par méthodes sandwich et compétition PARTIE B. Pyruvat

Concours « Agro-Véto »
AT - 0412
Technologie et techniques biologiques et biochimiques
Durée : 3 heures
Notes :
- L’usage d’une calculatrice, d’abaques et tables est interdit pour cette épreuve.
- Le sujet comprend de nombreuses questions indépendantes.
Si, au cours de l'épreuve, un candidat repère ce qui lui semble être une erreur d'énoncé, il le signale sur sa copie et
poursuit sa composition en expliquant les raisons des initiatives qu'il a été amené à prendre.
Chaque candidat est responsable de la vérification de son sujet d’épreuve : pagination et impression de chaque
page. Ce contrôle doit être fait en début d’épreuve.
En cas de doute, il doit alerter au plus tôt le chef de centre qui contrôlera et éventuellement remplacera son sujet.
PARTIE A. Dosages immunoenzymatiques en phases hétérogènes (ELISA)
par méthodes sandwich et compétition
(4 points)
Les deux méthodes seront présentées sous forme de schémas et de graphes légendés et
commentés. La réponse proposera différents systèmes de révélation. L'intérêt et les conditions des étapes
de lavage présentes dans les deux méthodes seront discutés avec soin.
La réponse devra être organisée. Le candidat devra apporter la plus grande rigueur à la rédaction.
PARTIE B. Pyruvates kinases et allostérie
(6 points)
Les pyruvate kinases (ATP:pyruvate 2-O-phosphotransferase, EC 2.7.1.40, PK) sont des enzymes
clés de la glycolyse et catalysent la réaction suivante :
phosphoenolpyruvate (PEP) + ADP = pyruvate + ATP
Le fructose-1,6-biphosphate est un effecteur de régulation des pyruvate kinases.
1 – Mesures de vitesses initiales de réactions pyruvate kinase (PK) grâce à un système de réactions
couplées
Les vitesses initiales de la réaction
PEP + ADP = pyruvate + ATP
catalysée par la PK sont mesurées selon le principe et le mode opératoire présenté dans le document n°1.
Des données concernant la lactate déshydrogénase sont proposées dans le document n°2.
1.1 A l'aide d'un schéma, représenter l'allure de la fonction absorbance = f(temps) lors de l'enregistrement
d'une cinétique pyruvate kinase.
Pour l’ensemble des questions suivantes, on suppose une vitesse initiale pyruvate kinase à mesurer
de 0,04 µmol.mL-1.min-1 (exprimée dans le milieu réactionnel).
1.2 Montrer que la réaction PK est effectivement limitante. Calculer la variation d'absorbance en min-1 qui
correspond à cette vitesse. On admettra une valeur de 6000 L.cm-1.mol-1 pour le coefficient d'absorbance
spécifique molaire du NADH.
1/4
T.S.V.P.
Document n°1. Mesures de vitesses initiales de réactions pyruvate kinase (PK)
Pour suivre les cinétiques pyruvate kinase on couple la réaction pyruvate kinase à la réduction du
pyruvate en lactate catalysée par la lactate déshydrogénase (LDH). Le NADH, qui absorbe fortement à
340 nm, est oxydé en NAD+ qui n'absorbe pas à cette longueur d'onde. L'enregistrement de l'absorbance
du système à 340 nm permet le suivi cinétique.
phosphoenolpyruvate (PEP) + ADP = pyruvate + ATP
(réaction principale catalysée par la PK)
pyruvate + NADH + H3O+ = lactate + NAD+ + H2O
(réaction indicatrice catalysée par la LDH)
Dans le système des deux réactions couplées, la réaction principale, en état de vitesse initiale, devra être
limitante de la réaction indicatrice.





