Aucun titre de diapositive - Département de génie chimique

publicité
La culture de cellules animales,
quosse ça donne?
Alain Garnier, Université Laval
Plan
• La culture de cellules animales:
– Qu’est-ce?
– Pourquoi?
– Comment?
Qu’est-ce?
•
•
•
•
Différentes sources
Différents types
techniques de transformation
Caractéristiques générales
Sources
•
•
•
•
Insectes
Poissons
Mammifères
Humains
Formes/tissus
•
•
•
•
•
•
•
Épithéliales/endothéliales (membranes)
Fibroblastes (tissus connectifs)
Myoblastes (muscles)
Neurones (syst. nerveux)
Hepatocytes (foie)
Erythrocytes (sang)
Lymphocytes (syst. immunitaire)
Formes...
Types
• Culture primaire: Culture initiale de cellules qui
viennent d’être prélevées d’un tissu. Différenciée.
Généralement à attachement obligatoire (ADC).
• Culture secondaire: Propagation d’une culture
primaire. Création d’une lignée cellulaire. Peut
être cultivé en suspension. Peut être indifférencié.
Durée de vie limitée (30-50 divisions).
• Lignée immortelle ou stable. Lignée cellulaire
transformée. Peut être cultivée en suspension.
Durée de vie illimitée.
Transformations
•
•
•
•
Naturelles
Chimiques
Virales
Dirigées
Différentes lignées
• MRC5, W138: secondaires, fibroblastes, poumons
humains, adhérentes, vaccins
• HeLa: cancer cervical humain (Helen La...), stable,
adhérentes, recherche
• CHO: ovaire de hamster chinois, stable,
adhérente/suspension, versatile
• Vero: reins de singe verts africains, stable, adhérente,
versatile
• Sf9, Spodoptera frugiperda, stable, système d’expression
baculovirus
• 293: embryon de rein humain, transformée par fragment
d’adénovirus, stable, hôte d’adénovirus, adaptée à la
suspension (293S)
Exemple: l’historique de la mise
en culture des 293
Graham, et al., J. Gen. Virol., 36:59-72, 1977
Caractéristiques générales
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Capable d’exocytose
Ne sécrète pas d’enzymes
Modifications post-traductionnelles
Introns/épissage (splicing)
Besoins nutritionnels complexes
Grande taille (10-20 m), pas de paroi
Sensible au contraintes hydrodynamiques
Temps de division lent (approx. 1 jour)
Densité cellulaire faible
Modification post-traductionnelle
•
•
•
•
•
Clivage
Pont S
méthylation, phosphorylation, glycosylation
conformation
ajout de ligands spécifiques (lipid anchor)
Glycosylation
Introns/Exons, Epissage (splicing)
Pourquoi?
• Pour l’étude
• Pour la production:
– Vaccins
– Protéines thérapeutiques
• anticorps
• agents immunologiques
• Hormones
– Tissus
– Vecteurs viraux
– Cellules souches
34% des nouveaux médicaments sont produits
en culture de cellules de mammifères
35%
34%
30%
25%
21%
22%
20%
%
15%
12%
12%
10%
5%
0%
Cell. Mam.
Microbe
Vaccins
Extr/Synthèse
Thérapie
génique
% de médicaments approuvés ou en essais cliniques en 2000 (Odum, Pharma. Eng., 2001)
Les anticorps
Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire pour réagir avec
un antigène donné. Ce sont des molécules de 150kDa, composées de 2 paires de
polypeptides, l’une de 25kD (chaîne courte, domaine variable), l’autre de 50 kDa
(chaîne longue, domaine constant). La chaîne courte est responsable de la spécificité de
l’anticorps pour son antigène
Production d’anticorps monoclonaux
MAb
Anticorps monoclonaux - applications
• 37% des nouvelles molécules thérapeutiques
biologiques
• Identification/diagnostic
• Thérapeutique:
– Contre cancer, Crohn, Asthme, SIDA, etc.
– Dirigés contre une protéine spécifique, ils peuvent
bloquer une interaction récepteur-ligand ou déclencher
une réponse immunitaire.
– Ils peuvent aussi être liés à un agent
chemothérapeutique, radioactif ou autre pour augmenter
leur effet.
Autres protéines
• Erythropoïétine (EPO, traitement de
l’anémie)
• Hormones de croissance:
– Transforming Growth Factor (TGF)
– Epidermal Growth Factor (EGF)
– Nerve Growth Factor (NGF)
• Anovulants
• Cytokines (Interleukine, interféron, etc)
• Agents coagulants (Facteur viii), anticoagulants, etc
Interleukin 4
Exemple: Agent anti-angiogénétique
(Laboratoires Aeterna)
Le processus de l’angiogénèse, soit la formation de nouveaux
vaisseaux, joue un rôle important dans le développement de la
tumeur cancéreuse. Certains agents peuvent inhiber ce
processus. Les agents isolés par Aeterna proviennent de l’aileron
de requin. La prochaine étape consiste à isoler les gènes
responsables de la synthèse de ces agents et de les cloner dans des
cellules animales.
Production de vaccins
Influenza
Herpes
Adenovirus
Thérapie génique
Maladies traitées
Vecteurs utilisés
Rétrovirus
Adénovirus
La thérapie génique consiste à traiter une maladie par le transfert de matériel
