPB et EL ont effectué les expériences PCR. JFL a produit un module d’analyse
pour valider les amorces. JPB a analysé les résultats.
Matériel suppplémentaire :
Interface web : JFL a produit un interface web pour le dessin d ’amorce selon RASE.
Fig S 1. JPB a effectué les expériences PCR. JPB et KT ont analysé les résultats. JPB et JFL
ont produit la figure.
Fig S2. JFL et JPB ont produit et analysé les résultats.
Table SI. JPB et DG ont effectué les expériences PCR. JPB a analysé les résultats. JPB a
produit la table.
Table S2. JPB et MD ont effectué les expériences PCR. JFL a fourni des résultats. JPB a
produit la table.
Table S3. JPB a produit la table.
Table S4. JPB et JFL ont produit la table
Supervision : KT, JPP et SAE
Ecriture : JPB a écrit le brouillon. SAE, JPB, JPP et JFL ont participé à la révision de toutes
les version subséquentes du manuscript.
72
Mise en contexte
La cancérogenèse modifie l'expression des ARNm et nous émettons l’hypothèse selon
laquelle certaines isoformes de l’épissage alternatif ont des fonctions clés dans le processus
de cancérogenèse. Bien que des exemples ponctuels supportant la modification de
l'expression de certaines isoformes dans les tumeurs solides ont été rapportés, il est
présentement difficile de connaître l’impact de l’épissage alternatif à l’échelle du génome
puisque leur quantification est laborieuse par les techniques actuelles. Pour y remédier,
nous avons réussi à établir une méthodologie à haut débit basé sur le PCR quantitatif nous
permettant d’amplifier spécifiquement les isoformes de l’ensemble des événements
d’épissage de la base de donnée NCBI RefSeq 36, soit 3323 événements.
Les travaux présentés dans ce chapitre ont pour but de démontrer que 1) Le design rationel
d’amorce PCR iso forme-spécifique est possible en exploitant une condition PCR
universelle; 2) la détection isoforme-spécifique est possible même en utilisant de l’ARN
total provenant de tissus fixés.
Résumé
La plupart des ARNs messagers sont épissés alternativement et plusieurs de ces iso formes
sont reliés à des pathologies humaines. Par contre, la contribution de ces événements
d’épissage alternatif au développement de conditions pathologiques demeure incertaine.
Comme l’apport de l’épissage alternatif au diagnostic et au pronostic devient de plus en
plus reconnu, il est d’autant plus pertinent de développer des méthodologies rigoureuses
afin de quantifier les isoformes de l’épissage à partir d’échantillons cliniques. Dans cet
ouvrage, nous présentons la procédure RASE (Real-time PCR Annotation of Splicing
Events) qui permet l’identification d’un grand nombre d’événements d’épissage dans les
tissus. RASE est en mesure de dessiner des paires d’amorces PCR pour 81% de l’ensemble
des événements d’épissage alternatif de la base de données de NCBI 36. Effectivement, la
plupart de ces amorces PCR permettent une amplification spécifique à partir d’ARN
73
provenant de lignées cellulaires ou de tissus fixés par le formaldéhyde. Avec cette
méthodologie, il est maintenant possible d’identifier rapidement le patron d’épissage
alternatif de tissus ou de valider les résultats issus d’autres méthodes telles que le
séquençage à haut débit ou les micropuces à ADN.
74
Article I: High-throughput quantification of splicing isoforms
Abstract
Most human messenger RNAs (mRNAs) are alternatively spliced and many exhibit
disease-specific splicing patterns. However, the contribution of most splicing events to the
development and maintenance of human diseases remains unclear. As the contribution of
alternative splicing events to diagnosis and prognosis is becoming increasingly recognized,
it becomes important to develop precise methods to quantify the abundance of these
isoforms in clinical samples. Here we present a pipeline for Real-time PCR Annotation of
Splicing Events (RASE) that allows accurate identification of a large number of splicing
isoforms in human tissues. The RASE automatically designed specific primer pairs for 81
% of all alternative splicing events in the NCBI build 36 database. Experimentally, the
majority of the RASE designed primers resulted in isoform-specific amplification suitable
for quantification in human cell lines or in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) RNA
extract. Using this pipeline it is now possible to rapidly identify splicing isoform signatures
in different types of human tissues or to validate complete sets of data generated by
microarray expression profiling and deep sequencing techniques.
75
Introduction
In eukaryotes, increased protein diversity is achieved by the alternative splicing of premRNA whereby a single gene can generate several splicing isoforms coding for proteins
with different functions (Fig. 1A). Nearly all multi-exon human genes are believed to be
alternatively spliced and point mutations in splice sites are responsible for at least 15 % of
all annotated genetic disease-causing mutations (Venables, 2006; Wang et al., 2008).
Studies of alternatively spliced isoforms in vitro suggested that splicing modifies gene
function and changes in splicing pattern have been linked to specific diseases (Tazi et al,
2009; Venables, 2006). However, understanding the function and association of splicing
isoforms with cellular phenotypes and pathology is limited by the logistics of detecting
tissue or disease-specific splicing patterns (Nagao et al., 2005; Ni et al., 2007; Pan et al.,
2008). We have recently demonstrated widespread alternative splicing changes in rare
frozen tumor samples with high enough RNA quality for end-point PCR characterization
(Klinck et al., 2008; Venables et al., 2008). However due to degradation and sample
preservation induced chemical modifications (i.e. formalin-fixed, paraffin-embedded
(FFPE) storage), there is a point at which the average length of intact extracted mRNAs
become too short for this type of end-point analysis; most clinically defined samples are
archived in FFPE blocks (Farragher et al., 2008; Koch et al., 2006; Oberli et al., 2008). In
theory, real-time PCR could circumvent this problem as amplicon length is not dependent
on the size of the alternative exon.
Difficulties in producing high specificity splice-sensitive primers to quantify the expression
of splicing isoforms using real-time PCR have severely limited the quality and feasibility of
genome-wide data sets. The specificity of a PCR reaction depends on accurate
identification of a sequence that can distinguish between different splicing isoforms. In
real-time PCR reactions using the intercalating SYBR Green dye as an indicator for DNA
amplification (Morrison et al., 1998) (a method favored because of its relatively low cost),
the long splicing isoform is specifically amplified by using one primer in the alternative
exon and an opposing primer in a constitutive exon (Fig. I B).
76
On the other hand, the amplification of the short splicing isoform is achieved by a
boundary-spanning primer (BSP) (Yang and Le, 1994) hybridizing to the sequence
encompassing the exon-exon junction with the opposing primer in a constitutive exon (Fig.
1C). Theoretically, the BSP strategy should provide unbiased amplification of short
splicing isoforms (Yang and Le, 1994; Vandenbroucke et al., 2001). In practice, achieving
iso form-specific amplification using the BSP strategy is challenging (Walton et al., 2007).
Mispriming due to perfect matching between either the 5’ or 3’ end of the BSP to the long
splicing isoform often results in erroneous amplification and thus reduces the fidelity of
specific splicing isoforms detection (Fig. ID). This is particularly important if the
amplicons generated by mispriming cannot be separated from the correctly primed product
by gel electrophoresis (see Fig. 1C and ID MP 5’). So far, no general rule for the design of
BSPs has been established (Bracco et al., 2006; Walton et al., 2007; Williams et al., 1999)
and experimentally testing the fidelity of BSPs using interference tests (Vandenbroucke et
al., 2001) (amplification from mixed templates containing a fixed amount of the long
isoform with serially diluted amounts of the short isoform) or the Wellman method
(Wellmann et al., 2001) (amplification of fixed amount of long isoform template) is a
costly and time-consuming process. Experimental validation of PCR primers is particularly
unsuitable for high-throughput quantitative analysis since each primer set has to be tested
and optimized individually.
/
Input Gene
77
“\
m
G ene selectio n
R eference sequence d a ta b a se
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Long splicing isoform
Short splicing isoform
it
T argettable Splicing E vents
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PCR
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Single c a sse tte exon
Alternative 5‘ splice site
Alternative 3‘ spuce site
Intron retention
—
4099
Primer D esign
Com parison of splicing isoforms se q u en c es
Evaluation of mispriming potential
Limitation of product size to < 100 bp
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PCR
3
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MP 3'
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PCR
a
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Primer quality
Specific amplification of the targeted isoform
—-*► 8 5 %
MP 5’
Figure 1 Problems associated with the detection of alternative splicing isoforms.
(A) Alternative splicing of a single cassette exon (gray box) generates two isoforms
differing by one exon. (B) Strategy for specific amplification of the long splicing isoform.
The cDNA is amplified using primers specific to the alternative (gray arrow) and the
constitutive (black arrow) exons. (C) Strategy for specific amplification of the short
splicing isoform. The cDNA is amplified using a boundary-spanning primer (BSP, gray
arrow) and an opposing primer hybridizing to a constitutive exon (black arrow). (D)
Mispriming is often caused by lack of complementarities between the alternative exon and
either the 3’ (MP 3’) or 5’ (MP 5’) ends of the BSP on the long splicing isoform. (E)
Summary of the RASE pipeline. In this study genes were selected based on the evidence of
alternative splicing (NCBI 36.2 database) and the nature of the splicing events.
In this study we defined the primer design rules necessary for the specific amplification of
splicing isoforms and integrated them into a pipeline for Real-time PCR Annotation of
Splicing Events (RASE). The RASE allows rapid and accurate quantification of a large
number of splicing isoforms in both human cell lines and FFPE tissues. As summarize in
figure IE, RASE successfully designed 3322 isoform-specific primer sets, representing 81
% of simple alternative splicing events of the NCBI human genome database (build 36)
78
(Pruitt et al., 2007) Our freely accessible web-interface provides access to RASE and
allows automatic definition of target splice sites and the identification of pre-optimized
primers that function under universal PCR conditions http://designs.lgfus.ca. The design
process was validated experimentally using 51 alternative splicing events and 254 different
primer sets
79
Results
Evaluation of essential BSP design parameters
In order to determine the key design parameters that define successful splicing isoform
discrimination, we first analyzed the BSP features contributing to mispriming due to its 3’
end complementary to both splicing isoforms. A training set of BSPs with systematically
increasing 3’ end portions (3 to 15 nucleotides) perfectly matching both isoforms were
designed and tested experimentally on four different alternative splicing events (Fig. 2 and
Suppl. Table 1). Briefly, the quantification of the mispriming potential of BSPs was done by
looking at the capacity of a BSP to amplify a template containing the putative mispriming
site (long isoform-specific splice site), compared to a second reaction with a perfectly
matching primer set (long-specific primer pair, LSPP) as a reference. Using this test, some
BSPs showed amplification in the presence of the long splicing isoform template. However,
these unspecific amplifications due to mispriming were detected very late (high Ct) when
compared to values obtained with the long-specific primer pair. We hypothesized that this
low amplification level might be induced by the unnaturally high amount of template
included in these artificial reactions. Therefore, we conducted tests to further evaluate BSP
specificities in typical real-time PCR experiments. The results indicated that BSPs resulting
in a ACt >16 can accurately discriminate between the different splicing isoforms (Suppl. Fig.
1). Using this strict cut-off limit, we found that 7-8 consecutive base pairs (Tm= 6 °C) is the
maximal number tolerated at the primer’s 3’ end to keep mispriming to a minimum level
(Suppl. Fig. 2). We generalize this rule design by testing a BSP validation set targeting 36
different short splicing isoforms carrying a 3’ end portion with a Tm lower than 6 °C. All
BSPs succeeded in giving specific amplification (Suppl. Table 2).
80
4000
20
25
30
35
40
45
50
Cycle
Figure 2 Systematic tiling of BSPs across an exon-exon junction.
BSPs harboring 15, 13, 11 and 9 bp complementarity to BCAS1 long splicing isoform in
their 3’ end show amplification curves while those with 8, 7, 5, 3 bp or no template controls
show no amplification. AIR and DCS stands for alternatively included region and
downstream constitutive sequence, respectively.
81
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IM
Q J02
Figure SI BSP specificity in typical qRT-PCR experiment
(A, left part) The test consists in a real-time PCR reaction containing the putative shortspecific primer pair (SSPP) and an excess of the long splicing isoform amplicon (red
curves). This reaction is compared to a second reaction measuring the long splicing isoform
amplicon input (green curves). Ideally, Ct values from red curves should be infinite,
demonstrating complete specificity. (A, right part) The interference test consists of real­
time PCR reactions on two serially diluted short isoform template: One in the absence (red
curves) and one in the presence (blue curves) of a fixed amount of long splicing isoform
amplicon corresponding to a Ct value of -19. Ideally, amplification efficiencies should be
identical, demonstrating complete specificity. (B) Summary of the BSPs specificity by our
test and the interference test. BSPs were considered specific when they produced a ACt of
16 or more in both reactions in our test. Note that ‘GOOD’ and ‘BAD’ examples
corresponds to NRG1 and PTPRB, respectively.
82
Evaluation of BSPs’ maximal 3' end Tm
20 «
Minimum
in BSP test
ACt = 16
AXIN1
BTC
PCSK6
BCAS1
-<■
5«
BSP 3* end T|^
Maximum
3’ end Thn= 6 "C
Figure S2 Evaluation of BSP’s maximal 3’ end Tm
BSPs for four different alternative splicing events featuring 8 to 15 bp in their 3’ end
matching both splicing isoform amplicon were submitted to our test as described previously
for supplementary figure 1. A linear regression of all AXIN1 points predicts the maximum
3’ end Tmto be 6 °C.
To determine the rule design that eliminate the mispriming due to 5’ end perfect match on
both splicing isoforms, we designed 59 different BSPs possessing a variety of mismatches
combinations on 49 alternative splicing events (Table 1 and Suppl. Table 3). BSPs were
challenged in a real-time PCR reaction using a reference cDNA, representing virtually all
splicing isoforms (Universal Human Reference RNA, UHRR), and were found specific if
no detectable product fall in the range expected if mispriming on the long splicing isoform
would occur. We found that a C/T, A/C or G/T as 3’ end terminal mismatch did not
discriminate well the long and short splicing isoform. In contrast, G/G, A/A, T/T, C/C and
G/A as well as any two consécutives mismatches toward the long splicing isoform were
highly specific for the short splicing isoform amplification (Table 1). Together, these
experiments led to the conclusion that a BSP must carry no more than 7-8 nucleotides fully
83
complementary and the inclusion of one terminal mismatch (G/G, A/A, T/T, C/C or G/A)
whenever possible two, toward the long splicing isoform to be truly short isoform-specific.
Tableau 1 Comparison between the specificity of the boundary-spanning primers
carrying different 3’end mismatches.
The specificity of 59 putative SSPPs carrying one or two mismatches with the long isoform
was challenged by using a reference cDNA containing all splicing isoforms. The specificity
score corresponds to the number of BSP that specifically amplify the targeted isoform for
each mismatch type.
Mismatch type
Specificity score
One 3' end terminal
C/T
4 on 7
A/C
5 on 6
G/T
2 on 11
A/G
7 on 7
G/G
2 on 2
C/C
3 on 3
A/A
4 on 4
T/T
7 on 7
Two terminal
Any
12 on 12
Automated splice site identification and primer design
The first step to detect any splicing isoform is to identify the alternative splicing event and
the unique sequence surrounding it. Therefore, we developed the RASE pipeline which
starts with a computational search tool that queries publicly available sequence databases
for either individual or all alternative splicing events simultaneously and identifies the
upstream constitutive sequence (UCS), the alternatively included region (AIR) and the
downstream constitutive sequence (DCS, Fig. 3A). As shown in figure 3B in step 1 to 4,
the algorithm described in the “Methods” section calculates the similarities of the
sequences found around the alternative splicing event to retrieve all BSP 3’ end sequences
possessing adequate length and mismatches toward the long splicing isoform. Then, the
best sequence is extended in its 5’ end and an opposing primer is designed to generate an
amplicon that ranges in length between 70 and 100 bp (Fig. 3B, step 5 and 6). The long
isoform-specific primer (LSP) was designed within the AIR (Fig. 3C). Out of 25011 genes
in the NCBI build 36 database, RASE generate specific pairs of primers for 4099 simple
84
alternative splicing events, which corresponds to 81% of the events, regardless of the event
type (i.e., single cassette exon, alternative 5’ and 3’ splice site and intron retention, Table
2). Specifically in the case of single cassette exons, the most frequent type of events, the
design success rate reached 87 %. Conversely, in the case of alternative 3’ splice sites, the
success rate was limited to 62 %, the lowest level observed.
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UCS
DCS
UCS
UCS
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1
85
Figure 3 Strategy for automated selection of high fidelity splice sensitive PCR primers.
(A) The first stage involves the identification of the upstream constitutive sequence (UCS),
alternatively included region (AIR) and downstream constitutive sequence (DCS) in all
simple alternative splicing events types; single cassette exon, alternative 5’ and 3’ splice
site and intron retention. (B) The second stage generates primer sequence to quantify the
short isoform of any given alternative splicing event. The schema in upper right, shows
regions that are expanded on both side of junctions. Black arrows indicates the orientation
of the nucleotide-by-nucleotide comparison use in step 1 and 2. In Step I: the script identify
the stretch of matching nucleotides between short and long splicing isoforms and the 5’ end
of the BSP in both orientation (BSP 5’ end similarity). Step 2: the script analyzed the
sequences for the presence of mismatches in terminal 3’ end toward the long splicing
isoform. (BSP 3' end similarity). Step 3: Sequences identified in step 1 and 2 are merged.
Sequences with a Tm > 6 °C are removed from the valid sequence list. Step 4\ Sequences
are sorted by mismatches number and by Tm. Step 5: An in silico 5’ end extension is
performed on the best sequence until adequate nucleotide composition. Step 6: The script
designs an opposing primer for the BSP yielding a SSPP (short-specific primer pair). (C)
The third stage generates primer sequence to quantify the long isoform of any given
alternative splicing event. The extended space design for the long-specific primer is
highlight in red (forward) and blue (reverse).
Tableau 2 Summary of the primer design data generated by RASE.
Splice-sensitive primers were designed for 4099 simple alternative splicing events (e.g.
single cassette exon, alternative 5’ and 3’ splice site, intron retention) out of 25011 genes
present in NCBI build 36. Primer specific to the short splicing isoform (SSPP). Primer
specific to the long splicing isoform (LSPP).
Number of alternative
Alternative splicing
Primer type
Design
splicing event
event type
success rate
(%)
2274
Single cassette exon
604
Alternative 5' splice site
642
Alternative 3’ splice site
579
Intron retention
4099
All splicing event
SSPP
LSPP
SSPP + LSPP
SSPP
LSPP
SSPP + LSPP
SSPP
LSPP
SSPP + LSPP
SSPP
LSPP
SSPP + LSPP
SSPP
LSPP
SSPP + LSPP
90
97
87
89
85
76
89
70
62
85
99
84
89
91
81
86
Experimental validation of RASE primers
To evaluate the fidelity of the RASE we experimentally tested a set of primers targeting 51
cancer-specific alternative splicing events (Klinck et al., 2008; Venables et al., 2008). As
much as three different primer designs for the long and short splicing isoforms of each gene
were generated and examined (Table 3). The evaluation process consisted of a single test
that looks at the primer capacity to amplify the targeted sequence in a cDNA from a
reference RNA (UHRR). The primers were disqualified if they resulted in non-specific
amplifications, abnormal amplification curves or the formation of primer-dimers when
amplified in the presence of cDNA containing both splicing isoforms. Additionally, an
efficiency curve was performed as described earlier (Nolan et al., 2006a). The results
indicate that an average of 85 % of the cases, at least one of the three primers set designed
for each splicing isoforms specifically amplified the targeted amplicon. Primers failed
either due to dimerization or the amplification of unspecific sequence. Interestingly, only
one primer set was completely inactive and spiking a synthetic template in UHRR cDNA
shows specific amplification of this inactive primer set. All together, it demonstrates that
UHRR cDNA is representative of almost all splicing isoforms investigated so far. As low
as three putative primer sets specific to the short splicing isoform misprimed on the long
version, a BSP specificity success rate of 94 %. All validated primer pair were tested in a
cDNA derived from a pool of RNA extracted from FFPE tissues. Most of the primer pairs
tested specifically amplified the targeted splicing isoform. Therefore, we conclude that
amplification of splicing isoforms is possible from both cell lines and FFPE tissues using
the RASE.
87
Tableau 3 Experimental validation of RASE designed primers.
Putative splice-sensitive primers designed by RASE were tested in a cDNA derived from
Universal Human Reference RNA (UHRR). Primer set yielding the expected band size,
purity and efficiency were classified as “Validated”. Alternative design was tested for
primers failing to specifically amplify the targeted isoform. Cumulative results are shown
as a % out of the total 51 primer pair tested. Primers were also tested for the amplification
of cDNA derived from FFPE RNA extract and the results are presented as a % out of the 40
SSPP and 47 LSPP tested.
FFPE pool
UHRR
Design
1
3
2
(%)
(%)
(%)
(%)
SSPP
Validated
70
76
78
83
Multi-band
16
16
16
2
4
4
4
Primer-dimers
0
2
No amplicon
2
0*
15
8
Bad efficiency
2
2
0
LSPP
Validated
75
88
92
83
4
Multi-band
2
2
2
Primer-dimers
19
10
6
0
No amplicon
0
0
0
15
2
Bad efficiency
0
0
0
88
Discussion
Quantitative real-time PCR, the current gold standard in mRNA quantification, has been
only marginally used for the quantification of splicing isoforms. This is probably because
the majority of software packages either cannot design splice-sensitive primers or design
primers
with
low
or
unverified
specificity
https://www.genscript.com/ssl-bin/app/primer
or
(e.g.
http://www.premierbiosoft.com.
http://wwwl.qiagen.com).
Another
important reason is that current packages do not take into account the high degree of
similarity between the exon-exon junction sequences of differentially spliced mRNAs.
In this study we circumvented these caveats by developing RASE, a pipeline that can
directly identify and retrieve alternative splicing information from any public database and
design primers that are specific to either the short or long splicing isoforms. To
discriminate between two closely related sequences, we took advantage of Taq DNA
polymerase requirements to prime PCR reaction: the overall duplex stability and the 3’ end
pairing. Numerous independent researchers addressed the minimal number of mismatches
and position required to specifically amplified unique splicing isoforms, but depending on
the exact experimental setting used, different conclusions were reached (Ayyadevara et al.,
2000). Here, we revisited this question by performing a comprehensive coverage on
multiple primer/template combinations. Requiring one, and whenever possible two,
terminal mismatches to the non-cognate sequence and at most 8 nucleotides of
complementarity to the cognate sequence at the 3’ end were critical parameters since they
allowed the largest coverage of designs in terms of the numbers of alternative splicing
events while retaining the high specificity required for real-time PCR splicing isoform
quantification. This automatic primer design provides ready-to-use primers for the robust
detection of splicing isoforms in days, something that previously took months to determine
using classical methods that required cloning of each splicing isoform, experimental testing
of individual primers and manual adjustments of mismatch number and annealing
temperature (Vandenbroucke et al., 2001;Walton et al., 2007; Williams et al., 1999). In
addition, we have extended universal primer design capacity to the quantification of
splicing isoform in fixed tissues. RNA extracted from FFPE blocks is of very poor quality,
which put the reliability of quantification in FFPE tissues in question (Farragher et al,
89
2008). Numerous parameters affecting raw Ct values were identified and reported and
proper normalization and adequate amplicon size were shown to dramatically increase the
quality of the data obtained from clinical samples (Abrahamsen et al., 2003; Antonov et al.,
2005; Cronin et al., 2004). In this study, RASE designed 3322 primer sets with suitable
amplicon size to quantify in fixed tissues, making it the first standardized primer design
process capable of quantifying splicing isoforms in formalin-fixed, paraffin-embedded
(EEPE) tissues. The difficulty in splice-sensitive primer design and validation also
significantly impaired the quality of large data sets obtained from techniques such as tiling
arrays (Castle et al., 2008) splicing arrays (Calarco et al., 2007), and deep sequencing (Pan
et al., 2008). In all cases, few splicing isoforms were validated by a secondary approach
and an even lower number have been screened in large patient cohorts to confirm their
disease association. Since RASE guarantees isoform specificity and provides pre-optimized
primers working under universal PCR conditions, it makes high-throughput annotation and
validation of splicing isoforms feasible.
The goal of the present study was to build a pipeline for isoform-specific quantification in
clinical samples using real-time PCR. To achieve this goal we built the RASE (Real-time
PCR Annotation of Splicing Events) platform to eliminate tedious and time-consuming
steps associated with primers validation and streamline the amplification process. The key
features of RASE includes automated nucleotide by nucleotide genome-wide analysis of
splicing isoforms and the evaluation of primers based on experimentally validated strict
criteria allowing amplification under universal PCR conditions. The outcome of RASE is
stored in the form of database of ready to use isoform-specific primer sequences for most
alternative splicing events in the NCBI build 36 database (available upon request). In
addition, custom primer design is also possible using publically available web-interface.
Using these tools it is now possible to design and conduct large-scale quantitative surveys
of splicing isoforms in cell lines or archival samples, paving the way towards a greater
understanding of the contribution of alternative splicing to complex human diseases such as
cancer.
90
Materials and methods
Splicing isoform-specific primer design. An application programming interface (API) and
executable computer assisted scripts capable of designing isoform-specific primer pairs
were developed using Perl version 5.8.8 (the Perl directory http ://w ww .peri, or g/1 with
CP AN modules (CP AN: Comprehensive Perl Archive Network http://cpan.org/) and the
gene
annotation
databases
were
stored
using
a
MySQL
database
server
http://www.mysql.com/. The design scripts can be called using a list of alternative splicing
events described in a tab-delimited file. Batch design of the whole NCBI build 36 human
annotation database (Pruitt et al., 2007) takes about 10 days on an average PC. Initially,
transcripts associated with any given gene were retrieved from the database and the
alternative splicing events (cassette exon, intron retention, alternative 3' splice site and
alternative 5' splice site) were identified using an algorithm similar to that used by
ASTALAVISTA (Foissac and Sammeth, 2007).
Prior to design SSPP, the script determines if a BSP orientation must be impose based on
the desired splicing event. To do so, it verified if the 3' end of the UCS or the 5’ end of the
DCS undergoes alternative splicing in other transcripts. If only the 3' end of the UCS did,
the script imposed the BSP to be the forward primer. Conversely, the BSP has to be the
reverse primer if only the 5' end of the DCS undergoes alternative splicing. In the case
where both undergo alternative splicing, the design was aborted. For the alternative splicing
events where no orientation was imposed, the chosen one was based on the following rules.
To determine 5' end similarity, the script compares, on a nucleotide-by-nucleotide basis, the
sequences found at the 3' ends of the AIR and UCS, and 5' ends of the AIR and DCS. If the
nucleotides are the same, iteration was performed on the next nucleotides of these regions
until a difference was reached for each orientation. The number of identical nucleotides
represents the 5' end similarity of the BSP (Fig. 3B, step 1). Next, RASE analyzed the
number and position of mismatches in terminal 3’ end by an algorithm similar to the one
use to determine the BSP 5' end similarity. All sequences with two consecutive terminal
mismatches or one strict terminal mismatch (A/A, T/T, C/C, G/G or G/A) were kept (Fig.
3B, step 2). Then, the sequences were extended in their 5’ end using the BSP 5’ end
91
similarity previously identified. The Tra of each sequence was calculated and all sequences
with Tm greater than 6 °C were rejected (Fig. 3B, step 3). The remaining sequences were
sorted: 1) Higher number of mismatches 2) Lower Tm (Fig. 3B, step 4). Afterwards, the
scripts iterated through the sequence list and expended the sequence using the 3' end of the
UCS or the 5' end of the DCS for forward or reverse BSP, respectively, until an adequate
Tmof 58 - 62 °C (optimal Tm = 60 °C), a GC content between 30-80 % (optimal 50 %) and
a maximal length of 30 nucleotides (minimum 18 nucleotides) were reached (Fig. 3B, step
5). Then, an opposing primer was designed using Primer3 (Rozen and Skaletsky, 2000)
with the default parameters excepted for the aforementioned Tm, GC content, primer length
parameters and the maximum Tm difference between primers was reduced to 3 °C. The
primer pair was scored for having no in silico off-targets (all possible amplification
products with a size smaller than 500 bp were considered as possible in silico off-targets
and were associated to the primer pair design when calling wublast (Gish, 1996-2003) or
NCBI blast (Altschul et al., 1997) as a script parameter on an in-house transcript database
based on the Aceview annotation (Thierry-Mieg and Thierry-Mieg, 2006), for giving low
primer pair penalties according to Primer3 and no mispriming when checked against the
Primer3 human mispriming library (Fig. 3B, step 6).
The LSPP design is described in figure 3C. To design long-specific primer (LSP), an
extended space design of 10 nucleotides outside the AIR was allowed according to the LSP
orientation. If the LSP was a forward, the space design consists of the AIR and the last 10
nucleotides of the UCS, allowing it to be a BSP. Conversely, if the LSP was a reverse, the
space design consists of the AIR and the first 10 nucleotides of the DCS. The opposing
primer was designed according to the rule described for the SSPP or aborted otherwise. All
primer pairs successfully validated were analyzed for the presence of single nucleotide
polymorphism (see http://palace.lgfus.ca, Suppl. Table 4 and UCSC Genome Browser
custom track for SNP verification). A low-throughput version (only one alternative splicing
event can be designed at a time) of the script was also developed and is available for the
scientific community via a web interface http://designs.lgfus.ca. Design scripts and API are
also available through http://palace.lgfus.ca.
92
RNA extraction and quality control. DNAse treatment on Universal Human Reference
RNA (UHRR, Stratagene) was performed using RNAse-free DNAse set (Qiagen, Canada).
Human normal and serous epithelial ovarian cancer tissues were obtained in 10 microns
FFPE shavings from the « Réseau de Recherche sur le Cancer du Fonds de la Recherche en
Santé du Québec » biobank. Single-step total RNA extractions on human ovarian tissue
were performed using RNeasy FFPE (Qiagen, Canada). The RNA was examined using
Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent technologies, Santa Clara, CA) and samples displaying
nucleic acid density ratio of 1.8 O.D.260/280 and RNA integrity (RIN) value higher than 9
were used. Lower RIN values were accepted for RNA extracted from FFPE tissues. The
presence of PCR inhibitors was evaluated using a SYBR Green version of the SPUD assay
(Nolan et al., 2006b) and genomics DNA contamination was examined using exonic
primers
of
PLD1
gene
(5 ’-TC ATTG ACC AAT CGGTGGCCTT -3 ’
TGAAGTGACCCGCTTCACACT-3’)
and
intron-spanning
of CCNE1
and
5’-
gene
(5’-
AAGTGGCGTTT AAGTCCCCTG A-3 ’ and 5 ’- ATG AT AC AAGGCCG AAGC AGC A-3 ’).
Quantitative PCR analysis. RNA reverse transcription was performed using 50-250 ng of
RNA with “Transcriptor”, random primer p(dN)6, dNTPs (Roche Diagnostics, Laval,
Québec, Canada) and RNAse OUT (Invitrogen). Total cDNA generated from FFPE tissues
were further purified on QIAquick PCR purification kit (Qiagen, Canada). Total cDNA
were pooled and diluted to 0.33-3.33 ng/pL. All forward and reverse primers were
individually resuspended at 20-100 pM stock solution in Tris-EDTA buffer (IDT, Iowa,
USA) and diluted as a primer pair to 1 pM in RNAse DNAse-free water (IDT, Iowa, USA).
10 pL Real-time PCR reactions were performed either in a 7500 ABI apparatus (Applied
Biosystems, Foster City, CA) or a Realplex (Eppendorf) with 5 pL of FastStart Universal
SYBR Green Master mix (Roche Diagnostics, Laval, QC, Canada) with the following
cycling: 10 min at 95°C; 50 cycles: 15 sec at 95°C, 30 sec at 60°C, 30 sec at 72 °C; and
melting curve: 15 sec at 95°C, 60 sec at 60°C ; 1 °C /min temperature gradient, 15 sec at
95°C) using 3 pL (totalizing 1-10 ng) of template cDNA or diluted amplicons in tRNA (50
ng/mL, Ambion) and 2 pL of a 1 pM solution of forward and reverse primer.
The primer test was performed in technical triplicate using 1 or 10 ng of cDNA generated
from RNA extracted from UHRR or from a 50/50 mixture of ovarian normal/cancerous
93
FFPE tissues, respectively. The amplicons generated during the primer test were examined
by capillary electrophoresis as previously described (Klinck et al., 2008) and stored for
future use. In one case (CCL4), a chemically synthetic template of the following sequence
5 ’AAGCTCTGCGTG ACTGTCCTGTCTCTCCTC ATGCT AGT AGCTGCCTTCTGCTCT
CCAGCGCTCTCAGCACCAAATTCCAAACCAAAAGAAGCAAGC-3’ was diluted and
used as an amplicon derived from the primer test as described above. Efficiency curve were
performed across a four-log serial dilution protocol. A derived value of 2,00 represents an
amplification efficiency of 100 % and primer pairs with an efficiency between 90 and 105
% (E = 1,90 - 2,05) are considered acceptable (Nolan et al., 2006a), although we considered
SSPPs with E = 1,85 -2,05. See http://palace.lgfus.ca, Suppl. Table 4 for all validated
primer sets mentioned in Table 3.
For the design of the training set used to evaluate mispriming potential (MP 5’, Fig. 2),
putative SSPPs were designed with a BSPs having 3 to 15 nucleotides in 3’ end passes the
exon-exon junction and a fixed opposing primer. Primers to generate the template were
designed as LSPP design with the additional constraints of having the LSP in the same
orientation as the BSP. BSP’s opposing primers were designed to perform nested PCR
using the long splicing isoform template. The amplification in UHRR cDNA was
performed as described for the primer test. Amplicons were in the range of 100 to 300 bp,
allowing evaluation of the quality of the amplification by amplicon sequencing using the
Big dye chemistry on a ABI 3730x1 apparatus. The mispriming potential was evaluated by
performing real-time PCR reactions in technical duplicates using 3 pL of the 1: 100 000
000 dilution of the template , 2 pL of primer set (LSPP as the reference primer pair and
SSPP as the putative primer pair to be challenged) in 10 pL final volume as described for
primer test. No template controls were run in parallel and were negative. A ACt (where □
ACt = C, sspp - C, lspp) was calculated. See http://palace.lgfus.ca, Suppl. Table 1 for primer
sequences.
For the evaluation of mispriming potential (MP 3’, Table 1), a BSP mismatch rule set was
design with BSPs fully matching the short splicing isoform and bearing one 3’ end terminal
mismatch or two consecutive 3’ end terminal mismatches toward the long splicing isoform.
94
Opposing primers were designed to yield amplicon in the range of 100 to 300 bp. Primers
were tested as mentioned for the primer test. See http://palace.lgfiis.ca Suppl. Table 3 for
primer sequences.
Acknowledgments
This work was supported by a grant from Génome Québec and Genome Canada. Sherif
Abou Elela is a Chercheur National of the Fonds de la Recherche en Santé du Québec.
Jean-Pierre Perreault holds the Canada Research Chair in Genomics and Catalytic RNA.
The authors would like to thank Bruno Lamontagne, Lucien Jr Bergeron, Julian P.
Venables, Benoit Chabot and Roscoe Klinck for reviewing this manuscript as well as Sonia
Couture for cell culture, Maxime Lévesque and Chu Shin Koh for implementation of
bioinformatic analysis module, Jules Gagnon for testing the script and web interface, Dany
Namroud for server administration and Marc-André Rodrigue for sequencing. SAE and JPP
are members of the Centre de Recherche Clinique Étienne-Lebel.
95
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97
Chapitre 2
Développement d’outils moléculaires isoforme-spécifiques
Auteurs du chapitre : Jean-Philippe Bros seau, Elvy Lapointe, Jean-François Lucier, Sonia
Couture, Philippe Thibault, Daniel Gendron et Eric Paquet.
Avant-propos
Figures 1, 2, 3, 6, 8, 9, 15, 16 et tableau 1. JPB a produit les résultats, interprété et réaüsé
tous les figures et tableaux.
Figures 4, 5 et tableau 2. EL a produit les résultats. JPB a interprété et produit les figures et
le tableau.
Figure 7. DG a produit les résultats. DG et JPB ont produit la figure.
Figures 11, 13 et 14. JPB (PCR quantitatif) et EL (endpoint PCR) ont produit les résultats.
JPB a interprété les résultats et produit la figure.
Les transfections ont été réalisées par SC.
Les analyses PCR ont été analysées par PP et JPB
Les dessins de TOSS et antisens ont été produits par JFL (85%), JPB (5%), EP (10%).
Les dessins de TOES et les stratégies afin d’inclure l’exon ont été dessinés par JPB et JFL.
Les dessins de siRNAs ont été dessinés par JPB et JFL, basés sur un algorithme conçu par
JFL.
98
Mise en contexte
Le développement des technologies antisens (dépendantes de la RNase H) et plus tard du
RNAi, a démontré qu’il est possible de cibler virtuellement n'importe quelle séquence d’un
ARNm mature afin de réprimer son expression. Par contre, la plupart des gènes sont épissés
alternativement et possèdent plusieurs isoformes très semblables dont la fonction est mal
comprise. Dans quelques cas, il a été possible d’adapter la stratégie antisens ou RNAi pour
cibler spécifiquement une des isoformes et en révéler sa fonction. Par contre, la plupart des
exemples cible un exon et il n’existe pas de règle de dessin pour les siRNAs à cheval sur la
jonction, la seule région à cibler dans le cas de l’isoforme court.
La technologie antisens peut également être adapté plus profondément afin d’influencer la
décision d’épissage du pré-ARNm. Le TOSS (targeted oligonucleotide silencer of splicing)
en est un exemple et a été publié récemment avant le début de notre étude par Villemaire et
collaborateurs (2003). Le TOSS est un oligonucléotide bifonctionnel possédant une portion
antisens complémentaire à l’exon alternatif ciblé et une portion non hybridante
reconnaissant le facteur d’épissage hnRNPAl. La preuve de concept a été réalisé en ciblant
le pré-ARNm endogène de BCL2L1 dans plusieurs lignées cellulaires cancéreuses
humaines. Toutefois, il n’est pas clair à quel point ce concept peut être généralisé à d ’autres
gènes, type d’événement d’épissage et si oui, quel en sont les règles de dessin.
Les travaux présentés dans ce chapitre ont pour but de démontrer que 1) Le TOSS
reprogramme réellement l’épissage de cible endogène, 2) Le design rationnel des TOSS est
possible; 3) Le design rationnel de siRNA jonction est possible.
99
Méthodologies
Transfection de TOSS ou SSO en 6 puits
D’abord, chacun des puits d’une plaque 6 puits (1 puits par oligonucléotide à transfecter)
est ensemencé avec une suspension de 250 000 cellules dans du milieu complet (1 mL) et
laissé adhérer à 37°C, 5% CO 2 pour 4 h. 30 min avant la fin du 4 h, les oligonucléotides
(2,4 pL; 200 pM) sont dilués dans l’Opti-MEM I (97,6 pL) dans un microtube de 1,5 mL.
Puis, la lipofectamine 2000 (3 pL/puits) est diluée dans l’Opti-MEM I (97 pL/puits) et
laissée reposer 5 min. Cette solution de lipofectamine 2000 (100 pL/puits) est ajoutée dans
chaque microtube contenant un oligonucléotide dilué et dans un tube contenant seulement
de l’Opti-MEM I (contrôle négatif), puis il faut la laisser reposer 20 min. La totaüté du
contenu de chacun des complexes oligonucléotide-lipofectamine 2000 (200 pL) est ajoutée
goutte-à-goutte dans leur puits respectif et incubée à 37 °C, 5% CO2 pour 24 h.
Électrophorèse capillaire (Caliper 901
Dessin d’amorces de endpoint PCR
Fait tel que décrit dans Klinck et collaborateurs (2008).
Essai endpoint PCR One step (Qiagen)
Fait selon les recommandations du manufacturier.
Bloc de TOSS in vitro.
D’abord, chaque TOSS est dilué en série par un facteur 10 (20 nM - 20 pM). Ensuite, les
différentes concentrations de TOSS (5 pL) sont diluées individuellement avec une solution
d ’ARN total de HeLa S3 (5 pL, 100 ng) et du tampon Qiagen 5X One step (2,5 pL). Cette
solution est chauffée (95°C, 3 min) et subséquemment refroidie (t.p., 15 min). Puis, une
solution de déoxynucléoside triphosphate (dNTPs, 1 pL), le tampon 5X (2,5 pL), l’eau
100
(4,66 pL), le mélange d’enzyme One step Qiagen (1 pL) et les amorces PCR (1,67; 9 pM)
sont ajoutées. Les tubes sont ensuite transférés sur un thermocycleur PCR et la PCR est
exécutée selon le protocole suivant : 50°C, 30 min; 95°C, 15 min; 35 cycles (94°C, 30 sec;
55°C, 30 sec; 72°C, 1 min); 72°C, 10 min. Après la réaction, les produits PCR sont séparés
par électrophorèse capillaire.
Quantification du TOSS résiduel au cours d’une extraction au Trizol®
L’expérience suivante est faite en parallèle pour les 8 puits excepté l’ajout de TOSS à des
moments bien définis. D’abord, huit puits de plaque six puits sont ensemencés avec une
suspension de 250 000 cellules dans du milieu complet (1 mL) et laissés adhérer à 37 °C,
5% CO2 pour 24 h. Le lendemain, le surnageant est enlevé et les cellules sont délicatement
lavées au D-PBS (1 mL). Du Trizol® (1 mL/puits) est ajouté et le TOSS Al_Bclx4 (480
nmol) est ajouté dans le puits 1. 5 min plus tard, le lysat cellulaire est passé 10 fois avec la
pipette avant d’être transféré dans des microtubes de 1,5 mL. À ce moment, Al_Bclx4 (480
nmol) est ajouté dans le microtube correspondant au puits 2. Ensuite, du CHCI3 (200 pL)
est ajouté ainsi que Al_Bclx4 (480 nmol) dans le microtube correspondant au puits 3. Les
microtubes sont ensuite fermés, agités manuellement (15 sec) et laissés reposer (2 min,
t.p.), avant d’être centrifugés (13 000 rpm, 15 min, 4°C). La phase aqueuse (supérieure, 0,5
mL) est ensuite transférée dans des microtubes contenant du glycogène (40 pg) et de
l’iPrOH (500 pL). À ce moment, Al_Bclx4 (480 nmol) est ajouté dans le microtube
correspondant au puits 4. Les microtubes sont fermés, agités manuellement (15 sec) et
laissés reposer (10 min, t.p.). avant d’être centrifugés (10 000 rpm, 10 min, 4°C). Le
surnageant est enlevé délicatement et de l’EtOH 75% (1 mL) y est ajouté. À ce moment,
Al_Bclx4 (480 nmol) est ajouté dans le microtube correspondant au puits 5. Les
microtubes sont refermés, vortexés (2 sec) et centrifugés (10 000 rpm, 5 min, 4°C). Le
surnageant est enlevé délicatement et du Al_Bclx4 (480 nmol) est ajouté dans le microtube
correspondant au puits 6. Les culots d’ARN totaux sont séchés à l’air libre (10 min) et
subséquemment resuspendus dans H2O (30 pL). À ce moment, Al_Bclx4 (480 nmol) est
ajouté dans le microtube correspondant au puits 7. Tous les microtubes sont laissés reposer
sur glace (2 min), vortexés (10 sec) et centrifugés (13 000 rpm, 15 sec, t.p.). Finalement, les
101
extraits d’ARN sont chauffés (10 min, 60°C) et Al_Bclx4 (480 nmol) est ajouté dans le
microtube correspondant au puits 8.