Les milieux réactionnels ont la composition suivante :
tampon réactionnel Tris-HCl 50 mmol.L-1, 0,1 mol.L-1 KCl, 5 mmol.L-1 MgSO4 , pH 7,5 ;
substrats PEP et ADP aux concentrations souhaitées ;
NADH 0,20 mmol.L-1 ;
Lactate déshydrogénase (LDH) selon une quantité conduisant à une vitesse maximale de la
réaction indicatrice dans les conditions du milieu réactionnel de 20 µmol.mL-1.min-1 ;
volume réactionnel total de 1 mL, 37°C, démarrage de la réaction avec 20 µL de préparation
pyruvate kinase à mesurer ajoutés à 980 µL de mélange réactionnel, suivi cinétique en continu à
340 nm.
Document n°2. Données caractérisant le comportement cinétique de la lactate
deshydrogénase (LDH)
La lactate deshydrogénase (LDH) utilisée pour la réaction indicatrice est une LDH de muscle
squelettique de lapin. Le comportement est Michaélien selon un mécanisme bi-bi ordonné avec fixation
première du NADH puis fixation du pyruvate.
Le coefficient de Michaelis pour le pyruvate est Kp = 0,100 mmol.L-1
Le coefficient de Michaelis pour le NADH est KN = 0,010 mmol.L-1
Le coefficient de dissociation du couple LDH-NADH est KsN = 0,002 mmol.L-1
V max [ NADH ][ pyr ]
L'équation générale de cinétique est : v i = [ NADH ][ pyr ]+ [ NADH ] K + [ pyr ] K + K K
p
N
sN
p
qui peut s'écrire : vi =
Vmax

KN
(1+
)
 NADH 
 pyr 
(1 
Kp
K sN
 NADH 
équation dite équation « doc2 »
)
KN
(1 
)
 NADH 
+  pyr 
AT – 0412 Documents page 1/4
Document n°3. Cinétiques pyruvate kinase (PK) de E. Coli, PEP substrat variable, ADP
paramétrique
Pour l’ensemble des graphes :
- V désigne la vitesse initiale ;
- FBP désigne l'effecteur fructose-1,6biphosphate ;
- [PEP] désigne la concentration en PEP dans le
milieu réactionnel ;
- [ADP] la concentration fixe d'ADP dans le
milieu réactionnel (2 mmol.L-1).
Document n°4. Pyruvates kinases (PK) chez le rat
Les mammifères proposent plusieurs isoenzymes. Les PK sont des homotétramères. C'est
l'épissage alternatif exclusif de l'ARN pré-messager du gène M qui conduit aux 2 isoenzymes M1 et M2.
M1 et M2 diffèrent ainsi de 21 résidus aminoacyls sur le segment protéique allant du résidu 388 au résidu
432. Ce segment forme 2 hélices alpha engagées dans l'association des sous-unités en homotétramère.
Dans le document ci-dessous M2.WT désigne l'enzyme M2 de type sauvage et M2.C423L un mutant de
M2 pour lequel la cystéine en position 423 a été remplacée par une leucine.
Pour l’ensemble des graphe :
- en abscisse la concentration en
phosphoénolpyruvate (PEP) en
µmol.L-1 ;
- en ordonnée le rapport vitesse
initiale sur vitesse maximale
(v/Vmax) ;
- la concentration en ADP est fixe
à 2 mmol.L-1 ;
- chaque enzyme est étudiée en
présence ou non de l'effecteur
fructose-1,6-biphosphate (FBP) à
la concentration de 0,5 mmol.L-1.
Note : Les données du document n°2 sont adaptées -afin d'obtenir des calculs simples- de http://biochemifa.kikkoman.co.jp/products/rinsyou/pdf/61170_ldhp.pdf et R. A. Stinson and H. Gutfreund Transient-kinetic studies of pig muscle lactate dehydrogenase, Biochem J. 1971 January 121(2): 235–240 (dernière
page). Les données des documents n°1, 3 et 4 sont adaptées de Valentini, Chiarelli ...,The Allosteric Regulation of Pyruvate Kinase, The Journal of Biological
Chemistry, 2000 Vol. 275, No. 24 :18145–18152 et Ikeda, Noguchi, Allosteric Regulation of Pyruvate Kinase M2 Isozyme Involves a Cysteine Residue in the
Intersubunit Contact, The Journal of Biological Chemistry, 1998 Vol. 273 : 12227-12233.