génétique. Les virus sont particulièrement bien adaptés pour accomplir cette tâche.
Culture de tissus
• Cellules de peau (Hopital du SaintSacrement, Laboratoire d'organogénèse
expérimentale)
• Reconstruction de la moëlle épinière
(Organogel inc.)
• Organes (foie, cœur, cerveau, etc)
• Cellules souches
Comment?
Caractéristiques générales
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Capable d’exocytose
Ne sécrète pas d’enzymes
Modifications post-traductionnelles
Introns/épissage (splicing)
Besoins nutritionnels complexes
Grande taille (10-20 m), pas de paroi
Sensible au contraintes hydrodynamiques
Temps de division lent (approx. 1 jour)
Densité cellulaire faible
Exemple de milieu de culture:
Dulbecco Modified Eagle medium (DMEM)
• Sels (mg/L)
–
–
–
–
–
–
–
CaCl2
Fe(NO3)3.9H2O
KCl
MgSO4
NaCl
NaHCO3
NaH2PO4.H2O
200.00
0.10
400.00
97.67
6400.00
3700.00
125.00
• Acides aminés (mg/L)
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
•
Arginine
Cystine.2HCl
Glutamine
Glycine
Histidine
Isoleucine
Leucine
Lysine.HCl
Méthionine
Phenylalanine
Sérine
+ mélange d'additifs non-définis
84.00
63.00
584.00
30.00
42.00
105.00
105.00
146.00
30.00
66.00
42.00
–
–
–
–
–
–
–
Méthionine
Phenylalanine
Serine
Thréonine
Tryptophane
Tyrosine.2Na.2H2O
Valine
30.00
66.00
42.00
95.00
16.00
104.00
94.00
• Vitamines (mg/L)
–
–
–
–
–
–
–
–
Ca.pantothénate
Chlorure de choline
Acide folique
Inositol
Niacinamide
Riboflavine
Thiamine.HCl
Pyridoxine.HCl
4.00
4.00
4.00
7.20
4.00
0.40
4.00
4.00
• Autres (mg/L)
–
–
–
Glucose
Rouge de phénol
Na.Pyruvate
4500.00
15.00
110.00
Sensibilité aux contraintes
hydrodynamiques
= problème d’oxygénation ou d’agitation
•Pourtant les besoins en O2 des cellules animales ne sont pas si
élevés
X (densité
cellulaire)
Bactéries
5-50 gMS/L
Cellules
animales
1-50 E6
cells/mL
QO2 (taux de
Oxygen
respiration
respiration rate
spécifique)
(OUR, mM/L)
0.01
50-500
mole/(gMS.h)
10-20 E-14
mole/(cell.h)
0.1-10
Les cellules animales ne supportent que de très petites
contraintes hydrodynamiques, ce qui fait en sorte que toutes
sorte d’indice de sévérité de l’agitation on été proposés:
  Di
ISF 
DT  Di
Integrated Shear Factor (Sinskey)
DE  ( 3 / Ps)1/ 4
Taille du plus petit tourbillon (Théorie de Kolmogoroff)
U E  (  Ps)1/ 4
Vitesse du plus petit tourbillon
CE  K ( Ps   3 ) 3/ 4
Concentration en plus petit tourbillon
TCS: Turbulent collision severity (Cherry et Papoutsakis)
ICS:
Impeller collision severity
Plusieurs géométries de bioréacteurs ont été
proposées:
• différentes formes d’agitateur
– marine
– ruban hélicoïdal
– «voiles»
•
•
•
•
gazosyphon
lits fluidisés
transfert de gaz par tube de silicone
enrichissement en oxygène
Agitateur «voiles»
Lit fluidisé
Division lente, faible densité
• Facilement contaminable
– une bactérie prendra facilement le dessus
– Nécessite des conditions d'asepsie très strictes
• Faible rendement en produit
– produit à haute valeur ajoutée
– produit qui ne peut être synthétisé dans d’autres
systèmes d ’expression
– Recherche de moyens pour augmenter la
densité cellulaire...
Au niveau cellulaire: le mécanisme de débordement
glutamine
NH3
GLUCOSE
OU
glucose
PYRUVATE
lactate
pyruvate
glutamate
TCA cycle,
resp. chain
GLUTAMATE
NH3
GLUTAMINE
-Ljunggren and Haggstrom, Biotechnol. Bioeng., 44: 808-818, 1994 (Hybridoma)
Au niveau du procédé
• L’optimisation du milieu prend du temps,
mais permet de faire de grandes économies
• La cuvée alimentée peut permettre
d’augmenter la densité cellulaire dans le cas
d’un substrat inhibiteur ou d’un produit
inhibiteur dont la production dépend de la
concentration en substrat.
• Le chemostat ou la perfusion vont permettre
une augmentation de la densité cellulaire et
de la productivité, mais avec un coût plus
élevé en milieu de culture
Au niveau du bioréacteur
–
–
–
–
Microporteurs (poreux ou non)
Micro-capsules
Fibres creuses
Rétention des cellules (perfusion):
• Spin-filters (intra ou extra bioréacteur)
• centrifugeuse en continu
• Sonosep
Microporteurs
Exemple: Un filtre rotatif intra- bioréacteur, combiné à un aérateur
Fibres creuses
Centrifugeuse en continu
Sonosep: séparation acoustique
Sortie
Entrée
Vidange
Conclusion
• La culture de cellules animales est coûteuse
et complexe.
• Elle ne doit être utilisée que pour produire
des molécules qui ne peuvent être obtenues
autrement.
• Elle permet alors de synthétiser des produits
à très haute valeur ajoutée
Téléchargement
Random flashcards
Commune de paris

0 Cartes Edune

Le lapin

5 Cartes Christine Tourangeau

aaaaaaaaaaaaaaaa

4 Cartes Beniani Ilyes

découpe grammaticale

0 Cartes Beniani Ilyes

relation publique

2 Cartes djouad hanane

Créer des cartes mémoire