Marquage de sonde au P32
20
ng
de
sonde
(anti-TOSS :
CACCCTAAGTCCCTATCATA
ou
anti-U6 :
TCTTCTCTGTATCGTTCC) est dilué avec de l’H20 (3 pL), du tampon kinase (1 pL), du
P32 gamma-ATP et de la T4 polynucléotide kinase (1 pL) dans un volume final de 10 pL et
placé dans un bain (37°C, 45 min). La réaction est arrêtée en ajoutant du tampon tris-EDTA
(TE) (10 pL) et en plaçant le microtube dans un bloc chauffant (65°C, 5 min). Le mélange
réactionnel est dilué avec de l’H20 (20 pL) et passé sur colonne S-200.
Northem-Blot
Un gel 12% d’acrylamide avec urée 8,3 M dans du tampon TBE (tris-borate-EDTA) IX est
moulé et laissé reposer. Puis, les échantillons sont chauffés (60°C, 2 min) et déposés sur
gel. Ceux-ci doivent d’abord pénétrer le gel pendant 20 min à 12 watts, puis 45 min à 19
watts. Une fois la migration terminée, les échantillons sont transférés sur membrane Hybrid
XL (4°C, 180 min, 400 mA). Une fois le transfert terminé, la membrane est soumise aux
rayons ultra-violets de chaque côté ( 2 x 2 min). La membrane est ensuite lavée avec 50 mL
de solution SSPE (NaCl-NaH2P0 4 -EDTA) 6X pH =7.7 contenant du Denhardt’s 2X, et du
SDS 0,1% (40°C, 60 min). La membrane est ensuite hybridée avec les sondes anti-TOSS
(7,5 pL) et anti-U6 (7,5 pL) fraîchement radiomarquées au P32 (40°C, 16 h) dans une
solution SSPE 6X (50 mL) contenant du Denhardt’s 2X et du SDS 0,1%. Le lendemain, la
membrane est lavée deux fois avec une solution de SSPE 6X (50 mL) contenant du
Denhardt’s 2X et du SDS 0,1% (40°C, 30 min). Finalement, la membrane est enveloppée
avec un saran et exposée sur film 24 h dans une cassette.
102
Essai de retard sur gel
Les oligonucléotides sont d’abord purifiés sur gel d’acrylamide. Puis, une fraction de ceuxci (1 |i.mol) sont marqués au P32 tel qu'il a été décrit précédemment. Ces oligonucléotides
marqués sont ensuite incubés avec SF2-GST (165 nM final) (généreusement donné par
Benoit Chabot) 10 min dans un tampon HEPES. Finalement, les complexes sont séparés sur
gel d’acrylamide 4% non-dénaturant.
Essai de PCR en temps réel
Intégrité de l’ARN (Agilent RNA chip)
Quantification de l’ARN (Nanodrop)
Test de présence d’ADN génomique
Tel qu’il a été décrit dans le chapitre 1.
Extraction d ’ARN total au Trizol® (Invitrogen)
Celle-ci a été faite selon les recommandations du manufacturier excepté l’ajout
d’acrylamide linéaire (5 pg) lors de la précipitation à l’isopropanol.
Extraction d’ARN sur colonne (Absolutely RNA 96 Microprep kit de Stratagene)
Tel qu’il a été décrit dans le chapitre 3.
103
Résultats : Développement d ’outils moléculaires isoforme-spécifiques
2.1 Développement d ’outils moléculaire favorisant l ’inclusion d ’exon alternatif
2.1.1 Méthodologie pour quantifier l ’effet des TOSS sur les isoformes de Tépissage
2.1.1.1 Le TOSS peut produire un changement de ratio artéfactuel in vitro.
Le dessin de TOSS original (Al_Bclx4) est conçu pour rediriger l’épissage vers le 5’ss en
amont dans l’exon 2 du gène BCL2L1 (Bcl-x) et a été publié récemment avant le début de
notre étude par Villemaire et collaborateurs (2003). Bien que la démonstration de
modulation soit évidente, les résultats ne sont pas représentés par le ratio conventionnel de
l’isoforme long sur le total, mais bien directement par un ratio de l’isoforme long sur
l’isoforme court. Cette dernière méthode permet difficilement de juger de l’amplitude de
modulation d’un TOSS. Nous avons donc re-analysé l’effet du TOSS contre BCL2L1
(Al_Bclx4) par endpoint PCR selon la méthode d’analyse conventionnelle (v|/).
Brièvement, des cellules PC-3 ont été transfectées transitoirement en présence de
lipofectamine 2000 (LF) par Al_Bclx4. Après 24 h, l’ARN total a été extrait au Trizol®,
dosé par Nanodrop et la qualité évaluée par Agilent Bioanalyzer 2100. Puis, un essai de
endpoint PCR en une seule étape spécifique au alt5’ du gène BCL2L1 a été effectué. Une
fois les produits PCR séparés par électrophorèse capillaire, le ratio d’isoforme est exprimé
sous forme de \|/ tel que décrit dans l’introduction. Lorsque comparé au véhicule de
transfection seul (LF), on note que Al_Bclx4 réduit la valeur de \|/ (Fig. 1). Pour apprécier
la spécificité de cet effet, un oligonucléotide de même chimie, longueur et séquence de
recrutement hnRNP Al, mais dont la portion antisens n’est pas complémentaire à l’ARNm
de BCL2L1 a été dessiné. En fait, cette séquence antisens est l’une des moins susceptibles
de s’apparier à des séquences codantes lorsque criblée in silico sur une banque d'ADNc
codant. Lorsque les cellules sont transfectées en parallèle par ce TOSS contrôle (ctrl
TOSS), son effet est similaire à celui observé par l’effet de la LF seule (Fig. 1), démontrant
ainsi le recours à une séquence antisens spécifique pour obtenir l’effet de modulation.
106
2.1.1.1 Quantification du TOSS résiduel post-transfection.
Bien que le changement de ratio induit artéfactuellement par le TOSS in vitro soit évident,
plusieurs variables (dont la proportion de TOSS effectivement entrée dans les cellules et le
pourcentage de TOSS dégradé post-transfection), rendent l’estimation de la concentration
résiduelle de TOSS dans les échantillons d’ARN total difficile à évaluer. Dans le but de
quantifier le TOSS résiduel 24 h post-transfection, un essai par buvardage de type Northern
a été réalisé suivant une transfection par un TOSS. Des cellules HeLa S3 ont été
transfectées par Al_Bclx4 (480 nmol). Une fois l’ARN total extrait au Trizol®, celui-ci est
mis en présence de deux sondes d’oligonucléotides d’ADN radiomarqués au P32 en 5’: la
première possédant une complémentarité parfaite avec la portion « tail » du TOSS, la
deuxième reconnaissant U6 snRNA. De façon surprenante, aucun TOSS n’a pu être détecté
dans l’extrait d’ARN transfecté alors qu’une faible quantité de Al_Bclx4 exogène (5 pmol)
et de U6 snRNA endogène sont détectables (résultats non montrés). Pour déterminer à quel
moment de la procédure d’extraction d’ARN le TOSS devient indétectable, la transfection
des cellules fut omise et huit extractions d’ARN furent menées en parallèle. Al_Bclx4 (480
nmol) a été ajouté (in vitro) une seule fois par extraction, chacune d’elle à différent point
stratégique du protocole d’extraction. Chacun des huit extraits d’ARN total a été soumis
aux conditions de détection décrites précédemment. Clairement, tous les extraits dont le
TOSS a été ajouté après la séparation des phases aqueuse et organique (phénolique)
révèlent la présence de TOSS (Fig. 3). Ces nouveaux résultats suggèrent que le TOSS serait
retenu dans la phase phénolique plutôt que dans la phase aqueuse lors de l’extraction
d’ARN. En résumé, cet essai démontre que l’extraction d’ARN à l’aide du Trizol® enlève
le TOSS, permettant ainsi d’obtenir des extraits d’ARN sans artéfact PCR.
<o
&
+TOSSàAétape
V
32p
H11
M «ft m Ê I
12345
sonde anti-U6
sonde anti-TOSS
6 7 8 9 10
Figure 3 Le traitement au Trizol® enlève le TOSS d’un extrait d’ARN total.
Des cellules HeLa S3 ont été ensemencées en plaque 6 puits en omettant la transfection.
Huit extractions d ’ARN furent menées en parallèle. Al_Bclx4 (480 nmol) a été ajouté (in
vitro) une seule fois par extraction, chacune d’elle à différent point stratégique du protocole
d’extraction au Trizol®. Piste 1: Diluer dans l’eau (contrôle positif). Piste 2: Ajout du
TOSS suivant l’addition du Trizol® dans la plaque 6 puits. Piste 3: Ajout du TOSS suivant
le transfert du Trizol® dans le microtube. Piste 4: Ajout du TOSS suivant l’addition de
chloroforme. Piste 5: Ajout du TOSS suivant l'ajout de glycogène et d’isopropanol au
surnageant. Piste 6: Ajout du TOSS suivant l’ajout de l’éthanol 75%. Piste 7: Ajout du
TOSS sur le culot d’ARN avant le séchage. Piste 8: Ajout du TOSS lors de la resuspension
de l’ARN total dans l’eau. Piste 9: Ajout du TOSS suite au chauffage de l’ARN total à
60°C. Piste 10: L’eau servant à la dilution du TOSS (contrôle négatif). Suivant la
séparation sur gel de polyacrylamide dénaturant et le transfert sur membrane de
nitrocellulose, celle-ci est mise en présence de sondes radio marquées: l’une reconnaissant
le petit ARN U6 et l’autre s’hybridant sur la portion « tail » de Al_Bclx4. On note que la
détection du petit ARN non codant U6 est uniforme dans tous les puits où de l’ARN total
est présent (pistes 2 à 10) alors que le TOSS est détecté uniquement lorsqu’il a été ajouté
suivant la séparation des phases organique et aqueuse (pistes 5 à 9).
108
2.1.1.3 Le TOSS module vraiment Vépissage in cellulo.
Comme le Trizol® enlève le TOSS présent dans un extrait d’ARN total, une expérience
montrant cette fois que la composante artéfactuelle due à la présence de TOSS peut être
éliminée grâce à l’action du Trizol® a été entreprise. Brièvement, une fois les extraits
d’ARN traités in vitro avec KITLG_TOSS_l et le bloc confirmé par endpoint PCR tel qu’il
a été décrit à la section 3.1.1, les extraits d’ARN ont été resoumis au protocole d’extraction
au Trizol®. Les résultats endpoint PCR suivants cette expérience confirment clairement le
pouvoir du Trizol® à enlever le TOSS, et donc, la composante artéfactuelle qui lui est
associée (Fig. 4A). La même expérience a été reprise avec AXINl_cass_t, BTC_cass_t, et
SYK_TOSS_l avec des conclusions similaires (Fig. 4B).
Bien que l’extraction d’ARN total au Trizol® est une méthode simple et peu coûteuse,
celle-ci est difficilement envisageable à haut débit. Des procédures exploitant des colonnes
de silice en format 96 puits comme le « Absolutely RNA 96 Microprep kit » de Stratagène
sont commercialement disponibles. Dans le but de connaître la capacité de cette technique
d’extraction d’ARN à se débarrasser des oligonucléotides 2’OMe tel le TOSS, des extraits
d’ARN ayant été préalablement traités in vitro avec du TOSS (KITLG_TOSS_l,
Al_Bclx4) ont été soumis au protocole d’extraction d’ARN tel que recommandé par
Stratagène. Suivant l’essai endpoint PCR spécifique à chacun des ASEs, les résultats
indiquent un effet de blocage et l’incapacité de l’extraction par colonne à contrer cet effet,
et ce, dans les deux cas (résultats non montrés). Nous avons donc entrepris des variations
du protocole original de Stratagène ayant comme objectif de réduire la complémentarité
entre le TOSS et l’ARNm, mais en vain (lavage avec une solution à faible pH, chauffage
suivi d’un refroidissement rapide; résultats non montrés). Pour contourner ce problème, des
extraits d’ARN contenant du TOSS ont systématiquement été soumis à des températures
croissantes de transcription inverse avec ou sans ajout de tampon Qiagen défavorisant la
formation de structure secondaire. Les résultats indiquent un effet favorable du tampon
Qiagen dans un cas sur six, alors que l’élévation de la température de transcription inverse
semble diminuer la quantité de produit PCR et fait augmenter la variabilité (résultats non
montrés).
109
A
KITLG
■Awarf tftzd o Après Irtzol
Effet de blocage
et
effet du trizol
I
S ans TOSS
Ctrl TOSS
KITLG TOSS 1
3
B
Ctrl TOSS
Sans TOSS
Avant
Après
Avant
TOSS
Après
Avant
Après
Effet de
blocage
Effet du
trizol
AXlN1_cass_t
13
21
13
19
2
17
11
15
BTC_cass_t
30
44
31
36
10
39
20
29
SYK_TOSS_1
62
62
63
61
29
58
33
29
Figure 4 Le Trizol® permet d’enlever la composante artéfactuelle.
KITLG_TOSS_l ou Ctrl TOSS (480 nmol) a été ajouté (in vitro) à des extraits d’ARN de
NIH-OVCAR-3. A) Les histogrammes en noir (Avant Trizol®) présentent les valeurs de \|/
obtenues par endpoint PCR et confirment le blocage du TOSS. Les histogrammes en blanc
(après Trizol®) présentent les valeurs de \p obtenues par endpoint PCR suivant une
soumission de chacun des extraits au protocole d’extraction au Trizol® et confirment l’effet
du Trizol® à enlever la composante artéfactuelle. B) La même expérience a été reprise avec
AXINl_cass_t, BTC_cass_t et SYK_TOSS_l avec des conclusions similaires. L’effet de
blocage est calculé en comparant les valeurs de \|/ «Avant» du TOSS et sans TOSS. L’effet
du Trizol® est obtenu en comparant les valeurs de y «Avant» et «Après» du TOSS. On
remarque que les valeurs effet de blocage et effet du Trizol® sont semblables pour un
TOSS donné.
110
Puisque l’extraction au Trizol® n’est pas envisageable à haut débit et qu’aucune alternative
n’est totalement efficace afin d’éliminer la composante artéfactuelle, une expérience
permettant d’estimer la composante artéfactuelle in cellulo a été mise au point. Des cellules
NIH-OVCAR-3 ont été transfectées par KITLG_TOSS_l. Après 24 h, les cellules ont été
décollées avec de la trypsine et séparées en deux parties égales. La première a été extraite
selon la procédure au Trizol®, la deuxième selon la stratégie en colonne de Stratagène.
Ensuite, la détection des isoformes a été effectuée telle que décrite précédemment. De cette
façon, les données résultantes de la méthode au Trizol® seront considérées comme
authentiques (réel effet de modulation) alors que celles provenant de la méthode par
colonne seront analysées comme étant la somme du changement de ratio réel plus la
composante artéfactuelle. Cette expérience a été répétée avec AXINl_cass_t, BTC_cass_t
et SYK_TOSS_l. Ainsi, la composante artéfactuelle atteint un A \)t (\|/Lf -
M/jo s s )
de près de
10 dans trois cas sur quatre et se chiffre à 20 dans le cas de KITLG_TOSS_l (Fig. 5A).
Comme l’amplitude de l’effet réel de modulation varie de 15 à 60, la composante
artéfactuelle joue un rôle mineur dans le cas de fort modulateur (KITLG_TOSS_l) et
possède un impact majeur dans le cas de faible modulateur (AXINl_cass_t, Fig. 5B). Ainsi,
11 est acceptable d’utiliser la stratégie en colonne lors d’expérience à haut débit et de
purifier les extraits au Trizol® advenant le cas de faible modulateur (A\|/ < 25).
Tel qu’illustré à la figure 2A, l’effet de blocage du TOSS ne s’applique qu’à l’isoforme
long. Conséquemment, l’expression de l’isoforme court ne devrait pas varier en fonction du
traitement au TOSS. Nous avons cherché à évaluer la variation de l’isoforme court en
fonction du traitement au TOSS. Cette fois, il n’est plus possible d’utiliser les valeurs de \|f
extraites des réactions endpoint PCR, car cette technique ne permet pas d’évaluer
l’expression des isoformes un à la fois. La PCR en temps réel permet de mesurer l’isoforme
court et l’isoforme long séparément. De plus, la quantification de l’expression globale (tous
les isoformes ARNm d’un gène) devient possible par PCR en temps réel. Pour ce faire,
l’ARN total extrait au Trizol® subit une transcription inverse en ADN complémentaire
(ADNc) à l’aide d’amorces hexamériques dont les nucléotides sont dégénérés. L ’ADNc est
subséquemment dilué et introduit dans trois réactions PCR dont les amorces sont
spécifiques à l’isoforme court, l’isofome long ou ciblent une portion commune aux deux
Ill
ARNm (global). Pour des fins de normalisation, des réactions PCR sur deux gènes ne
présentant que très peu de variation entre les échantillons à l’étude sont utilisées, soit un
total de cinq réactions PCR par échantillon. La méthode d’analyse de qBase (Hellemans et
al., 2007) est appliquée pour générer les valeurs d’expression relative pour chacun des
isoformes.
trizol □ colonne
K TLG
Réel effet
de modulation
Effet
artéfact
TOSS Ctrl
LF
KITLG_TOSS_1
i
j
B
Ctrl TOSS
LF
TOSS
Réel effet de
modulation
Effet
artéfact
4
9
trizol
colonne
trizol
colonne
trizol
AX!N1_cass_t
19
20
21
21
15
BTC_cass_t
41
41
42
44
14
7
27
7
SYK_T0SS_1
89
89
æ
89
17
8
52
9
colonne
6
Figure 5 Estimation de la réelle proportion de la composante artéfactuelle in cellulo.
Des cellules NIH-OVCAR-3 ont été transfectées par KITLG_TOSS_l et Ctrl TOSS. A) Les
histogrammes présentent les valeurs de y obtenues par endpoint PCR lorsque l’ARN est
extrait au Trizol® (noir) ou selon la stratégie en colonne de Stratagène (blanc). B) La même
expérience a été reprise avec AXINl_cass_t, BTC_cass_t et SYK_TOSS_l avec des
conclusions similaires. L’effet de réelle modulation est calculé en comparant les valeurs de
\|f du TOSS et de LF. La composante artéfactuelle est estimée en comparant les valeurs
obtenues pour le TOSS pour les deux méthodes d’extraction. On note que l’effet artéfact
représente une faible proportion de l’effet total dans trois cas sur quatre.
112
Pour démontrer les réels effets de modulation du TOSS par PCR en temps réel, des cellules
SKOV3ipl ont été transfectées par SHMTl_cass_l_t. Après 24 h, l’ARN total a été extrait
selon la stratégie en colonne de Stratagène. Puis, 10 pL d’ARN ont été subséquemment
purifiés selon la méthode d’extraction au Trizol®. Finalement, la détection des isoformes a
été effectuée par PCR en temps réel. Contrairement à l’isoforme long, on note que les
niveaux d’isoformes courts ne sont pas affectés par SHMTl_cass_l_t, démontrant leur
réelle modulation (Fig. 6A). La même expérience a été reprise avec FNl_TOSS_2,
MCLl_TOSS_3, SYK_TOSS_l et UTRN_cass_t avec des conclusions similaires (Fig.
6B).
fijOO
Colonne
6
300
3 200
« Global
.ZSMlZEIZMEh , l'Mie
■ Long
Trizol
?
□ Court
300
Ctrl TOSS
B
SHMT1 cass 1 t
Colonne
Trizol
Global
Long
Court
Global
Long
Court
FN1_T0SS_2
1 00
0.15
206
1 25
0.69
1.96
MCL1 _T0SS_3
09 9
0.53
18.0
0.94
0.52
17.9
SYK_T0SS_1
1 42
0.31
2.24
1 58
020
232
UTRN_cass_t
1 20
0.24
19.1
1 10
0.30
16.4
113
Figure 6 Confirmation du réel effet modulateur du TOSS in cellulo par PCR en temps
réel.
Des cellules SKOV3ipl ont été transfectées par SHMTl_cass_l_t et Ctrl TOSS. A) Les
histogrammes présentent les valeurs moyennes d'expression relative globale (gris), de
l'isoforme long (noir) et de l'isoforme court (blanc) par rapport à l’exon 117 de SHMT1 par
PCR en temps réel pour trois réplicats biologiques. Dans le haut, TARN a été extrait selon
la stratégie en colonne de Stratagène. Dans le bas, les mêmes échantillons d'ARN ont été
purifiés selon la méthode d'extraction au Trizol®. Contrairement aux niveaux d ’isoformes
longs, les niveaux d’isoformes courts ne sont pas affectés par SHMTl_cass_l_t. B) La
même expérience a été reprise avec FNl_TOSS_2, MCLl_TOSS_3, SYK_TOSS_l et
UTRN_cass_t avec des conclusions similaires.
Si le TOSS module réellement la proportion d’isoformes ARNm, ceci devrait se refléter
dans la quantité relative des isoformes protéiques. Pour le confirmer, nous avons choisi
deux gènes dont les isoformes ciblés par un TOSS sont techniquement séparables par
électrophorèse sur gel d ’acrylamide, soit CASP8 et CASP10. L’immuno-buvardage indique
une baisse de l’isoforme long et une hausse concomitante de l’isoforme court, démontrant
le réel effet de modulation des TOSS.
A
B
CASP8a
53 «
CASP8b
LF
A1_CASP84
MA1 CASP84m4
CASP10 d
CASP10a
ü
A1_C10-7
A1 C10-7m2
Figure 7 Effets des TOSS sur les isoformes de CASP8 et CASP10 au niveau protéique.
Des cellules HeLaS3 ont été transfectées par A) A1_CASP84 et Al_CASP84m4 (4
mésappariements dans la portion antisens) ainsi que B) Al_C10-7 et Al_C10-7m2 (2
mésappariements dans la portion antisens). Après 72h, les protéines ont été extraites et
l’impact des TOSS sur le ratio d’isoformes a été vérifié qualitativement par western-blot.
114
2.1.1.4 Modulation de type A et de type B.
Parmi les TOSS testés jusqu'à présent, tous produisent une réelle modulation de TAS, soit
une diminution de l’isoforme long, une augmentation de l’iso forme court et aucun
changement d’expression globale. Or, nous avons testé un TOSS additionnel ciblant l’exon
cassette 273 de FN1. De façon surprenante, ce TOSS (FNl_TOSS_l) se comporte comme
un siRNA spécifique à l’isoforme long. On observe une diminution de l’isoforme long sans
augmentation compensatoire de l’isoforme court et une diminution marquée de l’expression
globale (Fig. 8). Nous avons nommé ce comportement TOSS de type B, par opposition à
l’effet modulateur attendu que nous appellerons maintenant type A. A noter que pour ce
même événement, FNl_TOSS_2 procure une modulation de type A.
A
C
FN1 TOSS 2
FN1 TOSS 1
B
o 1.50
End-point PCR
8 100
■ Global
■ Long
□ Court
//- I E E 1
LF
273
192183
-H-
Ctrl T OSS
FN1_
TOSS_1
FN1_
TOSS_2
ill
Figure 8 Modulation de type A et de type B.
A) Schéma représentant la position de FNl_TOSS_l et FNl_TOSS_2 sur l’exon 273 de
FN1. B) Schéma représentant la position des amorces PCR utilisées pour la détection des
isoformes de FN1. C) Des cellules SKOV3ipl ont été transfectées par FNl_TOSS_l,
FNl_TOSS_2, Ctrl TOSS, et l’ARN total a été extrait en colonne. C) Dans le haut, les
histogrammes présentent les valeurs moyennes de \|/ obtenues par endpoint PCR pour trois
réplicats biologiques. Dans le bas, les histogrammes présentent les valeurs moyennes
d'expression relative globale (gris), de l’isoforme long (noir) et de l'isoforme court (blanc)
de FN1 par rapport à l'exon 273 par PCR en temps réel pour trois réplicats biologiques.
FNl_TOSS_2 procure une réelle modulation (type A) alors que FNl_TOSS_l se comporte
comme un siRNA spécifique à l'isoforme long (type B).
115
2. /. 1.5 Marche à suivre permettant la validation des TOSS à haut débit.
Les ASEs ciblés par les TOSS décrits dans ce chapitre ont été choisis en fonction de leur
association avec le cancer de l’ovaire (Klinck et al., 2008), du sein (Venables et al., 2008)
ou reliés à des cascades de signalisation apoptotique. Une grande proportion est décrite
dans le chapitre 3 et l’ensemble des résultats sont comptabilisés dans l’annexe 1. Pour être
en mesure de transfecter un grand nombre de TOSS en parallèle, nous avons entrepris la
transfection de cellules par les TOSS en format 96 puits. Les cellules cancéreuses sont
transfectées par les TOSS à 480 nmol (400 uM final) pour une période de 24 h en triplicats
biologiques, c'est-à-dire selon trois journées différentes. Après 24 h, les cellules sont
congelées à -80°C dans un tampon de lyse au fur et à mesure. L’isolation de l’ARN des
trois réplicats est effectuée simultanément avec le Absolutely RNA 96 Microprep kit
(colonne) avec de légères modifications au protocole original et inclut un traitement à la
Dnase. L’intégrité de l’ARN est confirmée par Agilent Bioanalyzer en effectuant l’analyse
du RNA integrity number (RIN) pour 10% des échantillons pris au hasard. Les valeurs sont
typiquement de 9.0 et plus. Des échantillons possédant un RIN inférieur à 8.0 indiquent une
détérioration de la qualité de l’ARN et les échantillons de cette plaque doivent être
questionnés. La présence d’ADN génomique contaminant est effectuée en soumettant les
échantillons d’ARN au test de présence d ’ADN génomique. Les échantillons nonconformes indiquent qu’un traitement supplémentaire à la désoxyribonucléase (DNase) doit
être fait ou les cellules doivent être transfectées à nouveau. La quantification est effectuée
par spectrométrie (Nanodrop) et les valeurs se situent généralement entre 5 et 20 ng/uL.
Les échantillons peuvent être directement soumis au protocole de endpoint PCR. Pour ce
faire, des amorces PCR sens et antisens doivent être dessinées sur les exons constitutifs
flanquant la région alternative (Klinck et al., 2008). Ensuite, l’amorce est utilisée pour la
synthèse de l’ADNc selon une procédure de transcription inverse et PCR en une seule étape
avec un volume fixe de 5,5 fiL. Les produits PCR sont séparés par électrophorèse capillaire
(Klinck et al., 2008). Les valeurs de \|/ sont rapportées pour chacun des échantillons et le À
\j/ ( v u - Vtoss) est utilisé pour connaître l’amplitude de modulation du TOSS.
116
Pour la quantification des isoformes par PCR en temps réel, une étape de synthèse d ’ADNc
avec des amorces hexamériques dégénérées est utilisée. Bien qu’il soit préférablement de
normaliser les quantités d’ARN selon la concentration pour la synthèse d’ADNc, elle est
effectuée sur un volume fixe (5,5 pL) d’ARN. La normalisation via des gènes de référence
(SDHA et PSMC4) dont le changement d’expression est minimal à travers les échantillons
assure une normalisation adéquate. Les amorces isoforme-spécifiques sont dessinées,
diluées et testées selon la procédure décrite au chapitre 1 (RASE pipeline). Pour les
amorces globales, un algorithme permettant de déterminer la région la plus commune à tous
les isoformes d’un gène est appliqué tel qu’il a été décrit au chapitre 3. Ces amorces sont
testées selon les mêmes standards que les amorces isoforme-spécifiques. La figure 9
résume les étapes clés de la marche à suivre afin de valider les effets de modulation des
TOSS à haut débit.
117
Collecte d e s échantillons
expérim entaux
Dessin de TO SS
1
Transfection
1
Isolement de l’ARN
D essin d’am orces
de end-point PCR
Essai de end-point PCR
1
Validation des
échantillons ARN
♦
End-point PCR
— ►
Analyse du
end-point PCR
♦
E ssai de PCR quantitatif
RASE pipeline
♦
Synthèse d’ADNc
PCR quantitatif
Analyse du
PCR quantitatif
Figure 9 Marche à suivre permettant la validation des TOSS à haut débit.
Les TOSS sont dessinés tel que décrit au chapitre 3. Des cellules sont transfectées en
format 96 puits pour une période de 24 h en triplicats biologiques par des TOSS (480
nmol). L’isolement de l’ARN des trois réplicats est effectué simultanément avec le
Absolutely RNA 96 Microprep kit (colonne). L’intégrité et la quantité d’ARN sont
vérifiées par Agilent Bioanalyzer et Nanodrop, respectivement. L’absence d’ADN
génomique contaminant est confirmée avec le test de présence d’ADN génomique. Des
amorces endpoint PCR sens et antisens sont dessinées tel que décrit par Klinck et
collaborateurs (2008). Celles-ci sont utilisées pour la procédure de transcription inverse et
PCR en une seule étape et les produits PCR sont subséquemment séparés par
électrophorèse capillaire. Les valeurs de \j/ sont rapportées pour chacun des échantillons et
le A \)/ (\|/LF - \|/toss) est utibsé pour connaitre l’amplitude de modulation du TOSS. Pour la
quantification des isoformes par PCR en temps réel, des amorces isoforme-spécifiques et
globales sont dessinées, diluées et testées tel qu’indiqué au chapitre 1 (RASE pipeline).
Ensuite, des amorces hexamériques dégénérées sont utilisées pour l’étape de synthèse
d’ADNc. La quantification relative des isoformes d’intérêt se fait en normaüsant via des
gènes de référence dont le changement d’expression est minimal à travers les échantillons.
118
2.2.2 Dessin rationnel de TOSS.
2.2.2.1 Paramètres propres aux TOSS.
2.2.2. l . l Complémentarité intra et intermoléculaire.
Les oligonucléotides ont tendance à se replier sur eux-mêmes en formant des paires de
bases Watson-Crick afin de minimiser leurs énergies. Le TOSS ne faisant pas exception à
cette règle, ce processus est susceptible d’interférer avec l’hybridation de la portion
antisens sur la cible du TOSS et/ou la portion « tail » pour la protéine hnRNP A l. Afin de
déterminer la complémentarité d’un TOSS avec lui-même, on utilise la différence d’énergie
libre de Gibbs : plus la valeur est négative, plus l’oligonucléotide a tendance à se replier sur
lui-même. Pour trouver la valeur seuil de
A G m tra m o ié c u ia ire
au-dessus de laquelle les TOSS ont
un repliement minimum, un script a été confectionné à l’aide de Unafold (Markham and
Zuker, 2005). Au total, 10000 séquences de TOSS prises au hasard ont été évaluées afin de
déterminer un
A G m tr a m o ié c u ia ir e
moyen et la déviation standard. Nous avons établi la limite
acceptable au AGmtramoiécuiaire moyen plus deux déviations standards, soit -9,4 kcal/mol.
La portion « tail », ayant pour objectif de recruter le facteur d’épissage hnRNP A l, possède
deux séquences UAGGG de haute affinité (Burd and Dreyfuss, 1994). Or, les motifs GGG
sont propices à la formation de structures secondaires de type G-quartet (Davis, 2004).
Puisque la formation d ’une telle structure demande l’association de quatre séquences GGG,
celle-ci pourrait avoir lieu avec une association intermoléculaire entre deux molécules de
TOSS. Lorsque la séquence antisens possède également deux séquences GGG, la formation
d’un G-quartet intramoléculaire est alors favorisée. Pour stabiliser ce type de structure, des
cations comme le Na+, mais préférablement le K+ sont requis. Comme le milieu
extracellulaire et intracellulaire possède des quantités généralement suffisantes de Na+ et de
K+, respectivement, il est possible que la concentration du TOSS disponible au site d’action
soit modifiée par la capacité d’un TOSS à former des structures secondaires tel le Gquartet. Pour tester cette hypothèse, cinq TOSS comportant des aptitudes à former des
structures secondaires et des capacités de modulation d’AS de différentes amplitudes ont
été choisis. Chacun des TOSS a d’abord été purifié sur gel d’acrylamide, chauffé (100°C,
10 min) et rapidement refroidi dans l’azote liquide. Puis, un aliquot (150 pL, 15 pM) a été
119
dilué dans des tampons (200 pL) mimant le milieu extracellulaire (Na+ = 110 mM, K+ = 5
mM) et intracellulaire (Na+ = 25 mM, K+ = 133 mM) selon les recommandations de Dasdia
et collaborateurs (1979). Des spectres de dichroïsme circulaire ont été enregistrés à 37°C au
temps = 0, 1, 4 et 24 h pour chacune des conditions expérimentales. Peu importe le temps
d’acquisition, les spectres sont demeurés parfaitement superposables pour un TOSS donné,
indiquant l’inertie du TOSS à former des structures secondaires, et ce, tant pour le tampon
élevé en Na+ que K+, (résultats non montrés). En somme, nous n’avons pas d’évidence que
les TOSS forment des structures secondaires de type G-quartet. Toutefois, les séquences
comportant des répétitions de GGGG sont à éviter dans le dessin de TOSS puisqu’elles sont
difficiles à synthétiser.
2.2.2.1.2 Chimie de la portion « tail » du TOSS.
Tous les TOSS étudiés jusqu’ici sont composés entièrement de nucléotides modifiés de
type 2’OMe. Il est important que la portion antisens soit composée de nucléotides modifiés
afin de préserver son effet indépendant de la RNase H. Par contre, il a été rapporté que
hnRNP Al se lie autant aux séquences d’ADN que d’ARN (Ding et a l, 1999). Dans
l’optique d’améliorer l’effet de modulation du TOSS, nous avons systématiquement varié
la chimie de la portion « tail » (2’OMe, ADN, ARN) et mesuré l’impact sur la modulation
de l’ASE modèle de KITLG. Des cellules SKOV3ipl ont été transfectées tel que décrit
précédemment et l’ARN total extrait au Trizol®. Tel qu’illustré à la figure 10, la version de
la portion « tail » originale en 2’OMe demeure la plus puissante pour moduler l’AS.
120
3
3
â
KITLG DNA
B
i Global
KITLG RNA
H ong
KITLG TOSS 1
-ff—
o Court
84
7 9 - 157110 -H-
500
KITLG
LF
cm t o s s
KITLG
RNA
KITLG
DNA
KITLG_
TOSS 1
3 3 3 3
Figure 10 Effet de la modification de la chimie de la portion « tail ».
A) Schéma représentant la position de KITLG_TOSS_l sur l’exon 84 de KITLG. Deux
autres TOSS de séquence identique, mais dont la chimie est différente: KITLG_RNA
(ARN) et KITLG_DNA (ADN) ont été dessinés. B) Schéma représentant la position des
amorces PCR utilisées pour la détection des isoformes de KITLG. C) Des cellules
SKOV3ipl ont été transfectées par KITLG_TOSS_l, KITLG_RNA, KITLG_DNA, Ctrl
TOSS et TARN total a été extrait au Trizol®. Les histogrammes présentent les valeurs
moyennes d'expression relative globale (gris), de l'isoforme long (noir) et de l'isoforme
court (blanc) par rapport à l'exon 84 de KITLG par PCR en temps réel pour trois réplicats
biologiques. La version de portion « tail » originale en 2’OMe demeure la plus puissante
pour moduler l’épissage.
2.2.2.1.3 Effet de la séquence de la portion « tail » du TOSS.
De façon générale, il existe deux grandes catégories de SSOs définies selon le
positionnement. Le plus souvent, l’antisens est situé directement sur la jonction exon-intron
ou encore complètement exonique. Dans ce dernier cas, il est postulé que celui-ci entre en
compétition avec un facteur d’épissage pour un site de liaison ayant un impact sur le ratio
d’AS. Comme le TOSS est lui aussi exonique, bloquant potentiellement un facteur
d’épissage quelconque, il est possible que l’effet de modulation du TOSS provienne
121
majoritairement de la portion antisens. Pour démontrer clairement la contribution de la
portion « tail » du TOSS, une série de 10 TOSS ainsi que leur portion antisens
correspondante ont été testés en cellules. Parmi les neuf TOSS qui fonctionnent, huit ont un
effet de modulation équivalent ou supérieur à l’antisens (Tableau 1). Cela indique le rôle
prépondérant que joue la portion « tail » du TOSS.
Tableau 1 Effet de la portion « tail » du TOSS.
Des cellules SKOV3ipl ont été transfectées par 10 TOSS et leur portion antisens (ASO) et
l’ARN total a été extrait en colonne. Les valeurs moyennes d’expression relative globale,
de l’isoforme long et de l’isoforme court sont obtenues par PCR en temps réel représentent
un triplicats biologique. Aug. = l’isoforme est détecté, mais non quantifiable. NON = Sans
effet. A = modulation de type A. B = modulation de type B.
PCR en temps réel
Verdict
Oligonucléotide
Global
Court
Long
0.90
0.16
NON
1.05
C110RF17_AS0_1
1.46
0.09
A
0.85
C110RF17 TOSS 1
0.87
0.81
0.40
NON
CHEK2_ASO_l
0.34
0.78
1.46
A
CHEK2_TOSS_l
A
1.19
1.66
0.05
FGFR1 ASO 1
0.06
A
0.95
1.57
FGFRl_TOSS_l
0.81
0.90
0.83
NON
FGFR2 ASO 1
1.04
0.82
0.60
NON
FGFRl_TOSS_l
0.40
A
1.05
Aug.
CCNE1_ASO_ 1
1.32
0.72
A
Aug.
CCNEl_TOSS_l
0.20
A
1.10
2.25
KITLG ASO 1
0.92
0.12
A
4.00
KITLG_TOS S_ 1
1.01
0.36
A
0.76
FN1 ASO 2
2.06
A
1.00
0.15
FNl_TOSS_2
0.87
NON
1.15
2.08
MCL1 ASO 3
A
0.99
18.04
0.53
MCLl_TOSS_3
B
0.34
0.82
0.14
SYK ASO 1
A
0.03
0.63
1.20
SYK_TOSS_l
1.82
A
0.88
0.06
LIG4 ASO 1
0.74
4.24
0.14
A
LIG4_TOSS_l
122
Pour démontrer la contribution de hnRNP Al dans l’effet de modulation du TOSS,
Villemaire et collaborateurs (2003) avaient comparé Al_Bclx4 à un TOSS dont les deux
séquences de liaison pour hnRNP Al sont mutées (MAl_Bclx4). Ce dernier ne présente
que très peu d’affinité pour une version écourtée de hnRNP Al (UP1) comparativement à
Al_Bclx4 in vitro et ne possède aucun effet notable sur la modulation de l’alt5’ de
BCL2L1 lorsque transfecté dans les cellules HCT-116 (Villemaire J., mémoire de maîtrise,
Université de Sherbrooke). Nous avons non seulement cherché à confirmer ce résultat, mais
avons également comparé l’effet d’un contrôle de la portion « tail » muté sur deux autres
ASEs (exon 45 de CASP8 et exon 84 de KITLG). Dans tous les cas, l’effet d’un TOSS
ayant la version de la portion « tail » mutée est en mesure de moduler l’AS, mais dans une
plus faible mesure que la version originale (voir annexe 1). Dans un cas, une portion « tail »
comportant un 5’ss a également été testée et donne des résultats similaires à la version
mutée précédemment décrite (voir annexe 1). Cela permet d’affirmer que la version
originale est celle permettant la plus grande modulation.
2.2.2.2 Paramètres propres à la cible
2.2.2.2.1 Effet de la position du TOSS vis-à-vis le site 5 ’.
Conceptuellement, il est postulé que le recrutement de hnRNP Al via la portion « tail » du
TOSS augmente l’effet stérique du TOSS et bloque l’accès de U1 snRNP à son 5’ss
(Villemaire et al., 2003). Conséquemment, l’AS a lieu préférentiellement sur le site le plus
disponible. En ce sens, plus un TOSS est situé loin du site alt5’, moins il devrait être en
mesure de moduler l’AS. Nous avons vérifié cette hypothèse en variant la position du
TOSS par rapport au site 5’, et ce, pour deux événements d’exon cassette (Tableau 2). De
façon générale, il n’y a pas de corrélation entre les valeurs de Axjr
(\|/ lf
-
V toss )
et la
distance en nucléotides par rapport au site 5’. Nous concluons en nuançant que l’action de
modulation du TOSS ne passe pas nécessairement par un blocage stérique du site 5’, mais
plutôt par la présence de hnRNP Al dans un contexte exonique.
123
Tableau 2 Effet de la position du TOSS par rapport au site 5’ d’épissage.
Des cellules SKOV3ipl ont été transfectées par six TOSS dont la distance varie vis-à-vis le
site 5’ et l’ARN total a été extrait en colonne. Les valeurs moyennes de À\}/ ( \ ] / Lf - vj/ross)
ont été calculées à partir des valeurs obtenues par endpoint PCR pour trois réplicats
biologiques.
TOSS______________Distance (nt)
Av|t
MCLl_cass_l_t
-38
66
MCLl_cass_2_t
-31
61
MCLl_cass_t___________ -2_________ 25
SHMTl_cass_l_t
-58
54
SHMT1,_cass__2_t
-49
41
SHMTl_cass t
0
52
Pour appuyer cette hypothèse, un TOSS (Al_KITLG_int8396_pl5) dont la portion antisens
s’hybride dans l’intron en aval de l’exon alternatif 84 de KITLG (+15 à +35) a été dessiné.
Pour favoriser le blocage stérique, la portion « tail » du TOSS est positionnée en 3’
(Gendron
et
al.,
2006).
Contrairement
au
contrôle
positif
KITLG_TOSS_l,
Al_KITLG_int8396_pl5 n’a généré aucune modulation (voir annexe 1). L’ensemble de
ces résultats converge vers un modèle permettant l’action du TOSS à distance et suggère sa
présence exonique comme nécessaire pour la modulation.