AT – 0412 Documents page 2/4
Document n°5. Carte fonctionnelle du vecteur pLIC-NHis
Légende :
Ori : origine de réplication
Kan : gène de résistance à la kanamycine (phosphotransférase)
lacI : gène codant LacI
T7 : promoteur transcrit par l’ARN polymérase du phage T7
RBS : site de fixation du ribosome
ATG (M) = séquence codant la méthionine initiatrice
TGA = (*) = séquence d’un codon STOP.
Code à une lettre des acides aminés : H= histidine , M=méthionine, V=valine, D= acide aspartique,
E=acide glutamique, N= glutamine
D’après JOURNAL OF BIOMOLECULAR TECHNIQUES, VOLUME 20, ISSUE 5, DECEMBER 2009
Document n°6. Site de reconnaissante et de coupure de l'enzyme PmlI
5' CAC GTG 3'
3' GTG CAC 5'
AT – 0412 Documents page 3/4
Document n°7 : Préparation du vecteur LIC
Double traitement du vecteur pLIC-NHis par pmlI (1.) et l'ADN polymérase (2.) de T4 en
présence de dGTP.
Dans la figure ci-dessous, seule la partie du plasmide concernée par le traitement est représentée.
PmlI
M H H H H H H G
5’CATATGCACCATCATCATCATCACGTGGAAGTGGATAACTGAGATCC 3’
3’GTATACGTGGTAGTAGTAGTAGTGCACCTTCACCTATTGACTCTAGG 5’
1. PmlI
2. T4 DNA polymérase + dGTP
5’CATATG 3’
5’ GTGGAAGTGGATAACTGAGATCC 3’
3’GTATACGTGGTAGTAGTAGTAGTG 5’
3’ GACTCTAGG 5’
Document n°8 : ADN à insérer prêt pour le clonage
gène cible
H
H
H
H
H
H
G
5’CAC CAT CAT CAT CAT CAC GGT ATG NNN NNN C 3’
3’CCA TAC NNN NNN G CAC CTT CAC CTA TT 5’
Masse molaire de l'histidine : 155 g.mol-1.
Masse molaire de la glycine : 75 g.mol-1.
AT – 0412 Documents page 4/4
1.3 En utilisant les données du document n°2, expliquer pourquoi la concentration en NADH dans le
milieu réactionnel (0,2 mmol.L-1) peut être considérée comme quasi-saturante et pourquoi l'équation
dénommée « doc2 » de ce même document devient alors :
v i = V max
[ pyr ]
K p + [ pyr ]
équation 1.3
1.4 Déduire de l'équation 1.3 que la concentration en pyruvate dans le milieu réactionnel quand le
système des deux réactions couplées a atteint son état quasi-stationnaire dynamique est elle même quasistationnaire à la valeur d'environ 0,2 µmol. L-1.
2– Les pyruvate kinases (PK) enzymes allostériques
2.1 Analyser les données du document n°3 (PK de E. coli).
Le document n°4 propose une étude des PK chez le rat dont il existe plusieurs formes
isoenzymatiques, notamment les formes dites M1 et M2.
2.2 Définir le terme isoenzyme.
2.3 Analyser les résultats expérimentaux proposés par le document n°4.
En présence de l'inhibiteur L-phénylalanine, le mutant M2.C423L présente une cinétique de
vitesse initiale en fonction de la concentration en PEP allostérique (ADP paramétrique à 2 mmol.L-1).
2.4 Tracer l'allure de cette cinétique sur un graphe reprenant les 2 courbes du document n°4 obtenues
avec M2.C423L (avec et sans FBP).
2.5 Quel complément est ainsi apporté à l'analyse réalisée en 2.3.
PARTIE C. Technologie de l’ADN recombinant
(10 points)
Le clonage d’ADN consiste en l’introduction d’un fragment d’ADN d’intérêt dans un vecteur
plasmidique. Différentes stratégies sont disponibles. On se propose d’étudier l’une d’entre elles, une
méthode de clonage sans étape de ligation, étape le plus souvent limitante. Cette méthode (dite LIC pour
Ligation Independant Cloning) n’utilise pas la stratégie classique impliquant enzymes de restriction et
ligase mais repose principalement sur l’utilisation des activités catalytiques des ADN polymérases.
