Université de Sherbrooke Détection, annotation fonctionnelle et régulation des isoformes de

Université de Sherbrooke
Détection, annotation fonctionnelle et régulation des isoformes de
l'épissage alternatif associées au cancer de l’ovaire
Par
Jean-Philippe Brosseau
Département de biochimie
Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé
en vue de l’obtention du grade de philosophiae doctor (Ph.D.) en biochimie
Sherbrooke, Québec, Canada
décembre, 2012
Membres du jury d’évaluation
Jean-Pierre Perreault, biochimie
Sherif Abou Elela, microbiologie
Nathalie Rivard, anatomie et biologie cellulaire
Rodney Ouellette, biochimie
Anne-Marie Mes Masson, Centre de recherche CHUM et Institut du cancer de Montréal
Jean-Philippe Brosseau, 2012

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RÉSUMÉ
Détection, annotation fonctionnelle et régulation des isoformes de
l'épissage alternatif impliquées dans le cancer de l'ovaire
Par
Jean-Philippe Brosseau
Département de biochimie
Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention
du diplôme de philosophiae doctor (Ph.D.) en biochimie, Faculté de médecine et des
sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4
L’expression des gènes modifiés contribue à l’initiation et la progression du cancer.
Malheureusement, les recherches actuelles s’attardent essentiellement à l’expression
globale des gènes sans tenir compte des différentes isoformes des ARNm résultant de
l’épissage alternatif, codant potentiellement pour des protéines de fonctions différentes. En
effet, la haute similitude et la complexité des isoformes ARNm rendent la discrimination
des isoformes laborieuse, raisons pour lesquelles l’épissage alternatif est historiquement
étudié gène par gène. C’est la raison pour laquelle nous avons développé une méthodologie
à haut débit pour la quantification des isoformes d’ARNm. Basé sur cette technique, cette
thèse présente une série d’évidences qui appuie l’hypothèse selon laquelle certaines
iso formes d’ARNm sont nécessaires à la tumorigénèse. Précédemment, des études
bioinformatiques à grande échelle ainsi que des validations expérimentales à petite échelle
ont révélé la présence d’isoformes spécifiques à certains types de cancers. Toutefois, ces
conclusions ont été tirées à partir de tumeurs dont le contenu cellulaire est hétérogène. Or,
il est bien connu que les niveaux des iso formes d’ARNm diffèrent largement en fonction du
type cellulaire et il est possible que les différences observées dans des tumeurs entières
soient des artéfacts résultant de la complexité cellulaire des tissus comparés. En nous
basant sur le cancer de l’ovaire comme modèle, nos préparations homogènes de différents
types cellulaires nous ont permis de révéler la présence d’isoformes associées au cancer
indépendamment de l’hétérogénéité des tumeurs. Étonnamment, les changements les plus
intéressants ne se retrouvent pas dans les cellules cancéreuses à proprement dites, mais dans
les cellules « normales » en bordure de la tumeur. Notre analyse des facteurs de régulation
de ces isoformes nous a permis d’affirmer que ces changements ne sont pas dûs à un
dérèglement anarchique des cellules cancéreuses, mais découlent plutôt d’un programme
destiné à avantager les cellules cancéreuses. Pour évaluer la fonction des isoformes
d’ARNm, nous avons généralisé des outils moléculaires permettant de reprogrammer
spécifiquement l’expression d’isoformes de gènes cible dans des lignées cellulaires
cancéreuses. Ainsi, le criblage systématique d’isoformes d’ARNm de gènes cibles associés
au cancer a permis de révéler leur caractère pro-cancer dans des essais in vitro. L’ensemble
de ces travaux démontrent la contribution des isoformes d’épissage dans le développement
des tumeurs solides.
Mots-clés: Cancer de l’ovaire, PCR en temps réel à haut débit, analyse de l’ARN, siRNA,
microdissection au laser, épissage alternatif, microenvironnement.