2.2.2.2.2 Type d ’événement d ’épissage.
Originalement, le TOSS a été employé pour moduler l’AS de l’alt5’ de BCL2L1. Nous
avons également ciblé l’alt5’ de BMP4 à l’aide de deux TOSS. BMP4_345_2_t produit une
forte modulation de l’isoforme court alors que BMP4_345_l_t génère une augmentation
modeste de l’isoforme court. Dans les deux cas, l’isoforme long est diminué et l’expression
globale n’est pas affectée (voir annexe 1). La reprogrammation d’un alt5’ n’est donc pas
exclusive à BCL2L1. Dans les paragraphes précédents, nous avons généralisé son emploi
avec succès aux exons cassettes simples (BTC, C llo rfl7 , CCNE1, CHEK2, FN1, KITLG,
LIG4, MCL1, SHMT1, SYK) qui constituent en fait le type d’événement alternatif le plus
fréquent chez l’humain.
2.2.2.2.2.1 Exons cassettes multiples.
Le TOSS module efficacement la plupart des exons cassettes simples. Qu’en est-il lorsque
deux exons alternatifs sont consécutifs? Est-ce que le TOSS reprogramme l’AS vers
124
l’isoforme le plus court possible (les exons alternatifs sont alors perçus comme un seul
grand bloc d’exon alternatif) ou l’action du TOSS est restreinte à l’exon alternatif ciblé?
Pour répondre à ces questions, trois événements de cassette double (APP, FGFR2 et
F ANC A) ainsi que trois événements de cassette triple (PTPN13, NRG1 et BCAS1) ont été
sélectionnés. Pour chaque événement, un TOSS a été dessiné sur le premier (FGFR2,
FANCA) ou sur le dernier (APP, PTPN13, NRG1, BCAS1) exon alternatif. En plus des
amorces de endpoint et de PCR en temps réel amplifiant spécifiquement l’exon alternatif
ciblé par le TOSS, des amorces endpoint PCR circonscrivant l’ensemble des exons
alternatifs consécutifs ont été conçues. Lorsque c’était possible, des amorces de PCR en
temps réel ont été élaborées de façon à quantifier des isoformes potentiellement modulées
par le TOSS. Dans le cas de FGFR2_TOSS_l et NRGl_cass_L_t aucune modulation n’a
été détectée. Seul PTPN13_cass_t a généré une modulation de type A alors que les actions
de APP_cass_t, BCASl_cass_t et FANCA_cass_L_t ont été classifiées comme étant de
type B (voir annexe 1). Dans l’ensemble, la reprogrammation du bloc d’exon alternatif
entier n’a jamais été observée. L’action du TOSS est donc spécifique à l’exon ciblé.
22.2.2.2.2 Alt3'.
Selon notre modèle actuel, le TOSS situé sur un exon alternatif agit en reprogrammant l’AS
vers le site 5’ en amont, favorisant ainsi une version d’isoforme plus courte. Qu’en est-il
des alt3’? Des études ont démontré que hnRNP Al peut créer de l’interférence avec U2
snRNP (Tange et al., 2001, Martins de Araujo et al., 2009). Il est alors possible que l’action
du TOSS puisse influencer la décision d’épissage au 3’ss. Un TOSS (DRFl_alt3JL_t) a été
dessiné sur l’exon 117 de DRF1 entre les deux sites alternatifs 3’ (Fig. 11 A). Avec des
amorces circonscrivant ces deux 3’ss alternatifs, on note une baisse marquée de la valeur de
\|/ (Fig. 11C, en haut). Par contre, lorsqu’une paire d’amorces circonscrivant l’exon
alternatif 117 en entier est utilisée, on note également une diminution de la valeur de y
(Fig. 11C, au milieu). Cela est surprenant puisqu’aucune isoforme sans l’exon 117 en entier
n’a été rapportée jusqu’ici (Thierry-Mieg and Thierry-Mieg, 2006). Des réactions de PCR
en temps réel spécifique à l’isoforme long ou commune à l’isoforme long et moyen (global)
indiquent une diminution de l’expression (Fig. 11C, en bas). Bien que l’isoforme court
contenant l’exon 52 n’a pu être quantifiée adéquatement dû à sa faible expression, l’action
125
du TOSS ne fait pas augmenter pour autant son expression (résultat non montré). Tout cela
suggère que DRFl_alt3_L_t agit comme modulateur de type B en réprimant l'exon
alternatif 117 en entier, mais ne reprogramme pas vers le site alt3’ en aval tel que souhaité.
i
Altematif 3
DRF1 aK3 L t
65 52i
Exon cassette
B
End-point PCR
(alternatif 3')
End-point PCR
(exon cassette)
■ Global
■ Long
■ Moyen
Court
Ctrl TOSS
DRF1 a»3L t
Figure 11 Modulation de l’alt3’ de DRF1.
A) Schéma représentant la position de DRFl_alt3_L_t sur l’exon 117 de DRF1. B) Schéma
représentant la position des amorces PCR utilisées pour la détection des isoformes de
DRF1. C) Des cellules SKOV3ipl ont été transfectées par DRFl_alt_3_L_t, Ctrl TOSS et
l’ARN total a été extrait en colonne. Dans le haut (alternatif 3’) et le milieu (exon cassette),
les histogrammes présentent les valeurs moyennes de vj/ par endpoint PCR pour trois
réplicats biologiques. Dans le bas, les histogrammes présentent les valeurs moyennes
d'expression de l'isoforme long (noir) et de l'isoforme moyen (carrelé) de DRF1 par rapport
à l'exon 117 par PCR en temps réel pour trois réplicats biologiques. DRFl_alt_3_L_t se
comporte comme un siRNA spécifique à l'isoforme long (modulation de type B).
2.2.2.2.23 Cas complexe de type exon cassette-alt5'.
Comme le TOSS module l'AS tant sur des alt5' que sur les exons cassettes, nous nous
sommes demandé quel serait le résultat de reprogrammation d'un TOSS situé sur un préARNm comportant à la fois un alt5' et un exon cassette en compétition. Le gène NUP98 est
126
un exemple où le transcrit subit de l’AS pour produire trois isoformes. L'exon 222 peut être
présent (long) ou non (court), mais il existe également un site alt5' à l'intérieur de l’exon
222, produisant l'exon 131 (moyen, Fig. 12A). Deux TOSS ayant des séquences antisens
complètement différentes ont été dessinés pour cibler la région située entre les deux sites
5’ss alternatifs sur l'exon 222 (Fig. 12A). Lorsque des amorces de endpoint PCR
circonscrivent entièrement l'exon 222, on remarque que l'effet de modulation est plus
prononcé dans le cas de NUP98_cass_l_t comparativement à NUP98_cass_t (Fig. 12C, en
haut). De plus, l'effet de ce dernier est nul sur la modulation du site alt5' alors que
NUP98_cass_l_t parvient à le moduler (Fig.
12C, au milieu).
Les effets de
NUP98_cass_l_t sont confirmés par l'augmentation du transcrit court et une diminution du
transcrit long, tel que quantifié par PCR en temps réel (Fig. 12C, en bas). De plus, les
quantités basales de transcrit moyen sont indétectables, mais un traitement avec
NUP98_cass_l_t permet de le détecter, corroborant la reprogrammation vers le site
alternatif 5’ produisant l’exon 131. Comme l'expression globale n'est pas affectée,
NUP98_cass_l_t est un modulateur de type A. Les mêmes tendances sont observées pour
NUP98_cass_t, mais dans une moindre mesure, corroborant les résultats endpoint PCR.
Dans le but de déterminer le rôle de la portion « tail » (donc indirectement de hnRNP Al)
vis-à-vis l'antisens, des contrôles sans portion « tail » (portion antisens seulement) ont été
dessinés. Ceux-ci sont en fait identiques aux deux TOSS précédemment décrits excepté
qu'ils ne possèdent pas de séquence de recrutement hnRNP A l. Les expériences endpoint
PCR confirment non seulement la capacité unique de NUP98_cass_l_t à moduler le site 5'
alternatif, mais que cet effet dépend de la portion « tail » du TOSS (Fig. 12D). En
conclusion, NUP98_cass_t promeut l'exclusion de l'exon 222 alors que NUP98_cass_l_t
permet de moduler à la fois l'exon 222 et le site alt5'.
127
NUP98 c a s s t
Exon cassette
NUP98 c a s s 1 t
ââ
91
131 91
B
End-point PCR
(exon cassette)
End-point PCR
(alternatif 5')
*
"*
2
a Global
â
-tt-mm
■Long
222
4 00
200
nnn
J- f h
. a n t*i. Æé f t . ifti
LF
CW T O SS
ta Moyen
J
□ Court
D
Exon cassette
latif 5’
LF
Ctrl
Antisens
Ctrl
TOSS
NUP93_ NUP98_ NUP98_ NUP98_
cass as cass t cass 1 as cass 1 t
âm
■
NU P98_
c a ss_ t
J
Ulff
NUP98_
cass_ 1 _ t
J
™r
128
Figure 12 Modulation de l’événement d ’épissage alternatif complexe (exon cassette et
alt5') de NUP98.
A) Schéma représentant la position de NUP98_cass_t et NUP98_cass_l_t sur l’exon 222
de NUP98. B) Schéma représentant les amorces PCR utilisées pour la détection des
isoformes de NUP98. C) Des cellules SKOV3ipl ont été transfectées par NUP98_cass_t,
NUP98_cass_l_t, Ctrl TOSS et l’ARN total a été extrait en colonne. Dans le haut (exon
cassette) et le milieu (alternatif 5’), les histogrammes présentent les valeurs moyennes de y
par endpoint PCR pour trois réplicats biologiques. Dans le bas, les histogrammes présentent
les valeurs moyennes d'expression relative globale (gris), de l'isoforme long (noir), de
l’isoforme moyen (carrelé) et de l'isoforme court (blanc) de NUP98 par rapport à l'exon 222
par PCR en temps réel pour trois réplicats biologiques. D) Des cellules SKOV3ipl ont été
transfectées par NUP98_cass_as, NUP98_cass_l_as, des versions sans portion « tail » des
TOSS étudiés en C. Dans le haut (exon cassette) et le bas (alternatif 5’), les histogrammes
présentent les valeurs moyennes de \|/ par endpoint PCR pour trois réplicats biologiques.
2.2.2.2.2A Cas complexe de type exon cassette-alt3'.
Qu’arrive-t-il maintenant lorsqu’un site alt3’ est en compétition avec l'exclusion d'un exon
cassette? En nous basant sur les résultats acquis pour les gènes DRF1 et NUP98, nous
spéculons qu'un TOSS situé sur l'exon cassette en aval du site alt3' produirait uniquement
l'exclusion de l’exon alors qu'un TOSS situé entre les deux sites alternatifs 3' produirait une
répression spécifique de l'isoforme le plus long. Pour le démontrer, nous avons d'abord
choisi de dessiner un TOSS sur l'événement complexe de TOPBP1. Comme la portion
alternative entre les deux sites 3' ne fait que 15 nucléotides, le TOSS TOPBPl_alt3_L_t a
été exceptionnellement dessiné à la jonction intron-exon de l'intron 715 et de l’exon 167
(Fig. 13A). La valeur de \jt calculée suivant la réaction endpoint PCR circonscrivant
entièrement l'exon 167 indique un effet positif de TOPBPl_alt3_L_t (Fig. 13C, en haut).
Par contre, les résultats de la réaction spécifique à l'événement alt3' indiquent que
TOPBPl_alt3_L_t n’a aucun effet sur le ratio isoforme long/isoforme moyen (Fig. 13C, au
milieu). De plus, les résultats d’expression des isoformes long et moyen sont corroborés par
PCR en temps réel (Fig. 13C, en bas). Cela est surprenant puisque TOPBPl_alt3_L_t n’est
pas supposé affecter les niveaux de transcrit moyen. Un alignement de séquence entre la
portion « tail » et la séquence exonique suivant le site alt3’ suggère que le TOSS s’hybride
également à l’isoforme moyen. Nous en concluons qu'il s'agit d'une répression des
iso formes long et moyen de TOPBP1: une modulation de type B.
129
Nous avons également procédé à l'évaluation d'un autre cas d’AS complexe de type
cassette-alt3': l'exon 551 du gène L1G3. Cette fois, nous avons dessiné deux TOSS; l'un en
amont (LIG3_cass_2_t), l'autre en aval (LIG3_cass_4_t) du site alt3' de l'exon 551. Tel
qu'il a étéattendu. l'essai endpoint PCR spécifique à l'événement alt3' démontre clairement
que seul LIG3_cass_2_t possède un effet sur le ratio du long (exon 551) vis-à-vis le moyen
(exon 331) alors que les deux TOSS indiquent des valeurs de \[/ diminuées avec la réaction
PCR spécifique à l'exon 551 entier (voir annexe 1).
100
80
fin
T0PB P1 alt3 L t
£
3’ 3’
y \ 3'
15 152 - J h H 1/ ..
End-point PCR
(exon c a sse tte
Et alternatif 3’)
.. „
HMoyen
court
20
0
Alternatif 3'
3.00
□ Global
■ Long
40
100
80
60
a. 40
20
n
B
Exon cassette
7 ^ -E Z a
167
>15 l à - / -
% 2.50
fi
2.00
c
o 1.50
? 1.00
a.
tu 0.50
0.00
Ctrl T O SS T 0P B P 1 alt3 L t
J §
■
Figure 13 Modulation de l'événement d ’épissage alternatif complexe (cassette et alt3')
de TOPBPI.
A) Schéma représentant la position de TOPBP1 jiR3_L_t sur l’exon 167 de TOPBPI. B)
Schéma représentant les amorces PCR utilisées pour la détection des isoformes de
TOPBPI. C) Des cellules SKOV3ipl ont été transfectées par TOPBPl_alt3_L_t, Ctrl TOSS
et TARN total a été extrait en colonne. Dans le haut (exon cassette) et le milieu (alternatif
3"), les histogrammes présentent les valeurs moyennes de \f/ par endpoint PCR pour trois
réplicats biologiques. Dans le bas, les histogrammes présentent les valeurs moyennes
d’expression relative globale (gris), de l'isoforme long (noir) et de l'isoforme moyen
(carrelé) de TOPBPI par rapport à l'exon 167 par PCR en temps réel pour trois réplicats
biologiques. Le TOSS TOPBPI__alt3 L t procure une modulation de type B.
130
2.2.2.2.2.5 Cas complexe de type exon cassette-alt3'-rétention d'intron.
Outre l’exon cassette, les alt3’ et alt5\ il existe un autre type d'événement simple: la
rétention d ’intron. Quelques exemples d’AS in vitro impliquent hnRNP Al pour sa capacité
à promouvoir l’épissage d’intron (Tange et a i, 2001, Wang et al., 2006). De ce fait, nous
émettons l'hypothèse qu'un TOSS situé dans l'intron pourrait augmenter l'efficacité
d'épissage du 5'ss en amont et du 3'ss en aval. Pour illustrer la rétention d'intron, nous
avons choisi l’événement complexe (alt3', exon cassette et rétention d'intron) de FN1. Deux
TOSS ont été dessinés; l'un exonique, en amont du 3’ss alternatif (FNl_alt3_L_t) et l'autre
intronique, en amont du site 3'ss de l'exon 107 (FNl_intron_L_t, Fig. 14A). Dans un
premier temps, on note que seul FNl_alt3_L_t module le site alt3' (Fig. 14C, en haut).
Dans un deuxième temps, les deux TOSS font chuter le ratio isoforme long/isoforme
moyen sans intron (Fig. 14C, au milieu). Dans le cas de FNl_alt3_L_t, ceci est dû à une
répression des deux isoformes contenant la portion alternative 3' (iso forme long et iso forme
moyen sans intron) tel qu’il a été montré par PCR en temps réel (Fig. 14C, en bas). Dans le
cas de FNl_intron_L_t, l'expression globale n'est pas affectée et les niveaux d'ARNm de
l'isoforme long sont diminués, concluant avec l’inhibition de la rétention d'intron (Fig. 14B,
en bas). Par contre, nous avons été en mesure de détecter l'isoforme court seulement qu'en
présence de FNl_intron_L_t. De plus, l'exclusion du bloc en entier (exon 467 au complet)
n'a pas été observée pour aucun des TOSS (résultats non-montrés). Cela signifie que le
TOSS FNl_intron_L_t agit non pas sur la rétention d'intron, mais sur l’exon cassette en
aval, permettant l'exclusion de l'exon.
Par la suite, nous avons tenté de cibler deux autres gènes ayant des événements de rétention
d'intron, soit POLI (POLI_intron_L_t) et TSSC4 (TSSC4_intron_L_t). Dans les deux cas,
l'essai endpoint PCR avec des amorces circonscrivant l'intron alternatif permet d'observer
une diminution de la valeur de \\f lorsque des cellules SKOV3ipl sont traitées avec ces
TOSS ciblant l'intron. Cela suggère que le TOSS favorise l'épissage de l'intron. Par contre,
il n'a jamais été possible de quantifier l'augmentation de l'isoforme épissé (court) par PCR
en temps réel, et ce, dans les deux cas. En fait, seul l'isoforme long de TSSC4 a pu être
quantifié, mais celui-ci n'est pas affecté par le traitement de TSSC4_intron_L_t. Quant à la
variation de l'expression globale, elle demeure inchangée (voir annexe 1). Vu les résultats
131
contradictoires, il n'est donc pas possible de conclure que les TOSS permettent une
modulation d'événement de rétention d'intron.
FN1 alt3 L t
â
100
FN1 intron L t
«
a
S'Aa'
75 192 93 107
Alternatif 3 ’
80
60
40
20
0
T T ^ r
too
B
•
End-point PCR
20
►
0
S 3.00
□ Global
■ Long
a Moyen
sans intron
Moyen
exon 192
□ Court
R étention d'intron
80
60
40
/ /
I tj'.L .I
467
iW i l i
U
ï 2 00
C
| L00
T ^cr
267
192
107 W m -//107 E D - # 107 â - #
1 T
M0 00
LF
Ctrl T O S S
FN 1_
a|û _ L _ t
M
FN 1_
intron L t
J âÊ
u«m
mu»
Figure 14 Modulation de l’événement d ’épissage alternatif complexe (exon cassette,
alt3' et rétention d'intron) de FN1.
A) Schéma représentant la position de FNl_alt3_L_t, FNl_intron_L_t, Ctrl TOSS sur
l’exon 467 de FN1. B) Schéma représentant les amorces PCR utilisées pour la détection des
isotbrmes de FN1. C) Des cellules SKOV3ipl ont été transfectées par FNl_alt3JL_t et
FNl_intron_L_t et TARN total a été-extrait en colonne. Dans le haut (alternatif 3’) et le
milieu (rétention d’intron), les histogrammes présentent les valeurs moyennes de \)/ par
endpoint PCR pour trois réplicats biologiques. Dans le bas. les histogrammes présentent les
valeurs moyennes d'expression relative globale (gris), de l’isoforme long (noir), de
l'isoforme moyen sans intron (carrelé) et de l’isoforme court (blanc) de FN1 par rapport à
l'exon 467 par PCR en temps réel pour trois réplicats biologiques.
132
2.3 Développement de stratégie générale réprimant l ’expression de l ’isoforme court
2.3.1 TOES dépendant de SF2
Le TOSS reprogramme les exons cassettes et les alt5' avec un haut taux de succès en
favorisant l'isoforme court. Nous nous sommes demandé s'il était possible de concevoir un
outil aussi général favorisant cette fois l'inclusion d’exon (l’isoforme long). Cet outil pluriel
est d'autant plus attrayant puisqu'il est susceptible de procurer un gain de fonction. Des
exemples sporadiques sur le développement de stratégies favorisant l'inclusion d'exon ont
été rapportés dans la littérature, la plupart ciblant le gène survival of motor neuron 2
(SMN2) (Skordis et a l, 2003, Cartegni and Krainer, 2003, Hua et al., 2007, Madocsai et
al., 2005). Nous nous sommes inspirés du dessin de TOES (targeted oligonucleotide
enhancer of splicing) de Skordis et collaborateurs (2003), (même chimie, portion « tail »,
longueur d'antisens et position sur l'exon) pour cibler deux ASEs dont l'exclusion de l'exon
est associée avec le cancer de l'ovaire (Klinck et al., 2008). Dans les deux cas, l’essai
endpoint PCR indique une augmentation du V|/ lorsque des cellules cancéreuses sont
transfectées par nos TOES (Fig. 15A). Comme les modifications PS procurent des effets
hors cibles notoires (Levin, 1999), nous avons contrôlé cette expérience avec des TOES de
même séquence, mais modifié complètement de 2'OMe (même chimie que le TOSS, en
omettant toutes modifications PS). Les résultats sont marquants: pour les deux gènes testés,
l'effet d'inclusion est aboli suite au traitement des TOES sans PS (Fig. 15A).
Il est possible que la perte de modulation de l'AS soit directement reliée à la perte d'affinité
de SF2 pour la portion « tail » en 2'OMe. Pour répondre à cette question, nous avons fait
synthétiser des oligonucléotides de différentes chimies (ADN, ARN et 2'OMe) avec ou
sans phosphorothioate (PS) correspondant à la séquence originale de la portion « tail » du
TOES. Une quantité de SF2-GST correspondante au EC50 (165 nM final) a été incubée
avec chacun des oligonucléotides 10 min dans un tampon HEPES avant d’être séparée sur
gel d ’acrylamide 4% non-dénaturant. Dans cet essai de retard sur gel, nous avons observé
que la portion « tail » a plus d’affinité pour l’ARN et le 2’OMe, mais pas pour l’ADN
(ARN = 2’OMe »
ADN). L ’affinité de liaison avec SF2 est légèrement majorée par les
modifications PS (Fig. 5B). Ceci suggère que les versions 2’OMe et ARN-PS des TOES de
133
la figure 5A se lient similairement à SF2. ce qui rf explique donc pas la différence d'impact
au niveau des ASEs ciblés. En effet, des cellules SKOV3ipl transfectées par une version de
SF2_KITLG_2'OMe
dont
la portion
« tail » est
uniquement
constituée
d'ARN
(SF2_KITLG_RNA) ne procurent pas les effets d’inclusion de son homologue
SF2_KITLG_PS (résultats non montrés). Ce qui tend à montrer que les effets de
modulation de TAS sont dépendants des modifications PS. En contrepartie, les
oligonucléotides en ARN simple brin sont plus propices à la dégradation que ceux modifiés
2'OMe et/ou PS. Il est donc possible que l'absence d'effets de SF2_KITLG__RNA soit
principalement due à sa dégradation précoce. Or, nous avons déjà démontré à la figure 9C
qu’un TOSS dont la portion « tail » est en ARN peut procurer des effets sur PAS qui se
situent à mi-chemin entre l’effet de l’antisens résiduel et celui de la version en 2'OMe
(Tableau 1). Ceci suggère qu’une portion « tail » en ARN est en mesure de résister
suffisamment à la dégradation pour induire un effet sur CAS. Conséquemment, l’ensemble
des résultats suggère que les modifications PS sont responsables des effets sur l'inclusion
d’exon.
A
103-
100
LOALS9
80 -
K ITLG
80
80 °" 4 0-
2D0•
■
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t
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—
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SF2JÆALS9J5
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LF
SF2J<TTLG_PS
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100
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complexé
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0
100
L _________________
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Portion
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PS
2’OMe
DNA
RNA
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SF2
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KH
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PS
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SF2
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K IT L G _
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&
im
134
Figure 15 Impact de la chimie du TOES sur la modulation de l’AS.
A) Effet de la modification PS sur la modulation de l’AS du gène cible. À droite: Des
cellules SKOV3ipl (droite) et NIH-OVCAR-3 (gauche) ont été transfectées pendant 24 h
par 480 nmol de SF2_LGALS9_PS, SF2_LGALS9_20Me (droite) et SF2_KITLG_PS,
SF2_KITLG_20Me (gauche). L’ARN total a été extrait au Trizol®. Les histogrammes
présentent les valeurs moyennes de \|/ obtenues par endpoint PCR pour trois réplicats
biologiques. L’augmentation de \|/ du gène cible est dépendante de la modification PS. B)
Effet de la chimie de la portion « tail » sur la liaison à SF2. Des oligonucléotides d ’ADN
(vert), d’ARN (noir) et 2’OMe (rouge) avec ou sans PS (carré gris) correspondant à la
séquence de la portion « tail » ont été testés pour leur affinité pour SF2-GST. Piste 1:
portion « tail » RNA sans SF2-GST. Piste 2 à 7: Différentes chimies de portion « tail » avec
SF2-GST. SF2 se lient préférentiellement à une séquence de chimie ARN. C) Effet de PS
sur l’AS de gène hors cible. Des cellules SKOV3ipl ont été transfectées pendant 24 h par
480 nmol de
ASO_KITLG_PS,
AS0_KITLG_20Me,
SF2_KITLG_PS
ou
SF2_KITLG_20Me. L’ARN total a été extrait au Trizol®. Les histogrammes présentent
les valeurs moyennes de xj/ obtenues par endpoint PCR et les barres d’erreur représentent la
déviation standard obtenue pour trois réplicats biologiques.
Pour démontrer définitivement l’effet toxique des PS sur PAS, des cellules SKOV3ipl ont
été transfectées par des oligonucléotides de différentes longueurs et séquences possédant ou
non des modifications PS ciblant KITLG. Un essai endpoint PCR a été effectué pour
vérifier la modulation de l'AS de gènes hors cibles (LGALS9, BCL2L1). Les résultats sont
nets: la modulation de l'AS est dépendante de la modification PS indépendamment des
séquences utilisées (Fig. 15C). De plus, un examen des cellules au microscope permet
d’identifier à l’œil les puits traités aux PS des puits non traités, car une grande proportion
des cellules se décollent et flottent dans le milieu sous l’action des PS. Il est donc fort
probable que le dérèglement de l’AS reflète en fait l’état de crise des cellules et ne soit pas
du tout une conséquence directe de l’action du modulateur. Ceci corrèle avec des travaux
sur l’antisens Genasense qui ont montré que des oligonucléotides PS induisent l’apoptose
de cellules cancéreuses avant même leur effet sur l’ARNm (Lai et al., 2006). Ceci appuie
notre argumentation à l’égard des modifications PS. Bien que celles-ci confèrent des
propriétés de modulation de l’ASE cible, elles permettent la modulation de plusieurs autres
ASEs, diminuant du même coup la spécificité d'action du TOES. À noter que le Ctrl TOSS
est entièrement composé de chimie 2’OMe et ne donne que rarement de tels effets hors
cibles (comparer les Figs. 1,5,6,8,10,11,12,13 et 14). En résumé, la modulation de l’AS est
135
une conséquence indirecte due aux oligonucléotides PS et non une cause directe de l’action
du modulateur.
Les effets de la portion « tail » des TOES testés semblent dépendants du contexte de l’exon
pour lequel cela a été originalement dessiné. Pour réussir à moduler l’AS spécifiquement et
indépendamment de PS, nous avons choisi d’exploiter une autre séquence de recrutement
pour SF2 (5’-GAUGGUGAAGAAGACACUGC-3’>, cette fois-ci préalablement validée
dans un contexte hétérologue. Cette séquence initialement retrouvée dans l’exon EDA du
gène FN1 favorise l’inclusion lorsqu’elle est insérée dans l’exon EDB (Muro et a l, 1999).
Ainsi, nous postulons que le TOES élaboré à partir de cette séquence permettra de favoriser
l’inclusion de l’exon EDB. Des cellules SKOV3ipl ont été transfectées par deux TOES
possédant cette nouvelle portion « tail », mais aucun n’a été en mesure de stimuler l’exon
EDB (résultats non montrés). Ceci indique clairement que l’inclusion d’exon via le
recrutement de SF2 est difficile à généraliser selon notre modèle de TOES.
2.3.2 TOES dépendant de RBFOX2
Comme le TOES dépendant de SF2 semble difficile à généraliser, nous nous sommes
tournés vers une stratégie de TOES où la portion « tail » recrute un facteur d’épissage dont
la séquence de liaison est un ISE. Ainsi, il est postulé que l’effet basai d’exclusion de la
portion antisens sera moins grand si nous avons recours à des TOES dont l’antisens se lie à
des séquences introniques. RBFOX2 est un facteur d’épissage qui manifeste ses effets
favorisant l’inclusion d’exon via la liaison à l’hexamère UGCAUG souvent présent en aval
d’exon cassette. Notre expérience avec RBFOX2 nous a permis d’identifier des ASEs qui
lui sont sensibles et indifférents par des stratégies de répression par siRNA en cellules
(Venables et al., 2009). Dans un premier temps, nous avons ciblé quatre ASEs (ECT2,
INSR, MPRIP et NDEL1) des plus sensibles à RBFOX2 avec des SSO 2’OMe. Ceux-ci
sont destinés à bloquer l’action de RBFOX2 en ciblant une séquence UGCAUG intronique
située dans les 100 nt suivants le 5’ss. Il est postulé que l’effet sera similaire à celui d ’une
répression de l’expression de RBFOX2. Ainsi, il serait ultimement possible de restituer la
dépendance à RBFOX2 en ajoutant une portion « tail » munie d’une séquence UGCAUG
(Fig. 16A). De façon surprenante, aucun des antisens ne parvient à moduler l’épissage des
136
cibles testées (résultats non montrés). Ces résultats nous laissent avec au moins trois
hypothèses: 1) L’action de RBFOX2 est principalement médiée par sa liaison à UGCAUG,
mais n’est pas gênée par la présence de l'antisens et se lie au double brin; 2) L’action de
RBFOX2 est médiée de façon redondante via plusieurs séquences de liaisons UGCAÜG; et
3) l’action de RBFOX2 est principalement indépendante de sa liaison à UGCAUG. Nous
ne sommes pas en mesure de rejeter l’une ou l’autre de ces hypothèses présentement, bien
que la deuxième soit préférée.
A
C
Figure 16 Autres stratégies favorisant l’inclusion de l’exon alternatif.
A) ASE dépendant de RBFOX2. Dans le haut: Masquage du site de liaison de RBFOX2
(ISE) par un SSO 2’OMe permettant de diminuer l’inclusion de l’exon alternatif. Dans le
bas: Récupération de la dépendance à RBFOX2 en introduisant une séquence liant
RBFOX2 via le même antisens 2’OMe. B) ASE indépendant de RBFOX2. Introduction
d’une séquence liant RBFOX2 via une portion antisens 2’OMe positionné en aval du 5’ss
de l’exon alternatif pour augmenter son inclusion. C) Cibler le 5’ss constitutif eu amont
(haut) ou le 3’ss constitutif en aval (bas) avec un SSO 2’OMe.
Dans un deuxième temps, nous avons ciblé quatre ASEs (AX1NI. BTC, FNI-EDA et
STIM1) indifférents à RBFOX2 avec des portions antisens 2’OMe et une portion « tail »
munie
d’une
(5*-CCCACCGCCUGCAUGCACUGCUCAC-3’)
UUG CA UG C UG UUG C A11GC GG U-3 ’) séquences
UGCAUG
afin
ou
de
deux
(5’-
les rendre
dépendants à RBFOX2 (Fig. 16B). Dans tous les cas, nous n’avons pas observé de
stimulation de l’exon alternatif, pas plus que l’exclusion d’exon souvent retrouvée lorsque
l’exon est directement ciblé (résultats non montrés). Nous en concluons que les stratégies
137
de type TOES favorisant l’inclusion d’exon basée sur SF2 ou RBFOX2 ne sont pas en
mesure d’influencer suffisamment la décision d’AS pour s’avérer efficace dans la plupart
des cas.
2.3.4 Antisens ciblant les jonctions constitutives
Vu les résultats infructueux de la stratégie TOES, nous avons pensé à une stratégie
indépendante du recrutement de facteur d’épissage. En bloquant le 5’ss constitutif en amont
d’un exon cassette, ceci interférera avec l’épissage du 3’ss de l’exon alternatif et le 3’ss de
l’exon constitutif en aval, mais pas avec l’épissage du 5’ss de l’exon alternatif et le 3’ss de
l’exon constitutif en aval (Fig. 16C). Suivant la même logique, il est théoriquement
possible de favoriser l’inclusion de l’exon alternatif en ciblant le 3’ss constitutif en aval
d’un exon cassette. Bien qu’il soit possible que le bloc d’une jonction constitutive se
répercute sur l’épissage constitutif et donc, sur l’expression globale, cette stratégie pourrait
s’avérer particulièrement avantageuse dans le cas d’ASE dont la séquence est courte et
donc difficile à dessiner. Nous avons mis en pratique cette stratégie en ciblant trois ASEs :
deux dont le 5’ss en amont a été ciblé (Cl lorfl7 et SLIT2) et un dont le 3’ss en aval a été
ciblé (SYNE2). Dans tous les cas, nous n’avons pas été en mesure d’observer une
augmentation notable de l’inclusion de l’exon alternatif (résultats non montrés). En
conclusion, les stratégies tentées pour généraliser la reprogrammation de l’inclusion de
l’exon ne se sont pas avérées un succès.
2.3.5 siRNAs spécifiques à l ’isoforme court
Dans le but de permettre une modulation de l’AS en faveur de l’isoforme long, nous nous
sommes tournés vers une technologie beaucoup plus mature : les siRNAs. En ciblant
spécifiquement l’isoforme court, la valeur de \|f ou Q\|/ sera à la hausse. Par contre, dans le
cas particulier des siRNAs ciblant spécifiquement l’isoforme court, aucune étude
systématique permettant de révéler des règles de dessin générales n’a été réalisée. Comme
les siRNAs sont des duplex d’une longueur de 19 bp, nous avons délimité la fenêtre de
dessin des siRNAs jonctions à 30 nt, soit 15 nt provenant de chacun des exons de la
jonction à cibler. Chacune des jonctions est flanquée d’un G constitutif, ce qui ne laisse
qu’un minimum de 3 mésappariements théoriques vis-à-vis l’isoforme long. La séquence
138
de 30 nt est soumise aux mêmes critères de dessin qu’un siRNA ciblant un exon, soit le
respect de l’asymétrie et l’absence de séquences hautement homologues (décrits dans le
chapitre 3). Règle générale, nous avons choisi deux siRNAs jonctions par ASEs. Pour
ceux-ci, les séquences guides potentielles ont été alignées sur les jonctions exon-exon
propres à l’isoforme long et les mésappariements ont été soigneusement annotés (voir
annexe 2). Dans tous les cas, les siRNAs jonctions possèdent un minimum de 3
mésappariements vis-à-vis chacune des jonctions exon-exon propres à l’isoforme long.
Afin de tester leur spécificité, des cellules SKOV3ipl ont été transfectées par des siRNAs
jonctions (10 nM final) ciblant TACC2, KIAA1217, SYNE2, APP, CD47 et C llo rfl7 .
Nous avons exploité la détection isoforme-spécifique par PCR en temps réel pour quantifier
chacun des isoformes séparément, seul moyen pour véritablement valider la spécificité du
siRNA jonction. En effet, la mesure du ratio d’isoforme (valeur de \|/) donnée par endpoint
PCR ne donne aucune information sur la quantité de l’un ou l’autre des isoformes, pas plus
que la valeur de la quantité globale. Tous les siRNAs dessinés s’avèrent spécifiques à
l’isoforme court sauf pour SYNE2 (annexe 2). Ce résultat incohérent nous a poussés à
analyser la similarité de la jonction exon 277-exon 140 de SYNE2 par rapport à la jonction
exon 277- intron 1777. Comme le pré-ARNm contient cette jonction exon-intron, l’effet
d’un siRNA ciblant l’intron serait similaire à l’effet d’un siRNA global, ce qui expliquerait
les effets de SYNE2_hitl_l_s sur l’isoforme long. En effet, une analyse de la séquence
intronique révèle une différence d’un seul nucléotide en position 1 (par rapport au siRNA).
Ceci suggère que la séquence intronique, autant que la séquence exonique doit être tenue en
compte lors du dessin de siRNAs jonctions.
139
2.4 Conclusions
Dans un premier temps, nous avons observé un artéfact PCR dû à la présence de TOSS
dans l’extrait d’ARN. En effet, une faible quantité de TOSS ajouté sur un extrait d’ARN
total suffit pour induire une modulation artéfactuelle du ratio d’isoforme in vitro. De façon
intéressante, nous avons remarqué qu’une extraction au Trizol® permet d’enlever le TOSS
d’un extrait d’ARN, et ainsi sa composante PCR artéfactuelle associée; alors qu’une
extraction en colonne ne le permet pas. La capacité à retenir ou non le TOSS dans l’extrait
d’ARN a été exploitée afin d’évaluer le véritable impact du TOSS résiduel 24 h posttransfection. L’ensemble des résultats indique que la composante artéfactuelle joue un rôle
mineur dans le cas de fort modulateur et possède un impact majeur dans le cas de faible
modulateur. De plus, l’augmentation de l’isoforme court et l’absence d’effet au niveau de
l’expression globale par PCR en temps réel démontre clairement les effets réels de
modulation des TOSS dans la plupart des cas. Nous avons donc utilisé la stratégie en
colonne pour le haut débit et les échantillons ont été purifiés au Trizol® en cas de doute.
Dans un deuxième temps, nous avons réalisé une série d’expériences afin de mettre au
point des règles de dessin de TOSS. Au total, 94 TOSS, TOSS contrôles et antisens ont été
testés. Les meilleures amplitudes de modulation sont obtenues avec un TOSS composé
entièrement de nucléotides modifiés en 2’OMe, une portion « tail » de séquence 5’-UAU
GAU AGG G AC UUA GGG UG-3’ et une portion antisens de 20 nucléotides
complémentaires à l’exon alternatif. Les effets sont indépendants de la position de
F antisens sur l’exon alternatif. Bien que la plupart des TOSS qui fonctionnent produisent
effectivement une réelle modulation que nous avons nommée type A, un certain nombre de
TOSS procurent un changement du ratio d’isoforme, mais également un changement
d’expression globale. Un TOSS doit donc être testé au moins par PCR en temps réel pour
son effet sur l’expression globale et par endpoint PCR ou PCR en temps réel pour son effet
sur le ratio d’isoforme. Le TOSS n’est pas limité aux sites alternatifs 5’ et permet de
moduler les exons cassettes simples et les sites alternatifs 3’ (type B seulement). Il permet
également de cibler spécifiquement un exon ou une région alternative d’un ASE complexe
ou de cassette multiple.
140
Dans un troisième temps, les résultats ont été compilés selon le type de modulation (type A,
type B) et le type d’ASE pour le premier TOSS dessiné par ASE afin d’évaluer le taux de
succès de dessin (Tableau 3). En faisant abstraction du faible nombre d’entrées pour les cas
de site alt3’ et 5’, on remarque que le taux de succès global est similaire peu importe le type
d’événement. Seuls les cas de rétention d’intron sont infructueux. Sauf pour les cas de site
alt3’, il ne semble pas y avoir de corrélation entre le type d’événement et le type de
modulation. En effet, outre le cas de site alt3’ du gène DRF1, deux autres cas d’événements
complexes mettant en cause des sites alternatifs 3’ (TOPBPI et LIG3) procurent des
modulations de type B, haussant le nombre à 3 en 3. Cela permet de conclure que les TOSS
ont une moyenne de 84% de succès lorsqu’ils ciblent des sites alternatifs 3’, 5’ ou des
exons cassettes, et ce, même s’il s’agit d’un événement complexe ou d’un exon cassette
multiple. De plus, la plupart des modulations sont de type A, faisant des TOSS des outils
moléculaires particuliers et distincts des siRNAs.
Finalement, plusieurs stratégies ont été élaborées pour tenter de favoriser l’inclusion d’exon
cassette. Par analogie à la stratégie TOSS qui recrute un facteur d’épissage se liant à des
ESS, nous avons testé la stratégie TOES qui consiste à recruter un facteur d’épissage se
liant à des ESE ou ISE. Ces approches n’ont pas été en mesure de stimuler l’AS de façon
notoire, pas plus que le ciblage des jonctions constitutives adjacentes. Le fait le plus
marquant est la modulation non spécifique de l’AS de façon PS dépendante. À l’inverse,
nous avons démontré la spécificité de plusieurs siRNAs ciblant la jonction exon-exon de
l’isoforme court et nous permet d’entrevoir la possibilité d’un criblage avec des siRNAs
longs (ciblant l’isoforme long) et siRNAs courts (ciblant l’isoforme court) afin de révéler la
fonction propre à chaque isoforme.
141
Tableau 3 Taux de succès des TOSS.
Les résultats ont été compilés selon le type de modulation (type A, type B) et le type d’ASE
pour le premier TOSS dessiné pour chacun des ASEs étudiés. Dans certain cas, les données
d’expression globale sont incomplètes et empêchent de définitivement conclure entre type
A et type B (A ou B). Les TOSS ont un taux de succès moyen de 84% (A ou B) et de 43 à
67% si l’on considère seulement la modulation de type A. ______________
Modulation
Taux de succès (%)
A B A o u B NON Total
A
B
0 1
Alt3'
0
0
1
0
100
1 0
1
Alt5'
0
2
50-100
0-50
Exon cassette
17 3
6
4
30
57-77
10-30
Complexe
2 2
2
1
7
29-50
25-50
Multiple
1
3 2
2
8
38-63
25-50
Rétention d'intron
0 0
0
2
2
0
0
Grand total
23 8
11
8
50
43-67
14-39
142
Chapitre 3
Alternative splicing of SYK regulates mitosis and cell survival
Auteurs de l’article: Prinos P, Garneau D, Lucier JF, Gendron D, Couture S, Boivin M,
Brosseau JP, Lapointe E, Thibault P, Durand M, Tremblay K, Gervais-Bird J, Nwilati H,
Klinck R, Chabot B, Perreault JP, Wellinger RJ, Elela SA.
Statut de l’article : Publié, Nature Structural & Molecular Biology 2011;18(6):673-9
Avant-propos
J’ai développé une méthodologie de validation des siRNAs et TOSS à haut débit qui a été
utilisée pour produire la figure 2. De plus, je suis intellectuellement impliqué dans la
conception de la figure 1. J’ai participé activement à la rédaction du texte de la section
« Matériels et méthodes supplémentaires ». De plus, le développement des outils
moléculaires présenté au chapitre 2 y est explicitement référé. Pour plus de détails,
consulter le « Author contribution » à la fin de l’article 2.
143
Mise en contexte
La cancérogenèse modifie l'expression des ARNm. Nous émettons l’hypothèse selon
laquelle certaines isoformes de f épissage alternatif ont des fonctions clés dans le processus
de cancérogenèse. Même si des analyses bioinformatiques prédisent que la plupart des
événements d’épissage affectant la portion codante des gènes produisent des isoformes
ARNm susceptible d’être traduites en protéine, il n’est pas clair quel en est l’impact sur
leur fonction.