1 - Activités des ADN polymérases
1.1 En plus de la réplication, les ADN polymérases sont impliquées dans un autre phénomène
physiologique, donner son nom et préciser son intérêt pour la cellule.
1.2 Les ADN polymérases portent trois activités : une activité polymérase et deux activités de type
exonucléase. Donner le rôle de chacune d’elles dans le processus de réplication.
1.3 Justifier en présentant la réaction chimique de polymérisation, le sens d'allongement du brin d'ADN.
1.4 Décrire à l’aide d’un schéma simple l’activité enzymatique exonucléasique 3’ à 5’ des ADN
polymérases.
2/4
Comme toutes les méthodes de clonage, la technologie LIC implique la préparation d’un vecteur
et de l’ADN à insérer. La méthode décrite permet l’insertion d’un cadre ouvert de lecture ou ORF (Open
Reading Frame) dans un vecteur d’expression procaryote permettant la synthèse de la protéine d’intérêt
fusionnée avec un peptide composé de 6 histidines.
Le document n°5 montre la carte du plasmide pLIC-NHis.
2 - Préparation du plasmide pLIC-NHis
Le vecteur pLIC-Nhis est digéré par une enzyme de restriction PmlI puis traité par l’ADN
polymérase du phage T4 en présence de dGTP. Le site de clivage de l’enzyme est donné dans le
document n°6.
2.1 Donner le nom des extrémités produites par l’enzyme PmlI.
Le produit final obtenu est représenté dans le document n°7.
2.2 Expliquer l’action de l’ADN polymérase de T4 en présence de dGTP comme unique
désoxyribonucléotide sur le vecteur linéarisé par PmlI.
3 - Préparation de l’ADN à cloner
L’ADN à cloner est préparé par PCR, réaction de polymérisation en chaîne, et utilise 2 amorces
encadrant le cadre ouvert de lecture du gène cible à amplifier.
3.1 Définir la notion de « cadre ouvert de lecture ».
3.2 Préciser la différence entre le cadre ouvert de lecture et la séquence transcrite chez les eucaryotes.
3.3 Réaliser un schéma soigneusement annoté montrant le premier cycle d'une PCR.
Dans le cas d'un clonage LIC, les amorces présentent une partie complémentaire de la séquence à
amplifier et une partie adaptatrice correspondant aux séquences LIC (les 2 séquences monobrins du
vecteur traité).
3.4 Préciser si la séquence complémentaire à l’ADN à amplifier doit être ajoutée du côté 5’ ou du coté 3’
de la séquence adaptatrice pour la confection des amorces. Justifier la réponse.
Après l’amplification, le produit de PCR est traité à l’ADN polymérase de T4 de façon à générer
les longues extrémités cohésives. Le produit obtenu est représenté sur le document n°8.
3.5 Préciser s’il a été nécessaire d’ajouter un ou plusieurs nucléotides lors de cette étape, si oui,
le(s)quel(s) ?
3/4
T.S.V.P.
4 - Clonage et vérification
L’hybridation du produit de PCR et du vecteur pLIC-NHis traités est réalisée à 37°C pendant 5
minutes (sans ligase), le mélange est alors utilisé pour transformer E.coli par électroporation. Le lot de
bactéries électro-compétentes a une efficacité de transformation de 8.107 transformés (transformant en
anglais) par µg d’ADN.
4.1 Calculer le volume de suspension à étaler pour obtenir 100 UFC (Unités Formant Colonie) par boîte
de culture, sachant que 0,1 ng d’ADN a été transformé et que le volume de suspension bactérienne après
électroporation est ajusté à 1,6 mL.
