cours_transfection_060306 Marie B
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TP master 1 Transfection La transfection des cellules eucaryotes Définition et Principe Transfert de gènes (ADNc) codant pour une protéine dans une cellule = protéine exogène Transfection Infection (méthode virale) Surexpression de cette protéine grâce à la machinerie cellulaire (transcription/traduction) ADN protéine exogène (1) Etude à partir de lysat protéique (activité enzymatique) (2) Etude in situ ARN ribosomes Une cellule eucaryote Techniques Réactifs chimiques - Calcium phosphate - DEAE-dextran - Liposomes artificiels Méthodes physiques - Microinjection directe (dans la cellule ou le noyau) : animaux transgéniques - Electroporation (perturbation de la membrane par un choc électrique) - Propulsion de microprojectiles contenant de l’ADN (in vivo) : plantes Utilisation de particules virales - Rétrovirus - Adénovirus - Particules virales non infectieuses Réactifs chimiques DEAE-dextran 1965 par Vaheri et Pagano Technique classique, in vitro DEAE-dextran = polymère cationique Association avec les acides nucléiques chargés négativement Endocytose cytoplasme noyau Réactifs chimiques Calcium phosphate 1973 par Graham et van der Eb Technique classique et bon marché, in vitro Mise en contact de l’ADN avec du chlorure de calcium dans un tampon phosphate Formation d’un précipité entre le calcium et l’ADN Précipité dans la cellule par endocytose ou phagocytose Réactifs chimiques Liposomes artificiels 1980 par Fraley et co. Efficacité de transfection in vitro et in vivo , fragments d’ADN , types cellulaires , Liposomes = lipides cationiques (+ lipides neutres) Réaction avec les acides nucléiques chargés négativement Compaction de l’ADN = complexe liposomes-ADN Endocytose cytoplasme noyau Applications (in vitro) 1. Surexpression de protéines absentes dans un type cellulaire donné : 1.1. - sa fonction Promoteur du vecteur ADNc codant pour la protéine - sa localisation in situ - son interaction avec d’autres protéines de la cellule ou une autre protéine transfectée (co-transfection avec 2 plasmides) 1.2. - Etude de l’activité d’un promoteur et sa régulation in situ Promoteur à étudier Gène rapporteur 1.3. - Elaborer une lignée cellulaire immortelle protéine exogène = Antigène T du virus SV40 -… Promoteur du vecteur ADNc codant pour l’Ag T 2. Modifier un gène existant / inhiber l’expression d’un gène existant Surexpression de protéines : Mise en évidence ADN protéine exogène Etude in situ ARN ribosomes • Transfection d’un ADNc codant pour une protéine non modifiée - Détection par immunocytochimie ou par Western blot • Transfection d’une construction possédant l’ADNc d’intérêt et une étiquette (« tag ») = Protéine de fusion ADNc tag - GFP (Green Fluorescent Protein) - HA, flag, c-myc … (anticorps) protéine de fusion Etude de l’activité d’un promoteur : Mise en évidence promoteur gène rapporteur galactosidase lysat protéique ADN protéine exogène activité enzymatique b galactosidase Mesure quantitative ARN in situ galactosidase ribosomes b-galactosidase (spectrophotomètre) Luciférase (luminescence) • Effet de facteurs endogènes (facteurs de transcription) • Effet de facteurs exogènes sur l’activité du promoteur - facteurs de croissance ajoutés dans le milieu de culture - transfection avec une 2ème construction codant pour une protéine pouvant réguler le promoteur étudié = co-transfection Préparation de l’ADN à transfecter • Réalisation de constructions plasmidiques : vecteur + ADNc/promoteur-gène rapporteur • ETUDE Vecteur commum d’expression catégorie de vecteurs à utiliser Plasmide GFPtag Plasmide activité promotrice Vecteur commum d’expression Promega Plasmide GFPtag ou étiquette GFP Promega Plasmide permettant d’étudier l’activité d’un site spécifique d’un promoteur Clontech Deux approches Transfection transitoire - Analyse de la transfection à 24-72 h -Perte du plasmide en quelques jours Transfection stable -Transfection à long terme - L’ADN est généralement intégré au niveau chromosomique - Isolation des clones cellulaires par dilutions limites (clonage cellulaire) -Criblage par résistance à un antibiotique des clones possédant l’ADN transfecté (néomycine, hygromycine, …) - 3-4 semaines Travaux pratiques de Master BCPP BUT : Transfecter des cellules COS avec des constructions plasmidiques contenant différents ADNc Technique des liposomes Plasmide 1 Plasmide 2 Plasmide 3 Protéine X-GFP Protéine Z-HA b galactosidase Immunocytofluorescence Réaction enzymatique colorimétrique Fluorescence directe Plasmide 1 ADN Protéine X-GFP Fluorescence directe (vert) * X-GFP Immunocytofluorescence Plasmide 2 *(2) ADN Z-HA (1) Protéine Z-HA (1) Anticorps de souris anti-protéine HA (anticorps primaire) Immunocytofluorescence (2) Anticorps de chèvre anti-IgG de souris * conjugué à la rhodamine (TRITC) (anticorps secondaire) Avantages Plasmide 3 b Galactosidase (1) Mise en évidence facile et rapide (2) Mesure quantitative (in situ) : nombre de cellules bleues / population totale (3) Mesure qualitative (dosage colorimétrique : Luciférase) Rôle de ce type de construction Réaction enzymatique colorimétrique (cellules bleues) Substrat de l’enzyme = X-gal (1) Vérifier que le type cellulaire utilisé peut être transfecté (2) Mesurer une efficacité de transfection Plasmide 1 + 2 Protéine Z - HA + Protéine X - GFP Localisation de 2 protéines au niveau d’une même cellule Besoin de 2 fluorochomes Mise en évidence de la présence d’une cellule Marqueurs généraux = La cellule en entière ou des structures particulières • Noyaux (PI: iodure de propidium, DAPI, YOYO, …) • Filaments d’actine, cytosquelette (rhodamine-phalloïdine) • Marqueurs spécifiques du réticulum endoplasmique • Marqueurs membranaires
