ephe_dip_sturny-leclere_2012.p

ETUDE DES SIGNAUX MACROPHAGIQUES
CELLULAIRES EN R´ EPONSE ` A L’INFECTION PAR
DIFF´ ERENTES SOUCHES CLINIQUES DE
CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS
Aude Sturny-Lecl`ere
To cite this version:
Aude Sturny-Lecl`ere. ETUDE DES SIGNAUX MACROPHAGIQUES CELLULAIRES EN
R´ EPONSE ` A L’INFECTION PAR DIFF´ ERENTES SOUCHES CLINIQUES DE CRYPTO-
COCCUS NEOFORMANS. Biologie cellulaire. 2012. <hal-01472831>
HAL Id: hal-01472831
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Sciences'de'la'Vie'et'de'la'Terre'
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MÉMOIRE'
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Sturny'Leclère'Aude'
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RÉPONSE'À'L’INFECTION'PAR'DIFFÉRENTES'SOUCHES'
CLINIQUES'DE'CRYPTOCOCCUS)NEOFORMANS'
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Sciences'de'la'Vie'et'de'la'Terre'
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ETUDE'DES'SIGNAUX'MACROPHAGIQUES'CELLULAIRES'EN'RÉPONSE'À'
L’INFECTION'PAR'DIFFÉRENTES'SOUCHES'CLINIQUES'DE'
CRYPTOCOCCUS)NEOFORMANS'
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RÉSUMÉ'
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Cryptococcus neoformans est une levure capsulée responsable d’infections opportunistes chez
les patients présentant un déficit immunitaire et plus particulièrement chez ceux atteints du
syndrome de l'immunodéficience acquise (SIDA). <&! X-/K*! H&! 0H)F! ./&P*! +*! H&!
L/R0G-L-LL-F*!*FG!)'*!KE'2'.-Y*'LE01&H2G*!()2!/*FG*!K-/G*HH*!+&'F!MOi!+*F!L&F!K&H./E!
)'!G/&2G*K*'G!&'G2X-'.2()*!&+&0GES!<&!L-'G&K2'&G2-'!+-''*!H2*)!j!)'*!0/2K-Y2'X*LG2-'!
0)HK-'&2/*S!<*F!K&L/-01&.*F!&HPE-H&2/*F!F-'G!H&!0/*K2e/*!L2IH*!+)! 0&G1-.e'*! *G!P-'G!
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H=-/L1*FG/&G2-'! +=)'*! /E0-'F*! 2KK)'2G&2/*! *XX2L&L*S! ALG)*HH*K*'Gg! +*! '-KI/*)F*F!
+-''E*F!F-'G!+2F0-'2IH*F!F)/!H&!P2/)H*'L*!+*!C.#neoformansS!"'!/*P&'L1*g!H&!/E0-'F*!+*F!
K&L/-01&.*F!j!H=2'X*LG2-'!0&/!H&!H*P)/*!/*FG*!*'L-/*!j!&00/-X-'+2/S!<*F!+-''E*F!0)IH2E*F!
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RESUME'.............................................................................................................................................................'2!
INTRODUCTION'..............................................................................................................................................'4!
7S!B:n#5CBCBB?3!8"CVC:,A83!T!<"!B$A,#7>8C8!SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS!_!
I.1.#Généralités#.................................................................................................................................................................#5!
I.2.#Répartition#géographique#et#habitats#...........................................................................................................#5!
I.3.#Facteurs#de#virulence#............................................................................................................................................#6!
77S!!<A!B:n#5CBCBBC3"!SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS!a!
II.1.#Epidémiologie#.........................................................................................................................................................#7!
II.2.#Clinique/Pronostic#................................................................................................................................................#8!
II.3.#Physiopathologie#...................................................................................................................................................#9!
777S!<A!:"#C83"!7,,?875A7:"!SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS!6O!
III.1.#Immunité#innée#..................................................................................................................................................#10!
III.2.#Immunité#adaptative#.......................................................................................................................................#14!
III.2.A.#Réponse#immunitaire#à#médiation#cellulaire#....................................................................................#14!
III.2.B.#Réponse#immunitaire#à#médiation#humorale#...................................................................................#15!
III.2.C.#Les#cytokiniques#et#les#chimiokines#........................................................................................................#16!
74S!:"#C83"!7,,?875A7:"!A!<=78V"B57C8!#A:!C.#NEOFORMANS!SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS!6a!
IV.1.#La#réponse#immunitaire#innée#.....................................................................................................................#18!