4.2 Justifier l’importance d’étaler la suspension sur un milieu contenant de la kanamycine.
La vérification de la qualité des clonages est réalisée par induction de la synthèse des protéines
recombinées dont la séquence a été clonée. Les masses moléculaires des protéines recombinées produites
sont systématiquement plus élevées d’environ 1 kDa que celle des protéines naturelles.
4.3 Justifier l'écart de masse moléculaire observé, à l'aide du document n°8.
4.4 Les documents n°5 et n°8 montrent les codons employés pour définir les séquences LIC. Justifier le
choix du codon à préférer quand plusieurs sont disponibles. Par exemple, pour la valine (notée V dans le
document n°5), on a choisi le codon GTG plutôt que GTC autre codon possible.
4/4
Document n°1. Mesures de vitesses initiales de réactions pyruvate kinase (PK)
Pour suivre les cinétiques pyruvate kinase on couple la réaction pyruvate kinase à la réduction du
pyruvate en lactate catalysée par la lactate déshydrogénase (LDH). Le NADH, qui absorbe fortement à
340 nm, est oxydé en NAD+ qui n'absorbe pas à cette longueur d'onde. L'enregistrement de l'absorbance
du système à 340 nm permet le suivi cinétique.
phosphoenolpyruvate (PEP) + ADP = pyruvate + ATP
(réaction principale catalysée par la PK)
pyruvate + NADH + H3O+ = lactate + NAD+ + H2O
(réaction indicatrice catalysée par la LDH)
Dans le système des deux réactions couplées, la réaction principale, en état de vitesse initiale, devra être
limitante de la réaction indicatrice.





Les milieux réactionnels ont la composition suivante :
tampon réactionnel Tris-HCl 50 mmol.L-1, 0,1 mol.L-1 KCl, 5 mmol.L-1 MgSO4 , pH 7,5 ;
substrats PEP et ADP aux concentrations souhaitées ;
NADH 0,20 mmol.L-1 ;
Lactate déshydrogénase (LDH) selon une quantité conduisant à une vitesse maximale de la
réaction indicatrice dans les conditions du milieu réactionnel de 20 µmol.mL-1.min-1 ;
volume réactionnel total de 1 mL, 37°C, démarrage de la réaction avec 20 µL de préparation
pyruvate kinase à mesurer ajoutés à 980 µL de mélange réactionnel, suivi cinétique en continu à
340 nm.
Document n°2. Données caractérisant le comportement cinétique de la lactate
deshydrogénase (LDH)
La lactate deshydrogénase (LDH) utilisée pour la réaction indicatrice est une LDH de muscle
squelettique de lapin. Le comportement est Michaélien selon un mécanisme bi-bi ordonné avec fixation
première du NADH puis fixation du pyruvate.
Le coefficient de Michaelis pour le pyruvate est Kp = 0,100 mmol.L-1
Le coefficient de Michaelis pour le NADH est KN = 0,010 mmol.L-1
Le coefficient de dissociation du couple LDH-NADH est KsN = 0,002 mmol.L-1
V max [ NADH ][ pyr ]
L'équation générale de cinétique est : v i = [ NADH ][ pyr ]+ [ NADH ] K + [ pyr ] K + K K
p
N
sN
p
qui peut s'écrire : vi =
Vmax

KN
(1+
)
 NADH 
 pyr 
(1 
Kp
K sN
 NADH 
équation dite équation « doc2 »
)
KN
(1 
)
 NADH 
+  pyr 
AT – 0412 Documents page 1/4
Document n°3. Cinétiques pyruvate kinase (PK) de E. Coli, PEP substrat variable, ADP
paramétrique
Pour l’ensemble des graphes :
- V désigne la vitesse initiale ;
- FBP désigne l'effecteur fructose-1,6biphosphate ;
- [PEP] désigne la concentration en PEP dans le
milieu réactionnel ;
- [ADP] la concentration fixe d'ADP dans le
milieu réactionnel (2 mmol.L-1).
Document n°4. Pyruvates kinases (PK) chez le rat
Les mammifères proposent plusieurs isoenzymes. Les PK sont des homotétramères. C'est
l'épissage alternatif exclusif de l'ARN pré-messager du gène M qui conduit aux 2 isoenzymes M1 et M2.