En théorie, la relation fonctionnelle entre deux isoformes peut rejoindre l’un des quatre
modèles du tableau 1. D’abord, si un des deux isoformes produit une protéine excluant un
domaine fonctionnel donné ou est ciblé vers la voie de dégradation NMD, alors seul le
premier isoforme est doté d’une fonction cellulaire donnée. La quantité de transcrit de
celui-ci dictera donc l’effet phénotypique et l’action d’un TOSS ou d’un siRNA long
devrait être effectif. Par contre, l’effet d’un TOSS ou d’un siRNA long se manifestera
également lorsque les deux isoformes proposent des fonctions opposées ou ayant une
relation de type dominant-négatif. Même si c ’est le rapport entre les deux isoformes (ratio)
qui prime, ces deux relations fonctionnelles distinctes ne pourront être mises en évidence
que par un siRNA global. En revanche, l’action d ’un TOSS sera sans effet dans une
situation ou les deux isoformes ont des fonctions identiques dans un contexte donné
(compensatoire).
144
Tableau 1 Relation fonctionnelle entre les isoformes de l’AS et influence théorique des
outils moléculaires sur le phénotype.
Quatre modèles exprimant la relation fonctionnelle entre un gène théorique et ses deux
isoformes (A et B) sont présentés. L’analyse globale de l’impact d’un TOSS, siRNA long
(A), siRNA court (B), et siRNA global (A et B) sur un phénotype choisi permet de déduire
la relation fonctionnelle des iso formes pour un contexte donné. L’isoforme long et
l’isoforme court ont été attribués arbitrairement aux iso formes A et B, respectivement. V =
effet phénotypique. V’ = effet phénotypique inverse. — = sans effet phénotypique.
Monofonctionnel :
Seul l’isoforme
possède une
fonction
Compensatoire :
Les deux
isoformes ont
des fonctions
similaires
Fonction A
Fonction A
Fonction B
[ A]+[B]
Isoforme A
Isoforme B
Dépendance
du phénotype
TOSS
siRNA A
siRNA B
siRNA global
[A ]
V
V
—
<
Antagoniste
type I :
L’isoforme B
agit en
dominantnégatif
Fonction A
Fonction anti-A
[A ]/ [B ]
Antagoniste
type II :
Les deux
isoformes ont
des fonctions
opposées
Fonction A
Fonction Z
[A]/[B]
<
V
V
V
— (ouV’)
—
V
V
V
—
—
Le gène BCL2L1 est un modèle d’étude attrayant puisque l’isoforme court (Bcl-xs) code
pour une protéine pro-apoptotique alors que l’isoforme long
( B c 1-x l )
a des propriétés anti-
apoptotiques. Puisque leurs fonctions sont opposées, le ratio des deux isoformes devrait
théoriquement dicter le phénotype. Or en pratique, il n’est pas clair si une simple altération
du ratio des isoformes sans changement d’expression globale peut induire un phénotype en
cellules. En effet, peu d’études ont directement comparé les effets de répression (et
conséquemment, d’un changement de ratio d’isoforme) et d’une simple modulation
d’iso forme endogène sur le phénotype de cellules humaines. En fait, les résultats les plus
complets proviennent d’études sur le gène modèle BCL2L1 (Mercatante et al., 2001,
Mercatante et al., 2002). Même dans ce cas bien étudié, il n’est pas clair si un certain ratio
de
B c 1-xl/ B
c 1- x S
dicte l’induction d’apoptose ou si un niveau minimal de Bcl-xs doit être
respecté.
Pour répondre à cette question, un modulateur d’AS (splice-switching oligonucleotide,
SSO) de 18 nt de longueur en 2’OMe-PS (5’ Bel) a été utilisé pour moduler le 5’ss de Bel-
145
xl vers Bcl-xs. Pour réprimer globalement l’expression de BCL2L1, un antisens ciblant la
jonction constitutive intron2-exon3 (3’ Bel) fut utilisé (Mercatante et al., 2001). En temps
normal, un tel antisens favoriserait
B c 1 -x l
tout en diminuant globalement l’expression de
BCL2L1, mais comme Bcl-xs est indétectable par immuno-buvardage dans les PC-3, 3’ Bel
agit
à
toute fin pratique comme répresseur spécifique de
B c 1 - x l.
Dans un essai quantifiant
l’ADN sous-diploïde par FACS, 5’ Bel est environ deux fois plus puissant que 3’ Bel
à
induire l'apoptose. Les auteurs en concluent que l’augmentation de Bcl-xs est nécessaire
pour générer de l’apoptose et que la diminution de Bcl-xL n’est pas suffisante. En appui
à
cette conclusion, le niveau de cellules apoptotiques semble corréler positivement avec la
force promotrice des vecteurs de surexpression de Bcl-xs dans les cellules MCF-7
(Sumantran et a l, 1995, Clarke et al., 1995). Dans une deuxième publication, l’équipe de
Kole corrèle l’efficacité
à
induire l’apoptose et les niveaux protéiques de
B c 1 -x l
et Bcl-xs
(Mercatante et a i, 2002). Plus une lignée cellulaire exprime fortement le gène Bcl-x, plus
le traitement de 5’ Bel sera efficace, ce qui est consistant avec une augmentation des
niveaux absolus de Bcl-xs.
Ceci fait contraste avec les résultats obtenus précédemment par les chercheurs d’Isis
Pharmaceuticals et le groupe de Zangemeister-Wittke (voir tableau 3). Alors que les
premiers n’observent pas d’induction d’apoptose dans les cellules A549 avec un SSO
(Taylor et al., 1999), les derniers sont en mesure d’augmenter le nombre de cellules
apoptotiques en ciblant spécifiquement Bcl-xL dans la même lignée cellulaire
à
l’aide d ’un
antisens dépendant de la RNaseH, le gapmer 4259 (Leech et al., 2000). Plus encore, le
traitement au gapmer 4259 décroît considérablement la viabilité cellulaire des cellules
MCF-7 traitées, tel que jugé par un essai d’exclusion au bleu de trypan. À noter toutefois
que les effets semblent être également lignée-dépendants puisqu’ils ne sont pas observés
dans les cellules SW2 malgré une répression similaire de l’ARNm. À la lumière de ces
résultats, c’est le ratio
B c 1 -x l
/Bcl-xs qui dicte le phénotype et non le niveau absolu de Bcl-
xs. Un peu plus tard, l’équipe de Massimo Caputi s’est lancée dans la course en employant
une technologie d’oligonucléotide bifonctionnel conceptuellement apparenté au TOES
nommé ESSENCE (exon-specific splicing enhancement by small chimeric effectors)
(Wilusz et al., 2005). Il s’agit d’un antisens en PNA (peptide nucleic acid) couplé
à
un
peptide mimant un domaine RS de facteur d’épissage SR. Ce chimère est positionné en
146
amont du 5’ss de Bcl-xs et favorise la génération de Bcl-xs au détriment de Bcl-xL.
Contrairement
à
l’équipe de Kole, ceux-ci sont en mesure d’observer une induction
d’apoptose dans les cellules HeLa. Finalement, Dodier et Piché ont ciblé
B c 1 -x l à
l’aide de
siRNA isoforme-spécifique. Bien qu’ils observent une augmentation d’apoptose des
cellules CaOV3, les essais ont été infructueux dans le cas de deux autres lignées ovariennes
(SKOV3ipl et NIH-OVCAJR3) soulignant les effets type cellulaires dépendants (Dodier
and Piche, 2006).
Tableau 2 Comparaison des effets de modulateurs d'AS et de répression isoformespécifique du gène BCL2L1 sur l'induction d'apoptose dans des cellules cancéreuses
lumaines.
Lignées
Induction d’apoptose suivant une
Induction d’apoptose suivant une
cellulaires modulation de Bcl-xL vers Bcl-xs
répression spécifique de Bcl-xL
A549
Non (Taylor et al., 1999)
Oui (Leech et al., 2000)
MCF-7
Non (Mercatante et al., 2001)
Oui (Simoes-Wust et a i, 2000)
MDAOui (Mercatante et al., 2002)
Oui (Simoes-Wust et al., 2000)
MB-231
Non (Mercatante et al., 2002)
N.D.
HeLa
Oui (Wilusz et al., 2005)
N.D.
CaOV3
Oui (Dodier and Piché, 2006)
PC-3
Oui (Mercatante et al., 2001)
N.D.
N.D = Non-c isponible
Pour éclaircir ce mystère, nous avons testé le SSO 5’ Bel en parallèle avec le TOSS
Al_Bclx4 dans le meilleur modèle cellulaire décrit par Kole R : les cellules PC-3
(Mercatante et al., 2001). Bien que la modulation vers Bcl-xs soit évidente pour tous par
RT-PCR, la viabilité cellulaire décroît seulement lorsque les cellules sont traitées avec 5’
Bel. Comme nous avons déjà expérimenté des effets non-spécifiques dûs aux modifications
PS, nous avons contrôlé cette expérience en comparant les effets de 5’ Bel à une version de
5’ Bel sans PS et à un autre oligonucléotide PS ciblant un autre gène (P-globin). Résultat: la
viabilité cellulaire est dépendante de la présence de PS et indépendante de la modulation
des iso formes. Des essais par immuno-buvardage afin d’évaluer la présence de PARP clivé
(un indicateur d’apoptose) se sont avérés négatifs, et ce même si les cellules PC-3 sont
sensibilisées avec une dose de cisplatin correspondant à sa valeur de ICio (concentration
requise pour obtenir 10% de l’effet maximal). Comme l’induction d’apoptose est
infructueuse avec un modulateur de Bcl-xL/Bcl-xs efficace, nous avons abandonné le gène
147
modèle BCL2L1 pour nous concentrer sur l’étude d’un ASE qui donne un fort phénotype
d’apoptose indépendemment de la présence de PS.
Les travaux présentés dans ce chapitre ont pour but de démontrer que 1) pour un gène
donné, un phénotype pro-cancer peut être obtenu par seule altération du ratio d’isoforme de
gène clé (sans altération de l’expression globale); 2) pour un gène donné, la dépendance au
ratio d’iso forme varie en fonction du contexte (essai phénotypique).
148
Résumé
Chez l’humain, la plupart des gènes produisent plusieurs iso formes ARNm dues à
l’épissage alternatif. Par contre, leur pertinence biologique demeure incertaine. Dans cette
étude, nous avons évalué l’impact de l’épissage alternatif sur des cellules cancéreuses. Le
patron d’épissage de 41 événements d’épissage alternatif reliés au cancer a été
systématiquement modulé et leurs effets sur la croissance cellulaire, la viabilité et
l’apoptose ont été notés. Nous avons identifié 3 événements d ’épissage associés à la survie
des cellules cancéreuses. De façon plus détaillée, la reprogrammation de l’épissage du gène
encodant la kinase SYK promeut la progression du cycle cellulaire et stimule la croissance
des cellules en suspension. De plus, un traitement exogène des cellules cancéreuses au
facteur de croissance épidermique (EGF) module le ratio d’épissage de SYK en faveur de
l’isoforme pro-survie tel qu’observé in vivo. Ces données suggèrent que l’épissage
alternatif de certains gènes est spécifiquement modulé durant la cancérogenèse pour
permettre l’expression d’iso formes favorisant la survie des cellules cancéreuses.
149
Article 2: Alternative splicing of SYK regulates mitosis and cell survival
Abstract
The majority of human genes produce multiple mRNA iso forms through alternative
splicing. However, the biological relevance of most splice variants remains unclear. In this
study, we evaluated the functional impact of alternative splicing in cancer cells. The
spbeing pattern of 41 cancer-associated splicing events was modulated and its impact on
cell growth, viability and apoptosis scored. We identified 3 splicing-dependent defects in
genes associated with cell survival. Specifically, changing the splicing pattern of the spleen
tyrosine kinase gene (SYK) promoted cell cycle progression and stimulated anchorageindependent growth. Strikingly, exposure of cancer cells to epithelial growth factor
modulated the SYK splicing pattern to promote the pro-survival isoform associated with
cancer tissues in vivo. The data suggest that splicing of selected genes is specifically
modified during tumor development to allow the expression of isoforms that promote
cancer cell survival.
150
Introduction
Currently, the majority of therapeutic approaches define a target as one protein, one gene or
one function. Yet, whole transcriptome sequencing has confirmed that only a minority of
genes produce a single protein1,2. Indeed, the vast majority of genes use alternative splicing
(AS) to produce several protein isoforms. In eukaryotes, AS plays a central role both in
protein diversity and post-transcriptional gene regulation. While AS can introduce or
remove regulatory elements to affect translation, localization or degradation of an mRNA3,
most often it will produce multiple and functionally diverse protein isoforms4.
Perturbations in alternative splicing are common and extensive in cancer 5 and can affect
cancer development and maintenance6. For example, a switch in the alternative splicing of
CD44 has been associated with the acquisition of metastatic potential7. Furthermore, a
splicing switch in Pyruvate Kinase, a glycolytic enzyme, is essential for cancer metabolism
and tumor growth8. However, the general impact of alternative splicing in cancer biology
and its impact on drug targeting remain largely unexplored9. Indeed, it is not clear in many
cases whether changing the proportion of a given set of splice variants contributes to cancer
biology independently of the level of gene expression.
RNA interference (RNAi) has become a preferred tool for discovering and evaluating the
impact of gene expression on the viability of cancer cells10. However, RNAi-based screens
commonly target genes without considering the variety of alternative mRNA isoforms
generated by AS. This limits our understanding of individual iso form functions and
strongly reduces the numbers of potential drug targets. Our recent studies in ovarian11 and
breast cancer12 identified 74 new cancer-associated splicing events. Here we describe a
systematic iso form-specific functional screen of 41 breast and ovarian cancer-associated
alternatively spliced variants with the goal of evaluating the impact of alternative splicing
on cancer biology. Our targeting approach utilizes a dual system for iso form-specific
silencing and modulation. This comprehensive approach harnesses the power of siRNA for
iso form-specific silencing13 and complements it with alternative splicing modulation using
bifunctional antisense oligonucleotides14. This approach uncouples the impact of splicing
modulation on cell function from phenotypic defects caused by changes in gene expression
levels. The results identify alternative splicing in genes associated with cell survival as
151
major targets for breast and ovarian cancer. Changing the splicing pattern of the tyrosine
kinase (SYK) altered cell survival and mitotic progression, while global knockdown of the
same gene had no effect, suggesting that at least for some genes, global knockdown of gene
expression cannot mimic the effects of alternative splicing on cell survival and apoptosis.
152
Results
Functional analysis of cancer-associated splice variants
A large number of alternative splicing events (ASEs) are modified in tumor cells5.
However, little is known about the contribution of alternative splicing to cancer biology. To
gain insights into this aspect, we have developed a platform for high-content functional
analysis of alternative splicing events (FASE) (Supplemental Figure 1) and have used it to
examine the function of 29 ovarian11 and 21 breast cancer variants12, including 9 common
to both cancers (supplemental Table 1). For a graphical representation of the protein
domains affected in these variants see http://palace.lgfus.ca/link/40 ases. Cancer-associated
ASEs were classified based on their splicing pattern, and isoform-specific inhibitors were
designed for all events with simple alternative 5’ events or cassette exons (Figure 1 and
Supplemental Figure 2). Two exon-specific short interfering RNAs (siRNAs) and 1
targeted oligonucleotide silencer of splicing (TOSS)14 were designed for each splicing
event and their impact on the phenotype of the SKOV3ipl ovarian cancer cell Une was
scored using multiplexed fluorescent dyes for cell count, viability and apoptosis assays
(Supplemental Figures 1 and 3). Assays were performed in biological and technical
triphcates and quality metrics (Z-factors) for each assay plate were calculated
(Supplemental Figures 1 and 3). Phenotypic defects reproduced by at least two independent
isoform specific inhibitors (ISIs) against the same spUcing event with a robust Z-score of
greater than 3 were considered functionally relevant and retained for further analysis. As
expected, mock transfection or transfection of unrelated siRNA or TOSS did not affect
ceUular phenotypes, while transfection of siRNA against the positive control, RBM8A,
consistently induced apoptosis and reduced cell counts and viabiüty (Supplemental Figure
3). While the majority of the targeted splicing events did not exhibit any phenotypic effect
(Z-score <3), four splicing events in the AGR3, FN1, MCL-1 and SYK genes produced
robust apoptosis induction (Suppl. Table 2). ISI dependent changes in the expression level
of AGR3 could not be validated by PCR due to its low expression level and thus it was not
pursued further. The remaining 3 genes affecting apoptosis have previously been
implicated in cell survival pathways15'16. Inhibiting the expression of the long isoforms of
these 3 genes by siRNAs resulted in a 3 to 8 fold increase in the ratio of apoptotic marker
153
positive cells (Supplemental Table 2 and Figure 2, left panels). Similar. 4 to 12 fold,
increases in the ratio of Pi-positive, non-viable cells were observed by siRNA-mediated
silencing of the long isoforms of these 3 genes (Supplemental table 2 and Figure 2, left
panels). Consistently, reprogramming FN1-EDB and SYK splicing using TOSS resulted in
increased apoptosis and decreased viability (Figure 2a and supplemental Table 2). In
contrast, modulation of MCL-1 alternative splicing with TOSS had modest effect on
apoptosis (Figure 2 b). Silencing of CCNE1 and LIG4 by splice isoform specific siRNA
produced marked decreases in cell viability (Z-scores>3, suppl. Table 2) but did not result
in substantial apoptosis (suppl. Table 2 and data not shown). Overall, the screen results
indicate that 10 % of the ASEs tested contribute to the viability of cancer cells in vitro.
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1
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VII
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1
1
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Jl
154
Figure SI FASE (Platform for High-Content Functional Analysis of Alternative
Splicing Events) screen pipeline.
One of the unique aspects of our platform is that it uses as its primary input a list of
experimentally annotated, cancer-associated alternative splicing events. The first step of our
workflow is identification of the alternative region that will be used for our bioinformatics
design of isoform-specific inhibitors (ISIs). An automated design algorithm for efficient
siRNA and TOSS design was developed in-house based on published and empirical
criteria. Our experimental design pipeline consists of randomized transfection plate set-up
to avoid systematic errors (row, column effects). ISIs are then transfected in triplicate per
plate (technical replicates) three independent times. Each plate also contains several
positive and negative controls for assay quality evaluation. Plate scanning and image
acquisition are performed following addition of fluorescent dyes 96 hours post-transfection.
9 images are scanned per well and a montage is generated representing each well. The data
file generated for each well is loaded into a database and analyzed bioinformatically with
various modules. The analysis output is graphically displayed in bar graphs per assay.
Quality metrics allow plate and assay validation by means of Z-factors. Data triage and
normalization by subtracting the negative control are then performed. This allows for hit
identification by Z-score calculation. Successful modulation of alternative splicing by QPCR and western blots allow for hit validation.
155
Ovarian and breast cancer—associated ASEs
74 A S E s
Selection of targetable ASEs
S im ple e v e n ts
A lternative E x o n s
Targe! Q uality
66
64
41
ISI Design
1 TOSS per ASE
2 SiRNA per ASE
nRNiP!
ia i r s i m .
_
—
•
Lofty ISUlfJRTl klRi-CSdt/Wf»
1 * 1
1
»
É C I
«
«I»
1 A 1 C |
« ■»
T ransfection
Phase 1 : HCS screen for phenotypic defects
Multiplex a s s a y
Cell count
Viability
A poptosis
Hi: selection
A ssa y Q C
Z-factcx
z -sc o re > 3
for 2 ISIs p e r ASE
Phase 2: validation of ISI dependent defects
Validate p h e n o ty p e specificity
by ex tra ISIs a n d global ssRNAs
Validate RNA splicing shifts by Q -P C R
Phase 3: phenotype confirmation by
secondary independent a ssa y s
PARP c le a v a g e , W e s te rn s , cell cycle ...
Figure 1 Strategy for functional annotation of cancer-associated alternative splicing
events (ASEs).
Ovarian and breast cancer-associated alternative cassette exons were identified and their
expression was modulated using isoform specific inhibitors (ISIs). Each simple alternative
cassette exon or alternative 5’ splice site was inhibited using 2 independent exon-specific
siRNAs and its splicing was modulated using a Targeted Oligonucleotide Silencer of
Splicing (TOSS). The impact of modulating the expression of splice isoforms on cell
proliferation, viability and induction of apoptosis was monitored using the high content
FASE platform (Functional Analysis of Alternative Splicing Events). Phenotypes caused by
selective modulation of splice isoform ratios and not the overall inhibition of gene
expression were considered as indicators of alternative splicing isoform-specific functions.
156
Alternative splicing ev en t
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E5E ,< ESS rwspjjferi® jtc®re
Figure S2 ISI design rules.
Long-isoform specific siRNA (left panel) and TOSS (right panel) selection criteria and
design rules. An algorithm for efficient siRNA and TOSS design was developed in-house
based on published and empirical criteria. The design algorithm is automated in a userfriendly web-based interface. The minimum exon length for ISI design is 20 nucleotides.
AIR: Alternatively Included region. UCS: upstream constitutive sequence; DCS:
downstream constitutive sequence.
157
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i'
Figure S3 FASE screen quality control.
Graphical representations of positive (RBM8 siRNA) and negative (lipofectamine) control
segregation for cell count, viability and apoptosis assays. Z-factors were derived from these
three different assay outputs of the multiplex screen.
i
«A1!
«S’
/&
l l
v
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Figure 2 Targeting of SYK, MCL-1 or FN1-EDB alternatively spliced isoforms
induces apoptosis.
The impact of TOSS and siRNAs targeting the pre-mRNAs coding for SYK (a), MCL-1 (b)
and FN1 (c) proteins on cellular phenotype (left panels) and RNA expression monitored by
Q-PCR (right panels) were evaluated and compared to mock transfected (LF) SKOV3ipl
ovarian cancer cells. Experiments were performed in three biological and three technical
replicates and an average for each cellular phenotype was calculated for each ISI. The
impact of TOSS and alternative exon-specific siRNAs on cell count (grey), loss of viability
(black) and apoptosis (white) are shown as bar graphs on the left panels. The Q-PCR
relative expression values for the overall gene expression, long splice isoform and short
splice isoform are indicated in the right panels by grey, black and white bars respectively.
Error bars represent the s.d. of the replicates. siRNA and TOSS with unrelated sequences
were used as negative controls. The 3 genes shown were analyzed with a full set of ISIs and
siRNAs that inhibit global gene expression (Gl, G2).
159
Inhibition of tumor-associated variants induces apoptosis
The phenotypic effects observed could be due to changes in alternative splice forms or a
general reduction in gene expression. To differentiate between these two effects, we
compared the impact of siRNA and TOSS on global and isoform-specific expression.
Global siRNAs equally inhibited the expression of constitutive, long and short splice
isoforms of SYK, MCL1 and FN1 (Figure 2, right panels). Isoform-specific siRNAs
inhibited the accumulation of the long, but not the short splice isoforms, while
proportionally reducing the overall gene expression. In contrast, reprogramming splicing
with TOSS simultaneously reduced the expression of the long and increased the expression
of the short splice iso form to various extents for SYK and MCL-1 transcripts without
altering overall mRNA levels (Figure 2, right panels). In contrast, TOSS against FN1-EDB
decreased the expression of the EDB+ FN1 isoform accompanied by a concomitant
decrease in the overall FN1 transcripts levels. Strikingly, while decreasing the overall
expression of these genes failed to trigger apoptosis, inhibiting the expression of the long
splice isoforms of all three genes induced apoptosis by 4 to 8 fold (Figure 2, left panels),
confirming the results of the high-content screen. Consistently, reprogramming the splicing
of SYK with TOSS induced apoptosis (Figure 2a, left panels, white bars). TOSS targeting
FN1-EDB produced apoptosis by decreasing the long EDB+ isoform and global FN1
expression levels thus behaving in a manner similar to an isoform-specific siRNA (Figure
2c). A second TOSS that modulated FN1-EDB splicing ratio without decreasing overall
FN1 expression did not produce apoptosis (data not shown). TOSS targeting MCL-1 did
not induce apoptosis despite a significant increase in RNA corresponding to the short
isoform (Figure 2b).
The inability of TOSS targeting MCL-1 to induce apoptosis suggests that either the change
in the splicing ratio of MCL-1 is not sufficient to induce apoptosis or that TOSS-induced
changes in MCL-1 mRNA expression do not lead to corresponding changes in protein
isoforms. To differentiate between these two possibilities we performed western blots
against MCL-1 in cells transfected with MCL-1 ISIs or control ISIs. MCL-1 iso formspecific siRNAs diminished the expression of the long MCL-1 protein (Suppl. Figure 4a).
However, MCL-1 TOSS did not change the levels of the long MCL-1 protein isoform nor
160
increase the short protein iso form (Suppl. Figure 4a). Therefore, TOSS against MCL-1 fails
to induce apoptosis because it does not change the ratio of the corresponding protein
isoforms, suggesting the existence of mechanisms that compensate for changes in the RNA
expression of this gene in the cell line tested. Indeed, MCL-1 transcripts are known to be
extremely unstable and the MCL-1 protein has a rapid turnover of about 30 min17.
Furthermore, exon skipping of MCL-1 produces a ffameshift resulting in a premature stop
codon thus making this message susceptible to nonsense mediated decay and highly
18
unstable . In support of this, we failed to detect any endogenous MCL-1 protein bands
corresponding to the short isoform even following TOSS treatment (Suppl. Figure 4a). We
also could not verify FN1-EDB protein iso form levels due to their large size (>220kDa),
which prevented the SDS gel separation of the isoforms (data not shown), and the absence
of suitable isoform specific antibodies. Consequently, we focused our studies on SYK and
did not pursue the analysis of FN1 and MCL-1 any further.
161
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CO
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PARPc
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Figure S4 Western validation for MCL-1 and SYK.
The impact of TOSS and siRNAs targeting (a) MCL-1 and (b) SYK pre mRNAs on their
respective protein isoforms (top panels), and PARP protein cleavage (middle panels) were
evaluated by western blot and compared to mock transfected (LF) cells. Total proteins were
extracted 72 hours post-transfection and an equal amount of proteins loaded on an 8%
SDS-PAGE. The antibodies used are as described in supplemental materials & methods
below. In the last lane of the b) panel, extracts transfected with a plasmid encoding for
MCL-1 (S) protein were loaded as a reference for the size of the MCL-1 short iso form.
162
To verify whether the SYK ISI-induced RNA splicing shifts had an impact at the protein
level, western analyses using antibodies against SYK proteins were performed following
treatment with different ISIs or control oligonucleotides (Figure 3 and Suppl. Figure 4b).
Global siRNAs against constitutively spliced SYK exons decreased all protein isoforms
while siRNA against the long SYK isoform decreased the expression of the long but not the
short protein isoforms. In contrast, treatment of the cells with TOSS reduced the expression
of the long and increased the expression of the short protein isoform of SYK (Figure 3a and
Suppl. Figure 4b). Successful modulation of SYK alternative splicing was associated with
enhanced cleavage of the apoptosis marker PARP, confirming the specific impact of
alternative splicing on apoptosis (Suppl. Figure 4b). The effects of SYK splicing
modulation were also investigated in a variety of normal and cancer cell lines expressing
different levels and splicing isoform ratios of SYK RNA in order to evaluate the specificity
of the observed effects on apoptosis. As expected, transfection of SYK specific ISIs in cells
that do not express SYK (e.g. MDA-MB231 and Hs578t breast cancer cell lines) or normal
cells (i.e. MCF-10A mammary epithelial cells or BJ-Tielf fibroblasts) did not promote
apoptosis (data not shown and Suppl. Figure 5c). In contrast, cells exhibiting the same SYK
splice isoform ratio observed in cancer tissues (e.g. HCT116 colorectal carcinoma and
TOV-112D endometrioid carcinoma cells) entered into apoptosis upon the modulation of
SYK alternative splicing (supplemental figure 5a and 5b). We conclude that the alternative
splicing of cancer- associated genes can specifically influence cancer cell viability and
apoptosis, in a manner that is largely independent of the overall level of gene expression.
U m
Relative cell ratio
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164
Figure 3 SYK alternative splicing regulates cell cycle progression and mitosis.
(a) Reducing the expression of the long SYK splice isoform induces the accumulation of
the SYK protein in the cytoplasm. Cells were treated by the different ISIs, the nuclei (N)
and cytoplasm (C) were separated using differential extraction and centrifugation, proteins
extracted and visualized by western blot as indicated in Figure 3 a. Total cellular proteins
(T) were also loaded as reference. The nuclear splicing factor hnRNP U and the
cytoplasmic protein actin were used as fractionation markers. SYK L and SYK S indicate
the position of the long and short splicing isoforms of SYK, respectively, (b) Inhibiting the
expression of SYK(L) isoform induces changes in nuclear morphology. The cells were
treated with control siRNA or SYK(L) siRNA as indicated and nuclei were stained with
Hoechst 96 hours post-transfection. The non-viable cells were stained with propidium
iodide. Arrows indicate abnormal or supernumerary nuclei. The numbers in the bottom of
each image indicate the average numbers of abnormal nuclei +/- s.d. observed per
treatment, (c) SYK alternative splicing regulates mitosis and cytokinesis. Top panel:
images from SYK or control ISI transfected cells were visually inspected and cells with
abnormal mitosis/supernumerary nuclei were counted and plotted as bar graphs. The
numbers are the average of 3 independent transfections. Bottom panel: Western blot of the
same samples with a phosphohistone H3 antibody, a known mitosis marker45, (d) SYK
alternative splicing regulates progression through the G2/M phase of the cell cycle. The cell
cycle distribution of SKOV3ipl cells 48hrs post-transfection with different ISIs was
analyzed using flow cytometry. The accumulation of transfected cells in G0-G1 phases
(gray), S phase (white) and G2-M phase (black) relative to that of untreated cells is shown
as bar graph. The data are an average of three independent transfection experiments and
error bars represent the s.d. (e) EGF promotes SYK (L) exon inclusion. Bar graph depicting
the changes in SYK splicing upon EGF treatment. The PSI values were calculated as
described previously 11. Error bars represent the s.d. from 3 independent treatments.
165
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- Cell count
~ Loss of viability
) = Apoptosis
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A:
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2©2
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Figure S5 SYK phenotype validation in other cell lines.
The impact of long-isoform specific siRNAs targeting SYK on cell proliferation, viability
and apoptosis in a) HCT116 colorectal carcinoma; b) TOV112D endometrioid carcinoma
and c) BJ-Tielf immortalized fibroblast cell lines. Cell numbers, viability and apoptosis
were monitored using fluorescence markers and the relative changes were calculated and
used to generate the bar graphs. The error bars represent the variation observed in three
technical and three biological replicates.
166
Alternative splicing of SYK controls cell cycle and mitosis
Previous reports suggested that SYK splice isoforms are localized differently in the cell19,20.
Therefore, we investigated the possibility that changes in SYK alternative splicing induce
apoptosis by changing the cellular localization of the protein. Cytoplasmic and nuclear
proteins were fractionated following treatment with different SYK ISIs and SYK protein
isoforms were detected by western blot. In untreated cells, the long SYK isoform, SYK(L),
is predominantly nuclear and the short isoform, SYK(S), is predominantly cytoplasmic
(Figure 3a). Treatment of the cells with ISIs reduced the expression of the long isoform of
SYK in the nucleus and the majority of SYK proteins became cytoplasmic. This suggests
that altering the cellular localization of the protein may induce apoptosis. To determine
whether the impact of SYK alternative splicing is limited to the regulation of apoptosis/cell
survival or extends to other known SYK cellular activities like cell proliferation, we
monitored the impact of the ISIs on cell cycle progression. Upon close visual examination
of cell images from SYK ISI-treated SKOV3ipl cells, we noted an increased amount of
cells displaying abnormal nuclear morphology with larger, aberrant nuclei and of cells
bearing two or more nuclei (Figures 3b, 3c) indicating a role for SYK(L) in mitotic exit and
cytokinesis. Changing the alternative splicing of SYK led to an accumulation of cells in the
G2/M phase of the cell cycle (Figure 3d) consistent with defective mitosis. The mitotic
arrest was confirmed by the increase in phospho-histone H3 (Figure 3c). Notably, the
mitotic arrest was isoform-specific as it was not observed by general SYK knockdown with
global siRNAs (Figure 3d). Intriguingly, SYK TOSS produced the opposite effect than that
of SYK siRNAs i.e. decrease in abnormal mitosis and phospho-histone H3 levels (Figure
3c) suggesting that increasing the expression of the short SYK isoform can compensate for
the long isoform dependent effect on mitosis. Given the importance of mitogenic signaling
in oncogenesis and cell proliferation, we investigated the effect of oncogenic growth factors
on SYK splicing. The pro-survival alternative splicing pattern of SYK was observed in
vitro upon exposure to epidermal growth factor (EGF, Figure 3e) known to promote cell
proliferation and differentiation, underscoring the role of alternative splicing in regulating
the activity of this gene. Therefore, we conclude that cancer cell mitosis is regulated by
both the amount and ratio of SYK splicing isoforms.
167
SYK(L) isoform induces JUN-dependent cell survival
To understand how SYK alternative splicing promotes malignant growth, we tested the
impact of the different SYK ISIs on the expression of a panel of apoptosis, cell cycle and
cancer-relevant genes by Q-PCR. Reducing the expression of the long isoform of SYK
resulted in prominent increases in the expression of JUN 21 as measured by Q-PCR in
SKOV3ipl cells (Supplemental Table 3). Notably, this result was observed when targeting
the expression of the long SYK isoform by either siRNA or TOSS, but not when the overall
expression of SYK was downregulated by siRNA against constitutive exons (Supplemental
Table 3). This suggests that changing the splicing pattern of SYK and not the global
expression impacts the MAPK/JNK signalling pathway that acts as a conduit for apoptosis
22. To directly test this hypothesis, we evaluated the effect of a JNK inhibitor SP60012523
on SYK-induced apoptosis. As shown in Figure 4a, the inhibition of JNK with SP600125
partly rescued the apoptosis induced by modulation of SYK(L) isoform expression in
SKOV3ipl cells (Figure 4a), indicating that the SYK-induced phenotype is mediated at
least in part by JUN activation. We conclude that the production of SYK(L) by alternative
splicing promotes JNK-dependent cell survival.
168
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+
Figure 4 SYK(L) promotes malignancy and anchorage-independent growth.
(a) SYK alternative splicing regulates JUN-dependent cell survival. SKOV3ipl cells were
transfected with siRNAs targeting SYK (L). 24 hours later cells were treated with the JNK
inhibitor SP600125 or DMSO control. The cells were allowed to grow for 72 hours and
subsequently apoptotic cells were stained with annexin-V as in figure 2a. Results represent
the average of three individual experiments, (b) Expression of SYK long splice isoform is a
marker for tumor malignancy. The ratio of SYK splice isoforms was monitored by Q-PCR
in RNA extracted from 6 borderline (LMP), grade 1 (Gl) or grade 3 (G3) ovarian tumors.
The percent splicing index (Q-PSI) was calculated as described and the relative values are
presented as box plots, (c) Altering the alternative splicing pattern of SYK inhibits
anchorage-independent growth. SYK ISI-transfected SKOV3ipl cells, or cells transfected
with control ISIs, were seeded in 96-well plates containing soft agar and incubated for 7
days in order to form colonies. Cells were subsequently stained with Hoechst and total
fluorescence was measured and plotted against ISI controls. The time frame of the assay
precluded the use of the TOSS. Error bars represent the s.d. of three independent
experiments.
j ry
169
SYK(L) promotes tumor malignancy and anchorage-independent growth
Our results suggest that increased expression of SYK long isoform in tumors may not only
increase cell survival, but also cellular proliferation and tumor aggressiveness. To test this
hypothesis we monitored SYK splicing in a total of 18 ovarian cancer tissues from tumors
of low malignant potential (LMP), grade 1 tumors (G l) and the aggressive grade 3 tumors
(G3). Consistent with the notion that SYK regulates tumor aggressiveness, the expression
of the SYK long isoform was higher in Gl tumors compared to LMP tissues and higher still
in G3 tumors (P-value between LMP and G3 = 0.001, Figure 4b). To further dissect the
mechanism by which SYK splicing promotes aggressive tumor growth, we monitored the
impact of silencing the SYK(L) isoform on anchorage-independent growth in vitro. As
shown in Figure 4c, the ability of SKOV3ipl cells to form colonies in soft agar was
markedly inhibited with siRNAs against the long isoform or against both long and short
isoforms. This indicates that, unlike the impact of SYK on apoptosis and mitosis that
requires a minimum expression of the short isoform, the effect on tumorigenesis is only
influenced by the expression level of the long form independent of the splicing ratio. We
conclude that the expression level of the SYK long splicing isoform regulates tumor
aggressiveness by promoting anchorage-independent growth and cell proliferation.
Alternative splicing regulation is a common feature of the MAPK/JNK pathway
In order to determine whether or not alternative splicing dependent regulation of gene
function is limited to SYK or extends to other members of the MAPK/JNK pathway, we
tested the functional impact of all cancer-associated ASEs5 in this pathway. A list of all
cancer associated splicing events in genes with ontology terms related to phosphoinositide3 kinase signal transduction or MAPK/JNK (http://palace.lgfus.ca/link/pheno screen pi3kakt) was examined for function in vitro as described in Figure 1. From this, we identified
13 cancer-associated isoforms (see http://palace.lgftis.ca/link/mapk-jnk annotation for an
annotation table) and validated previously undefined isoform specific function for
MAP3K7 (TAK1) and MINK1 kinases. In both cases, silencing the long splicing isoform
of these two genes reduced cell viability by inducing apoptosis in SKOV3ipl cells
(Supplemental Figure 6). We conclude that alternative splicing plays a critical role in
modulating the production of isoforms of players regulated by the MAPK/JNK pathway.
170
10
m
j
= Los» of viability
| * Apoptosis
■B 4
Figure S6 MAPK isoforms essential for cell viability.
The impact of ISIs against the pre-mRNAs coding for MAP3K7 and MINK1 isoforms on
the viability (black) and apoptosis (white) phenotypes of SKOV3ipl cells is shown relative
to lipofectamine and ISI controls. The error bars represent the variation observed in three
technical and three biological replicates.
171
Discussion
In this study we have presented a procedure for evaluating the functional impact of
alternative splicing on phenotypic parameters that are relevant to cancer. Moreover, we
have uncovered cancer-specific alternative splicing events that promote cell proliferation
and survival. Approximately, 10% of all tested breast and ovarian cancer-associated
splicing events significantly affected cell viability in vitro confirming that splicing pattern
changes in cancer are not simply an inconsequential anomaly of diseased cells, but instead
may have been selected for functional advantages.
The strongest impact we observed on apoptosis was after inhibiting the expression level of
the long isoform of MCL-1, a member of the BCL2 mitochondrial apoptotic regulator
family. MCL-1 is primarily localized to the outer mitochondrial membrane where it
promotes cell survival by interacting with other Bcl-2 family members24. Active MCL-1
promotes cell viability by inhibiting the activation of caspases leading to apoptosis. MCL-1
has a short half-life due to its regulation at multiple levels, including alternative splicing,
allowing the rapid induction by survival signals or elimination of the protein by apoptotic
signals25. Alternative splicing leads to MCL-1 exon 2 skipping and deletion of the Cterminal transmembrane domain resulting in protein mislocalization to the cytosol24. Our
results suggest that apoptosis is regulated by the expression level of the long isoform of
MCL-1 (Figure 2 and Suppl. Figure 4a). This observation is somewhat different from
earlier experiments showing that over-expression of the MCL-1 short isoform, which lacks
the pro-survival transmembrane and BH2 domains, causes apoptosis18,26. In our hands
apoptosis was induced upon decreasing the expression level of the long isoform even when
the expression of short isoform was not detectable by western blot (Supplemental Figure
4a), suggesting that apoptosis is not strictly dependent on increasing the amount of the short
isoform. Apoptosis was not induced to the same levels by siRNA against constitutive exons
compared with those against those targeting the long isoform. However, close inspection of
the knockdown level suggests that global inhibition in these experiments did not reduce the
amount of the long isoform to the same level observed with the long isoform specific
siRNA (supplemental figure 4a and data not shown). Once again the results are consistent
with a long isoform specific effect on apoptosis. Indeed, inhibition of the MCL-1 long
172
isoform by itself in skin cancer cell lines was also shown to cause apoptosis27. Therefore, in
the case of MCL-1, apoptosis appears to be regulated at least in part by changing the
expression level of the long isoform.
In addition to regulating the splicing of apoptotic genes, tumorigenesis also impairs
9O
apoptosis by altering the splicing of kinases such as SYK . We have found that ovarian
tumors preferentially express the long isoform of SYK. Intriguingly, SYK is required for
leukemic B cell proliferation and survival by regulating MCL-1 expression I5’16. This
isoform was previously reported to affect the subcellular distribution of the SYK protein
kinase via a non-classical nuclear localization signal (NLS) located in the alternative
exon19. Indeed, our data show that the SYK(L) isoform is nuclear and changes in SYK
splicing affect its nuclear localization, consistent with these observations. In addition, we
find that modulation of SYK splicing causes cell cycle perturbations and defective mitosis.
The involvement of SYK in cell proliferation and mitotic progression has been documented
in breast cancer cells29'30. Furthermore, SYK has been shown to localize to the centrosomes
where it associates with y-tubulin31. SYK is also found in microtubules32 and it
phosphorylates cx-tubulin33 , thus providing a possible explanation for why changing the
splicing of this gene impairs mitosis. On the other hand, the mechanism by which SYK
splicing exerts its effect on apoptosis appears to be mediated by the activity of c-JUN. The
expression of this protein that regulates cell cycle and apoptosis22 was found to be modified
upon changing SYK splicing (suppl. table 3). In addition, the SYK isoform-dependent
apoptotic phenotype was rescued in the presence of JNK inhibitors underlining the
importance of c-JUN expression for the induction of SYK-dependent apoptosis. Together
the results are consistent with a model where cancer cells promote cell survival by inducing
the expression of SYK pro-survival isoform that in turn suppresses the expression of c-JUN
and its target genes thus inhibiting apoptosis (figure 5).
173
EGF
SYK(L)
—
+
»
Mitosis
Microtubules
Cytoplasm
SYK(L)
Nucleus
JUN
Cel! survival
Proliferation
Figure 5 A model depicting the different functions of the SYK(L) pro-survival
isoform.
Extracellular growth factors such as EGF activate signal transduction pathways. The EGF
signal promotes a splicing shift in the SYK long isoform, which affects SYK protein
isoform subcellular localization and activities. SYK(L) can have at least two distinct
functions depending on its cellular location: it can enter the nucleus where it normally
represses JUN expression and promotes cell survival; cytoplasmic SYK(L) can associate
with the centrosome and microtubules where it is essential for mitotic spindle assembly and
cytokinesis.
