3) Electroporation!
!
On met des cellules dans une cuvette avec de part et d'autre deux électrodes et on va
exercer choc électrique très rapide, de l'ordre de la milliseconde, et très fort pour que la
membrane se perméabilise de manière transitoire pour ne pas que la cellule explose mais
par contre elle fait entrer le matériel à l'intérieur. On casse la membrane très rapidement
mais de façons tellement transitoire que normalement la cellule n'a pas le temps
d'exploser.!
Le problème est qu'il faut régler 3 paramètres, le temps de permeabilisation, la densité du
champ électrique et la résistance. Beaucoup de cellules meurent durant ce traitement.!
On se sert de cette technique quand on n'a plus d'espoir.!
Pour certains types cellulaires, des appareillages spécifiques avec des milieux tampon
spécifique des cellules permettent un bon résultat pour ces lignées.!
!
4) Efficacité de transfection!
!
Nombre de cellules transfectées versus le nombre de cellules dans le,flacon de culture.!
Ça correspond au nombre de cellules qui ont été transfectées.!
Ca peut être extrêmement variable en fonction de du milieu qu'on utilise (de 0 à 95% de
cellules transfectées). Certains types cellulaires sont intransfectables, personne n'a mis au
point le protocole qui permet de les transfecter. !
!
•Comment l'évaluer? On se sert de gènes rapporteurs.!
On transfecte les cellules avec de la beta-galactosidase puis on révèle par le X-Gal. Ca ne
s'utilise plus trop mais on le voit encore dans certains papier. !
Le plus pratique est d'utiliser la cytometrie en flux et donc la fluorescence, on transfecte
les cellules avec de la GFP et on passe directement les cellules en cytométrie en flux
(sans marquage puisque les cellules sont déjà fluorescentes) qui va nous donner le
pourcentage de cellules transfectées. !
Quand on a une nouvelle lignée c'est essentielle de tester les conditions de transfection.!
!
•Transfection transitoire : !
Analyse de l'expression au bout de 24 a 48 heures. Le plasmide est dans le noyau mais il
n'est pas encore intégré au chromosome mais il peut être transcrit. Cependant puisqu'il
n'est pas intégré il peut être perdu au cours des divisions cellulaires.!
!
•Expression stable: !
On transfecte avec un plasmide qui comporte un gène de résistance a un antibiotique et
on va mettre les cellules,en sélection dans cet antibiotique. En général on utilise la
neomycine. On met les cellules pendant 2-3 semaines dans le milieu qui comporte
l'antibiotique et seules les cellules qui vont exprimer le plasmide de façon stable vont
pousser dans ce milieu la. Il y a plein de cellules qui vont perdre le plasmide, il y a entre 1
et 10% de cellules qui vont être capable d'intégrer ce morceau de plasmide dans le
chromosome et ce sont celles la qu'on veut sélectionner. En milieu de sélection, sur le
long terme, celles qui n'ont pas intégrer le plasmide vont mourir mais celles qui ont intégré
le plasmide vont se maintenir. Ça va faire des cellules qui vont exprimer le plasmide de
façon stable. !
L'intérêt est que normalement toutes les cellules transfectées expriment le gène qu'on a
intégré. !
!