M1 et M2 diffèrent ainsi de 21 résidus aminoacyls sur le segment protéique allant du résidu 388 au résidu
432. Ce segment forme 2 hélices alpha engagées dans l'association des sous-unités en homotétramère.
Dans le document ci-dessous M2.WT désigne l'enzyme M2 de type sauvage et M2.C423L un mutant de
M2 pour lequel la cystéine en position 423 a été remplacée par une leucine.
Pour l’ensemble des graphe :
- en abscisse la concentration en
phosphoénolpyruvate (PEP) en
µmol.L-1 ;
- en ordonnée le rapport vitesse
initiale sur vitesse maximale
(v/Vmax) ;
- la concentration en ADP est fixe
à 2 mmol.L-1 ;
- chaque enzyme est étudiée en
présence ou non de l'effecteur
fructose-1,6-biphosphate (FBP) à
la concentration de 0,5 mmol.L-1.
Note : Les données du document n°2 sont adaptées -afin d'obtenir des calculs simples- de http://biochemifa.kikkoman.co.jp/products/rinsyou/pdf/61170_ldhp.pdf et R. A. Stinson and H. Gutfreund Transient-kinetic studies of pig muscle lactate dehydrogenase, Biochem J. 1971 January 121(2): 235–240 (dernière
page). Les données des documents n°1, 3 et 4 sont adaptées de Valentini, Chiarelli ...,The Allosteric Regulation of Pyruvate Kinase, The Journal of Biological
Chemistry, 2000 Vol. 275, No. 24 :18145–18152 et Ikeda, Noguchi, Allosteric Regulation of Pyruvate Kinase M2 Isozyme Involves a Cysteine Residue in the
Intersubunit Contact, The Journal of Biological Chemistry, 1998 Vol. 273 : 12227-12233.
AT – 0412 Documents page 2/4
Document n°5. Carte fonctionnelle du vecteur pLIC-NHis
Légende :
Ori : origine de réplication
Kan : gène de résistance à la kanamycine (phosphotransférase)
lacI : gène codant LacI
T7 : promoteur transcrit par l’ARN polymérase du phage T7
RBS : site de fixation du ribosome
ATG (M) = séquence codant la méthionine initiatrice
TGA = (*) = séquence d’un codon STOP.
Code à une lettre des acides aminés : H= histidine , M=méthionine, V=valine, D= acide aspartique,
E=acide glutamique, N= glutamine
D’après JOURNAL OF BIOMOLECULAR TECHNIQUES, VOLUME 20, ISSUE 5, DECEMBER 2009
Document n°6. Site de reconnaissante et de coupure de l'enzyme PmlI
5' CAC GTG 3'
3' GTG CAC 5'
AT – 0412 Documents page 3/4
Document n°7 : Préparation du vecteur LIC
Double traitement du vecteur pLIC-NHis par pmlI (1.) et l'ADN polymérase (2.) de T4 en
présence de dGTP.
Dans la figure ci-dessous, seule la partie du plasmide concernée par le traitement est représentée.
PmlI
M H H H H H H G
5’CATATGCACCATCATCATCATCACGTGGAAGTGGATAACTGAGATCC 3’
3’GTATACGTGGTAGTAGTAGTAGTGCACCTTCACCTATTGACTCTAGG 5’
1. PmlI
2. T4 DNA polymérase + dGTP
5’CATATG 3’
5’ GTGGAAGTGGATAACTGAGATCC 3’
3’GTATACGTGGTAGTAGTAGTAGTG 5’
3’ GACTCTAGG 5’
Document n°8 : ADN à insérer prêt pour le clonage
gène cible
H
H
H
H
H
H
G
5’CAC CAT CAT CAT CAT CAC GGT ATG NNN NNN C 3’
3’CCA TAC NNN NNN G CAC CTT CAC CTA TT 5’
Masse molaire de l'histidine : 155 g.mol-1.
Masse molaire de la glycine : 75 g.mol-1.
AT – 0412 Documents page 4/4