SYK acts as a tumor suppressor in breast cancer and loss of its expression is required for
malignant growth and tumor cell invasion . Paradoxically, SYK can also act as an
oncogene in other types of tumors and SYK over-expression has been associated with Tcell lymphomas34 and chronic leukemias35, as well as gastric cancer36 and head and neck
carcinomas37 where its expression correlates with tumor progression and is of prognostic
value. These contradictory expression profiles of SYK in different tumor types are difficult
to explain based on global gene expression. Confusion about the role of SYK in different
cancers may be due in part to the methods of evaluating the expression and the functional
impact of SYK because no distinction was made in these studies between the global and
splice isoform-specific increase in SYK expression. It is possible that differential
expression of SYK(L) and SYK(S) may contribute to these disparate observations in
174
different cancers. In support of this, Wang and coworkers19 observed elevated SYK(S)
expression in human breast carcinomas, but not in matched normal mammary tissues,
suggesting a role for SYK(S) in mammary tumor progression. Consistent with a role for
SYK alternative splicing in tumorigenesis, Goodman et al. have observed aberrant SYK
splicing in childhood acute B-cell leukemias38. Alternatively, the differences in SYK
behavior in different cancer types may be due to differences in the contribution of SYK to
tumor biology. In this study, we have found that while apoptosis is affected only by
changes in the splicing pattern of SYK (figure 2a), mitosis and cell proliferation are
affected by both changes in SYK splicing and expression levels (figure 3), while
anchorage-independent growth (figure 4c) is mostly driven by overall SYK expression and
not splicing. Accordingly, tumors depending on SYK for viability will be mostly dependent
on SYK splicing and its impact on c-JUN, which is cell type specific, while those tumors
using SYK to modulate cell adhesion, will be mostly affected by changes in the overall
expression level of SYK. In our hands, we found that ovarian cancer and colorectal cancer
cell lines are most sensitive to changes in SYK splicing while invasive breast cancer cell
lines generally do not express SYK29 and therefore are not sensitive to SYK modulation in
vitro (supplemental Fig. 5 and data not shown). Indeed, SYK splicing pattern was linked to
ovarian and not breast cancer in vivo 11,12. In all cases, our observations underline the need
to re-examine previously established links between SYK gene expression and tumor
behavior with a clear distinction between isoform and global changes in gene expression.
The functional contribution of alternative splicing to cancer cell biology reported here is
not static but responds to extracellular signals.
Indeed, we observed increased exon
inclusion in SYK and FN1-EDB alternative exons with short-term EGF treatment (figure
3e). This finding is consistent with previous reports indicating that FN1 alternative splicing
is regulated by growth factors through the PI3K/AKT and Ras signal transduction pathways
39. The effect of EGF on alternative splicing of SYK and FN1 is likely to be mediated by
splicing modulators such as proteins of the SR or hnRNP families40. Indeed, knocking
down hnRNP-K in SKOV3ipl cells changes the splicing pattern of these genes and
promotes apoptosis (supplementary figure 7). Strikingly, EGF has been reported to regulate
hnRNP-K expression and activity 41, thus suggesting that the EGF effects on SYK and FN1
175
alternative splicing could be mediated by hnRNP-K. Intriguingly, exon junction complex
components have recently been shown to regulate MAPK splicing and EGF signaling in
Drosophila42,43. It is thus tempting to speculate on the existence of an additional layer of
complexity involving alternative splicing in the EGF / Ras signaling axis with functional
consequences in tumor progression (supplemental figure 8). Indeed, we found that
apoptosis is induced upon altering the splicing of the MAP3K7 and MINK genes, both part
of the MAPK cell survival pathway, which were previously linked to ovarian and breast
cancers5 and Ras-induced growth arrest in ovarian epithelial cells44, respectively. Based on
these data, we propose that splicing acts as a modulator of cancer cell survival / cell death
by regulating the EGF/MAPK/JNK pathway. It is also important to note that the impact of
alternative splicing on the cell survival pathway is likely to be stronger than what is shown
in this study since the functional impact of many splicing events associated with cancer in
vivo might be missed due to the limited conditions and cell type that may be sampled in
vitro.
176
Figure S7 hnRNP-K controls SYK, MCL-1 and FN1 alternative splicing ratios (a) and
is essential for SKOV3ipl cell survival (b).
HnRNP-K silencing was performed as described previously 48. (a) The effect of hnRNP-K
siRNA-niediated knockdown on the alternative splicing profiles of SYK, FN-EDB and
MCL-1 was assessed by RT-PCR as described before48, (b) The effect of hnRNP-K
silencing in SKOV3ipl cells was assessed by the multiplex viability, apoptosis,
proliferation assay as described in Suppl. Figure 1.
177
E x t r a c e l lu l a r S u r v iv a l S ig n a l s
Cytokines/TNF
FN1 COB
I
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I
SYK t
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MAPK
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MAP3K7
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*
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A S F /S F 2 ?
Cell p r o li f e r a t io n
L+
i
cell survival
Cell s u r v i v a l
N u c leu s
Figure S8 Alternative splicing regulation of EGF/MAPK signaling.
Model depicting how EGF signaling may affect alternative splicing and subsequently
diversify the signaling repertoire in the EGF/ MAPK/ JNK pathways by regulating the
expression of the functional isoforms identified in this study (depicted in green). The
functional isoforms (FN1, SYK. MCL-l, MAP3K7 and MINK) required tor cell viability
are highlighted in green.
178
Acknowledgements
We are indebted to Claudine Rancourt (Département de Microbiologie, Université de
Sherbrooke) for providing cell lines and help in the initial set-up phase of the project,
Bruno Lamontagne and Lucien Jr. Bergeron for assay set-up and help with troubleshooting.
We thank the Reseau de Recherche sur le Cancer FRSQ tissue bank for ovarian tumor
tissues and Leonid Volkov for help with flow cytometry. This work was funded by a grant
from Genome Canada and Génome Québec. B. Chabot is the Canada Research Chair in
Functional Genomics. Jean-Pierre Perreault is the Canada Research Chair on Genomics and
Catalytic RNA. S. Abou Elela is a Chercheur National of the Fonds de la Recherche en
Santé du Québec (FRSQ).
Author contributions
D.G, M.B., D.G., S.C., J.P.B. and E.L. carried out experiments and analyzed data and JF.L., P.T. and J.G-B. analyzed data and prepared figures. J-F.L. developed the ISI design
program and the FASE statistics and bioinformatics analysis tools. J.P.B., K.T., E.L. and
P.T. developed the Q-PCR procedures used to evaluate ISI impact on splicing. H.N. did the
histopathological review of tissue specimens. P.P., K.T., J.V., R.K., J. P.P., B.C., R.J.W.
and S.A.E. designed experiments, discussed data and participated in the writing of the
paper. P.P. and K.T. supervised experiments and analyzed data. P.P. and S.A.E. wrote the
manuscript.
179
Methods
Cell culture and transfection. All cell lines were cultured in antibiotic- and antimycoticfree media (Wisent). The ovarian adenocarcinoma SKOV3ipl cell line was grown in
DMEM/F12 (50/50) medium supplemented with 10 % fetal bovine serum and 2 mM LGlutamine.
TOV112D
endometrioid
carcinoma
cells
and
HCT116
colorectal
adenocarcinoma were propagated in OSE medium or McCoy’s modified 5a medium
(Wisent) respectively supplemented with 10% FBS and 2mM L-Glutamine. Cell
propagation and passaging were as recommended by ATCC (American Type Culture
Collection). Recombinant human EGF (Pepro-Tech) was used at 50ng m l1 for the EGF
induction experiment. For image analyses and RNA extractions, SKOV3ipl cells were
seeded in 96-well tissue culture-treated imaging plates (BD Biosciences) at a density of
5,000 cells per well. For immunoblotting and FACS analyses, cells were seeded at 350,000
cells per well in 6-well plates (BD Biosciences). Transfections were performed in
suspension using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer’s protocol
and 10 nM of 21-mer siRNA duplexes or 400 nM of TOSS oligonucleotides with 2’OMe
chemical modifications (IDT). Each oligonucleotide was transfected in randomly
positioned wells in triplicate (technical replicates) on at least three different transfection
dates (biological replicates). The transfection efficiencies were confirmed by transfecting a
fluorescent AlexaFluor-488 conjugated negative control siRNA (AllStars siRNA, Qiagen)
in every plate. For the rescue experiments, JNK inhibitor II (SP600125, EMD Biosciences)
was added 24 hours post-transfection at 10 pM final concentration.
SiRNA and TOSS oligo design. To design long isoform-specific siRNA and TOSS, an
algorithm identifying the alternatively included region was employed46. All possible
stretches of 19 (siRNA) or 20 (TOSS) nucleotides were extracted and scored
(Supplementary Figure 2). The top scoring siRNAs and TOSS were used for the FASE
screen. Refer to the supplementary material for all sequences. To perform global gene
knockdown using siRNA, a global gene junction-ranking algorithm was developed (JF
Lucier, unpublished).
180
RNA extraction and quantitative PCR. Total RNA extractions were performed in 96well plates with the Absolutely RNA Microprep Kit (Stratagene) as recommended by the
manufacturer except that DNase treatments were done at 37°C. RNA quality and presence
of contaminating genomic DNA was verified as described46. RNA integrity was assessed
for 11 random samples per 96-well plate with an Agilent 2100 Bioanalyzer. Reverse
transcription was performed at 55°C on a fixed volume (5.5 pi) of RNA sample with
Transcriptor (Roche Diagnostics), random hexamers, dNTPs and 10 units of RNaseOUT
(Invitrogen) in a total volume of 10 pi. All cDNAs were diluted by adding 65 pi of RNAse
DNAse-free water. Quantitative PCR reactions were performed on 1 ng cDNA as described
elsewhere48. Relative expression levels were calculated using the qBASE framework 47
using PSMC4 and SDHA as reference genes. Primer design and validation were evaluated
as described elsewhere46. Additionally, an algorithm was developed to design primer pairs
targeting constitutive exon junctions of a given gene and were tested as described46. In
every run, a no template control and a no reverse transcription control (no RT) on a mocktransfected sample was performed for each primer pair. These controls were consistently
negative.
Apoptosis/viability/cell enumeration triplex assay. A 96-well multiplex assay was
performed to simultaneously monitor viability, apoptosis and cell count in each well. Cells
were stained 96 h post-transfection with the following three fluorescent dyes: 1 pg ml"1 of
propidium iodide (Invitrogen), 1:350 of annexin V-Alexa Fluor 647 (Invitrogen) and 800
ng ml"1 of Hoechst 33342 (Invitrogen) in an annexin binding buffer (pH 7.4) composed of
10 mM HEPES, 140 mM NaCl and 2.5 mM CaCb- High-content endpoint fluorescence
images were acquired on a BD Pathway 855 Bioimager (BD Biosciences) using a 20X
objective with a laser-based auto focus and excitation and emission filters appropriate for
each fluorescent dye. Experimental error was reduced with the acquisition of nine images
(800 pm gap between each frame) per well per dye. Image pre-processing and
segmentation were performed with Attovision 1.6 software (BD Biosciences). Thresholds
were applied manually to identify propidium iodide and annexin V positive cells.
181
Soft Agar Colony Formation Assay. SKOV3ipl cells were seeded at 5,000 cells per well
and transfected in 96-well tissue culture-treated plates. 24 hrs after transfection, the cells
were trypsinized and seeded in a 1.2% agar base layer (MJS BioLynx) containing
DMEM/F12 supplemented with 20 % FBS and 4 mM L-Glutamine. Once the cell layer was
solidified, 100 pi of medium was added to each well and the plates were incubated for 7
days at 37°C under 5 % CO2. On the seventh day, medium was removed, and the cells were
stained for 1 hour with Hoechst 33342 (5 pg m f1). Fluorescence was measured on a
FLX800 microplate fluorescence reader (BioTek Instruments).
Immunoblotting. Cells were collected from 6-well plates at 72 h post-transfection, pooled
and lysed as described previously50. Refer to Supplemental Methods for the conditions and
the antibodies used.
Statistical analysis and quality control metrics. A pilot screen was employed to establish
the dynamic range and robustness of the assay with z-factor scores routinely in excess of
0.5 (Supplementary Fig. 3). The z-factor49 was determined by calculating the average and
standard deviation of the randomly distributed triplicate wells of the positive control
RBM8A versus the lipofectamine control wells for each plate.
Data processing and hit identification. The primary screening assay produced a multiplex
readout of cell count, viability and apoptosis by a combination of 3 vital dyes (Fig 1).
Triplicate technical replicates of triplicate biological transfections were performed. A
complete randomization of the plate was employed each time to eliminate systematic
instrument measurement errors (Supplemental Figure 1). All valid plates were normalized
by comparing to lipofectamine treatment (Supplemental Figure 9). A stringent statistical
cut-off of 3 median absolute deviations 50,51 above the median measurements per assay
(corresponding to a robust z-score>3) was employed to minimize false positives and ensure
true positive phenotypes50. This method is robust to outliers and can identify weak hits and
is thus deemed ideal for RNAi screens50. All the steps for data processing, normalization
and hit calling are outlined in Supplemental Figure 9.
182
1.
C reate th e d a ta b a s e (SQUTE)
2.
R etrieve th e ex p erim en tal inform ation from LIMS:
- p late inform ation
• well inform ation
- tre a m e n t inform ation
3.
E x tract im age inform ation u s in g BD path w ay so ftw a re (text file)
4.
E xtract ROI a n d a s s o c ia te d d y e p a ra m e ter inform ation:
- Weil ID
- ROI ID
• PI inten sity
- A nexin intensity
- H oestch intensity
5. N orm alised e a c h ROI b a se d o n p late m edian and m ed ian a b so lu te deviation (MAD) =
ROi d ye p a ra m e te r v alue - p late dye p a ra m e te r m edian
p late dye p a ra m e te r MAD
6. A ssig n plate dye p a ra m e ter positiv e ROI th re sh o ld
1.
C alcu late well s ta s tis tic s for e a c h dye p a ra m e ter (well a s s a y s ta ts):
• Cell c o u n t = Total n u m b e r of ROI in well b a se d o n h o e sc h t intensity
- P ositive ratio - N um ber of positive cells for d ye p a ra m e ter
Weil total ROI (cell co u n t)
2.
N orm alise well s ta tis tic s b a s e d on plate n e g atice c o n tro l (NC):
Well a s s a y s ta ts norm »
o e
t0) o
re «5«3
E 8
IS
cre £re
well a s s a y s ta ts v a lu e
NC p late well a s s a y s ta t s a v erag e
1.
C alcu late tre a tm e n t te c h n ica l replicate s ta tistic s
• a v erag e (avg)
• sta n d a rd deviatio n (stdev)
- m edian
• MAD
2.
C alculate p late z fa c to r (QC):
£ a
3 x (PC well a s s a y s ta ts norm pla te std ev + NC well a s s a y s ta ts norm p late std ev )
1
-
| PC well a s s a y s ta ts norm p late avg - NC well a s s a y s ta ts norm plate avg |
re
o>
o c
& =r
O
2«û !c
cre -o
c
£«
1.
C alculate tre a tm e n t biological replicate a s s a y s ta tis tic s (sc re e n tre a tm e n t a s s a y s ta ts norm ):
- a v erag e (avg)
- sta n d a rd deviation (stdev)
- m edian
• MAD
2.
Perform hit calling s ta tistic s u sin g a MAD b a se d z sc o re :
S creen tre a tm e n t a s s a y s ta ts norm ~ S creen m e d ia n a s s a y s ta t s norm
S creen m edian MAD a s s a y s ta ts norm
183
Figure S9 Data analysis flowchart displaying all the data processing, normalization
and bioinformatic and statistical analysis steps for the FASE high-content screen.
After import of raw data in a database, the data is processed to extract meaningful
predefined parameters for each fluorescence measurement. Quantitative phenotypic data is
then normalized to a standard treatment (LF) and ranked according to Z-scores. ROI: region
of interest; MAD: median absolute deviation51; NC: negative control; PC: positive control;
QC quality control.
184
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187
Chapitre 4
Programmed modulation of alternative splicing in the tumor microenvironment
Auteurs de l’article: Brosseau JP, Lucier JF, Nwilati H, Thibault P, Gameau D, Durand M,
Couture S, Lapointe E, Prinos P, Klinck R, Perreault JP, Chabot B and Elela SA.
Statut de l’article : Soumis et en révision depuis le 19 juillet 2012, Nature Structural &
Molecular Biology
Avant-propos
JPB a produit toutes les figures. JPB a écrit le brouillon. SAE et JPB ont participé à la
révision de toutes les versions subséquentes du manuscript. Voir la section « author
contribution » pour plus de détails.
Mise en contexte
La cancérogenèse modifie l'expression et la maturation des ARNm, qui sont normalement
finement régulés par divers mécanismes, y compris l’épissage alternatif. Bien que plusieurs
exemples ponctuels de dérégulation d’isoforme de l’épissage aient été répertoriés, il n ’est
pas clair à quel point les isoformes de l’épissage alternatif contribuent à la cancérogenèse.
Nous avons exploité la méthodologie de quantification d’isoformes développée au chapitre
1 afin de mettre en lumière un réseau d’épissage alternatif dérégulé dans le
microenvironnement des tumeurs ovariennes.
Les travaux présentés dans ce chapitre ont pour but de démontrer que 1) l’expression de
certaines isoformes sont modifiés dans les tumeurs indépendemment de leur composition
cellulaire hétérogène; 2) l’expression globale de facteurs d’épissage associés aux tumeurs
corrèle avec le changement d’expression d’isoformes associés aux tumeurs; 3) certains de
ces changements ont lieu dans le microenvironnement de la tumeur.
188
Résumé
Il est bien établi que l’épissage alternatif est perturbé dans plusieurs types de cancers. Par
contre, il n’est pas clair si l’épissage alternatif est une conséquence secondaire ou est
directement impliqué dans le développement de la tumeur. Dans cet ouvrage, nous avons
identifié des isoformes de l’épissage alternatif spécifiques au cancer qui ne sont pas
affectées par la composition cellulaire des tissus. De façon surprenante, les résultats les plus
intéressants
proviennent
des
cellules
stromales
adjacentes
à
la
tumeur
(microenvironnement). En effet, nos résultats indiquent que la répression de RBFOX2 et
QKI provoque l’exclusion d’un sous-ensemble d’exon à caractère mésenchymal. En
somme, nos résultats indiquent que le transcriptome des cellules du microenvironnement
est modifié pour permettre aux tumeurs épithéliales de se développer.
189
Article 3: Programmed modulation of alternative splicing in the tumor microenvironment
Abstract
Pre-mRNA alternative splicing is modified in cancer, but the origin and specificity of these
changes remain unclear. Here, we probed ovarian tumors to identify cancer-specific splice
isoforms that are not affected by variations in tumor tissue composition. Surprisingly, the
most informative events occurred in the tumor microenvironment where the suppression of
a subset of mesenchymal exons was caused by the downregulation of splicing factors
RBFOX2 and QKI. Together, our results indicate that the architecture of transcripts is
systematically and specifically redesigned in the tumor microenvironment.
190
Introduction
Ovarian cancer is the fourth most common cause of cancer-related death in women, largely
because it is typically diagnosed at advanced stages '. Like most solid tumors, the majority
of ovarian cancers are epithelial in origin. By definition, ovarian cancer leads to an
enrichment of the ovarian epithelial content. Ovaries that are normally composed of a thin
layer of epithelial cells and a large mass of stromal cells that include fibroblasts, smooth
muscle cells and endothelial cells are dramatically transformed into a large epithelial mass
in advanced cancer stages . In addition, the composition of the cells surrounding the tumor
(the tumor microenvironment) changes as the tumor grows and gets established 3. The
tumor microenvironment is composed of extracellular matrix (ECM), genetically stable
cancer-associated fibroblasts (CAFs), immune cells and soluble factors required for cancer
progression and metastasis 4,5. Interplay between tumor and adjoining stromal tissues has
been observed to be an important aspect of the tumorigenic process 6,7. Indeed, it was
shown that epithelial ovarian cancer cells could directly induce a CAF phenotype (i.e.
changes of normal fibroblasts into CAFs) via secretion of transforming growth factor beta
q
Q
’ . At the same time, CAFs may secrete growth factors such as hepatocyte growth factor to
promote cancer cell proliferation and invasion I0.
Gene expression, and more recently alternative splicing, a highly regulated and cell typespecific process, have been found to be globally altered in cancer cells 11 B. Profiling the
global expression resulted in several sets of biomarkers capable of detecting cancer
subtypes and was particularly successful in differentiating between different breast cancer
subtypes 14 15. However, most expression profiling techniques focus on changes in the
levels of gene expression and simply ignore changes in the transcript architecture due to
alternative splicing. Profiling the expression of splicing isoforms identified potential
markers for ovarian and breast cancers, and some of these were shown to be required for
cell survival in vitro UJ6J7, Hundreds of splicing isoforms associated with the cell
cytoskeleton and other tissue-specific genes were associated with ovarian cancer when
RNA extracted from whole tumor tissues was compared to that extracted from normal
ovaries 12. This made the distinction between cancer and tissue-specific markers difficult
12’18. The search for biomarkers is further complicated by the high epithelial plasticity of
191
cancer cells 19-20; it is believed that some cancer cells undergo an epithelial-to-mesenchymal
transition (EMT) to increase their migratory and invasive potential 2123. The splicing of
several EMT-associated genes was shown to be modified in cancer cell lines 24-25, but the
role of alternative splicing in defining the epithelial or mesenchymal status of cancer cells
in patient tissues remains unclear. Comparison between different cell lines of different
tissue origin or during EMT identified several EMT and mesenchymal-to-epithelial (MET)
specific alternatively spliced isoforms as well as associated splicing factors like ESRP1/2
24-25. Some of these splice variants and their regulators may be linked to cancer as suggested
by in vitro studies
25
. However, their general association with tumor tissues and their
specific roles in cancer development remains to be confirmed.
Recently, enriched cell populations generated by laser capture microdissection (LCM) have
been useful in the identification of tumor-specific expression markers 26-27. In this study we
have used this approach to identify a highly specific group of cancer-associated ASEs by
isolating tumors and their microenvironment and comparing them with their reciprocal
normal tissues. Strikingly, most of the ASEs associated with the tumor microenvironment
resulted in the exclusion of mesenchymal-enriched exons, and many of these events were
regulated by the cancer-associated splicing factors QKI and RBFOX2. Our results indicate
that cancer cells induce programmed changes in a restricted set of functionally related
mRNAs.
192
Results
Identification of cancer-specific modulation of alternative splicing
Identifying the molecular characteristics of cancer by comparing tumor and normal tissues
is often hampered by tissue heterogeneity. Therefore, we sought to obtain relatively pure
cell populations from representative tumor and normal tissues by laser capture
microdissection (LCM). Normal ovaries and high-grade serous ovarian tumors were
dissected and visual inspection indicated that homogeneous populations of stromal and
epithelial cells were obtained from each tissue (Fig. la). Given the low number of epithelial
cells in normal ovaries, fallopian tube, which is considered the origin of serous ovarian
cancer 28'29, was used as a source for normal epithelium. The dissected portions of the
tumor microenvironment and normal stroma were mostly composed of fibroblasts (Fig. 1a),
and only samples that had a similar number of fibroblasts, immune cells and endothelial
cells were used for RNA extraction (see Material and Methods for details). The identity of
the isolated cells was also confirmed molecularly by monitoring the global expression
levels of established epithelial and stromal markers 30 by quantitative RT-PCR (Fig. lb). As
expected, epithelial-specific genes including the surface protein E-cadherin CDH1 31 and
the desmosome component desmoplakin DSP 3233 were overexpressed in the epithelial cell
populations (Fig. lb). Conversely, overexpression of the intermediate filament protein VIM
34 and the cell adhesion factor FN1 34 (stromal markers) were observed specifically in the
stromal cell populations (Fig. lb). To compare the overall epithelial and mesenchymal
status of the different samples we monitored the global expression of a panel of established
tissue markers in normal and cancer tissues. In general, the expression of 53 epithelial and
stromal markers confirmed the similar overall epithelial and stromal nature of both cancer
and normal tissues (Fig. lc). Consistently, immunohistochemical analysis of ovarian cancer
tissues confirms the predominant expression of stromal markers (FN1 and VIM) in the
ovarian tumor microenvironment and the expression of the epithelial marker (CDH1) in
ovarian cancer cells (http://www.proteinatlas.org/). Together these tests confirm the
homogeneity and comparable nature of the normal and cancer cell populations isolated by
LCM.
193
Fallopian time
Epithelum
Cancer
Eptheliim
Earn
;p v ;
Before
Falopian
luce stroma
Ovarian
stroma
Tumor
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4 Ovarian stroma
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microenvironment
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Epithelial es pression pattern
Mesenchymal expression pattern
Mo cancer association
Figure 1 Brosseau 2012
1.0
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■
-X 3tft *(i R
sa ivs
2 g
OVC 78 E; OVC 78 S
Ov C 189 E • O v C 181
Literature keymores
search
i?
£ jc2
3 -3
II
2 5
3 2
T, i*
1.5
$3 2.0
3 2
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3. a
5 I
ô s
â §.
Ft 11
.•'IM
d sp
1C'
194
Figure 1 Laser capture microdissection (LCM) of normal and cancer ovarian tissues.
(a) Shown are hematoxylin and eosin stain samples from Fallopian tubes, ovaries, and highgrade serous ovarian tumors visualized by light microscopy before and after dissection at
lOx magnification. The limits of dissected tissues are indicated in green and the type of
tissues examined is indicated on top. Dissected tissues with similar cell population in both
normal and cancer samples were chosen for RNA extraction. Typically, dissected Fallopian
tube epithelium was composed of 90% epithelial and 10% fibroblast cells; dissected cancer
epithelium was composed of more than 95% epithelial and less than 5% fibroblast and
other non epithelial cells (e.g. endothelial and inflammatory cells); dissected Fallopian tube
stroma, dissected ovarian stroma and dissected tumor microenvironment was composed of
60-80 % fibroblast, 10-20% endothelial and 10-20% of inflammatory cells (see Materials
and Methods for details) (b) The quality of the dissected tissues was assessed by examining
the expression of established epithelial (e.g. CDH1 and DSP; left panels) and stromal (e.g.
VIM and FN1, right panels) markers by quantitative RT-PCR. The global expression of the
different markers was determined in the epithelium and stroma of four-paired normal
Fallopian tube (upper panels) and nine paired high-grade serous ovarian cancer samples
(bottom panels). Relative values were normalized to housekeeping genes as previously
described 17 and the expression ratio (epithelium / stroma) was plotted as bar graph. The
dashed line indicates the threshold separating stromal and epithelial expression levels.
Detailed description (Supplementary Table 13) and individual expression values
(Supplementary Table 14) of the dissected tissues are provided as supplementary
information, (c) Expression pattern of classical epithelial and mesenchymal markers in
dissected ovarian cancer tissues. Quantitative RT-PCR assays were developed for the
classical gene expression markers associated with epithelial and stromal tissues in NCBI
PubMed database 64. The expression of 53 stromal mesenchymal and epithelial markers
was monitored in four dissected Fallopian tube and cancer epithelium as well as four
ovarian and tumor microenvironment. Relative values were normalized to housekeeping
genes as described in a. Markers that distinguish between normal and cancer tissues by at
least two fold in expression level were re-examined using an independent set of epithelial
and stromal tissues (see Materials and Methods for the details). The resulting number of
markers capable of discriminating between cancer and normal tissues is underlined. The
epithelial / mesenchymal expression pattern of the newly identified cancer- associated
markers is illustrated in the form of pie charts.
To investigate cancer-specific alternative splicing, we examined the splicing profiles of 870
simple ASEs (cassette exons, alternative 5’ or 3’ splice sites and intron retention events)
found in the RefSeq database
35
PCR
(the
(Fig.
2a)
in dissected normal and cancer tissues by quantitative RTraw
data
are
accessible
through
http://palace.lgfus.ca/pcrreactiongroup/list/226). Comparison of the splicing patterns
obtained from the Fallopian tube and cancer epithelium identified eight cancer-specific
ASEs, referred to hereafter as the cancer epithelial signature (CES) (Supplementary Table
1, column 1). On the other hand, comparison of the tumor microenvironment to normal
195
stroma splicing patterns revealed 10 cancer-specific ASEs, referred to hereafter as the
cancer stromal signature (CSS) (Supplementary Table 2, column 1). The splicing profiles
obtained from dissected tissues displayed distinct patterns that cannot be reproduced by
simple subtraction from the profile obtained from the original non-dissected samples
(Supplementary Fig. 1). Accordingly, the systematic and consistent changes in splicing
cannot be explained by random variation in the quality of dissection. The CSS and CES
splicing signatures were not linked to changes in the expression levels of the cognate genes,
indicating that the splicing differences are not simply the result of a change in mRNA
levels (Supplementary Table 1, column 2 and Supplementary Table 2, column 2). We
conclude that the changes in alternative splicing not only distinguish between tumor and
normal tissues, but also permit the discrimination between the tumor microenvironment
from normal stroma.
a
■ Turns r mi era e rvir onm e rt
U n d s s e c te d ovarian tumor
□ C a n c e r epithsSum
0
ovc 189
sv e 283
o v c 278 ove 328
T issues
b
100 n
■ Fallopian tube strom a
0 U n d s s e c te d F aitopiantube
□ F aflopiantube epithelium
FT 262
FT 385
196
Figure SI Comparison between the splicing patterns obtained in undissected and
dissected ovarian cancer and Fallopian tube mirror image samples.
Shown are histograms representing the quantitative splicing pattern (Qvy) 1 (Qvy of 100
mean that only the long isoform is present and Q\|i of 0 mean that only the short isoform is
present) of (a) a tumor microenvironment associated splicing event (MPRIP) in LCM
tumor microenvironment (black), undissected ovarian tumor (gray) and LCM cancer
epithelium (white) from four ovarian serous high-grade tissues and (b) a cancer epithelium
associated splicing event (TJP1) in LCM Fallopian tube stroma (black), undissected
Fallopian tube (gray) and LCM Fallopian tube epithelium (white) from two normal
Fallopian tubes as detected by quantitative RT-PCR. Detailed description of the tissue
compared are provided in Supplementary Table 13.
The clinical usefulness of the newly identified cancer-specific signatures was evaluated by
monitoring their capacity to distinguish between undissected normal and cancer tissues.
Five out of the 10 CSS ASEs (.A B ll, CAST, CD46, MPRIP and PBRM1), were able to
distinguish normal from cancer tissues with P < 5.0e-07 (t-test), while three others (CD68,
GIT2, MSRB3) distinguished between the normal and cancer tissues with P < 0.01 (t-test)
(Supplementary Table 2, column 4). In the case of CES, three out of the eight ASEs
distinguished between cancer and normal tissues with P < 0.01 (t-test) (Supplementary
Table 1, column 4). These results indicate that the CSS is more apt than the CES at
detecting cancer in RNA extracted from undissected tumors, perhaps due to the low
epithelial content of tissues extracted from normal ovary. Indeed, the CES misidentified all
Fallopian tube tissues as cancer samples (Fig. 2b, left panel), while the CSS correctly
classified four out of six Fallopian tube samples as normal tissues in spite of their epithelial
contents (Fig. 2b, right panel). Overall, the different analyses of the CSS and CES behavior
in undissected tissues identified five CSS ASEs (CAST, CD46, MPRIP, MSRB3 and
PBRMl) that can detect cancer regardless of the tissue purity and the cellular composition
of the control (normal ovaries or Fallopian tube) tissues (Supplementary Table 2, column
4). This later group of five CSS ASEs, which could be useful in the clinic, was named the
ovarian cancer signature (OCS). Three ASEs (CAST, CD46 and PBRMl) from this OCS
were also able to discriminate between undissected tissues originating from 18 normal
breast and 20 ductal breast cancer with P < 5.0e-07 (t-test) further confirming the value of
this signature (Supplementary Table 3). ASEs that are not included in this group
nevertheless remain interesting for the purpose of understanding cancer biology and the
197
mechanism regulating alternative splicing in cancer using dissected tissues. We conclude
that while both the cancer epithelium and the tumor microenvironment may exhibit cancerspecific alternative splicing patterns, the ASEs that emerged by comparing the tumor
microenvironment and normal stromal tissues are more powerful at identifying cancer and
less dependent on tissue origin and cell- type composition.
198
4 Ovarian strona
o.arian stroma
vs
5 Tumor
mcroeiT, roiv'tenl
a
vs
4 Tu mor
Tissue expression
microenvironment
and qPCR
assay vaid3lion
3313 ----------------► 870
ASEs
ASEs
ucei
iRefSeq 36.3;
5 Fallopian tuse
epithelium
vs
6 Cancer epithelium
Tissues
Tissues
»
5
§
8 CES ASEs
15 ASEs
4 Falopian
tuoe epithelum
vs
4 Cancer epithelium
Cancer status
. . ■
Epithelial content ■ • i m a s s i
->S3Pl9
10 CSS ASEs
26 ASEs
••irrii;rirrrin ii
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K1A41217
MPRIP
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Cancer status
Hznz2
100m
0%
EEZZZ
0 10 20 30 40 50 60 70
Exon M B B É n w j » ' , .
exclusion
Splicing pattern
3
Epithelial content
:ss
:E S ASEs
\
/
Hesenchsmal-li:e
splicing pattern
EpXhelial-enriched exon
Figure 2 Erosseau 2012
Epithelial-li.e
spllcirpg pattern
/
\
✓
CD47, EIF4G2.
GIGYF2
80
»
100
E*on
inclusion
ASEs
/
I Ion preferential
splicing pattern
/
KIAA1217. IIFAT6.
OSBPL9, U P I
<
\
.
.
KIF13
tlon preferential
splicing pattern
ABI1. CAST. CD46.
MARCHS. MPRIP
l.lesench.mal enrichec exon
\
✓
I1DRG2. PERI,11 COS8.GIT2. MSRB3
E.xon *ith non preferential splicing pattern
199
Figure 2 Splicing of a subset of mesenchymal-enriched exons is repressed in the
ovarian tumor microenvironment.
(a) Strategy for the identification of cancer-specific alternative splicing patterns. Expression
of the 3313 simple ASEs (i.e. cassette exons, alternative 5’ and 3’ splice sites, and intron
retention) annotated in the RefSeq database 36.3 35 was examined using endpoint PCR
amplification of 5 RNA samples extracted from normal Fallopian tube tissue and ovarian
cancer tissues (see Materials and Methods for the details). Validated quantitative RT-PCR
assays were developed for a total of 870 expressed ASEs and the resulting PCR values
were used to calculate the mean quantitative splicing shift 17 (AQ\|/ = Qvy tumor - Q v
normal ) in the different normal and cancer tissues described in Fig. lc and Supplementary
Table 13 (see Materials and Methods for the details). ASEs were ranked based on a t-test of
the mean quantitative splicing shift and ASEs displaying statistically significant differences
between normal and cancer tissues (P < 0.05, t-test) and a AQ\|/ > 15 were re-examined in
an independent set of dissected tissues (see Materials and Methods for the details). The
final number of validated ASEs capable of discriminating between normal and cancer
epithelium (CES) or stroma (CSS) is indicated, (b) Stromal markers detected in undissected
cancer tissues. The quantitative percent splicing pattern (Qy) 17 of the CES and CSS ASEs
was determined by quantitative RT-PCR in an independent set of undissected ovarian
tissues containing 9 high-grade serous ovarian cancer, 6 Fallopian tube and 14 normal
ovarian tissues (Supplementary Table 15). The results are displayed in the form of two
heatmaps representing the splicing patterns of the CES (left panel) and the CSS (right
panel) in the different tissues. Gene names and the gene clusters are shown on the y-axis.
The type of tissues is indicated at bottom and the tissue clusters are shown on top. Cancer
and normal tissues are indicated by black and white boxes, respectively. Epithelial contents
are indicated by gray gradients at bottom, where white indicated no epithelial contents and
dark gray indicated 100% epithelial cells. The color code representing the different splicing
patterns is indicated at bottom. Dark orange indicates complete exon exclusion and bright
yellow signifies complete exon inclusion, (c) Epithelial splicing isoforms are enriched in
the tumor microenvironment. The cancer epithelial signature (CES) and the cancer stromal
signature (CSS), which include the ASEs capable of detecting cancer in both dissected
tissues and whole tumors were divided into groups based on their expression patterns in
normal mesenchymal and epithelial tissues (see Material and Methods for details). The
constitutive exons are indicated as white boxes and introns as lines. Epithelial- and
mesenchymal-enriched exons are indicated in black and gray boxes, respectively. Gene
names are indicated at bottom.
Cancer represses the inclusion of a subset of mesenchymal-enriched exons
Many of the ASEs in the cancer epithelium signature (CES) were found in genes linked to
different aspects of tumorigenesis such as apoptosis (e.g. CD47
) and other related
cellular functions. In contrast, the ASEs in the tumor microenvironment (CSS) found in
genes linked to EMT (e.g. PBRMl 37,38 and CD46 39) or associated with EMT-related
200
processes such as cell migration and invasion (e.g. ABU 40, CAST 41 and MPRIP 42)
(Supplementary Table 1, column 5 and Supplementary Table 2, column 5). This suggests
that ASEs making up the CES may influence basic cellular functions required for tumor
survival, while those occurring in CSS modulate their mesenchymal characteristics. Indeed,
three out of the five CSS ASEs with known EMT-related functions (ABI1 40, PBRMl 37,38
and MPRIP 42) exhibited switch-like splicing shifts (splicing pattern differing by more than
50 percentage points), when normal epithelial and stromal tissues were compared, while
only one ASE (TJP1 43) from the CES was spliced in a tissue-specific manner
(Supplementary Table 1, column 2 and Supplementary Table 2, column 2). Therefore, at
least in the dissected cell population, the tumor microenvironment harbored more changes
in the splicing of EMT-related genes than the tumor itself (Supplementary Table 1, column
5 and Supplementary Table 2, column 5). These changes in the tumor microenvironment
promoted the expression of epithelial splicing isoforms through the exclusion of five
mesenchymal-enriched exons (exons that are predominantly included in mesenchymal cells
compared to epithelial cells) and the inclusion of two epithelial-enriched exons (exons that
are predominantly included in epithelial cells compared to mesenchymal cells) (Fig. 2c,
Supplementary Table 2, column 2). This indicates that the epithelial-like splicing pattern in
the tumor microenvironment is mostly due to the repression of mesenchymal-enriched
exons (Supplementary Fig. 2). This directional splicing shift is specifically associated with
the CSS since ASEs linked to cancer epithelium exhibited either the mesenchymal splicing
pattern (through epithelial-enriched exon inclusion) or simply had non-preferential splicing
pattern (Fig. 2c, Supplementary Table 1 column 2). We conclude that alternative splicing in
the tumor microenvironment is modified to favor the suppression of a subset of
mesenchymal-enriched exons.
201
Input ASEs set
(870 ASEs)
CSS A SEs
(10 A SEs)
30%
15%
/
13%
/
\
y 'l m
■
Epithelial-enriched exon
II M esenchym al-enriched exon
I I Non preferential splicing pattern
Figure S2 Mesenchymal-enriched exons are preferentially regulated in the tumor
microenvironment.
The number of epithelial- and mesenchymal-enriched exons in the discovery screen input
ASEs set (IAS) and the cancer stromal signature (CSS) ASEs (see Fig. 2) are shown in the
form of pie chart. Only 13% of the exons in the IAS were enriched in mesenchymal cells,
while 50% of the CSS ASEs were mesenchymal-enriched exons (P = 0.004, Fischer’s exact
test).
Identification of cancer-specific splicing factors
To understand how the ASEs of the CES and CSS are regulated, we examined the
expression of 370 putative splicing factors in epithelial and stromal cells isolated from
normal and cancer tissues using quantitative RT-PCR (raw data are accessible through
http://palace.lgfus.ca/pcrreactiongroup/list/219).http://palace.lgfus.ca/pcrreactiongroup/list/
227). Comparison of the RNA levels in normal and cancer tissues identified 26 and 40
splicing factors whose expression was changed in the cancer epithelium and the tumor
microenvironment, respectively (Fig. 3a, Supplementary Table 4, columns 1-3). The
overlap between the tumor epithelium and its microenvironment was small (8%) (Fig. 3b),
as would be expected from tissues with distinct profiles of alternative splicing (Fig. 2c).
The relatively small numbers of splicing factors associated with the tumor (7%) and its
microenvironment (11%) indicates that the deregulated expression of splicing factors is not
global (Fig. 3a). The epithelial and or mesenchymal relationship of the cancer-associated
202
splicing factors was established by comparing their expression in normal dissected
epithelium and stroma and determining the direction of their expression levels in cancer
(raw data are accessible through http://palace.lgfus.ca/pcrreactiongroup/hst/227). As was
the case with CSS ASEs (Fig. 2c), the cancer-associated splicing factors also displayed
epithelial-like expression pattern in the tumor microenvironment, while no directional
expression pattern was observed in the cancer epithelium (Fig. 3b, Supplementary Table 4
column 4). Therefore, ovarian cancer appears to induce epithelial-like expression of a small
subset of splicing factors and ASEs in adjacent stromal cells. This focused reprogramming
of alternative splicing appears specific to the tumor microenvironment as it occurs to a
much lower extent in the tumor itself. Together these observations suggest that cancer
alters the expression of splicing factors in the microenvironment to reprogram the splicing
of a specific group of mesenehymal-enriched exons.
203
4 Ovarian stroma
vs
i Turret
rmcroerrvnonrnent
qPCR assay
validation
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Literaiure ^e y * o rd s
search
r,
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AFailcpiari
fuse epithelium
vs
4 Cancer epithelium
4 Cvanan stroma
vs
5 Tumor
microenvironment
123 ■
>2 fold
92.............. ... :— :— •»- 2&
5 Fallopian tuse
epithelium
vs
5 Cancer epithelium
b
Cancer
epithelium
Tumor
microenvironment
Epithelial-like expression pattern
Mesenchymal-like expression pattern
Hon preferential expression
C3ncer epithelium
associated splicing factors
•=T i o
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Cancer epithelium
Tumor microenvironment
associated splicing factors
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TJP1
KIAA1217
NFAT5
CD47
EIF4G2
GIGYF2
CAST
CD46
MPRIP
k
1
>- ï
T JP 1
KIA.A1217
NFAT5
EF4>
G1GVF2
MPRIP
AB)1
MARC H8
MSRE3
PBRM1
MARCHS
M SRB 3
PBRM 1
M l Exon exclusio
Figure 3 Brosseau 2012
a ï I 5 a
33 CO CL "c — 03
Exon inclusion
Mk'.ro^ nv ir<i n rnwit
c
204
Figure 3 The expression of cancer-associated splicing isoforms is regulated by a small
group of splicing factors.
