Aucun titre de diapositive - Département de génie chimique
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La culture de cellules animales, quosse ça donne? Alain Garnier, Université Laval Plan • La culture de cellules animales: – Qu’est-ce? – Pourquoi? – Comment? Qu’est-ce? • • • • Différentes sources Différents types techniques de transformation Caractéristiques générales Sources • • • • Insectes Poissons Mammifères Humains Formes/tissus • • • • • • • Épithéliales/endothéliales (membranes) Fibroblastes (tissus connectifs) Myoblastes (muscles) Neurones (syst. nerveux) Hepatocytes (foie) Erythrocytes (sang) Lymphocytes (syst. immunitaire) Formes... Types • Culture primaire: Culture initiale de cellules qui viennent d’être prélevées d’un tissu. Différenciée. Généralement à attachement obligatoire (ADC). • Culture secondaire: Propagation d’une culture primaire. Création d’une lignée cellulaire. Peut être cultivé en suspension. Peut être indifférencié. Durée de vie limitée (30-50 divisions). • Lignée immortelle ou stable. Lignée cellulaire transformée. Peut être cultivée en suspension. Durée de vie illimitée. Transformations • • • • Naturelles Chimiques Virales Dirigées Différentes lignées • MRC5, W138: secondaires, fibroblastes, poumons humains, adhérentes, vaccins • HeLa: cancer cervical humain (Helen La...), stable, adhérentes, recherche • CHO: ovaire de hamster chinois, stable, adhérente/suspension, versatile • Vero: reins de singe verts africains, stable, adhérente, versatile • Sf9, Spodoptera frugiperda, stable, système d’expression baculovirus • 293: embryon de rein humain, transformée par fragment d’adénovirus, stable, hôte d’adénovirus, adaptée à la suspension (293S) Exemple: l’historique de la mise en culture des 293 Graham, et al., J. Gen. Virol., 36:59-72, 1977 Caractéristiques générales • • • • • • • • • Capable d’exocytose Ne sécrète pas d’enzymes Modifications post-traductionnelles Introns/épissage (splicing) Besoins nutritionnels complexes Grande taille (10-20 m), pas de paroi Sensible au contraintes hydrodynamiques Temps de division lent (approx. 1 jour) Densité cellulaire faible Modification post-traductionnelle • • • • • Clivage Pont S méthylation, phosphorylation, glycosylation conformation ajout de ligands spécifiques (lipid anchor) Glycosylation Introns/Exons, Epissage (splicing) Pourquoi? • Pour l’étude • Pour la production: – Vaccins – Protéines thérapeutiques • anticorps • agents immunologiques • Hormones – Tissus – Vecteurs viraux – Cellules souches 34% des nouveaux médicaments sont produits en culture de cellules de mammifères 35% 34% 30% 25% 21% 22% 20% % 15% 12% 12% 10% 5% 0% Cell. Mam. Microbe Vaccins Extr/Synthèse Thérapie génique % de médicaments approuvés ou en essais cliniques en 2000 (Odum, Pharma. Eng., 2001) Les anticorps Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire pour réagir avec un antigène donné. Ce sont des molécules de 150kDa, composées de 2 paires de polypeptides, l’une de 25kD (chaîne courte, domaine variable), l’autre de 50 kDa (chaîne longue, domaine constant). La chaîne courte est responsable de la spécificité de l’anticorps pour son antigène Production d’anticorps monoclonaux MAb Anticorps monoclonaux - applications • 37% des nouvelles molécules thérapeutiques biologiques • Identification/diagnostic • Thérapeutique: – Contre cancer, Crohn, Asthme, SIDA, etc. – Dirigés contre une protéine spécifique, ils peuvent bloquer une interaction récepteur-ligand ou déclencher une réponse immunitaire. – Ils peuvent aussi être liés à un agent chemothérapeutique, radioactif ou autre pour augmenter leur effet. Autres protéines • Erythropoïétine (EPO, traitement de l’anémie) • Hormones de croissance: – Transforming Growth Factor (TGF) – Epidermal Growth Factor (EGF) – Nerve Growth Factor (NGF) • Anovulants • Cytokines (Interleukine, interféron, etc) • Agents coagulants (Facteur viii), anticoagulants, etc Interleukin 4 Exemple: Agent anti-angiogénétique (Laboratoires Aeterna) Le processus de l’angiogénèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux, joue un rôle important dans le développement de la tumeur cancéreuse. Certains agents peuvent inhiber ce processus. Les agents isolés par Aeterna proviennent de l’aileron de requin. La prochaine étape consiste à isoler les gènes responsables de la synthèse de ces agents et de les cloner dans des cellules animales. Production de vaccins Influenza Herpes Adenovirus Thérapie génique Maladies