SUMMARY
Detection, functional annotation and regulation
of splicing isoforms in ovarian cancer
By
Jean-Philippe Brosseau
Département de biochimie
Thesis presented to the Faculté de médecine et des sciences de la santé for the
obtention of the title of philosophiae doctor (Ph.D.) in biochemistry, Faculté de médecine et
des sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4
Cancer cells modify their gene expression pattern to promote tumor growth. Unfortunately,
current research focuses almost exclusively on global gene expression changes, without
taking into account the fact that the majority of genes produce multiple alternative splicing
variants, which potentially code for proteins of different functions In fact, the main reason
splicing isoforms are still studied on a gene by gene basis is because the high sequence
similarity and complexity of mRNA isoforms make it very difficult to detect and quantify
them. To overcome this difficulty, we developed a high-throughput methodology to
accurately quantify splicing isoforms. This methodology has been applied in this thesis to
generate evidence supporting a causal role for splicing isoforms in the tumorigenesis of
solid tumors. A few years ago, genome-wide bioinformatics predictions, and some
experimental validations in human tissues, suggested the existence of cancer-specific
splicing isoforms. However, these conclusions may be simply explained by the cellular
heterogeneity of tumor. In fact, it is well established that alternative splicing is a cell type-
specific process. To address this, we microdissected cancer tissues and demonstrated that
some splicing isoforms are truly cancer-associated and independent of tumor cell type
content. Surprisingly, the most interesting changes were found in the “normal” stromal
cells surrounding the tumor and not within the cancer cells. Our analysis of splicing-factor
expression changes using the same tissue set allowed us to confirm that these splicing shifts
were not a random process, but rather part of a defined splicing program promoting tumor
development. To evaluate the functional contribution of splicing isoforms, we developed
molecular tools that modulate splicing of endogenous targets in cancer cell lines. We used
these tools to decipher the pro-cancer properties of cancer-associated splicing isoforms
using in vitro assays. Overall, this work demonstrated the contribution of splicing isoforms
in solid tumor development.
Keywords: Ovarian cancer, high-throughput real-time PCR, TOSS, siRNA, laser
microdissection, alternative splicing, microenvironment.

iv
TABLE DES MATIÈRES
RÉSUMÉ ................................................................................................................................................... ii
SUMMARY ............................................................................................................................................ iii
TABLE DES MATIÈRES ....................................................................................................................... iv
LISTE DES TABLEAUX ...................................................................................................................... vii
LISTE DES FIGURES ............................................................................................................................ ix
LISTE DES ABRÉVIATIONS ............................................................................................................. xii
INTRODUCTION ................................................................................................................................. 16
1 Le Cancer ............................................................................................................................................ 16
1.1 Généralités ....................................................................................................................................... 16
1.1.1 Définitions ..................................................................................................................................... 16
1.1.2 Statistiques ..................................................................................................................................... 17
1.1.3 Facteurs de risque ......................................................................................................................... 17
1.2 Modélisation de la cancérogenèse .................................................................................................. 18
1.2.1 Cancérogènes ................................................................................................................................ 18
1.2.2 Oncogènes ..................................................................................................................................... 18
1.2.4 Progression séquentielle de la cancérogenèse ........................................................................... 20
1.2.3 Gènes suppresseurs de tumeurs ................................................................................................... 23
1.2.5 Rôle du microenvironnement de la tumeur .................................................................................. 25
1.2.6 La transition épithéliale-mésenchymale et mésenchymale-épithéliale ....................................... 27
1.2.7 Origines des CAFs ....................................................................................................................... 32
1.3 Cancer de l ’ovaire ........................................................................................................................... 33
2 Epissage des ARNm ............................................................................................................................ 39
2.1 Épissage constitutif..........................................................................................................................39
2.2 Épissage alternatif .......................................................................................................................... 44
2.2. / Type d ’événements d ’épis sage alternatif. .................................................................................... 44
2.2.2 Mécanisme de régulation ............................................................................................................. 45
2.2.2.1 Mécanisme de régulation classique .......................................................................................... 45
2.2.2.2 Expression tissu-spécifique de facteurs d ’épissage ................................................................. 48
2.2.3 Rôle dans la cancérogenèse ....................................................................................................... 49