(a) Strategy for the identification of cancer-associated splicing factors. The expression of
all splicing factors identified in both the RefSeq database and the NCBI PubMed database
64 were evaluated by quantitative RT-PCR in the different normal and cancer tissues
described in Fig. lc. Splicing factors capable of discriminating between cancer and normal
tissues by at least two fold are underlined, (b) The tumor microenvironment is associated
with epithelial-enriched splicing factors. The Venn diagram illustrates the tissue
distribution of the cancer-associated splicing factors obtained in a. The pie chart indicates
the epithelial / mesenchymal expression of the cancer-associated splicing factors as
identified by quantitative RT-PCR analysis of RNA extracted from Fallopian tube
epithelium and ovarian stroma (see Supplementary Table 4 column 4 and Materials and
Methods section for values and details, respectively), (c) Depletion of the tumor
microenvironment associated splicing factors alters the splicing pattern of the cancer
stromal signature (CSS). The cancer-associated splicing factors were depleted using siRNA
in the ovarian cancer cell line SKOV3ipl. The impact on the CES and CSS ASEs identified
in Fig. 2, was evaluated using quantitative RT-PCR. Exons inclusion (gray boxes) or
exclusion (black boxes) generating a quantitative spbeing shift 17 (AQ\|/ = Qvj/ knockdown Q v control ) of at least 10 was considered significant and presented in the form of a table.
For simphcity, only the ASEs regulated by at least one splicing factor and the splicing
factors regulating at least one ASE are shown. The expression of all splicing factors except
DDX39 was downregulated in cancer tissues and therefore the illustrated in vitro
knockdown of these factors are expected to induce a spbeing pattern similar to that detected
in cancer tissues, (d) Illustration of the CES and CSS ASEs as exon exclusion and
inclusion. To enable direct comparison between the splicing shift (AQv|/) 17 produced by the
spbeing factors knockdown (illustrated in c) and that detected in tissues (Fig. 2), the
cancer-associated genes were listed in the same order used in c and their expression in
cancer tissues is indicated as exon exclusion (black boxes) and inclusion (gray boxes)
(Supplementary Table 1 column 1 and Supplementary Table 2 column 1).
All mesenchymal-enriched exons associated with CSS, are repressed in the tumor
microenvironment (Fig. 2c) and most of the cancer-associated spbeing factors presented in
figure 3c, with the exception of DDX39, are downregulated in cancer. Therefore, silencing
of spbeing factors in cancer cell lines is expected to induce the exclusion of all cancerassociated exons that are directly regulated by these spbeing factors. Accordingly, we
depleted 47 out of 61 cancer-associated spbeing factors by at least two fold using two
independent siRNAs in the model ovarian cancer cell line SKOV3ipl (Supplementary
Table
5
and
raw
data
are
accessible
through
http://palace.lgfus.ca/pcrreactiongroup/list/23219) and tested the impact on the spbeing
pattern of both CES and CSS ASEs. As shown in Fig. 3c, spbeing factors bnked to cancer
epithebum affected mostly CES events while those repressed in the tumor
microenvironment led to the exclusion of mesenchymal-enriched exons (Fig. 3c). In 71%
(22 out of 31) of the cases, the depletion of spbeing factors in SKOV3ipl altered
alternative spbeing in the same direction as that observed in cancer tissues (Fig. 3d). These
205
results demonstrate that the splicing pattern detected in the tumor microenvironment results
at least in part by changes in the expression of splicing factors.
Examining the effects of knocking down cancer-associated splicing factors on CES and
CSS ASEs revealed two groups of splicing factors. The first group includes core
spliceosomal factors such as SF3A2 44, SNRPD2 45 and SNRPG 46, while the second
includes alternative splicing regulators RBFOX2 47 and QKI 48. The knockdown of the first
group, which are underexpressed in the tumor microenvironment modified the splicing of 2
out of 8 CSS ASEs expressed in the SKOV3pil cell line (compare Fig. 3c and Fig. 3d), but
they also induced apoptosis (data not shown), as would be expected from the knockdown of
essential splicing factors. Induction of apoptosis and general perturbation of splicing
patterns makes the distinction between direct and indirect effects very difficult and as such
this group of splicing factors were not pursued further. In contrast, reproducing the tumor
microenvironment associated downregulation of the RBFOX2 or QKI in SKOV3ipl cells
replicated the cancer-associated splicing profile of 4 out of 8 CSS ASEs without
dramatically affecting cell viability (compare Figs. 3c and Fig. 3d and data not shown).
This indicates that a part of the splicing profiles observed in the tumor microenvironment is
reproduced by the inhibition of RBFOX2 and QKI expression.
The tumor microenvironment exhibits limited changes in the mesenchvmal-to-epithelial
(MET) associated splicing program
The expression profile of established stromal markers demonstrated clearly the stromal
nature of the tumor microenvironment (Fig. lc) indicating that the majority of cells in the
tumor microenvironment maintain their mesenchymal phenotype. In contrast, the
expression of most CSS ASEs (Fig. 2c) and cancer-associated splicing factors (Fig. 3b)
displayed epithelial-like splicing patterns and expression, respectively. These observations
suggest either that the tumor induces the MET splicing program without affecting the
global expression levels of known markers (Fig. lc) or that it modifies a subclass of genes
associated with MET without generating the canonical epithelial phenotype. All MET and
EMT splicing factors were not preferentially expressed in the cancer epithelium or the
tumor microenvironment when compared to normal tissues except for ESRP1/2, which was
overexpressed in the tumor microenvironment (Supplementary Table 6). This indicates
that, overall, the expression of the EMT and MET splicing regulators is not perturbed in
cancer tissues. In addition, only 4 out of 17 ASEs previously associated with EMT 25
(PBRM1, EN AH, BA1AP2 and CLSTN1) were linked to the tumor microenvironment (Fig.
4, Supplementary Table 2 and Supplementary Table 7). However, for simplicity, they were
206
not incorporated in the CSS if they were not identified in the original tumor
microenvironment association screen (Fig. 2a). This further confirms that cancer displays
limited changes in the splicing of a subset of mesenchymal-enriched exons and no global
modification of the MET splicing program.
207
Cancer
EMT
♦ I
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2
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BA AP
PBRM1
KIE13A
ENAH
ST
CD46
MPRIP
;B11
MARCHS
MSRB3
PBRM1
Exon exclusion
Exon inclusion
Figure 4 Brosseau 2012
208
Figure 4 The expression of splicing factors associated with mesenchymal- to- epithelial
transition (MET) are not systematically modified in cancer tissues.
The association between the EMT 25 (e.g. ESRP1/2 and PTBP1/2) or the tumor
microenvironment (e.g. QKI and RBFOX2) associated splicing factors and the splicing of
ASEs linked to EMT (upper panel) or tumor microenvironment (lower panel) was
evaluated by knocking down these splicing factors and calculating the mean quantitative
splicing shift 17 (AQ\|/ = Qy knockdown - Qvy control ) of each ASE as described in Fig. 3c.
The knockdowns were performed in the ovarian cancer cell line SKOV3ipl with the
exception of ESRP1/2, which was knocked down in the epithelial cell line ZR-75 because it
is not expressed in SKOV3ipl. The impact on splicing patterns was evaluated by
quantitative RT-PCR as described in Fig. 3c. Exons inclusion (gray boxes) or exclusion
(black boxes) generating a quantitative splicing shift of at least 10 was considered
significant (see Material and Methods for details) and presented in the form of a table. The
expression of the different splicing factors in the tumor microenvironment (cancer) and in
vitro twist-induced EMT in epithelial cells (EMT) 25 is shown on top, where the upward
and downward arrows indicate an increase and decrease in expression, respectively.
To determine the overlap between the tumor microenvironment and the EMT / MET
splicing programs, we compared the effect of knocking down the MET splicing factors
ESRP1/2 and the EMT splicing factor PTBP1 (Supplementary Table 5) to that generated by
the knockdown of the cancer-associated factors RBFOX2 and QKI. Comparison of the
splicing profiles of the different knockdowns indicated that 71% (12 out 17) of the EMT
associated ASEs tested are regulated by either PTBP1 or ESRP1/2, but that only two were
also regulated by the tumor microenvironment-associated splicing factors RBFOX2 and
QKI (Fig. 4, upper panel). Consistently, a low number of CSS ASEs were affected by the
EMT or MET-specific splicing factors in a way that mimics the expression pattern in the
tumor microenvironment (Fig. 4, lower panel). We conclude that the splicing pattern of
CSS ASEs is not directly linked to the expression of EMT or MET associated splicing
factors.
The tumor microenvironment-associated splicing factors OKI and RBFOX2 regulate
common splicing targets
To determine the extent of overlap between RBFOX2 and QKI splicing targets and uncover
potentially new cancer-associated splicing events, we compared the effects of depleting the
expression of these two proteins on a larger set of ASEs. We monitored the splicing
209
profiles of 48 pre-established RBFOX2-regulated ASEs 12 and 57 newly identified QKIregulated ASEs (see Material and Methods for details) after QKI or RBFOX2 knockdown
in SKOV3ipl (Supplementary Table 8, columns 3-5). As indicated in Fig. 5a, 66% (37 out
of 56) of ASEs modified by RBFOX2 knockdown were also affected by the depletion of
QKI, and half (37 out of 74) of the QKI regulated ASEs were perturbed by RBFOX2
knockdown. The effect of RBFOX2 and QKI knockdown on the common group of ASEs
(Fig. 5a) displayed a Pearson correlation of 0.65 (P = 1,5e-05), confirming their status as
shared splicing targets (Fig. 5b). This indicates that there is a broad overlap between QKI
and RBFOX2 splicing targets. To determine the functional significance of the common
RBFOX2 and QKI splicing targets, we classified them according to their epithelial /
mesenchymal preferential splicing pattern and calculated the number of exon inclusions
and exclusions in both mesenchymal and epithelial groups (Fig. 5c, Supplementary Table 8,
column 7 and Supplementary Table 9). The results indicate that RBFOX2 promotes
inclusion of QKI-independent exons, while QKI favors the exclusion of exons that are not
controlled by RBFOX2, irrespective of their relative epithelial or mesenchymalenrichment. In contrast, most exons regulated by both RBFOX2 and QKI were
mesenchymal-enriched. In the tumor microenvironment the expression of QKI and
RBFOX2 is downregulated (Supplementary Table 4) and their expression level is
correlated with the changes in alternative splicing. Therefore, while RBFOX2 and QKI
may individually affect different splicing targets, collectively they converge to favor the
inclusion of a subset of mesenchymal-enriched exons, which explains why the
downregulation of these splicing factors leads to exon exclusion in the tumor
microenvironment.
210
48 RBF 0X2
regulated ASEs
QKI
knockdown
RBFOX2
knockdown
93 unique
ASEs
57 QKI
regulated ASEs
R BFO X 2 v ~ “- « w ''“-'v O K J
Endpoint PCR
Quantitative RT-PC R
qPC R a s s a y
v a lid a tio n
R B F O X 2/ ^<— v - —»vQKj
fl5
f2 a
A ssociation to
mictoen vi ro nmentt /
in
.
RBF 0 X 2 s — y ç — "v. OKI
100
Effect of RBFOX2 knockdown
33 J
Epithelial mesenchymal
preferential splicing pattern
RBF 0 X 2 ✓
Pearson 0.65
R = 1.56-0 6
v — s .O K I
(RBFOX2)
50
m
t
PBFO>?
"T "'
(QKI)
QKI
/
....... '
Mesenchymal-enriched won
-100
■5<L. '
50
Neither MesenchyrrisS-enriched or Epithelial-enriched exon
100
Constitutive exon
< T-io
i
-100 ;
Effect of QKI knockdown
A
Cancer-associated ASE (% )
sc
8 C
D
APBB2 CZ>-
-r i ; y
MPRIP
it gas
CD45 r :
I
RBFOX2
Figure 5 Brosse au 2012
RBFOX2 and
QKI
QKI
Epithelial exon
C~3
Legend
30
Mesenchymal exon
E
a qki binding site ;a c u a a y ;
Constitutive excn
Eg
CZC CAST
R - ■;;j FNIP1
q
-
R,
::;j p b rm 1
::::: a t p h c
R r s f o x 2 ointang site (WGCAUG?
211
Figure 5 RBFOX2 and QKI regulate the expression of common epithelial splicing
isoforms in the tumor microenvironment.
(a) Identification of common RBFOX2 and QKI splicing targets. RBFOX2 and QKI were
individually knocked down using two independent siRNAs in SKOV3ipl. The effect of the
different knockdowns was evaluated by endpoint PCR using a set of 48 pre-established
RBFOX2 targets and a set of 57 newly identified QKI targets (see Material and Methods
for details). The 93 ASEs responding to the knockdown of at least one splicing factor are
presented in the form of Venn diagram (i). Quantitative RT-PCR primers were designed
and validated for 77 out of 93 ASEs (ii) and their expression in the tumor
microenvironment or the epithelial and stromal normal tissues was tested as described in
Fig. 2 (iii). (b) Comparison of the impact of RBFOX2 and QKI knockdown on the splicing
of 37 common ASEs. The impact of RBFOX2 and QKI knockdown on the common set of
37 splicing targets discovered in a, was plotted as a quantitative splicing shift 17 (AQ\|/ = Q\|/
knockdown - Q y control ) to generate a scatter graph. The Pearson correlation between the
effect of RBFOX2 and QKI knockdown on splicing pattern and its p value is indicated on
the top right of the graph, (c) Schematic representation of the effects of RBFOX2 and QKI
on alternative splicing. In normal tissues, RBFOX2 favors exon inclusion, while QKI
favors exon exclusion regardless of the epithelial / mesenchymal splicing patterns of the
targeted alternative splicing events. In contrast, the knockdown of RBFOX2 and QKI
mostly lead to the inclusion of mesenchymal-enriched exons in cases where the ASEs are
affected by both splicing factors (i.e. common ASEs). The exons and introns are presented
in the form of boxes and lines, respectively. Arrows indicate exon inclusion and bar-headed
lines indicate exon exclusion. Gray boxes indicate mesenchymal exons and the boxes with
gray and black gradient indicate an exon with non-preferential epithelial or mesenchymal
splicing pattern, (d) Common RBFOX2 and QKI targets are more likely to be associated
with the tumor microenvironment than those affected by only one splicing factor. The bar
graphs represent the percentage of the RBFOX2, QKI or common RBFOX2 and QKI
splicing targets (identified in a) associated with the tumor microenvironment as described
in Fig. 2a. (e) Schematic representation of the protein binding sites near RBFOX2- and
QKI-responsive exons. The position of RBFOX2 and QKI binding sites (WGCAUG and
ACUAAY) in 8 common RBFOX2 and QKI splicing targets associated with the tumor
microenvironment (identified in Fig. 3c and Fig. 5d) are indicated as “R” and “Q”,
respectively. The binding sites were found in five regions: 250 nts from the 5’ splice site of
the upstream intron (A); 250 nts from the 3’ splice site of the upstream intron (B); within
the exon (C); 250 nts from the 5’ splice site of the downstream intron (D); or 250 nts from
the 3’ splice site of the downstream intron (E).
If RBFOX2 and QKI regulate splicing in the tumor microenvironment, we expect at least
some of the alternative splicing events affected by the knockdown of these proteins in vitro
to be associated with cancer in vivo. Accordingly, we monitored the splicing profiles of
RBFOX2 and QKI-dependent ASEs in the tumor microenvironment. Out of 29 ASEs
tested, seven ASEs including three that overlap with Fig. 2a (Supplementary Table 2,
columns 1-2) were associated to the tumor microenvironment (Supplementary Table 10,
212
columns 1-2). A total of five were mesenchymal-enriched exons excluded in the tumor
microenvironment (Supplementary Table 2, column 2 and Supplementary Table 10,
column 2). Indeed, these four additional ASEs (APBB2, ATP11C, ITGA6, FNIP1) could
be considered potential markers for ovarian cancer. However, for simplicity they were not
incorporated in the CSS, which refer only to ASEs identified in the original association
screen using dissected tissues (Fig. 2a). Overall, 24% (7 out of 29) of the RBFOX2 and
QKI-dependent ASEs were associated with the tumor microenvironment, whereas less than
7% of the ASEs affected by only one of the two splicing factors were linked to cancer (Fig.
5d). This indicates that while a substantial fraction of ASEs under the control of RBFOX2
and QKI are associated with the tumor microenvironment a large number of RBFOX2 and
QKI in vitro splicing targets are not. Together these results suggest that while RBFOX2 and
QKI are important regulators of cancer-associated genes, other factors influence their
capacity to modulate the splicing of their target genes in the tumor microenvironment.
Examining the sequence surrounding the RBFOX2 and QKI-dependent ASEs revealed
consensus binding motifs 49,50 for at least one of the two splicing factors, in all cases except
ITGA6 (Fig. 5e). This suggests that RBFOX2 and QKI directly contribute to the splicing
decisions of this specific subset of mesenchymal-enriched exons.
Repression of mesenchymal-enriched exons is not an exclusive feature of ovarian cancer
It was previously suggested that RBFOX2 might be inactivated in breast cancer through the
skipping of a 40 nucleotides C-terminal cassette exon (exon 11) 12,51. Therefore, at least
some of RBFOX2 splicing targets, including those associated with the ovarian tumor
microenvironment, are likely to be similarly modified in breast cancer. To examine this
possibility we compared the splicing pattern of the set of RBFOX2 and QKI-dependent
ASEs associated with the tumor microenvironment in undissected ovarian and breast
tumors using quantitative RT-PCR. As expected, the splicing patterns in both ovarian and
breast cancers were tightly correlated, indicating that RBFOX2 and QKI splicing targets are
also repressed in high-grade breast cancer (Fig. 6a, Supplementary Table 3), and suggesting
that breast and ovarian cancer use similar mechanisms for modifying the splicing patterns
of tumor associated ASEs. Consistently, an independent study using a large number of
213
breast cancer tissues concluded that QKI expression is reduced in breast tumors (P < 3.0e03, t-test) 48. In our hands, however, the most striking difference between tumor and normal
breast tissues was not the change in global expression but rather in the pattern of QKI
splicing (Fig. 6b, Supplementary Table 11 and Supplementary Table 12). In the tumor,
QKI-6 isoform was preferentially expressed over the QKI-7 isoform. This change was
previously shown to affect QKI activity
. Therefore, both changes in the expression and
splicing of QKI are altered depending on the type of cancer or cancer-subtype examined.
Together the data suggest that RBFOX2 and QKI play an important role in regulating the
splicing of a subset of mesenchymal-enriched exons in both ovarian and breast cancer.
B>
Splicing shift
QKI relative mRNA expression
■PEB2
-*■
f'O
Ui
O
O
O
>•..............
i
MPRIP
A
FNIP1
O
ITGA6
A
CD46
C?
A ..-,-
CAST
O
U
ATP 11C
-U
O
u Un dissected oreast tumors
fO
Undissected ovarian tumors
QKI splicing shift
W
m
PBRM1
f t
214
215
Figure 6 The common RBFOX2 and QKI splicing targets are deregulated in both
ovarian and breast cancer.
(a) The behaviour of 8 common RBFOX2 and QKI splicing targets associated to the tumor
microenvironment was monitored using quantitative RT-PCR in 14 normal and 13 serous
high-grade ovarian cancer tissues and their quantitative splicing pattern (Qq/) 17 compared
to that detected in 18 normal and 20 ductal breast cancer tissues (Supplementary Table 3).
Shown are histograms representing the mean quantitative splicing shift 17 (AQ\|/ = Qq/
t u m o r - Qv n o r m a l ) , (b) QKI expression is altered by different mechanisms in ovarian and
breast cancer. The expression (left panel) and splicing pattern (right panel) of QKI was
monitored by quantitative RT-PCR in breast and ovarian samples as described in a. The
global expression pattern was calculated relative to housekeeping genes as previously
described 17 and the relative value presented in the form of a bar graph. The splicing pattern
of QKI iso forms 6 (short) and 7 (long) was calculated as mean quantitative splicing shift 17
(AQy = Qq/ t u m o r - Qy n o r m a l ) as previously described in a and plotted in the form of bar
graphs. When significant, the p-value (t-test) of difference in expression or splicing shift is
displayed on top of histogram by asterisks (* means P < 0.05; ** means P < 5.0e-07).
Discussion
In this study we compared the splicing program of a homogenous population of normal and
cancer cells with the goal of identifying cancer-specific splicing isoforms. The results
indicate that differences between normal and cancer tissues are much smaller than
previously thought. Analyzing the expression of the Ref. Seq alternative splicing events in
RNA extracted from whole ovarian tumors identified 336 cancer-associated ASEs 11,12,
while comparison of normal and cancer epithelial or stromal tissues identified a total of 25
cancer-specific ASEs (Fig. 2c, Supplementary Table 7 column 1 and Supplementary Table
10 column 1). Most of the 336 whole tumor markers affected cell-type specific genes
including those linked to cell architecture (MPR1P 42), cell plasticity (MAP3K7) and cell
movement (CEACAMl) n . In contrast, those identified using dissected tissues were mostly
linked to tumorigenesis or membrane (signaling) associated functions (Fig.
2,
Supplementary Table 1 column 5 and Supplementary Table 2 column 5). Therefore, while
whole tumor screens identified cell-type specific genes, comparison of samples with similar
cell composition produced gene signatures that are more directly associated with tumor
biology. Consistently, the overlap between the two types of screens was limited to 13 ASEs
commonly identified as cancer-specific markers by the two approaches (Supplementary
216
Fig. 3). Strikingly, all the common ASEs except one (OSBPL9) were identified as tumor
microenvironment markers, suggesting that most of ASEs identified in whole tumor
screens are epithelial markers that could easily be eliminated as false positives when
samples with similar epithelial contents are compared. In any case, it is clear that
comparison of dissected tissue of similar composition is much more likely to reveal true
cancer-specific markers.
ASEs associated with
un dissected tissu es
288 ASEs
ASEs com m on to this
study and V enable J
NSM B2009
170 ASEs
ASEs associated with
dissected tissues
1 3 ASEs
< 1%
/ 92 %
■
ASEs asso ciated with cancer epithelium
I!
ASEs associated with tumor microenvironment
[I]
No cancer association
Figure S3 Monitoring the splicing pattern of ASEs associated with whole tumors in
dissected tissues.
Out of 288 ASEs that were previously associated with whole ovarian tumors 2, 170 where
included in the input set used in the dissected tissue screen described in Fig. 2. The pie
chart illustrates the number of whole tumor associated events that were preferentially
expressed in dissected cancer tissues. The majority of ASEs identified in whole tumor did
not distinguish between dissected normal and cancer tissues.
217
Contrary to in vitro assumptions 24-25, we found no evidence of strong mesenchymal
splicing patterns in high-grade ovarian cancer epithelium. The expression of wellestablished epithelial expression markers like CDH1 and DSP (Fig. lc) and the histological
inspection of ovarian tumors (http://www.proteinatlas.org/) confirmed the epithelial nature
of cancer cells. In addition, no mesenchymal-enriched exons were detected in the tumor
cancer epithelium (Fig. 2c) and none of the splicing factors linked to EMT were
differentially expressed in tumor tissues (Supplementary Table 6, column 2). These data
suggest that if indeed EMT was active in the samples tested, the fraction of attached
epithelial cells acquiring mesenchymal character is relatively small. This conclusion is also
supported by earlier studies that failed to identify a strong EMT signature in dissected
ovarian cancer tissues 21. Therefore, while cancer may induce changes in the splicing
program of certain genes in the direction of EMT in vitro, these changes may be restricted
to a very small population of cancer cells in tumor tissues.
The changes in splicing in the tumor microenvironment were mostly repression of
mesenchymal-enriched exons (Fig. 2c). However, the majority of the established
mesenchymal markers were expressed normally suggesting that the observed changes in
splicing are not due to MET (Fig. lc). In addition, the expression of most EMT and MET
associated ASEs (Fig. 4) and splicing factors (Supplementary Table 6 column 3) were not
altered in the tumor microenvironment, suggesting that the expression of EMT and METdependent exons is not globally deregulated in cancer. Consistently, the splicing factors
associated with the tumor microenvironment (e.g. QKI) were not necessarily linked to
EMT
25
. Therefore, it appears that cancer suppresses the mesenchymal characters of certain
exons for reasons other than the induction of MET. Indeed, overexpression of QKI blocks
proliferation in vitro and acts as a potential tumor suppressor in colon cancer 53 and
astrocytic tumors 54.
Reducing the expression of splicing factors in any given cell line in vitro lead to changes in
large number of ASEs, few of which can be associated with a given condition in vivo. In
our hands, repression of QKI or RBFOX2 in vitro changed the splicing pattern of a total of
39 common splicing targets in the SKOV3ipl ovarian adenocarcinoma cell line (Fig. 3c,
218
Fig. 5a and Supplementary Table 8, columns 3-5). However, only a small subset of these
where associated with the tumor microenvironment in vivo (Fig. 2a and Fig. 5d). This may
reflect differences between cell lines grown in vitro and patient tissues. The splicing events
affected by QKI and RBFOX2 knockdowns in vitro might be affected by other cancerassociated splicing factors not present in the cell lines tested. Indeed, the outcome of any
splicing target is determined by many splicing factors that may vary depending on the cell
line and conditions tested. For examples, RBFOX2 and RBFOX1 splicing activities were
found to be affected by hnRNP HI and TFG in brain 47. On the other hands, RBFOX2 and
the neuron-specific splicing factor NOVA were found to regulate common splicing targets
in neuronal tissues 55. It was also shown that the splicing factor QKI controls the expression
of other splicing factors like hnRNPAl, suggesting that one splicing factor may lead to a
cascade of changes in splicing that goes beyond its direct splicing targets 56. In the case of
ovarian cancer, the effect of QKI on splicing appears not to be mediated by hnRNPAl as
the expression level of hnRNPAl is associated with the tumor microenvironment
(Supplementary Table 4, column 3) but its depletion affects the splicing of only one
(MPRIP) common RBFOX2 and QKI splicing target in SKOV3ipl cell line (Fig. 3c).
Therefore, while the data presented in this work points to a group of splicing targets that are
specifically regulated by QKI and RBFOX2 in the tumor microenvironment, it is likely that
the generation of the cancer splicing program involves a large number of factors that
together define the splicing outcome in the tumor microenvironment.
The cancer stromal signature (CSS) discovered in ovarian cancer was also detected in
breast cancer, indicating similarity in the splicing patterns of these types of cancer. The
CSS was tested in a variety of breast cancer types including high-grade estrogen receptor
positive and negative ductal breast cancer samples (Fig. 6). Overall, the splicing profile of
these ASEs was similar to that detected in the microenvironment of ovarian tumors
regardless of the estrogen receptor status or cancer subtype, underlining the generality of
the newly discovered signature. Earlier study of luminal (estrogen receptor positive) and
basal (estrogen receptor negative) breast cancer cell lines identified cancer subtype specific
splicing signatures
25 57
’ .In contrast, we did not find any statistically significant differences
in the splicing patterns of tumor microenvironment and RBFOX2 and QKI dependent
219
ASEs in estrogen receptor positive and negative breast cancer subtypes (Supplementary
Table 3). This contradiction might be due to differences between the minimalistic, in vitro
growth conditions of monolayer cell cultures and the intricate, three-dimensional complex
growth of cells in patient tissues in vivo or the number and nature of splicing events
examined. The expression pattern of splicing factors was also perturbed in both ovarian and
breast cancer but in different ways: in ovarian cancer the expression of RBFOX2 and QKI
was downregulated, while their splicing patterns were altered in breast cancer (Fig. 5) 12.
Other studies of QKI expression in breast cancer suggested that QKI might also be
downregulated in breast cancer
58
, suggesting that the expression of QKI varies between
breast cancer tumors. Therefore, while there is similarity between the breast and ovarian
cancer splicing patterns, there is difference in the way these patterns are produced in each
type of cancer.
Oncogenesis and tumor progression rely on a reciprocal secretory communication program
with the tumor microenvironment 59. This communication results in a tumor
microenvironment replete with inflammatory mediators, growth factors, matrix remodeling
enzymes and angiogenic factors 60. Growth factors produced by many kinds of cancer cells
including breast and ovarian carcinomas attract fibroblasts and stimulate their proliferation
61. Differentiation of fibroblasts in the vicinity of cancer cells to myofibroblasts (i.e.
activated fibroblasts) is important for tumor growth and has been observed in several in
vitro studies using ovarian cells
. This transformation is required for tumor development
since fibroblasts derived from the omentum, the richly vascularized fatty subperitoneal
layer surrounding the ovaries, increased ovarian cancer cell adhesion and invasive
behavior, whereas omentum-derived mésothélial cells reduced growth of ovarian cancer
cells 63. In this study, we uncovered a new layer of tumor-dependent modification of
stromal cells defined by changes in alternative splicing. These changes occur preferentially
in the tumor microenvironment and include differences in the splicing of genes related to
diverse functions linked to cancer development and were associated with changes in the
expression of splicing factors. Interestingly, the cancer-specific splicing markers that are
least sensitive to tissue composition are found in the tumor microenvironment and not the
tumor itself, suggesting that cancer can be detected more by changes in the
220
microenvironment that may even take place early in tumor development. However, it is
currently unclear whether these changes in stromal cells precede tumor development or
occur after the tumor is established. In vitro studies using cell and animal models will be
required to clarify this issue. In any case, the results presented here pave the way for in
depth studies of a new level of tumor dependent modification of gene expression in stromal
cells. All together, it suggests that cancer cells modulate their environment in a specific and
programmed fashion and that the monitoring of splicing provides sensitive and specific
markers that may prove to have clinical values.
221
Acknowledgments
We thank the “Réseau de Recherche sur le Cancer FRSQ” tissue bank for ovarian and
breast normal and tumor tissues, David Huntsman and the British Columbia tumor bank for
the Fallopian tube samples, the Alberta tumor bank for the low malignant potential sample
and Vincent Normandeau-Babin for clinical data management. We also thank David
Huntsman for discussions and advice in the early stages of this work. We thank FernandPierre Gendron, the “Service de phénotypage” and members of the Department of
pathology from the Université de Sherbrooke for help with LCM and tissue preparation.
This work was funded by a grant from the Canadian Cancer Society Research Institute and
the Canadian Institute of Health Research (CIHR). Jean-Pierre Perreault is the Canada
Research Chair on Genomics and Catalytic RNA. Benoit Chabot is the Canada Research
Chair in Functional Genomics. Sherif Abou-Elela is a Chercheur National of the Fonds de
la Recherche en Santé du Québec (FRSQ).
Authors contribution
Designed experiments: JPB, SAE, JFL, HN
Analyzed data: JPB, JFL, PT, SAE
Paper writing: JPB, SAE, BC
Supervised experiments: RK, PP, JPP, BC, SAE, RK
Carried out experiments: JPB, MD, DG, SC, EL, HN
Competing interests
We declare no competing interests.
222
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226
Online Methods
Tissue selection
Clinically homogeneous (high grade, high stage and chemonaïve) tumors were selected for
both dissected and undissected analyses. Tissue sourcing was performed as previously
described 11,16 and separated into 6 sample sets; 1) the active ASEs set containing one
Fallopian tube, one low malignant potential, one serous ovarian cancer grade 1, one serous
ovarian cancer grade 3 and one ovarian clear cell carcinoma, 2) the LCM discovery set
containing 4 normal ovarian stroma, 4 Fallopian tube epithelium, 4 cancer epithelium and 4
tumor microenvironment samples, 3) the LCM validation set containing 4 normal ovarian
stroma, 5 Fallopian tube epithelium, 5 cancer epithelium and 5 tumor microenvironment
samples, 4) the fresh frozen (FF) and formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) matched
sample-sets containing mirror images of 4 undissected normal ovaries and 4 undissected
ovarian serous carcinomas, 5) the undissected serous ovarian samples-set is composed of
14 undissected normal ovaries, 6 Fallopian tube (FT) and 13 undissected ovarian serous
carcinomas and 6) the undissected ductal breast samples-set composed of 18 normal breast
tissues and 20 ductal breast cancer samples. The samples labelled OVN 250 S and OVN
308 S did not pass the RNA quality control tests and therefore were rejected from further
analyses. The percentage of epithelial and stromal cells in each samples were determined
using hematoxylin and eosin stained mirror image samples. The description of individual
samples is listed in Supplementary Table 13, Supplementary Table 15 and Supplementary
Table 16. Dissected regions were selected based on the epithelium (hematoxylin) and
stromal cells (eosin) specific staining patterns. Cancer epithelial cells were selected based
on their morphology (cylindrical or cubic cells with round to ovoid nuclei) and the absence
of necrosis. Cells in the tumor microenvironment where selected based on their
morphology (spindle cells with spindle nuclei) from the region adjacent to tumors
visualized at lOx magnification.
Cell culture, transfection, RNA extraction and quantitative RT-PCR
227
Cell culture, transfection, RNA extraction and quantitative RT-PCR were performed as
previously described
17 65
’ except for FFPE and LCM samples. The breast cancer cell line
ZR-75 was grown in RPMI 1640 medium supplemented with 10% (v/v) FBS and 2mM LGlutamine. LCM samples isolated using several successive 8 pm cut from FFPE bloc of
each LCM sample were deposited on membrane slide (Molecular Machines & Industries,
Canada). In general, 1-3 cuts were used for ovarian stroma and cancer epithelium, while 35 and 8-15 cuts were used for tumor microenvironment and Fallopian tube, respectively.
LCM slides were stained with hematoxylin and eosin (Fischer, Canada) and were dissected
using MMICellCut (Molecular Machines & Industries, Canada). Samples with the same
cell type and tissue source were pooled. RNA extraction was performed using RNeasy
FFPE kit (Qiagen, Canada) with the following modifications: dissected material were
incubated in Aqua DePar IX (Davis Diagnostics, Canada) for 15 minutes at 95°C then
lysed by incubation in tris-guanidinium thiocyanate 4M (Sigma-Aldrich, Canada) and 10
pL of proteinase K (Qiagen, Canada) for 15 minutes at 55°C followed by 15 minutes
incubation at 80°C. Finally, demodification was achieved by the addition of NH4CI (SigmaAldrich, Canada) to a final concentration of 2.5M and incubation for 20 min at 95°C.
DNase treatment was performed using RNase-free DNase set (Qiagen, Canada). The
resulting RNA (250 ng / reaction) was subjected to a single round of 25 PCR cycles of
amplification using Sigma whole transcriptome amplification kit (Sigma-Aldrich, Canada).
The resulting DNA libraries were purified using Qiaquick PCR purification kit (Qiagen,
Canada) and diluted to a final volume of 12.5 mL. Global 17 and isoform-specific 65
quantitative RT-PCR primers were designed and validated as previously described 65. The
reliability of the gene expression assay using RNA samples from archived material was
evaluated by comparing technical duplicates of amplification (Supplementary Fig. 4b),
global gene expression (Supplementary Fig. 4a) and splicing pattern (Supplementary Fig.
5) obtained from the fresh frozen (FF) and fresh frozen formalin-fixed, paraffin- embedded
(FFPE) matched samples-set and different methodology (e.g. quantitative RT-PCR vs
endpoint PCR, see Supplementary Fig. 4c and Supplementary Fig. 5). The quality of the
tissue dissection was verified visually (Fig. la) and through the expression of known celltype markers (Fig. lb). The expression levels of the different markers did not vary greatly
between tissues of the same type confirming the absence of random sample-to-sample
228
variations in cell type (Fig. lb and Supplementary Table 14). Furthermore, the changes in
gene expression observed in tumor samples were gene-specific and not marker type specific
(e.g. epithelial or stromal, see Supplementary Fig. lc and Supplementary Table 14)
confirming that any changes observed in cancer tissues are not due to variation in the level
of
cell
type
contaminations.
All
raw
PCR
data
are
available
through
http://palace.lgfus.ca/pcrreactiongroup/list/219.
Primer design and alternative splicing screens
The previously described LISA platform (LISA )11 was updated with RefSeq database build
36.3 35 and used for automatic identification of ASEs and the design of isoform-specific
PCR primers as described before 12. ASEs with strong evidence of the expression of both
splicing isoforms (active ASEs) were identified by endpoint PCR using four individual
ovarian tissues (one clear cell, one low malignant potential, one serous grade 1 and one
serous grade 3) and 1 Fallopian tube tissue as previously described 12. Iso form-specific
quantitative RT-PCR primers were designed for all active ASEs and validated using a
universal human reference RNA as described earlier 65. Primer pairs showing no PCR
amplifications were subsequently tested using RNA extracted from FFPE pool that include
two normal ovaries and two serous ovarian cancer tissues, totalizing 1740 validated primer
pairs (covering 870 ASEs). The screen for cancer-specific ASE markers was performed in
two steps: 1) Discovery screen, which consists of surveying 870 ASEs in the LCM
discovery samples-set and 2) Validation screen, which assess the expression of all ASEs
obtained from the discovery screen in an independent LCM samples-set. Splicing pattern
(Qv) values were calculated as described elsewhere l7. In the discovery screen, ASEs were
selected for further studies if they were expressed with a splicing shift ( A Q y = Q v|/ j u m o r
M IC R O EN V IR O N M EN T
epithelium )
~
Q V O V A R IA N
STR O M A
Or
Q v |/C A N C E R
EPITH ELIU M
~
Q V f ALLOPIAN
T U BE
of at least 15 in at least 3 out of 4 tissues. A t-test was used to rank ASEs and an
arbitrary cut-off was applied at P < 0.05. In the validation screen, ASEs were considered
cancer-associated if they were expressed in at least 3 out of 4 tissues (ovarian stroma) or 3
out of 5 tissues (tumor microenvironment, cancer epithelium and Fallopian tube
epithelium) with a splicing shift (A Q v )/
= Q ^/ tumor
or
tube epithelium )
Q \ j/ cancer
epithelium
- Q ^ fallopian
microenvironment
- Q vo varian
stroma
of at least 15. The validity of the
229
markers identified in this screen and their capacity to detect cancer were further evaluated
using a third independent set of undissected ovarian serous tumors. ASEs association with
cancer was considered specific if they displayed a splicing shift (AQ\\i = Qv|/ovarian cancer
- Qvnormal ovary or Qv|/ovarian cancer - Qvnormal fallopian tube) of at least 15 and a P
< 0.01 (t-test). Data clustering were performed using the R package (www.r-project.org).
Splicing factors screen
Search of the NCBI literature database PubMed 64 retrieved 389 spliceosome associated
genes. Validated quantitative RT-PCR assays were successfully developed for 370 out of
the 389 splicing factors tested. The splicing factors discovery screen consisted of surveying
the global expression of all 370 splicing factors in the LCM discovery samples-set
(Supplementary Table 13) by quantitative RT-PCR. Genes expression levels relative to
housekeeping genes 17 was determined and those that vary between the tumor
microenvironment and ovarian stroma, between cancer epithelium and Fallopian tube
epithelium by at least two folds in at most one normal and at least three cancer samples or
at most one cancer and at least three normal tissue were selected and validated using LCM
validation sample set (Supplementary Table 13). Genes with expression that vary by at
least two folds in tumor microenvironment / ovarian stroma or cancer epithelium /
Fallopian tube epithelium in at most two normal and at least five cancer or at most two
cancer and at least five normal tissue were considered associated. A similar strategy was
used to screen the epithelial and established mesenchymal markers described in Fig. lc.
Evaluation of the epithelial / mesenchymal expression pattern of splicing factors and
variants
Cancer-associated exons were assigned as mesenchymal-enriched or epithelial-enriched by
examining the mean exon inclusion level (y values) found in four 66 ovarian stroma and
four Fallopian tube epithelium from the LCM discovery sample set (Supplementary Table
15 column 2 and Supplementary Table 2 column 2). Exons were considered to be tissue
enriched (either mesenchymal or epithelial) when they exhibit a quantitative splicing shift
(AQ\)/ = Qvovarian stroma - Qvfallopian tube epithelium) of at least 15. The preferential
230
epithelial / mesenchymal splicing pattern in cancer tissues was determined by comparing
the quantitative splicing shift (AQxy =
Q V cancer
epithelium
-
Q w a l l o pia n
Q\)/tumor
microenvironment
tube epithelium )
- Q ^ ovarian
stroma
or
and the epithelial / mesenchymal-
enriched exon assignment (Supplementary Table 1 column 2, Supplementary Table 2
column 2, Supplementary Table 7 column 2 and Supplementary Table 10 column 2). The
same method was used to evaluate the preferential epithelial or mesenchymal expression of
splicing factors (Supplementary Table 4 column 4) and those displaying at least two fold
difference in a specific tissue where considered tissue-specific.
Identification of splicing factors dependent ASEs in cell lines
The expression levels of the 61 cancer-associated splicing factors were determined using
quantitative RT-PCR in SKOV3ipl cell line 66. A raw Ct of 30 or less for a 1 ng cDNA
input was considered as “expressed”. Forty-seven splicing factors were expressed and
successfully knocked down with two non-overlapping siRNAs in SKOV3ipl (see
Supplementary Table 17 for sequences). PTBP1 and PTBP2 (PTB1/2) were targeted
simultaneously to provide overall PTB knockdown 67. ESRP1 and ESRP2 (ESRP1/2) were
not expressed in SKOV3ipl and thus were simultaneously knocked down in the epithelial
cell ZR-75 24. RNA was harvested 72 hours after transfection and the quality of knockdown
was evaluated by quantitative RT-PCR (Supplementary Table 5). RNA extracted from cells
where splicing factors were knocked down by at least two folds or more was used to
monitor the impact on 18 cancer-associated ASEs by quantitative RT-PCR. ASEs
displaying quantitative splicing shift (AQi|/) of at least 10 between the knockdowns and
mock transfection were considered significant. All cancer-associated ASEs regulated by at
least one splicing factor and splicing factors regulating at least one ASE are shown in Fig.
3c.
(the
raw
data
are
accessible
through
http://palace.lgfus.ca/pcrreactiongroup/list/219229).
Identification of RBFOX2 and OKI dependent ASEs
To determine QKI-responsive ASEs, QKI was knockdown using two independent siRNAs
in SKOV3ipl cell line. Effective knockdown of at least two folds was confirmed by
231
quantitative RT-PCR and the splicing pattern (y values) of 382 alternative cassette exons
(ACE) were monitored by high-throughput endpoint PCR. A splicing shift (Ai|/) of at least
10 between the mock transfection and each siRNA was considered significant. The effect of
QKI on RBFOX2 splicing targets was evaluated using an established set of 48 RBFOX2
splicing targets 12 as described above (Supplementary Table 8). The tendency of RBFOX2
and QKI co-regulated exons to be associated to tumor microenvironment was evaluated as
described in Fig. 2a.
A m p lifica tio n 2 (Q- Psi)
Quantuaji
RÏ-PC WI. O-Pa j
FFP E AMP
E w fp o m t PCR
iP ?