traitées Vecteurs utilisés Rétrovirus Adénovirus La thérapie génique consiste à traiter une maladie par le transfert de matériel génétique. Les virus sont particulièrement bien adaptés pour accomplir cette tâche. Culture de tissus • Cellules de peau (Hopital du SaintSacrement, Laboratoire d'organogénèse expérimentale) • Reconstruction de la moëlle épinière (Organogel inc.) • Organes (foie, cœur, cerveau, etc) • Cellules souches Comment? Caractéristiques générales – – – – – – – – – Capable d’exocytose Ne sécrète pas d’enzymes Modifications post-traductionnelles Introns/épissage (splicing) Besoins nutritionnels complexes Grande taille (10-20 m), pas de paroi Sensible au contraintes hydrodynamiques Temps de division lent (approx. 1 jour) Densité cellulaire faible Exemple de milieu de culture: Dulbecco Modified Eagle medium (DMEM) • Sels (mg/L) – – – – – – – CaCl2 Fe(NO3)3.9H2O KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4.H2O 200.00 0.10 400.00 97.67 6400.00 3700.00 125.00 • Acides aminés (mg/L) – – – – – – – – – – – • Arginine Cystine.2HCl Glutamine Glycine Histidine Isoleucine Leucine Lysine.HCl Méthionine Phenylalanine Sérine + mélange d'additifs non-définis 84.00 63.00 584.00 30.00 42.00 105.00 105.00 146.00 30.00 66.00 42.00 – – – – – – – Méthionine Phenylalanine Serine Thréonine Tryptophane Tyrosine.2Na.2H2O Valine 30.00 66.00 42.00 95.00 16.00 104.00 94.00 • Vitamines (mg/L) – – – – – – – – Ca.pantothénate Chlorure de choline Acide folique Inositol Niacinamide Riboflavine Thiamine.HCl Pyridoxine.HCl 4.00 4.00 4.00 7.20 4.00 0.40 4.00 4.00 • Autres (mg/L) – – – Glucose Rouge de phénol Na.Pyruvate 4500.00 15.00 110.00 Sensibilité aux contraintes hydrodynamiques = problème d’oxygénation ou d’agitation •Pourtant les besoins en O2 des cellules animales ne sont pas si élevés X (densité cellulaire) Bactéries 5-50 gMS/L Cellules animales 1-50 E6 cells/mL QO2 (taux de Oxygen respiration respiration rate spécifique) (OUR, mM/L) 0.01 50-500 mole/(gMS.h) 10-20 E-14 mole/(cell.h) 0.1-10 Les cellules animales ne supportent que de très petites contraintes hydrodynamiques, ce qui fait en sorte que toutes sorte d’indice de sévérité de l’agitation on été proposés: Di ISF DT Di Integrated Shear Factor (Sinskey) DE ( 3 / Ps)1/ 4 Taille du plus petit tourbillon (Théorie de Kolmogoroff) U E ( Ps)1/ 4 Vitesse du plus petit tourbillon CE K ( Ps 3 ) 3/ 4 Concentration en plus petit tourbillon TCS: Turbulent collision severity (Cherry et Papoutsakis) ICS: Impeller collision severity Plusieurs géométries de bioréacteurs ont été proposées: • différentes formes d’agitateur – marine – ruban hélicoïdal – «voiles» • • • • gazosyphon lits fluidisés transfert de gaz par tube de silicone enrichissement en oxygène Agitateur «voiles» Lit fluidisé Division lente, faible densité • Facilement contaminable – une bactérie prendra facilement le dessus – Nécessite des conditions d'asepsie très strictes • Faible rendement en produit – produit à haute valeur ajoutée – produit qui ne peut être synthétisé dans d’autres systèmes d ’expression – Recherche de moyens pour augmenter la densité cellulaire... Au niveau cellulaire: le mécanisme de débordement glutamine NH3 GLUCOSE OU glucose PYRUVATE lactate pyruvate glutamate TCA cycle, resp. chain GLUTAMATE NH3 GLUTAMINE -Ljunggren and Haggstrom, Biotechnol. Bioeng., 44: 808-818, 1994 (Hybridoma) Au niveau du procédé • L’optimisation du milieu prend du temps, mais permet de faire de grandes économies • La cuvée alimentée peut permettre d’augmenter la densité cellulaire dans le cas d’un substrat inhibiteur ou d’un produit inhibiteur dont la production dépend de la concentration en substrat. • Le chemostat ou la perfusion vont permettre une augmentation de la densité cellulaire et de la productivité, mais avec un coût plus élevé en milieu de culture Au niveau du bioréacteur – – – – Microporteurs (poreux ou non) Micro-capsules Fibres creuses Rétention des cellules (perfusion): • Spin-filters (intra ou extra bioréacteur) • centrifugeuse en continu • Sonosep Microporteurs Exemple: Un filtre rotatif intra- bioréacteur, combiné à un aérateur Fibres creuses Centrifugeuse en continu Sonosep: séparation acoustique Sortie Entrée Vidange Conclusion • La culture de cellules animales est coûteuse et complexe. • Elle ne doit être utilisée que pour produire des molécules qui ne peuvent être obtenues autrement. • Elle permet alors de synthétiser des produits à très haute valeur ajoutée