IV.2.#La#réponse#immunitaire#adaptatrice#........................................................................................................#20!
4S!C?57<3!;="5?;"3!SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS!M6!
V.1.#Les#modèles#d’études#de#la#réponse#immunitaire#..................................................................................#21!
V.2.#Etude#de#l’expression#par#PCR#en#temps#réel#...........................................................................................#25!
47S!#:C%<",A57D?"!"5?;7""!"5!C%N"B57V3!SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS!!
MATERIEL'............................................................................................................................................................''
&'METHODES'......................................................................................................................................................'!
7S!3C?B$"3!;"!C.#NEOFORMANS!SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS!!
I.1.#Origine#............................................................................................................................................................................##
I.2.#Repiquage,#stockage#.................................................................................................................................................##
I.3.#Préculture#et#préparation#des#levures#avant#contact#avec#les#macrophages#.................................##
II.#Matériel#et#culture#cellulaire#..................................................................................................................................##
II.1.#Source#............................................................................................................................................................................#!
II.2.#Entretien#......................................................................................................................................................................#!
II.3.#Préparation#avant#contact#avec#les#levures#.................................................................................................#!
777S!,C;"<"!;=785":AB57C8!,AB:C#$A>"3kC.#NEOFORMANS!SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS!!
III.1.#Anticorps#monoclonal#IgG1#E1#.........................................................................................................................##
III.2.#Interaction#macrophages/C.#neoformans#...................................................................................................##
III.3.#Optimisation#du#modèle#......................................................................................................................................#!
74S!#:"#A:A57C8!;"3!A:8!SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS!!
IV.1.#Protocole#d’extraction#d’ARN#............................................................................................................................##
IV.2.#Traitement#DNase#..................................................................................................................................................#!
IV.3.#Synthèse#de#cDNA#...................................................................................................................................................#!
4S!#B:!D?A8575A574"!SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS!!
V.1.#Light#Cycler#480#II#Roche#......................................................................................................................................#!
V.2.#Dessin#des#amorces#..................................................................................................................................................#!
V.3.#Protocole#d’amplification#par#PCR#...................................................................................................................#!
V.4.#Mise#au#point#du#protocole#de#qPCR#................................................................................................................#!
V.5.#Critères#d’analyse#des#données#générées#par#qPCR#...................................................................................##
V.6.#Électrophorèse#...........................................................................................................................................................#!
V.7.#Mise#au#point#des#courbes#standards#de#référence#....................................................................................#!
V.8.#Détails#de#la#méthode#de#calcul#de#quantification#relative#par#le# ΔΔ dt#...........................................#!
RESULTATS'.........................................................................................................................................................'!
7S!C#57,73A57C8!;?!,C;"<"!B"<<?<A7:"!"o#":7,"85A<!SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS!!

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77S!C#57,73A57C8!;"3!#:C5CBC<"3!;"!D?A857V7BA57C8!;"!<="o#:"337C8!SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS!!
II.1#Mise#au#point#et#validation#du#protocole#d’extraction#d’ARN#...............................................................##
II.2.#Intérêt#du#traitement#à#la#DNase#..#II.3#Mise#au#point#et#validation#du#protocole#de#synthèse#
de#ADNcII.4.#Mise#au#point#du#protocole#de#PCR,#validation#des#couples#d’amorces#et#validation#
des#critères#d’analyse#:#Exemple#pour#le#gène#de#la# β ^Actine#.........................................................................#!
II.5.#Validation#des#courbes#standard#de#référence#pour#tous#les#gènes#cibles#:#Exemple#pour#le#
gène#de#l’IL^6#.......................................................................................................................................................................##
II.6.#Démarche#de#reproductibilité#des#courbes#standard#...............................................................................#!
777S!A8A<n3"!;="o#:"337C8!;"3!>"8"3!SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS!!
III.1.#Validation#de#la#méthode#de#quantification#et#du#système#..................................................................#!
III.2.#Résultats#du#niveau#d’expression#des#gènes#sur#une#cinétique#précoce#..........................................#!
III.3.#Résultats#d’expression#des#gènes#liées#aux#conditions#d’opsonisation#............................................##
par#E1#.....................................................................................................................................................................................#!
DISCUSSION'........................................................................................................................................................'!
&'PERSPECTIVES'...............................................................................................................................................'!
BIBLIOGRAPHIE'................................................................................................................................................'!
ANNEXES'..............................................................................................................................................................'!
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BIBLIOGRAPHIE'...........................................................................................................................................'32!
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