232
233
Figure S4 Evaluation of the reliability of the formalin-fixed, paraffin-embedded
(FFPE) based RNA expression assays by quantitative RT-PCR.
(a) Quantitative RT-PCR was conducted using reverse transcribed (RT) RNA extracted
from fresh frozen (FF) undissected normal and serous ovarian cancer tissues or using
amplified RNA (AMP) extracted from matching sets of formalin-fixed, paraffin embedded
(FFPE) tissues (Supplementary Table 13). The scatter graph represents the mean fold
difference in the expression levels of 42 genes detected in four normal ovaries and four
high-grade serous ovarian cancer and normalized to housekeeping genes as previously
described '. Most of the genes showing two or more fold difference in gene expression
between normal and cancer FFPE tissues (21 out of 26) displayed the same expression
pattern in the matching FF tissues. The Pearson correlation between the gene expression
levels detected in RNA extracted from FF and FFPE and its accompanying p value are
indicated on top right, (b) The reliability of RNA amplifications was evaluated by
comparing the quantitative splicing patterns (Qy)1 of 870 ASEs obtained from quantitative
RT-PCR performed using a RNA sample independently amplified from the same tissue
(OVC 278). Shown is a scatter plot of the quantitative splicing pattern (Q\)/) of 359 ASEs
detectable in both samples. The Pearson correlation and its accompanying p value are
indicated at bottom, (c) Comparison of splicing pattern obtained by endpoint PCR (\|/) and
quantitative RT-PCR (Qv|/). The quantitative splicing shift (AQy) of 370 splicing events
monitored by quantitative RT-PCR in dissected material was compared to the splicing shift
(Av|/) of an overlapping set of splicing event previously recorded by endpoint PCR in whole
ovarian tumors using FF RT samples 2. The Pearson correlation and its p value are
indicated at the top right.
234
Q u a n tita S v e R T -P C R F F AMP
E n d p o s n t P C R F f AMP
Q u a l i t a t i v e R T -P C R F F RT
Q u a n tita tiv e R T -P C R F f PE A M P
□ Normal ■ Cancer
Figure S5 Comparison between quantitative and end-point PCR using amplified and
non-amplified RNA extracted from fresh and fixed tissues.
(a) The mean splicing pattern (vp) was monitored by endpoint PCR in four normal ovaries
(white column) and four ovarian serous high-grade cancer tissues (black column) from
amplified (AMP) and fresh frozen (FF) RNA in a panel of 10 splicing events. The mean
quantitative splicing pattern (Qvj/) 2 were monitored in (b) FF and AMP RNA, (c) formalinfixed, paraffin-embedded (FFPE) and AMP RNA and (d) FF and RT RNA using the same
panel of 10 splicing events described in a and a FF and FFPE matched set (see
Supplementary Table 13). Error bars indicate the mean standard deviation.
235
Supplementary Table legends
Tableau SI Description of the cancer epithelial signature (CES) alternative splicing
events (ASEs).
Official gene symbol are listed in column 1. The mean quantitative splicing pattern (Qvj/) 1
of the 8 ASEs associated with cancer epithelium (CES) was determined in Fallopian tube
epithelium, cancer epithelium, ovarian stroma, undissected Fallopian tube and undissected
ovarian tumor from the LCM discovery sample set (column 2), the LCM dissected
validation set (column 3) or the undissected sample set (column 4). The mean quantitative
splicing shift (AQv|/) of the difference between cancer epithelium and Fallopian tube
epithelium, ovarian stroma and Fallopian tube epithelium, undissected ovarian tumor and
undissected Fallopian tube are indicated. The global expression levels of the host genes
harboring the alternative splicing events were determined using quantitative RT-PCR
primer pairs targeting common exonic sequence and normalized to housekeeping genes as
previously described
The t-test score of the difference between Fallopian tube and
ovarian tumor are indicated. “No” indicates the absence of preferential epithelial /
mesenchymal splicing pattern, “NE” means not expressed and “ND” means not determined.
Cancer-related gene function and function related to the epithelial or mesenchymal cells are
indicated in column 5. Laser capture microdissection (LCM) indicates dissected tissues.
Tableau S2 Description of the cancer stromal signature (CSS) alternative splicing
events (ASEs).
Official gene symbol are listed in column 1. The mean quantitative splicing pattern (Qv|/) 1
of the 10 cancer stromal signature (CSS) ASEs was determined in ovarian stroma, tumor
microenvironment, Fallopian tube epithelium, undissected normal ovary and undissected
ovarian tumor from the LCM discovery sample set (column 2), LCM validation sample set
(column 3) or the undissected sample set (column 4). The global expression levels of the
host genes harboring the alternative splicing events were determined using quantitative RTPCR primer pairs targeting common exonic sequence and normalized to housekeeping
genes as previously described
The mean quantitative splicing shift (AQy) of the
difference between tumor microenvironment and ovarian stroma, ovarian stroma and
Fallopian tube epithelium, undissected ovarian tumor and undissected normal ovary are
listed. The t-test score of the difference between undissected normal ovary and undissected
ovarian tumor are listed. “No” indicates the absence of preferential epithelial /
mesenchymal splicing pattern. Alternative splicing events that belong to the ovarian cancer
signature (OCS) are indicated. Cancer-related gene function and fonction related to the
epithelial or mesenchymal cells are indicated in column 5. Laser capture microdissection
(LCM) indicates dissected tissues.
Tableau S3 Description of the common RBFOX2 and QKI splicing targets associated
with the tumor microenvironment.
The mean quantitative splicing patterns (Qy) 1 of all tumor microenvironment associated
ASEs that are affected by both RBFOX2 and QKI in cell lines (listed in Fig. 6a) were
monitored in undissected tissues extracted from normal breast, breast tumor, normal ovary,
Fallopian tube and ovarian tumors. The mean quantitative splicing pattern (AQ\|/) is
indicated for individual tissue and tissue type. The splicing shift and t-test score of the
236
difference between normal breast and breast tumor, estrogen receptor positive and negative
breast tumor, Fallopian tube and ovarian tumor, normal ovary and ovarian tumor are listed.
“NE” indicates not expressed.
Tableau S4 Expression patterns of cancer-associated splicing factors.
The global expression of each splicing factors gene associated to cancer (Fig. 3) was
determined using quantitative RT-PCR in the different discovery and validation samplesset and normalized relative to housekeeping genes as previously described '. The fold
difference between cancer epithelium and Fallopian tube epithelium (column 2), tumor
microenvironment and ovarian stroma (column 3) or Fallopian tube epithelium and ovarian
stroma (column 4) are shown. Association with cancer is indicated by yes or no. Splicing
factors that are only expressed in cancer epithelium or tumor microenvironment and not in
the reciprocal normal tissues are indicated by “CS” because numerical values could not be
determined. Similarly, the factors that are only expressed in normal tissues are indicated by
“NS”. “ND” indicates not determined and “NE” indicates not expressed. “No” indicates the
absence of preferential epithelial / mesenchymal splicing pattern.
Tableau S5 Validation of the splicing factors knockdown.
The knockdown of the different splicing factors was validated using quantitative RT-PCR
and the extent of the knockdown determined as fold difference relative to mock transfection
(knockdown). The name of each factor (Gene name), names of the different siRNA
(siRNAs), the cell type in which splicing factors are preferentially expressed (Associated
cell type) and the cell line where the knockdown was performed (Cell line) are indicated.
Tableau S6 The expression of splicing factors associated with mesenchymal-toepithelial transition (MET) are not systematically modified in cancer tissues.
The global expression of the EMT-associated splicing factors 3 was determined using
quantitative RT-PCR in the different discovery and validation samples-set and normalized
relative to housekeeping genes as previously described '. The fold difference between
cancer epithelium and Fallopian tube epithelium (column 2) and tumor microenvironment
and ovarian stroma (column 3) are shown. Association with cancer is indicated by yes or
no. EMT / MET direction is indicated. Splicing factors that are only expressed in tumor
microenvironment and not in the reciprocal normal tissues are indicated by “CS” because
numerical values could not be determined. “ND” indicates not determined. The
knockdowns were performed in the ovarian cancer cell line SKOV3ipl with the exception
of that of ESRP1/2, which was knocked down in the epithelial cell line ZR-75 because it is
not expressed in SKOV3ipl.
Tableau S7 List of EMT associated alternative splicing events that are preferentially
expressed in tumor tissues.
Official gene symbol are listed in column 1. The mean quantitative splicing pattern (Q\|/) 1
of three splicing events associated with EMT 3 and tumor microenvironment was
determined by quantitative RT-PCR in ovarian stroma, tumor microenvironment and
Fallopian tube epithelium from the discovery LCM sample set (column 2) and validation
sample set (column 3). The mean quantitative splicing shift (AQv|/) between tumor
microenvironment and ovarian stroma, ovarian stroma and Fallopian tube epithelium are
also indicated. Laser capture microdissection (LCM) indicates dissected tissues.
237
Tableau S8 Identification of RBFOX2 and QKI common splicing targets.
The splicing pattern (\|/) of splicing events that were previously associated with either
RBFOX2 (RBFOX2 ASEs) or QKI (QKI ASEs) were determined after the knockdown of
either RBFOX2 or QKI in the SKOV3ipl cell line (see Fig. 5a). The name of each gene
(Official gene symbol), the endpoint PCR primers used (ED PCR primers), source of each
RNA examined (i.e. mock transfection (LF); RNA from cells transfected with unrelated
siRNA (siCTL); RNA from cells transfected with QKI specific siRNAl and siRNA2; RNA
extracted from cells transfected with RBFOX2 specific siRNAl and siRNA2), the
RBFOX2 and QKI specificity of each splicing event (RBFOX2 ASEs; RBFOX2 and QKI
ASEs; QKI ASEs), the primers used for quantitative PCR (qPCR primers) and the
preferential expression of splicing events in epithelial and mesenchymal tissues (Epithelial
mesenchymal preferential expression) are indicated on top. “ND” indicates not determined,
“NA” indicates not available and “NE” indicates not expressed.
Tableau S9 RBFOX2 and QKI preferentially regulate the expression of mesenchymalenriched exons.
Exons affected by RBFOX2 or QKI knockdown were classified based on their expression
levels in epithelial (Epithelial-enriched exons) and stromal (Mesenchymal-enriched exons)
tissues. The number of events leading to exon exclusion or inclusion, after the knockdowns
of either RBFOX2 or QKI and the knockdown of both RBFOX2 and QKI in SKOV3ipl
cell line are indicated. Mixed behaviour indicates exons that are regulated by both QKI and
RBFOX2 knockdowns in opposite direction (i.e. one factor knockdown induce inclusion
while the other induce exclusion).
Tableau S10 Splicing pattern of RBFOX2 and QKI splicing targets in cancer tissues.
Official gene symbol are listed in column 1. The mean quantitative splicing pattern (Qi|/) 1
of all RBFOX2 and QKI regulated ASEs (Fig. 5a) was determined in ovarian stroma, tumor
microenvironment, Fallopian tube epithelium, undissected normal ovary and undissected
ovarian tumor from the LCM discovery sample set (column 2), LCM validation sample set
(column 3) or the undissected sample set (column 4). The mean quantitative splicing shift
(AQi|/) and t-test of the difference between undissected ovarian tumor and undissected
normal ovary is listed. Laser capture microdissection (LCM) indicates dissected tissues.
Tableau S U QKI-6 and QKI-7 splicing pattern in undissected tissues.
The quantitative splicing pattern (Q\|/) of QKI-6 and QKI-7 isoform was monitored in
undissected tissues extracted from normal breast, breast tumor, normal ovary and ovarian
tumor. The tissue type is indicated. The mean quantitative splicing shift (AQ\|/) 1 and t-test
of the difference between normal breast and breast tumor, normal ovary and ovarian tumor
are listed. “NE” indicates not expressed.
Tableau S12 QKI relative global expression in undissected tissues.
The relative global expression of QKI was monitored in undissected tissues extracted from
normal breast, breast tumor, normal ovary and ovarian tumor and was calculated relative to
housekeeping genes as previously described '. The tissue type is indicated. The relative
expression is indicated for individual tissue and the mean for each tissue type. The mean
238
quantitative splicing shift (AQig) and t-test score of the difference between normal breast
and breast tumor, normal ovary and ovarian tumor are listed.
Tableau S13 Clinical data of tissues used for laser capture microdissection (LCM)
samples.
Patient identification, patient diagnostic, the cell type isolated after dissection, its new
identification and the presence of matched fresh frozen tissues (mirror images existed in
both paraffin and fresh frozen forms) are indicated.
Tableau S14 Global expression levels of established epithelial and stromal markers in
normal and cancer tissues.
Quantitative RT-PCR was performed using primers against all known epithelial and
stromal expression markers (Fig. lc). The expression value normalized to housekeeping
genes is indicated for each tissues examined. The description of each tissue is listed in
Supplementary Table 13.
Tableau S15 Clinical data associated with the undissected serous ovarian tumors used
in this study.
Patient identification, simplified identification, patient diagnostic, the percentage of cancer
cells in the tumor samples and the percentage of epithelial cells in the tumor are indicated.
“ND” indicates not determined. * indicated the percentage of epithelial cells generally
found in distal Fallopian tube samples (http://www.proteinatlas.org/).
Tableau S16 Clinical data associated with the undissected ductal breast tumors used
in this study.
Patient identification, patient diagnostic and estrogen receptor (ER) status are indicated.
“ND” indicates not determined.
Tableau S17 List of siRNAs used for the knockdown of splicing factors.
Each siRNA name and its antisense sequence are indicated.
239
References
1.
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3.
Prinos, P. et al. Alternative splicing of SYK regulates mitosis and cell survival. Nat
Struct Mol Biol 18, 673-9 (2011).
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Mol Biol 16, 670-6 (2009).
Shapiro, I.M. et al. An EMT-driven alternative splicing program occurs in human
breast cancer and modulates cellular phenotype. PLoS Genet 7, el002218 (2011).
240
DISCUSSION
L’épissage alternatif (AS) est un mécanisme qui permet à un seul pré-ARNm de produire
deux ou plusieurs isoformes ARNm. Les séquences résultantes sont hautement similaires et
il est difficile de les détecter. Pour y remédier, nous avons élaboré une méthodologie basée
sur la PCR en temps réel. Nous avons démontré qu’il est possible d’exploiter cette
technique pour cribler un grand nombre d’événements d’épissage alternatif (ASEs) dans
des conditions PCR universelles, à partir d’ARN totaux de tissus fixés (ELFE), tout en
demeurant quantitatif.
Des analyses bioinformatiques prédisent des changements de patron d’AS dans certains
types de cancers et sont confirmés par des validations expérimentales sur un petit nombre
de tissus dans certains cas. Par contre, l’AS est un processus qui est propre à chaque type
cellulaire et les tumeurs analysées ont un contenu cellulaire hétérogène. Il n’est donc pas
clair si ces changements de patron d’AS sont véritablement associés aux tissus cancéreux.
Nos préparations homogènes de principaux types cellulaires ont permis de révéler la
présence d’isoformes associées au cancer indépendamment de l’hétérogénéité des tumeurs.
Étonnamment, les changements les plus intéressants ne se retrouvent pas dans les cellules
cancéreuses proprement dites, mais dans les cellules « normales » en bordure de la tumeur.
Notre analyse des facteurs de régulation de ces isoformes a permis d’affirmer que ces
changements ne sont pas dus à un dérèglement anarchique des cellules cancéreuses, mais
découlent plutôt d’un programme destiné à avantager les cellules cancéreuses.
Des analyses bioinformatiques prédisent que la plupart des ASEs affectant différentes
portions codantes des gènes produisent des isoformes ARNm susceptibles d’être traduits en
protéine. Dans quelques cas, des démonstrations expérimentales faites à partir de vecteur de
surexpression ou de répression spécifique (siRNA, antisens) permettent de discriminer et
mettre en valeur les fonctions des isoformes de l’AS. Bien que certains concepts d’outils
moléculaires pouvant moduler le patron d’AS aient été publiés, il n’existe pas de règle
générale de dessin. Nous avons non seulement conçu des règles de dessin pour le TOSS
(targeted oligonucleotide silencer of splicing) mais également élargi son usage aux exons
241
cassettes, les ASEs les plus courants chez l’humain. Appuyé par notre méthodologie basée
sur la PCR en temps réel, nous avons démontré que la plupart des TOSS reprogramment
l’AS sans affecter l’expression globale. Puis, nous avons comparé directement l’effet de
siRNA (répression de l’isoforme long et modulation du patron d’AS) et de TOSS
(modulation du patron d’AS sans répression globale) sur 41 ASEs de gènes associés au
cancer. L’analyse phénotypique de cellules cancéreuses indique que dans quatre cas, les
propriétés pro-cancer (résistance à l’apoptose) ont pu être reliées à la répression d ’un
isoforme en particulier, évidence qui encore une fois, appuie notre hypothèse selon laquelle
la production de certains isoformes sont en mesure de promouvoir le développement de
tumeurs. De plus, dans le cas de l’exon 69 de la kinase SYK, la résistance à l’apoptose et la
croissance en agar mou sont strictement dépendantes du ratio des isoformes et de
l’expression globale, respectivement. Ces derniers résultats permettent d’expliquer
certaines discordances retrouvées dans la littérature et accentuent le besoin d’intégrer
l’analyse des isoformes d’AS dans les études d’expression génique.
1 Quantification de séquences hautement similaires
1.1 Quantification de l ’expression globale et isoforme-spécifique sur une même plateforme
De façon générale, les données d’expression par PCR en temps réel sont rapportées sous
forme de quantification relative pour chacune des isoformes. De cette façon, il est souvent
difficile de comparer directement ces résultats avec ceux provenant d’autres plateformes
(endpoint PCR, micropuces à ADN ou le séquençage de deuxième génération).
Contrairement au endpoint PCR, il est possible de quantifier séparément chacun des
isoformes par PCR en temps réel. Pour obtenir une valeur de ratio d’isoforme, le nombre de
copie absolue d’une isoforme donnée doit être déterminé par rapport à une courbe standard
afin de relier la quantité de fluorescence libérée au nombre de copies du transcrit (Bustin,
2000). Comme la précision de cette méthode dépend en grande partie du dosage des
analytes utilisés pour produire la courbe standard, un plasmide unique incluant une copie de
chacune des isoformes est idéal (Vandenbroucke et al., 2001). Ainsi, il sera non seulement
possible d’obtenir la proportion d’isoforme long et court (ratio d’isoforme) mais également
l’expression globale du gène.
242
Afin d’éviter cette procédure laborieuse, nous avons imaginé une quantification par ratio
des isoformes par PCR en temps réel sans faire intervenir une courbe standard. Par analogie
au endpoint PCR, nous l’avons nommé Qv|r. De plus, puisque la formule du Qt|/ est
indépendante des gènes de référence (HKGs), cela facilite le processus de quantification,
particulièrement lorsque des tissus sont utilisés. Ceci permet donc d’obtenir une valeur de
ratio des isoformes absolus simplifiée.
À l’heure actuelle, la détermination d’un changement d’expression globale entre deux
échantillons ou plus par PCR en temps réel est effectuée grâce à une troisième paire
d’amorces commune à tous les transcrits du gène et suivant le schéma de quantification
relative avec normalisation par « housekeeping » (HKG). Or, il serait possible d’estimer un
changement d’expression globale à partir des données obtenues avec les paires d’amorces
isoformes-spécifiques. En effet, si les deux isoformes présentent un changement
d’expression dans le même sens (les deux isoformes augmentent ou diminuent), c’est qu’il
y a changement d’expression globale. Pour confirmer ce changement, la troisième paire
d’amorces ciblant la totalité des transcrits du gène doit être utilisée pour valider cette
nouvelle approche. Il serait possible d’exploiter cette stratégie à la ré-analyse de données
brutes issues des deux criblages effectués à la figure 2 du chapitre 4. Pour donner un
exemple, la portion du transcriptome qui est affectée uniquement par la transcription et non
par l’AS dans le stroma adjacent et dans les cellules épithéliales du cancer séreux avancé de
l’ovaire pourrait être révélée.
En théorie, les micropuces à ADN de type « exon array », « exon/junction array » ou le
séquençage de deuxième génération peuvent tous être exploités tant pour l’expression
génique que pour déterminer les isoformes d’AS différentiellement exprimés (Costa et ai,
2010). En pratique, les algorithmes de normalisation complexes et le manque de pouvoir
statistique préviennent l’utilisation adéquate des deux types de données (expression globale
et ratio d’isoforme). De plus, et ce, malgré les récentes avancées (Waldron et al., 2012)
l’utilisation de FFPE est encore laborieuse pour les micropuces à ADN et le séquençage de
deuxième génération. Bien que nous n’ayons criblé qu’un peu moins de 900 ASEs, il est
243
théoriquement possible de cribler la totalité des 3322 ASEs de la base de données RefSeq
prédit par RASE, soit un nombre comparable aux études de micropuces à ADN (Pan et a i,
2004, Fagnani et al., 2007).
1.2 Quantification transcrit-spécifique
Il n’est pas rare que plusieurs ASEs aient lieu sur un même pré-ARNm. Dans un certain
nombre de cas d’ASEs complexes (par exemple un exon ayant un 5’ss et un 3’ss alternatif),
RASE est en mesure de simplifier le tout en décortiquant les ASEs sous-jacents. Ainsi, la
région IIICS du gène FN1 composée d’un alt3’ et d’une rétention d’intron est perçue par
RASE comme quatre transcrits distincts (chapitre 2, Fig. 14). Le positionnement d ’amorce
et la proximité des deux ASEs permettent la quantification de tous les transcrits
séparément. De façon intéressante, l’isoforme moyen sans intron de FN1 IIICS nécessite
deux BSPs (chapitre 2, Fig. 14). La situation se complexifie lorsqu’un pré-ARNm possède
deux ASEs ou plus qui sont distancés par plus de 300 nt. Le gène FN1 possède également
deux autres régions d’AS, dont EDB, située à ~ 3 kb en amont de IIICS (chapitre 2, Fig. 8).
Comme l’amplification d’un amplicon de 2000 bp est impraticable par PCR en temps réel,
il est impossible de déterminer la co-régulation des deux ASEs. En d’autres termes, il est
possible de quantifier l’isoforme long et l’isoforme court de EDB, mais il n’est pas possible
de préciser si le transcrit court par rapport à EDB comprend ou non l’intron 93 de IIICS.
On parle alors du concept de famille d’isoformes longs et famille d’isoformes courts.
Seule la technique de buvardage de type Northern permet d’apprécier chacun des transcrits
d’un gène, à la condition que chacune des régions alternatives soit de longueur
significativement plus élevée que la limite de résolution du gel, ce qui est somme toute rare.
Le séquençage de deuxième génération ne permettra de « connecter » deux ASEs que si les
« reads » sont de taille suffisante pour englober ces ASEs. En ce sens, l’ARN fragmenté
provenant de FFPE ne pourra être utilisé et de l’ARN de haute qualité sera nécessaire pour
ce type d’expérience. La quantification transcrit-spécifique à haut débit est le prochain défi
des techniques de quantification des isoformes de l’AS.
244
1.3 Application des règles de dessin d ’amorce-jonction pour d ’autres cas de séquences très
semblables
Outre les isoformes de l’AS, il existe des variations dans la séquence de notre ADN d’un
seul nucléotide nommé « single nucleotide polymorphism » (SNP). La détection de ces
SNPs par PCR est laborieuse. La PCR en temps réel a été utilisée maintes fois pour la
détection de SNP, mais presque toujours conjointement avec une sonde fluorescente de
type Taqman™ (Hampe et a l, 2001). Il n’est pas toujours évident d’obtenir une
hybridation différentielle suffisamment grande pour régler le problème de faux positif.
Nous avons montré au chapitre 1 que certaines de nos amorces-jonction (BSP) sont
capables de discerner des séquences distinctes d’un seul nucléotide lorsque le
mésappariement sur l’isoforme long est strict. Nous émettons donc l’hypothèse qu’il est
possible d’exploiter nos règles de dessin de BSP afin d’amplifier spécifiquement l’allèle
porteur de SNP sans amplifier l’allèle sauvage (Tableau 1). Nous avons fait l’étude de trois
cas d’amorce-jonction comportant des mésappariements en position Nx et Nz, mais dont le
Ny est pairé, soit une situation similaire à la stratégie proposée par Zhou et collaborateurs
(2004) (voir Tableau 1). En accord avec ces derniers, nous n’avons pas été en mesure
d’obtenir un produit PCR même après 50 cycles. De façon intéressante, une des trois
amorces possède des mésappariements permissifs en position Nx et Nz. Ceci signifie que
l’introduction volontaire d’un mésappariement en position Nx (permissif ou strict) est en
mesure d’éliminer le problème de faux positif puisque nous n’observons aucun signal.
Malheureusement, nous n’avons pas vérifié l’amplification d’une amorce dont le Nx est
mésapparié, mais dont le Ny et Nz sont pairés. Cette réaction est nécessairement moins
efficace vis-à-vis un appariement parfait, mais il est fort probable qu’un mésappariement
permissif (A/C, G/T et C/T) soit bien toléré. L’avantage de cette stratégie réside du fait que
peu importe le nucléotide en Nx, il sera toujours possible de concevoir un mésappariement
permissif.
245
Tableau 1 Stratégies de dessin d’amorce allèle-spéciflque.
Pour amplifier spécifiquement l’allé le SNP sans amplifier l’allèle sauvage, divers
positionnements de mésappariement ont été proposés. La position du SNP est encadrée en
pointillé.
_________________________________________________
A lléle S N P
A llé le s a u v a g e
Nx Ny Nz
R éféren c e s
Nx Ny Nz
M etc a lfe P e t a l , 1995
iN
7
Z h o u G H et a l . 2004
-W A I
Y aku H. e t a l , 2008
- M
3
A ono T e t al , 2000
_A_j7
Plusieurs stratégies endpoint PCR ont été mises de l’avant (Tableau 1) et le design original
consiste à pairer le nucléotide en 3’ terminal de l’amorce avec le SNP (Metcalfe et al.,
1995). Conséquemment, cette amorce aura un mésappariement en 3’ terminal sur l’allèle
sauvage. S’il s’agit d’une substitution de type T pour A, G pour C, A pour C, C pour G, G
pour T ou G pour A (en rouge dans la figure 1A), ceci a pour effet de produire un
mésappariement strict en 3’ terminal. Dans ces cas, nos résultats suggèrent que
l’amplification de l’allèle porteur du SNP sera spécifique (Fig. 1A). Par contre, la fréquence
de ce type de substitution est faible, et la plupart des SNPs provoqueront des
mésappariements permissifs (A/C, G/T et C/T) lorsque cette stratégie est employée (Fig.
1B). Dans ces cas, il est possible de substituer volontairement un ou des nucléotides de la
portion 3’ terminal afin de diminuer l’amplification non-désirée de l’allèle sauvage. Les
données de notre étude systématique des paramètres essentiels à la spécificité des amorcesjonctions suggèrent donc qu’il serait possible de réaliser des règles générales de dessin
d’amorce SNP afin de discriminer tous les types de substitution SNP vis-à-vis leur
séquence de type sauvage, ce qui demeure encore laborieux à ce jour. Cette stratégie
246
pourrait se révéler particulièrement avantageuse lorsque des échantillons FFPE sont
utilisés. En effet, les modifications de bases qu'entraîne la fixation se prêtent mal aux
techniques de séquençage (Qiu et al., 2008).
B
A
Type sauvage
Type sauvage
Figure 1 Fréquence et mésappariement de l’amorce allèle-spécifique sur l’allèle de
type sauvage selon le type de SNP.
Tableaux indiquant toutes les substitutions nucléotidiques possibles entre le type sauvage et
le porteur SNP. A) L’intersection représente le mésappariement amorce SNP/allèle de type
sauvage et les mésappariements stricts sont indiqués en rouge. Par exemple, pour la
substitution d’un C pour un A, l'amorce SNP possède un T en 3' terminal pour s’apparier
avec le A de l’allèle SNP et se mésapparier avec le C de l’allèle de type sauvage (T/C). B)
Les intersections en rouge sont les substitutions les plus fréquentes.
Dans cet ordre d’idées, les gènes dupliqués des protéines ribosomaîes de Saccharomyces
cerevisiae sont excessivement semblables. Afin de quantifier l’expression d’un gène à la
fois. Parenteau et collaborateurs (2011) se sont inspirés des règles de dessin d'amorcejonction issues du chapitre 1. Ainsi, la quantification de l'expression de chacun des gènes
dupliqués de protéines ribosomaîes a permis de révéler la contribution des séquences
introniques dans leur inter-régulation.
247
2 Nouvelles stratégies pour la modulation de l ’AS de cibles endogènes
2.1 Modulation d ’ASEs simples par les TOSS
Les TOSS sont des outils moléculaires conçus pour moduler l’AS en favorisant l’isoforme
court sans changer l’expression globale. Au chapitre 2, nous avons exploité notre stratégie
de quantification isoforme-spécifique afin de confirmer la réelle modulation de 42 ASEs
simples, faisant du TOSS un outil simple à utiliser en cellules. Le design rationel de TOSS
permet de garantir une modulation de l’épissage dans 87% des cas d’exon cassette simple.
Au contraire, il est recommandé de tester plusieurs SSOs (splice switch oügonucleotides)
afin de s’assurer que l’un d’entre eux fonctionne adéquatement (Aartsma-Rus et al., 2005;
Hua et a i, 2007). Contrairement au TOSS, l’effet de ceux-ci est beaucoup plus dépendant
de la séquence ciblée sur l’exon (Aartsma-Rus et al., 2005; Hua et a i, 2007).
De façon surprenante, la modulation de certain TOSS est également accompagnée d ’une
diminution globale de l’expression, un effet similaire à ce que l’on observe avec un siRNA
ciblant spécifiquement l’isoforme long (siRNA long). Il est possible que ce comportement,
rebaptisé modulation de type B, tienne origine de l’interférence du TOSS avec les facteurs
d’épissage constitutif. Ainsi, dans une fraction des cas, le TOSS de type B hybridé à sa
cible culminerait vers un complexe d’épissage non-productif (qui ne formerait pas
d’ARNm mature). En ce sens un antisens ciblant une jonction constitutive peut altérer
l’expression globale d’un gène (Mercatante et al., 2001). Par contre, les effets sur
l’expression globale ne sont généralement pas systématiquement vérifiés. Il n’est donc pas
possible de déterminer si la modulation de type B est plus susceptible via un TOSS ou un
SSO. Alternativement, le même résultat pourrait découler d’une dégradation isoformespécifique, quoique moins probable. L’ASE en soi ne semble pas être un facteur puisque
nous avons observé de la modulation de type A et de type B pour des TOSS situés sur un
même ASE (chapitre 2, Fig. 7). De plus, cette modulation de type B ne semble pas être
dépendante de hnRNPAl puisque nous en avons observé pour un antisens (chapitre 2,
Tableau 5). Il serait intéressant d’approfondir le mécanisme d’action du comportement de
type B de façon à mieux concevoir les TOSS de type A. En comparant les TOSS de type A
248
et B et leur cibles, il est probable qu'un dénominateur commun puisse être identifié
(séquence antisens, séquence cible à proximité du TOSS).
2.2 Modulation d'ASEs complexes par les TOSS
Originalement, le TOSS a été employé pour la modulation d'un alt5' (Villemaire et ai.
2003). Nous avons élargi le spectre des ASEs pouvant être ciblé par le TOSS en incluant
les exons cassettes simples et les alt3’. Nous avons testé le comportement des TOSS dans
des cas d’ASE complexes, comme par exemple une compétition de plusieurs 5’ss et/ou
3’ss. Un TOSS situé entre deux 5’ss ou deux 3'ss sur un exon lui-même alternatif favorise
l'exclusion de l’exon entier. Cette observation rejoint le modèle de Wang et collaborateurs
(2006), qui propose que des ESS, dont la séquence est apparentée h hnRNPAl (classe I),
bloque le 3’ss en amont et le 5’ss en aval (Fig. 2A).
A
B
SU
1 ESS
E S S b in d in g
Iran s -fa c to r
]
■ESI OR |
Hi }
Whiii M■
^
MEsmi ^
5 ’ s p l i c e s it e
3' s p lic e site
Figure 2 Mécanismes (Paction des ESS selon le modèle de Wang et collaborateurs
(2006).
Les ESS dont le motif est apparenté ià A) hnRNPAl (classe 1) agissent en bloquant le 5 ’ss
en aval et le 3'ss en amont et B) hnRNPF/H ou au 5’ss consensus (classe II) agissent en
bloquant la communication inter 3'ss et 5’ss tant exonique qu’intronique. Images adaptées
de Wang (2006).
Ce modèle prédit également que des séquences apparentées à hnRNPF/H ou similaires au
5'ss consensus agissent plutôt en bloquant la définition de l'cxon (Fig. 2B). Si ce modèle
249
dit vrai, alors un TOSS munit d’une telle séquence serait en mesure de favoriser le site
d’épissage distal même dans le cas où l’exon est lui-même alternatif. Ainsi, il serait
possible de favoriser préférentiellement le 5’ss alternatif ou le 3’ss alternatif (Fig. 3A), une
possibilité de design rationnel qui n’a pas été démontré par les outils moléculaires actuels.
De plus, un TOSS situé sur l’exon alternatif mais en dehors des deux sites d’AS favoriserait
l’exclusion de l’exon entier, tel que nous l’avons rapporté pour LIG3_cass_4_t au chapitre
2 (Fig. 3B). Dans les cas d’exon cassette multiple, le TOSS demeure spécifique à l’exon
ciblé. Il serait intéressant de vérifier l’effet combiné de TOSS ciblant chacun des exons
alternatifs contigus. Ainsi, il serait possible de promouvoir l’exclusion en bloc.
Entropiquement parlant, la saturation de tous les exons d’un même pré-ARNm est
défavorable et cette stratégie risque d’être également dispendieuse. Alternativement, le
modèle de Wang et collaborateurs (2006) prédit qu’une séquence de classe I située dans un
intron flanqué de deux exons alternatifs promouvoit l’exclusion des deux exons. Ainsi, un
seul TOSS serait nécessaire dans le cas d’un double exon cassette (Fig. 3C). Les résultats
du TOSS FNl_intron_L_t (chapitre 2, Fig. 14) sont consistents avec le modèle de Wang et
collaborateurs (2006). En effet, ce TOSS de classe I favorise l’exclusion de l’exon alternatif
267 alors que l’exon 107 en aval n’est pas exclu puisqu’il possède un 5’ss constitutif. En
revanche si une séquence de classe II était utilisée sur un intron difficile à épisser, la
définition de l’intron serait favorisée et permettrait ultimement d’inhiber la rétention
d’intron (Fig. 3D).
Comme il est connu que la longueur des introns est proportionnelle à leur épissage dans des
extraits nucléaires, les longs introns étant difficilement épissés, nous avons imaginé une
deuxième série de nouveaux dessins de TOSS autour de ce concept. Pour stimuler leur
épissage, des TOSS pourraient cibler les extrémités d’un intron de grande longueur. Il est
postulé que hnRNPAl se dimérise une fois liée à sa séquence, permettant ainsi de
rapprocher les exons à se joindre et conséquemment, l’inclusion de l’exon alternatif. Bien
que le traitement simultané par deux TOSS (chacun ciblant une extrémité) est efficace in
vitro, ils ne semblent pas agir selon un mécanisme coopératif, probablement à cause de
motif de liaison UAGGG déjà présent dans la séquence intronique étudiée (MartinezContreras et al., 2006). Il serait néanmoins intéressant de vérifier l’efficacité de cette
250
stratégie sur des ASEs endogènes flanqués d’intron long (Fig. 3E). En extrapolant ce
concept, il est possible d’imaginer que des motifs TOSS positionnés de part et d’autre d ’un
exon alternatif puissent recruter et promouvoir la dimérisation de hnRNPAl, favorisant par
le fait même l’exclusion d’exon, voire un groupe d’exon multiple (Blanchette and Chabot,
1999) (Fig. 3E). Ainsi, le ciblage simultané de TOSS sur des séquences introniques
permettrait de favoriser tant l’exclusion ou l’inclusion d’exon, selon les besoins. Il serait
intéressant de tester ces nouveaux dessins de TOSS aux cas étudiés en détail au chapitre 2.
Le TOSS pourrait donc s’avérer être un outil complémentaire général qui permettrait non
seulement de moduler l’AS et d’en évaluer la fonction des isoformes, mais également
d’étudier le rôle des SREs dans un contexte endogène. En effet, au lieu de modifier la
séquence du gène pour y implanter un ESS, il est possible grâce au TOSS d’exhiber
spécifiquement un ESS ou ISS sur le pré-ARNm endogène.
251
D
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EE3— m — CZ3—
t
OU
✓
HH
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mûr ; î -—
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OU
CH
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Figure 3 Nouveaux dessins de TOSS
A) Cas com plexe de type exon cassette-altlU B) Cas com plexe de type exon cassette-alt5 ’
C) Cas d ’exon cassette multiple. D) C as de rétention d ’intron. E) Cas d 'e x o n cassette. II =
Séquence de classe M selon W ang et collaborateurs (2006).
252
2.3 Nouvelles stratégies pour stimuler l ’inclusion d ’exon
Les stratégies illustrées à la figure 3B et 3E sont dessinées dans le but de promouvoir
l’isoforme long. Ces outils sont d'autant plus attrayants puisqu'ils sont susceptibles de
procurer un gain de fonction. Bien que des siRNAs courts (ciblant l’isoforme court) furent
testés avec succès, nous n’avons pas réussi à produire un outil moléculaire capable de
stimuler l’inclusion d’exon sans effet sur l’expression globale de cible endogène. Très
récemment, une étude ayant pour but de diminuer la toxicité associée aux modifications PS
et d’augmenter l’effet d’inclusion des TOES a été publiée (Owen et al., 2011). Malgré de
nombreuses variations de séquences et de chimie de la portion « tail », aucun TOES
(targeted oligonucleotide enhancer of splicing) n’est plus puissant pour induire l’inclusion
de l’exon 7 de SMN2 que celui de la publication originale (Skordis et a i, 2003). Deux
conclusions en accord avec nos données et pertinentes pour de futurs travaux ressortent de
cette étude: 1) Il est possible de reprogrammer l’AS avec une portion « tail » en ARN ou
2’OMe; 2) L’effet d’inclusion est très sensible à la position et l’orientation de la portion
« tail ». En effet, nous avons observé que dans 7 cas sur 10, l’utilisation d’un SSO
reprogramme l’AS vers la forme courte, soit l’inverse de l’effet attendu avec un TOES
(voir chapitre 2, Tableau 1). Bien que les TOSS soient a priori dessinés afin de cibler des
ESEs putatifs, des antisens ciblant des ESS putatifs n’ont pas été en mesure de stimuler
l’inclusion d’exon (Annexe 1). Bref, cela signifie qu’il est plus facile d ’induire l’exclusion
d’un exon cassette. En d’autres termes, les ESEs sont beaucoup plus dépendants de leurs
contextes (séquences avoisinantes et facteur d’épissage en trans) que les ESS.
253
3 Impact fonctionnel des isoformes de / ’épissage alternatif dans la cancérogenèse
3.1 Impact fonctionnel des isoformes de Vépissage alternatif de gènes associés au cancer
Des analyses bioinformatiques prédisent que la plupart des ASEs affectant différentes
portions codantes des gènes produisent des isoformes ARNm susceptibles d’être traduites
en protéine. Par contre, un nombre limité de gènes reliés au cancer ont été ciblés par des
modulateurs d’AS (Tableau 2) ou par des siRNAs isoforme-spécifiques (Tableau 3), et
l’impact sur le phénotype vérifié. Dans de très rares cas, les effets des modulateurs ont été
comparés directement (Jiang et al., 2008) ou peuvent être comparés indirectement (Ghigna
et al., 2005, Ghigna et al., 2010) aux effets de répresseurs, mais il est toujours difficile de
réconcilier l’ensemble des résultats et de conclure sur la nécessité de diminuer l’expression
globale pour induire un phénotype en cellule.
254
Tableau 2 Exemples de gènes associés au cancer ayant été ciblés avec des modulateurs
d’AS (SSO, TOSS ou TOES) dans des cellules cancéreuses humaines.
Le type d ’événement ciblé, le type de chimie utilisé pour le modulateur, son
positionnement et l’effet sur l’épissage et phénotypique résultant est indiqué. La définition
de chacune des chimies de modulateur est mentionnée à la figure 20 de l’introduction
excepté 2’- VÏOE (2’ Ométhoxyét lyl). N.D. = non disponible.
Gène
Type de Chimie Positionne-ment Effet sur
Effet
Référence
ASE
du
l’épissage phénotypi­
modulât
que
eur
associé
MDM2 Cassette
PNA
Chevauche la
Induit la Sensibilise (Shiraishi
jonction intronrétention
les
et al.,
exon du 3’ss,
de l’intron
cellules
2010)
en amont
J ARàl a
et l’ex­
camptothé
clusion de
-cine
l’exon
ciblé.
ERBB2 Cassette
PNA
Chevauche la
N.D.
Induit
(Pankrato
jonction intronl’ex­
(HER-2)
va et al.,
exon du 3’ss
clusion de
2010)
l’exon
ciblé
Cassette 2’-MOE
Chevauche la
Induit
N.D.
(Wan et
jonction exonl’ex­
al., 2009)
intron du 5’ss
clusion de
l’exon
ciblé
MCL-1
Cassette Morpho­
Deux
Induit
Induit
(Shieh et
oligonucléotil’ex­
lino
l’apoptose al., 2009)
des ciblent
dans les
clusion de
l’exon désiré :
l’exon
cellules
Un chevauchant
BCC et
ciblé
la jonction
AGS.
intron-exon du
3’ss, l’autre
chevauchant la
jonction exonintron du 5’ss
BCL2L1
2’-MOE Complètement
Alt5’
Redirige Sensibilise (Taylor et
(Bcl-x)
exonique
les
vers le
al., 1999)
cellules
(séquence
5’ss en
A549 au
exacte nonamont
dévoilée)
cisplatin
et aux
UVB
255
2’OMe
(TOSS)
Complètement
exonique en
aval du 5’ss
Redirige
vers le
5’ss en
amont
Redirige
vers le
5’ss en
amont
PS2’OMe
Chevauche la
jonction exonintron du 5’ss
Chimère
PNApeptide
Ser-Arg
(ESSEN
CE)
PS2’OMe
Complètement
exonique en
amont du 5’ss
Redirige
vers le
5’ss en
amont
Chevauche la
jonction exonintron du 5’ss
Redirige
vers le
5’ss en
amont.
VEGF
Cassette
Morpholino
Chevauche la
jonction intronexon du 3’ss
Induit
l’ex­
clusion de
l’exon
ciblé.
TAF6
Alt5’
PS2’OMe
Complètement
exonique, en
aval du 5’ss
Redirige
vers le
5’ss en
amont.
BRCA1
Cassette
Chimère
PNApeptide
Ser-Arg
(ESSEN
CE)
Complètement
exonique
FGFR1
cassette
Morpholino
Masque un ISS
MSTR1
(Ron)
Cassette
2’OMe
(TOES)
Complètement
exonique
Stimule
l’inclusion
de l’exon
18 portant
la
mutation
E1694X
Stimule
l’inclusion
de l’exon
ciblé
Stimule
l’inclusion
de l’exon
ciblé
N.D.
(Villemaire et al.,
2003)
Induit
l’apoptose
dans les
cellules
PC-3
Induit
l’apoptose
dans les
cellules
HeLa
(Mercatan
-te et al.,
2001)
Induit
l’arrêt du
cycle
cellulaire
en G1
Induit la
vasculari­
sation
dans les
cellules
PC-3
Induit
l’apoptose
dans les
cellules
HeLa
N.D.
(Zhaozui
et al.,
2006)
(Wilusz et
al., 2005)
(Catena et
al., 2007)
(Wilhelm
et al.,
2008)
(Cartegni
and
Krainer,
2003)
N.D.
(Bruno et
al., 2004)
N.D.
(Ghigna et
al., 2010)
256
PKC
Alt5’
2’MOE
Chevauche le
5’ss en aval
Redirige
vers le
5’ss en
amont
N.D.
(Jiang et
a l, 2008)
Tableau 3 Exemples de gènes associés au cancer et ciblés avec des siRNAs isoformespécifiques dans des cellules cancéreuses humaines.
Le type d’événement ciblé, l’isoforme et l’elffet phénotypique associé est indiqué.
Type de
Isoforme ciblé Effet phénotypique associé
Gène
Référence
ASE
Cassette
Court
MSTR1
Réduit la migration des
(Ghigna et
(exon 11 )
(Ron)
cellules 293 surexprimant
a l, 2005)
ASF/SF2
Long
Cassette
Induit la proüfération des
H-Ras
(Camats et
cellules HeLa
(Pl9)
al., 2009)
Court
BIRC7
Alt3’
Réduit la proüfération des
(Crnkoviccellules HeLa
Mertens et
(isoforme (3)
al., 2006)
Long
Rétention
Réduit l’invasion des
CCND1
(Kim et al.,
d’intron
(b isoforme)
cellules T24
2009)
Long
Cassette
eIF4H
Réduit la proüfération des
(Wu et al.,
(iso forme 1)
cellules LOVO
2011)
Long
BCL2L1
Alt5’
Réduit la proüfération des
(Dodier and
(Bcl-xL)
(Bcl-x)
ceüules CaOV3
Piche, 2006)
Court
Cassette
Réduit la méthylation du
DNMT3B
(Wang et al.,
(DNMT3B4)
promoteur RASSF1A
2007)
Long
Cassette
Réduit l’activation du
BRD8
(Hosoya et
récepteur de la thyroïde
al., 2008)
(p 120(3)
dans les cellules PC-3
Court
Induit l’apoptose des
Alt5’ et
(DiFeo et al.,
KLF6
cellules A549
3’ss
(iso forme
2008)
cryptique
SV1)
Long
Alt5’
Induit l’apoptose des
PKC
(Jiang et al.,
ceüules NT2
2008)
(PKCÔVIII)
Long
CXCR3
Alt3’
Augmente la proüfération
(Datta et al.,
(isoforme B)
des cellules MDA-MB2006)
435
Court
Réduit
l’invasion
des
Cassette
CD99
(Byun et al.,
ceüules MDA-MB-435
2006)
Long
Cassette
Réduit
la
proüfération
des
MDM2
(Gigüo et al.,
ceüules ARO
multiple
(DMX211)
2005)
Rétention
Long
Induit
un
délai
lors
de
la
(Fletcher et
NEK2
(NEK2B)
mitose des ceüules HeLa
d’intron
al., 2005)
Long
Augmente la résistance
Cassette
MYLK
(Clayburgh et
(Iso forme 1)
trans-épithélial (réduit la
al., 2004)
perméabilité)
257
Afin de déterminer l’impact fonctionnel de l’AS dans la cancérogenèse, nous avons
sélectionné des gènes dont les isoformes sont associés au cancer du sein et/ou de l’ovaire
(Klinck et al., 2008, Venables et al., 2008). Puis, nous avons confronté directement
l’impact de siRNAs (répression de l’isoforme long) et de TOSS (répression de l’isoforme
long et augmentation de l’isoforme court) sur l’induction d’apoptose de cellules
cancéreuses ovariennes (SKOV3ipl) de 41 ASEs endogènes. Nous avons d’abord émis
l’hypothèse qu’il serait plus facile d’identifier des isoformes avec des relations
fonctionnelles de type antagoniste, c’est pourquoi nous avons systématiquement criblé les
ASEs en trois phases lors du chapitre 3. D’abord une sélection positive avec des siRNAs
longs et des TOSS. Puis, une sélection négative en évaluant l’effet de siRNAs globaux.
Enfin, nous avons changé le contexte (l’essai phénotypique) dans le cas de SYK pour en
déterminer les conséquences sur la relation fonctionnelle des deux isoformes. Ainsi, nous
avons identifié quatre ASEs dont le phénotype résultant est relié au ratio d’isoforme plutôt
qu’à l’expression globale du gène, démontrant l’impact de PAS sur la fonction de gènes
associés au cancer. De plus, pour un même ASE, nous avons observé que la dépendance du
phénotype quant à l’expression globale et le ratio d’isoforme peut varier drastiquement en
fonction du contexte phénotypique (apoptose, prolifération et croissance en suspension).
Bien que certains gènes ciblés soient effectivement impliqués dans le processus d’apoptose
(MCL1, PTPN13), la plupart des gènes criblés ne le sont pas a priori. Ce criblage
systématique permet donc d’annoter de nouvelles fonctions iso forme-spécifique à des
gènes associés au processus de cancérogenèse.
Dans le cas du gène MCL1, le TOSS devrait donner le même effet que les siRNAs longs,
mais aucune modulation des iso formes protéiques n’est détectée par immuno-buvardage,
malgré la modulation évidente des isoformes ARNm et contrairement à ce que nous avons
observé pour SYK, CASP8 et CASP10 (voir Fig. S4 de l’article 2 et Fig. 7 du chapitre 2).
En appui avec la relation antagoniste des isoformes long (MCL-1l) et court (MCL-ls) mise
en lumière par notre approche, plusieurs membres de la famille Bel ont des effets similaires
dont : B c 1-xs / B c 1-x l et BCL-2a/BCL-2(3 (Akgul et al., 2004). De plus, un essai de levure à
double hybride avec MCL-ls indique qu’il n’interagit qu’avec MCL-li. et non avec
plusieurs partenaires de la famille Bel, indiquant qu’il s’agit probablement d’un
258
antagonisme de type dominant-négatif (Bae et al., 2000). Dans ce cas, une répression
effective de MCL-ls devrait générer un phénotype d’apoptose similaire à une répression de
MCL-1l. Malheureusement, les séquences particulières de la jonction unique des isoformes
courts ne nous ont pas permis d’évaluer le phénotype dû à leur répression. Notre stratégie
permet néanmoins de prédire la relation fonctionnelle entre deux isoformes de l’AS.
Le gène FN1 produit la fibronectine 1, une glycoprotéine de la matrice extracellulaire
importante pour l’adhésion cellulaire. Dans le cas particulier de ces isoformes incluant
l’exon EDB, bien peu de rôles lui ont été clairement attribués, malgré plus de 20 années de
recherche (White et al., 2008). Au cours de notre travail, nous avons évalué des siRNAs
longs ciblant l’exon EDB, mais aussi ciblant l’exon EDA et la jonction exon 267 - intron
93 de la région alternative IIICS. Seuls ceux spécifiques à l’exon EDB permettent d’induire
l’apoptose des cellules SKOV3ipl, permettant d’identifier un rôle fonctionnel pour
l’isoforme EDB. À l’inverse, ce sont les siRNAs longs ciblant la région alternative IIICS
qui atténuent la migration des cellules SKOV3ipl. De façon importante, ces phénotypes ne
peuvent pas être reproduits par une simple répression globale (résultats non-montrés).
Dans le cas de l’exon 69 de SYK, celui-ci code pour un domaine de liaison entre deux
domaines SH2 (Src homology 2). Il a été proposé que celui-ci encode un signal de
localisation nucléaire qui permet la redistribution intracellulaire de la kinase SYK (Wang et
al., 2003a). Effectivement, seul le TOSS ou les siRNAs longs parviennent à relocaliser la
protéine SYK vers le cytoplasme et affecte la survie cellulaire, qui est en partie médiée par
la voie de signalisation de JUN. Par contre, lorsqu’il est question de croissance
indépendante de l’adhésion, tant les siRNAs longs que les siRNAs globaux sont en mesure
de perturber la croissance des cellules dans l’agar mou. Dans ce dernier contexte, la théorie
prédit un comportement similaire pour un siRNA court si les deux iso formes ont des
propriétés similaires (modèle compensatoire), mais la séquence particulière de la jonction
spécifique à l’isoforme court ne se prête pas au dessin de siRNA.
Afin de démontrer clairement l’impact de l’AS sur la fonction, nous avons procédé à
l’évaluation de l’induction d’apoptose par un 2e criblage systématique de siRNAs globaux
dans la même lignée cellulaire et sur la même série de gènes décrite au chapitre 3. Cette
259
fois-ci, c’est la répression globale des gènes BMP4 et SYNE2 qui sensibilise les cellules à
l’apoptose et non les siRNA longs (résultats non-montrés). Bien que nous n’ayons pas
évalué les effets de siRNAs courts, ceux-ci doivent potentiellement révéler le phénotype
décrit par les siRNAs globaux. Ceci expliquerait pourquoi le TOSS n’induit pas le
phénotype soutenu par les siRNAs globaux, puisque l’on s’attend à la même absence
d’effet qu’avec les siRNAs longs. Il s’agirait donc de cas monofonctionnels dont l’isoforme
court détient la fonction. Par contre, ceci est contre intuitif pour BMP4 puisque l’iso forme
court constitue moins de 10% de l’ensemble des transcrits. De plus, l’ASE est situé en
5’UTR, donnant lieu à des protéines identiques. Il est possible que ce gène possède d ’autres
iso formes qui ne sont pas annotées à l’heure actuelle, ce qui expliquerait les ambiguïtés
présentées. Ces deux ASEs potentiels exigent donc une validation et une attention
supplémentaire avant de conclure. Reste que l’évaluation systématique des gènes possédant
un phénotype dû à la répression globale (siRNAs globaux) ou isoforme-spécifique (siRNA
long) ne présente pas de chevauchement.
Comme un changement de ratio des iso formes de SYK, FN1 et MCL1 a initialement été
observé entre des ovaires normaux et d’autres cancéreux (Klinck et al., 2008), il est tentant
d’impliquer ces isoformes dans la résistance à l’apoptose des cellules cancéreuses de
l’ovaire in vivo. Par contre, seul le ciblage de MCL-1l permet la reprogrammation vers un
ratio « normal ». En effet, on note une diminution de la valeur de \|f pour l’exon 69 de SYK
et EDB de FN1 dans les tumeurs ovariennes. Conséquemment, c’est donc une
augmentation du \|/ (siRNA court ou TOES) qui devrait sensibiliser les cellules à l’apoptose
et non l’inverse. Par contre, l’ovaire normal comme source de normalisation n’est pas un
choix judicieux pour les études du cancer de l’ovaire séreux de haut grade pour deux
raisons. Premièrement, il est constitué presqu’exclusivement de cellules stromales alors que
les tumeurs sont d’origine épithéliale. Comme TAS est un processus qui est propre à
chaque type cellulaire, il est alors normal de constater des différences d’expression
d’isoformes entre ces deux types cellulaires (sans nécessairement être associé au cancer).
Deuxièmement, les cellules épithéliales en surface de l’ovaire ne seraient pas les cellules
d’origine de la plupart des cas de cancer séreux de haut grade; ce serait plutôt les cellules
épithéliales sécrétrices de la trompe de Fallope (Colgan et al., 2001; Medeiros et al., 2006;
260
Callahan et al., 2007; Kim et al., 2012). Ce sont en fait ces motifs qui nous ont poussés à
utiliser la technologie LCM afin de comparer directement les cellules épithéliales entre
elles (chapitre 4). Des trois ASEs discutés, seul l’exon 69 de SYK a été criblé dans les
tissus LCM du chapitre 4 et n’est ni associé aux cellules cancéreuses épithéliales ni au
microenvironnement de la tumeur. De plus, l’expression du facteur d’épissage hnRNPK,
sensé réguler l’ensemble de ces trois ASEs, n’est pas affectée lorsque l’on normalise
l’expression avec les cellules normales épithéliales de la trompe de Fallope (résultat nonmontré). L’extrapolation des résultats in vitro présentés avec SYK demeure donc limitée.
3.2 Cibles potentielles pour le TOSS
Le TOSS est un excellent outil pour mettre en valeur l’impact fonctionnel de deux
isoformes à l’égard de leur ratio. Sur les 41 ASEs criblés, nous avons été en mesure d’en
identifier un seul ASE (SYK) pour lequel le ratio des isoformes (TOSS) est critique pour
les phénotypes d’apoptose et de viabilité. En revanche, la répression spécifique d’un seul
isoforme (par siRNA long) est nécessaire et suffisante pour induire l’apoptose (MCL1 et
FN1) ou diminuer la viabilité (CCNE1 and LIG4) de plusieurs cas. Le fait que peu de ASEs
produisent un phénotype par le TOSS peut être dû au choix du type d’essai phénotypique
ou à la classe de gène ciblé. Comme le criblage par siRNAs longs génère 4 fois plus de
ASEs associés à un phénotype que le criblage par TOSS, ceci suggère que le phénotype
d’apoptose est moins dépendant du ratio d’isoforme est beaucoup plus dépendant de
l’expression d’un isoforme en particulier (le long), du moins pour ce sous-ensemble de
gènes. Comme les résultats présentés au chapitre 4 suggèrent que les ASEs criblés sont
spécifiques au type cellulaire plutôt que spécifiques aux cellules cancéreuses comme tel, il
serait intéressant d’exécuter le même type de criblage, mais pour un ensemble de ASEs
vraiment associé au cancer (CES et CSS ASEs du chapitre 4). Est-ce que l’association au
cancer augmente les chances de produire un phénotype in vitrol Si oui, est-ce plus probable
par l’action d’un TOSS ou d’un siRNA long? Si la majorité des phénotypes sont produits
par le TOSS, cela supporterait notre hypothèse voulant qu’il existe un programme
d’épissage dont l’impact fonctionnel est indépendant de la transcription. Dans la négative,
261
il est tout à fait plausible que le contexte (essai phénotypique) ne soit pas approprié pour
valoriser le TOSS à ca juste mesure.
3.3 Impact fonctionnel du programme RBFOX2 et QKI dans la cancérogenèse
Des analyses bioinformatiques prédisent des changements de patron d’AS dans certains
types de cancers et sont confirmés par des validations expérimentales sur un petit nombre
de tissus dans certain cas. Il n’est pas clair si ces changements de patron d’AS proviennent
d’un effet secondaire des cellules cancéreuses (conséquence) ou plutôt le résultat d’un
programme destiné à promouvoir le développement de la tumeur (causal). Afin de
supporter notre hypothèse générale voulant que les isoformes de l’AS soient importantes
pour le développement des tumeurs, nous avons identifié un certains nombres de ASEs
dérégulés dans le cancer de l’ovaire séreux de haut grade. Puis, nous avons déterminé les
facteurs d’épissages qui sont altérés et finalement, nous avons associé le changement de
ratio d’isoforme observé et l’expression globale des facteurs d’épissage dérégulé par
siRNA in vitro. Cette démarche nous a conduite à l’identification d’une paire de facteurs
d’épissage
alternatif (RBFOX2 et
QKI)
impliquées dans la régulation d’exon
mésenchymaux dans le microenvironnement des tumeurs ovariennes.
Cette stratégie pourrait être appüquée afin de déterminer un programme d’AS responsable
de l’induction d’apoptose des cellules cancéreuses ovariennes. En partant des facteurs
d’épissage associés aux cellules épithéliales cancéreuses de l’ovaire du chapitre 4, la
surexpression individuelle de ceux-ci dans une lignée ovarienne cancéreuse permettrait
d’identifier les joueurs responsables de la résistance à l’apoptose des cellules cancéreuses.
Alternativement, le criblage pourrait être fait en évaluant la résistance accrue dans une
lignée épithéliale normale lors de la répression de facteurs d’épissage par siRNA. L’étape
suivante serait de vérifier l’impact sur l’AS de gènes apoptotiques par PCR à haut débit ou
sur le transcriptome entier par séquençage à haut débit. Ainsi, le suivi de l’impact sur l’AS
en parallèle avec des marqueurs de l’apoptose permettrait d’identifier un programme d ’AS
qui promouvoit la résistance à l’apoptose des cellules cancéreuses.
262
Tel que relaté à la section 2.2.2.2 de l’introduction, RBFOX2 est un facteur d’épissage qui
est exprimé de façon tissu-spécifique et qui influence le ratio d’isoformes de plusieurs
ASEs. Son expression est importante afin de coordonner le développement normal du
système nerveux (Gehman et al., 2012), du système cardiaque ainsi que des muscles
squelettiques (Gallagher et a i, 2011). En combinaison avec d’autres facteurs, il est
soupçonné d’être impliqué dans des programmes d’AS promouvant l’identité des cellules
musculaires squelettiques (Llorian and Smith, 2011) et neuronale (Zhang et a i, 2010).
Une mutation autosomale récéssive affectant l’expression de QKI originalement découverte
par Sidman et collaborateurs (1964) produit des tremblements caractéristiques chez la
souris dus à une myéline défectueuse (qkv). La délétion du gène QKI est létale chez la
souris, ne permettant pas aux embryons de se développer plus de 10 jours in utero (Li et a i,
2003). Le gène QKI subit de l’AS dans sa portion 3’ pour générer 3 isoformes ARNm de 5,
6 et 7 kDa d’où leur nom: QKI-5, QKI-6 et QKI-7. QKI-5 est le seul isoforme à posséder
un signal de localisation nucléaire (Wu et a i, 1999). La protéine qki-7 est exclusivement
cytoplasmique alors que QKI-6 peut se retrouver tant au cytoplasme qu’au noyau, un
résultat qui pourrait s’expliquer par une hétérodimérisation avec la protéine nucléaire QKI5 (Larocque et al., 2002). Ces trois isoformes ont un domaine de liaison à l’ARN de type
KH et font partie d’une famille de protéines qui regroupe entre autres hnRNPK et Sam68
(Chenard and Richard, 2008). Ils ont un rôle à jouer dans la maturation des ARNm. Plus
précisément, les isoformes cytoplasmiques QKI-6 et QKI-7 sont impliquées dans la
stabilisation ou la traduction des ARNm de gènes impliqués dans la différentiation
cellulaire via la liaison à un motif ACUAAY en 3’UTR (Larocque et a i, 2005). En
revanche, l’iso forme nucléaire QKI-5 est présumé responsable de la régulation directe de
l’AS de gènes impliqués dans le maintien de la gaine de myéline comme la glycoprotéine
MAG (myelin-associated glycoprotein) (Wu et al., 2002). À noter que ce sont les iso formes
QKI-6 et QKI-7 qui sont réprimées dans les oligodendrocytes du modèle murin qkv. En ce
sens, il n’est pas exclu que QKI-6 ou QKI-7 pourrait aussi agir indirectement sur les
ARNm de certains facteurs d’épissage comme hnRNPAl (Zhao et al., 2010, Zearfoss et al.,
2011). D’autre part, la localisation nucléaire partielle de QKI-6 et ses effets potentiellement
directs sur l’AS pourraient expliquer le changement de ratio des isoformes favorisant
263
1’isoforme QKI-6 au détriment de l’iso forme QKI-7 dans les échantillons de sein de la
figure 6 du chapitre 4.
Bien que RBFOX2 et QKI semblent avoir des rôles distincts, le chapitre 4 met en lumière
un ensemble d’ASEs régulé de façon redondante par ces deux facteurs d’épissage. En
comparant le profil d’AS et l’expression de facteurs d’épissage de tissus épithéliaux et
mésenchymaux normaux et cancéreux, nous avons découvert que les cellules du
microenvironnement de tumeurs de l’ovaire possèdent un profil qui ressemble beaucoup
aux cellules épithéliales normales. Tel que discuté dans le chapitre 4, nos résultats
indiquent qu’il ne s’agit vraisemblablement pas d’une transition mésenchymale-àépithéliale (MET) (Fig. 4, voie 1). En fait, il n’est pas clair en quoi l’acquisition de
propriétés épithéliales favoriserait directement ou indirectement la progression de la tumeur
épithéliale. Il est possible que la cancérogenèse induise la différenciation épithéliale des
cellules avoisinant la tumeur afin de lui ressembler, mais que la cascade de signalisation est
interrompue prématurément, d’où le maintien du phénotype stromal. En se sens, il serait
intéressant d’évaluer la présence du programme RQ dans un système où des cellules
précurseures se différencient en cellules épithéliales.
Phénotype
épithélial
/
✓
1/
^
Répression de
w
RBFOX2 et Q K \ / s '
Fibroblastes
--------------------------------
V v
\
*
4S
Phénotype
tumoral
Phénotype
CAF
Autre phénotype
264
Figure 4 Impact du programme RBFOX2 et QKI sur les fibroblastes normaux.
Schématisation hypothétique de l’impact de la désactivation du programme RBFOX2 et
QKI sur le phénotpe des fibroblastes. La répression de RBFOX2 et QKI pourrait
promouvoir un phénotype 1) épithélial; 2) tumoral; 3) de type CAF ou 4) autre dans le but
de promouvoir le développement de la tumeur.
Il est possible que la répression de RBFOX2 et QKI induise une transformation des
fibroblastes au point de leur faire acquérir des propriétés tumorigéniques (Fig. 4, voie 2).
De façon intéressante, une surexpression du facteur d’épissage SF2 (Kami et a i, 2007) ou
SRp20 (Jia et a i, 2010) dans des fibroblastes immortalisés de rat est suffisante pour
permettre la formation de sarcome lorsqu’injecté, dans des souris immuno-déficientes, ce
qui les placent au rang de proto-oncogène. Curieusement, un modèle murin du cancer de
l’ovaire originant de la trompe de Fallope indique que le carcinome prend place dans le
stroma de la trompe, suggérant que les cellules d’origine seraient mésenchymales (Kim et
a i, 2012). Par contre, QKI est suspecté comme gène suppresseur de tumeur dans les
cancers du système gastro-intestinal (Yang et al., 2010, Bian et a i, 2012). Par définition, la
suppression du gène favorise la formation de tumeur, mais requiert la présence d’oncogène.
En effet, la suppression de TP53 ou PTEN dans les fibroblastes du microenvironnement
accélère la formation de tumeur épithéliale adjacente, mais ne parvient pas à transformer les
fibroblastes en adénocarcinome ou en sarcome (Kiaris et a i, 2005, Trimboli et a i, 2009).
Malgré tout, il serait intéressant de déterminer l’impact du programme RQ sur la
tumorigénicité de fibroblastes normaux par des essais de croissance en agar mou et par
injection sous-cutanée dans un modèle murin immuno-déficient suite à une répression de
RBFOX2 et QKI.
Si la répression de RBFOX2 et QKI ne permet pas aux fibroblastes d’acquérir des
propriétés tumorigéniques, alors elle pourrait permettre leur différenciation en cancerassociated fibroblasts (CAPs) (Fig. 4, voie 3). Ceux-ci sont reconnus pour sécréter des
facteurs qui influencent positivement la prolifération et l’invasion, et contribuent à la
résistance à l’apoptose de la tumeur (Shimoda et a i, 2010). Tel que décrit à la section
1.2.7, les CAFs se distinguent par l’expression de marqueurs et de phénotype spécifique. Il
serait intéressant de vérifier la prolifération, l’invasion et la résistance à l’apoptose de
cellules cancéreuses épithéliales suite à la désactivation du programme RQ de fibroblastes
265
en co-culture. D’une façon ou d’une autre, le programme RQ doit contribuer à la
progression de la tumeur d’une quelconque façon pour justifier son existence (Fig. 4, voie
4).
4 Potentiel clinique des signatures moléculaires obtenues par microdissection
En théorie, les signatures moléculaires issues de biopsies peuvent également permettre de
révéler le pronostic d ’une patiente. Par exemple, l’analyse non-supervisée de 285 tumeurs
ovariennes a permis une sous-classification moléculaire de quatre types séreux de haut
grade dont un qui corrèle avec la sévérité du phénotype clinique. En effet, l’expression de
gènes habituellement exprimés dans les cellules stromales caractérise une sous-population
de tumeurs séreuses de haut grade et est associée à une durée de survie plus courte que les
autres sous-types moléculaires (Tothill et al., 2008). Fait intéressant, le faible contenu
épithélial des tumeurs de ce sous-groupe corrèle avec la forte expression de ces gènes
stromaux dans le microenvironnement de la tumeur, révélant que cette signature ne
provient pas des cellules épithéliales cancéreuses mais bien des cellules stromales. Par
contre, l’association cünique n’a été corroborée que partiellement puisqu’une étude
ultérieure de «The Cancer Genome Atlas » n’a pas été en mesure d’associer un de ces
sous-groupes au degré de survie (Bell D et al., 2011, Bentink et al., 2012). Ces études, ainsi
que d’autres dans le cancer du sein (Finak et al., 2008, Farmer et al., 2009) suggèrent que
les signatures stromales peuvent être utilisées à des fins pronostiques.
En date du dépôt de cette thèse, aucune étude de profilage des isoformes épissées
alternativement dans le cancer de l’ovaire n’a été réalisée par un autre groupe de recherche
que le nôtre. Il est donc impossible d’analyser rétrospectivement une étude antérieure de
grande envergure telle qu’il est usuel de le faire pour l’expression globale. Le pronostic de
la patiente et la durée de sa survie suivant son diagnostic sont intimement liés à la
sensibilité de sa tumeur à la chimiothérapie de première ligne et à l’efficacité de la
cytoréduction. La plupart des tumeurs ovariennes de haut grade sont initialement sensibles,
mais finissent par progresser au cours des deux années suivantes. Le temps pris pour
récidiver est une bonne mesure de la survie globale de la patiente et en fait un bon
266
marqueur pronostique. Malheureusement, les tissus utilisés au cours du chapitre 4, pour
lesquels le suivi complet de la patiente y est associé, sont très limités et ne permettent pas
de procéder à des analyses de corrélation avec les données cliniques.
267
CONCLUSIONS
L'épissage alternatif (AS) est un mécanisme par lequel un pré-ARNm produit plusieurs
isoformes ARNm. Bien que l'AS influence plus de 90% des gènes, la fonction associée à
chacune des isoformes est difficile à évaluer. Ceci est en partie dû au défi que représente la
quantification des isoformes. Dans cette thèse, nous avons élaboré une méthodologie à haut
débit permettant une quantification isoforme-spécifique ou globale (toutes les isoformes)
dans des conditions PCR universelle. Nous avons illustré le potentiel de cette approche en
l'appliquant à deux problématiques importantes de la biologie actuelle. Dans un premier
temps, il nous a été possible de systématiquement disséquer la contribution de chacun des
isoformes de gènes impliqués dans le cancer de l'ovaire sur le phénotype de cellules
cancéreuses. Pour ce faire, nous avons d'abord développé une méthodologie générale
permettant de caractériser des outils moléculaires (siRNA, TOSS) à haut débit. Le TOSS
(targeted oligonucleotide silencer of splicing) est un antisens bifonctionnel qui favorise
l'exclusion d'un exon alternatif. Nous avons développé des règles de dessin et généralisé
son utilisation en démontrant par deux techniques (endpoint PCR et PCR en temps réel)
que le TOSS reprogramme l'AS en favorisant l'isoforme court; et qu'il n'affecte pas
l'expression globale du gène dans la plupart des cas. En s'appuyant sur cette méthodologie,
nous avons clairement démontré qu'il est possible d'induire l'apoptose des cellules
cancéreuses SKOV3ipl en ciblant spécifiquement une seule des isoformes du gène SYK et
que ce phénotype est indépendant de l'altération de son expression globale. Dans un
deuxième temps, il a été possible de caractériser la dérégulation de l'AS dans les cellules
cancéreuses de l'ovaire séreux de haut grade et leur microenvironnement. Pour ce faire,
nous avons utilisé un appareil de microdissection au laser pour isoler les cellules
épithéliales des cellules stromales de trompe de Fallope et d’ovaire. De cette façon, nous
avons été en mesure de quantifier l’expression globale de 370 gènes associés au
splicéosome ainsi que l'expression de l’ensemble des isoformes répertoriés dans NCBI
RefSeq 36.3 (870 ASEs). En combinant les résultats de criblage des tissus et d'approche par
répression transitoire (siRNA), nous avons identifié un programme d’AS régulé par
RBFOX2 et QKI. En comparant les signatures de profil d’AS et de facteurs d’épissage dans
268
des tissus épithéliaux et mésenchymaux normaux, nous avons découvert que le
microenvironnement des tumeurs ovariennes possède un profil moléculaire épithélial. Bien
que RBFOX2 et QKI aient leurs propres cibles ASEs et fonctions, leur cibles communes
sont presqu’exclusivement des exons mésenchymaux inclus dans les tissus normaux.
Comme RBFOX2 et QKI sont réprimés dans le microenvironnement de tumeur ovarienne,
ceci explique pourquoi ce sont majoritairement des exons mésenchymaux qui soient exclus.
Ce programme est également désactivé dans d’autres adénocarcinomes (sein), ce qui laisse
croire que ce programme est général et important pour le développement des tumeurs
épithéliales.
269
REMERCIEMENTS
Je suis reconnaissant envers mes superviseurs Jean-Pierre Perreault et Sherif Abou Elela,
ainsi que mon jury de thèse composé d’Anne-Marie Mes-Masson, Nathalie Rivard et
Rodney Ouellette. Merci pour votre précieux temps passé à lire cette thèse afin d’en faire
non seulement un meilleur ouvrage, mais également faire de moi un auteur scientifique plus
accompli.
Sur le plan professionnel, trois personnes m’ont apporté une aide inestimable dans trois
circonstances différentes; sans quoi le travail présenté dans cette thèse serait franchement
différent. La première personne m’a transmis sa fougue et ses connaissances techniques
nécessaires à la realisation de l’article 1. Son passage dans notre laboratoire a transformé
nos façons de faire et nous a doté d’une solide structure de travail dont on se sert encore et
dont on se servira longtemps, et qui sous-tendent tous les chapitres de cette thèse. Merci
Karine Tremblay.
La deuxième personne est aussi fougueuse que la première. Notre collaboration de tous les
jours s’est concrétisée par 1) le développement des outils moléculaires isoformesspécifiques, 2) la réalisation d’un premier article dans RNA, 3) une amitié. Ensemble, nous
avons mis à notre disposition des moyens à la hauteur de nos ambitions pour bâtir nos
rêves. Merci Jean-Francois Lucier.
La troisième personne a apportée la crédibilité nécessaire à la réalisation du chapitre 4.
L’embauche d’un pathologiste senior demeure un des bons coups de Sherif à ce jour. Cela
nous a permis de faire le ménage dans notre banque de tissus et conséquemment, nous a
dicté les études réalisables, mais surtout celles qui ne sont pas possibles. Merci Hanad
Nwilati.
J’aimerais remercier les artisans du LGFUS qui sont dans l’ombre, notamment Roscoe
Klinck, celui qui a bâti la plateforme à partir de rien. Son équipe actuelle (Philippe
Thibault, Elvy Lapointe et Mathieu Durand) a non seulement vivement participé à la
270
réalisation de certaines portions de la thèse, mais plus important encore, je peux les
considérer comme des amis. Plusieurs membres passés et présents du laboratoire ont su
forger la personnalité du LGFUS et faire avancer les projets à leur façon. Je pense ici à
ceux que j ’ai connu (Anne et Lyna, le vénérable du sommet, Takis, Dan Garneau,
Geneviève, Marianne, Junior, Bruno). Bonne chance à Daniel Gendron sur les épaules de
qui repose maintenant la pression de faire rayonner ce projet.
Sainte-Julie a le droit à un paragraphe à part. Bien qu’elle ne travaille pas sur le « vrai
projet » du LGFUS, je lui dois tout mon respect pour son dévouement envers la science, et
sa touche magique qui lui permet d’obtenir ce qu’elle veut de Sherif tout en lui donnant
l’impression que c’était l’idée de Sherif. Elle a aussi eu la générosité, tout comme Rachel,
Guylaine, Laurence et Brigitte, de se taper la correction de mes fautes d’ortographes,
nombreuses et répétitives.
Ma famille m’a été d’un grand soutien tout au long de mes 13 ans passés à Sherbrooke,
pariculièrement dans la dernière année là où ma sœur (Marie-Bri) et son conjoint (FrancoisXavier) m’ont hébergé pour l’été, avant de passer la relève à mes parents (Jacques et
Brigitte).
Merci pour tout Amélie, Mariana, Guylaine.
271
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286
ANNEXES
Annexe 1 Base de données de TOSS
Pour chacun des ASEs ciblés par les TOSS, le type d’ASE, le nom de l’oligonucléotide et
les amorces PCR sont indiqués. Aug. Détection possible seulement lors d’un traitement
avec le TOSS ou SSO; A = modulation de type A; B = modulation de type B; NON = sans
effet; A ou B = Le TOSS ou SSO fonctionne mais les résultats ne permettent pas de
trancher en faveur d’une modulation de type A ou B.
Disponible à partir de http://palace.lgfus.ca/pcrreactiongroup/list/265.
Annexe 2 Étude de spécificité des siRNAs spécifiques à T isoforme court
Dans la colonne « Séquences », les nucléotides qui diffèrent par rapport à la jonction ciblée
sont soulignés. Dans la colonne « Position des mésappariements », la position
dumésappariement est notée en fonction de la numérotation du brin antisens du siRNA de 1
à 19.
287
Séquences
TACC2
Position des mésappariements
GCCCAGAG GAGTTCCGATT
siRNA 1
TACC2_cass_S_s
CAGAG GAGTTCCGATTCTG
siRNA 2
TACC2_cass_S_ 1_s
Exon 126/
exon 137
TCTGATAGCCCAGAG GAGTTCCGATTCTGA
Exon 126/
intron
TCTGATAGCCCAGAG GTACGGTGGGGGCCC
1 à 3 et 5 à 10
1 à 6 et 7 à 13
Exon 126/
exon135
TCTGATAGCCCAGAG CATCTCCCCAGCTGC
1 à 4, 8, 9 et 11
4 à 7, 11, 12 et 14
Intron/
exon 137
TCCCTCTCTCATCAG GAGTTCCGATTCTGA
14 à 16, 18 et 19
17 à 19
Exon135/
exon 137
CAAGGACCTCAGCAG GAGTTCCGATTCTGA
14 à 16, 18 et 19
17 à 19
2.00 i
|
1.50
*3
CO
0)
LF
si
Ctrl
TACC2 c a ss S s
[ E3 Global ■ Long □ Court I
TACC2_cass_S_1__s
288
KIAA121
7
Séquences
siRNA 1
GAGAGACCAG CGAGAAAAT
siRNA 2
Exon833/
exon50
Position des mésappariements
KJAA 1217_cass_S_s
GACCAG CGAGAAAATGATG
KIAA 1217_cass_S_ 1_s
AGACAGAGAGACCAG CGAGAAAATGATGAA
I
Exon833/ AGACAGAGAGACCAG GTAAGGTGCAGTGAG 1 à 6, 8 et 9
intron
2 à 10, 12 et 13
Exon833/ AGACAGAGAGACCAG AGAGAGGATGCAAGC 3, 4 et 9
exon105
1 à 3, 7, 8 et 13
Intron/
exon50
13 à 19
17 à 19
12, 14, 16, 18 et 19
16 et 18
Exon105/
exon50
2.00
|
TTTTCTTTTATTCAG CGAGAAAATGATGAA
CAAAGATGCGTCTAG CGAGAAAATGATGAA
-
1.50
ro
a>
k.
o 1.00
»
tn
£
& 0.50 -
0.00
-
si
C trl
KIAA1217_cass S s
[a G L O B A L ■ L O N G □ S H O R T
j
KIAA1217_cass_S_1_s
289
SYNE2
siRNA 1
Séquences
Position des mésappariements
CAGCGCACTGTCAG GTAAA
siRNA 3
SYNE2_hitl
_l_s
AGCGCACTGTCAG GTAAAT
siRNA 2
SYNE2_cassett
e_S_s
GCACTGTCAG GTAAATCCA
SYNE2_hitl
_2_s
Exon277/
exon 140
ACAGCGCACTGTCAG GTAAATCCATTTCGG
Exon277/
intron
ACAGCGCACTGTCAG GTAACAGCTGGGTIC
1
1 et 2
2à4
Exon277/
exon69
ACAGCGCACTGTCAG ATGTAGAAATCCCTG
2,3 et 5
1,3, 4 et 6
2 à 4, 6, 7 et 9
Intron/
exon 140
TGTCTTTCGTTTCAG GTAAATCCATTTCGG
10, 12 à 19
11,13 à 19
14, 16 à 19
Exon69/
exon140
TGAAAGCGTCTTCTG GTAAATCCATTTCGG
7, 10à 13, 16, 17 8, 11 à 14, 17 et 11, 14 à 17 et
et 19
18
18
2.00
-
LF
sictri
S Y N E 2_hit1_1_s
0 G lobal ■ Long □ Court
SY N E 2. c a s s e tte _ S _ s
290
APP
Séquences
siRNA 4
siRNA 2
Position des mésappariements
TGTGGCAGCGCCA TTCCTA
APP_cass
_S_7_s
GGCAGCGCCA TTCCTACAA
siRNA 1
APP_cass
_S_l_s
CAGCGCCA TTCCTACAACA
siRNA 3
APP_cass_S
_s
CGCCA TTCCTACAACAGCA
APP„cass_S
_4_s
Exon 168/
exon 134
TGTGTGGCAGCGCCA TTCCTACAACAGCAG
Exon168/
intron
TGTGTGGCAGCGCCA GTAAGTGGACCCTTC
1 à 4 et 6
Exon 168/
exon57
TGTGTGGCAGCGCCA TGTCCCAAAGTTTAC
1,2, 4 et 5 3 à 5, 7 et 1, 2, 5 à 7, 9 2 à 5, 8 à
8
et 10
10, 12 et 13
Intron/
exon134
Exon57/
exon 134
TCTTCTACTTTATAG TTCCTACAACAGCAG 7 à 13, 15 10 à 16,
à 18
18 et 19
GAGATCCTGTTAAAC TTCCTACAACAGCAG 7 à 16, 17 lOà 19
et 19
Exon203/
exon 134
AAGAGGTGGTTCGAG TTCCTACAACAGCAG 7 à 15, 17 lOà 18
à 19
2 à 7 et 9
1, 4 à 9 et
11
1 à 4, 7 à 12
et 14
12 à 18
15 à 19
12 à 19
15 à 19
12 à 19
15 à 19
2.00
> 150
LF
sictrl
A P P _ c a ss_ S _ s
A PP_cass__S_1_s A P P c a s s S 4 s
□ Global □ Long ■ Court
A P P _ c a ss S 7_s
291
CD47
siRNA 3
Séquences
Position des mésappariements
GGAACCCCTTAATG AATAA
siRNA 1
CD47_cas
s_S_2_s
AACCCCTTAATG AATAACT
siRNA 2
CD47_cass_
S_s
CCCCTTAATG AATAACTGA
CD47_cas
s_S_l_s
siRNA 4
CCCTTAATG AATAACTGAA
Exon25/
exon213
AGGAACCCCTTAATG AATAACTGAAGTGAA
Exon 25/
intron
AGGAACCCCTTAATG GTATGTGGTTATTTC
1à 5
1à 7
1, 3 à 9
1, 2, 4 à 10
Exon 25/
exon33
AGGAACCCCTTAATG CATTCAAAGAATCAA
1, 2 et 5
1 à 4 et 7
1 à 6 et 9
2 à 7 e t 10
Intron/
exon213
TTTTCAATTTTCCAG AATAACTGAAGTGAA 7 à 9 e t 12
à 19
GAATGATGAATGATG AATAACTGAAGTGAA 9 et 11 à
19
9 à 11 et 13 11 à 13 et
à 19
15 à 19
12 à 14 et
16 à 19
11 et 13 à
19
14 et 16 à
19
Exon 33/
exon213
Exon 32/
exon213
Exon93/
exon213
CD47_cass_
S_3_s
13 et 15 à
19
ATACAACCTCCTAGG AATAACTGAAGTGAA 7, lOà 12 9, 12 à 14 et 11, 14 à
et 17 à 19 19
16
ATATGAAATTTGTGG AATAACTGAAGTGAA 7 à 9 e t 12 9 à 11 et 14 11 à 13 et
à 19
à 19
16 à 19
2.00
1.50
LF
sictrf
CD47_cass_S_2_s CD47_cass_S_s CD47_cass_S_1_s CD47_cass_S_3_s
i E3 Global ■ Long □ Court I
12, 15 à 17
12 à 14 et
17 à 19
292
C il orfl 7
siRNA 2
siRNA 1
Séquences
Position des mésappariements
CTCCCGGGAGAG AAATATT
C11orfl 7_cassette
S_l_s
CCCGGGAGAG AAATATTAT
C11orfl 7_cassette_S_
s
Exon228/ GTTCTCCCGGGAGAG AAATATTATTCATCT
exon105
Exon228/ GTTCTCCCGGGAGAG GTGAGGGTCGCTGTG
intron
1à 7
1à 9
Exon228/ GTTCTCCCGGGAGAG
exon81
1,2, 4 et 6
2, 3, 5 et 7
AGAGAAGAGAGACCC
Intron/
exon105
ACATTACGTCTCTAG AAATATTATTCATCT
10 à 15, 17 et 19
12 à 17 et 19
Exon81/
exonl05
TCAAGTCAGTGTGGG AAATATTATTCATCT
9, 11, 13, 15, 17 à
19
11, 13, 15, 17 et 19
2.00
> 1.50
o 1.00
* 0.50
sictrl
C11orf17_cassette__S_1 s
m Global ■ Long □ Court
C 11orf17_cassette S s
293
Annexe 3 Tableau SI-17 du chapitre 4
Disponible à partir de http://palaee.lgfus.ca/pcrreactiongroup/Iist/219
Usemame : brosseau_review
Password : SX1IT4 LR