BIOCHIMIE - REACTIONS CELLULAIRES (BI301)

BIOCHIMIE - REACTIONS CELLULAIRES (BI301) - Juin 2015
Sujet portant sur le cours de James Sturgis – A rendre sur une copie séparée
Durée conseillée : 45 minutes
Quelles réactions sont faites par les enzymes :
1. Aldolase
2. Phosphofructokinase (PFK) ?
Décrire l'action d'ATP sur ces deux enzymes.
Dans une cellule la concentration de fructose-2,6-bis phosphate est environ 1mM.
Supposant que les deux enzymes ont des cinétiques Michaeliennes, et sachant que
pour ces deux enzymes on connait certains paramètres dans la cellule (voir tableau)
que pouvez vous dire de l'activité des enzymes ?
Aldolase PFK
Vmax 200 M min-1 50 M min-1
Km (Fructose 6 Phosphate) - 0.5mM
Km (Fructose 1,6 bis Phosphate) 0.5mM 2mM
Km (Glyceraldehyde 3 phosphate) 0.2mM -
Si la constante catalytique de l'aldolase est de 1.33 x 103 sec-1 quelle est la
concentration de l'aldolase dans une cellule ?
Sujet portant sur les travaux pratiques – A rendre sur une copie séparée
Durée conseillée : 30 minutes
1. Vous avez besoin du tampon BMX de composition suivante :
MES 20 mM – NaCl 0.15M – DTT 3 mM – EDTA 1mM – SDS 0.5%
Comment préparer 100 ml de tampon BMX concentré 10 fois à partir de:
MES (PM=195.4 g.mol-1) – NaCl 3M – DTT 3 M
EDTA 0.5 M – SDS en poudre
2. Pourquoi utilisons nous le SDS dans l'SDS-PAGE ?

BIOCHIMIE - REACTIONS CELLULAIRES (BI301) - JANVIER 2015
Sujet portant sur le cours de James Sturgis – A rendre sur une copie séparée
Durée conseillée : 20 minutes
Repondre a une seule des deux questions A ou B
A) L'enzyme Pyruvate carboxylase ajoute une molécule de di-oxyde de carbone (CO2) sur
le groupement méthyl du Pyruvate pour former un di-acide (acide oxalo-acetique).
Pendant cette réaction une molécule d'ATP est hydrolysée en ADP et PO4.
1. Faire un schema de cette réaction (5 points)
2. Pourquoi coupler la carboxylation du pyruvate et l'hydrolyse d'ATP ? (2 points)
3. Est-ce une réaction d'anabolisme ou catabolisme et pourquoi ? (1 points)
4. A votre avis cette réaction serait-elle propice à la régulation ? (2 point)
B) Donnez quelques élements communs au métabolisme de tout organisme vivant et donc
probablement très anciens (10 points)
Sujet portant sur les travaux pratiques – A rendre sur une copie séparée
Durée conseillée : 20 minutes
1. On souhaite mettre en œuvre une stratégie de purification d’une protéine P en insérant
en amont de son extrémité N-terminale un peptide destinés à faciliter sa purification.
Citer le nom de ce peptide utilisé pour cet usage. Préciser quel support ou ligand peut
être utilisé pour immobiliser cette protéine sur une colonne de chromatographie, ainsi
que le facteur qui, ajouté dans le tampon d’élution, conditionne la libération de cette
protéine de la colonne d’affinité (3pts).
2. Comment préparer 10 ml de tampon de charge pour SDS-PAGE composé de 2 %
(P/V) SDS, 10% (V/V) glycérol, 5% (V/V) -mercaptoéthanol, 62,5 mM Tris-HCl, pH
6,8, et 0,05% de bleu de bromophénol à partir de : SDS (PM : 288,379 g/mol), de
glycérol (90%), de -mercaptoéthanol (100%), de Tris (PM: 121,14g/mol), et de bleu
de bromophénol (5%). (3pts)
3. Quel traitement supplémentaire subiront les échantillons protéiques repris dans ce
tampon avant d'être chargés sur gel d'acrylamide ? (1pt)
4. Pour visualiser une protéine de 10 kDa, vous utilisez : (1pt)
◦Un gel d’acrylamide à 7%
◦Un gel d’agarose à 2%
◦Un gel d’acrylamide à 15 %
◦Un gel d’agarose à 0.5%
5. Que peut-on déduire de ces observations, concernant une même protéine soumise à
diverses électrophorèses et révélée par coloration spécifique ? (1pt)
◦Après électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS, on révèle une
bande de 100 kDa
◦Dans les mêmes conditions, mais en ajoutant du D, on révèle une bande de 50
Kda.
6. Vous disposez d’une protéine purifiée. Pour évaluer la quantité vous mesurez par
spectrophotométrie : (1pt)
◦la DO à 260 nm
◦la DO à 280 nm
◦la DO à 600 nm

Biochimie (Réactions Cellulaires)
2014-2015
Partiel de Novembre 2014
Calculette permis, Documents non-permis
Durée 1 heure.
A) Cette question concerne la cinétique d'une réaction d'isomérisation entre un aldéhyde et une
cétone, comme nous l'avons vu en cours.
1. Donnez un exemple de ce type de réaction, et l'enzyme qui la fait. (4)
Dans le tableau sont indiquées les concentrations de produit (aldéhyde) en fonction de temps pour
quatres échantillons. Les differents échantillons avaient des conditions initiales différentes en
concentration de substrat (cétone) et contennaient tous 0.5 μM d'enzyme.
Concentration de produit (M) en fonction de temps
Temps Echantillon 1 Echantillon 4 Echantillon 4 Echantillon 4
0.3 mM cétone 1 mM cétone 3 mM cétone 10 mM cétone
0 sec 0.04 -0.30 0.15 0.09
30 sec 19.5 51.0 71.0 123.0
60 sec 40.0 100.0 145.0 230.0
90 sec 58.0 149.5 210.0 340.0
2. Quelles sont les vitesses initiales des réactions dans les quatres cas. (6)
3. Estimer les valeurs de Km et Vmax observées pour l'enzyme. (4)
4. Connaissant la concentration d'enzyme, calculer la constante catalytique (kcat). (2)
5. La vitesse de la réaction depend du pH. A partir de vos connaissances de la catalyse par ce
type d'enzyme, quels groupements ionisables pourraient être impliqués. (4)
B) Les groupements phosphoryles (PO4) sont très importants dans le métabolisme et sa régulation.
1. Pourquoi les métabolites sont ils souvent phosphorylés? (2)
2. Donner un exemple d'une enzyme et la réaction qui phosphoryle un métabolite non-
phosphorylé (5)
3. Quelles sont les caractéristiques thermodynamiques (G et G°') constatées en général pour
les réactions de phosphorylation? Comment peut-on expliquer cela en quelques mots? (5)
4. La phosphorylation joue des rôles également dans la régulation (8). Donner des exemples de :
1. Une localisation dépendante de la phosphorylation ;
2. Une dimérisation dépendante de la phosphorylation ;
3. Une activité enzymatique dependant de la phophorylation ;
4. Un signal transmis dans la cellule grâce à la phosphorylation ;
5. Une stabilité dépendante de la phosphorylation

Biochimie (Réactions Cellulaires)
2012-2013
Partiel – 1 heure
Les calculettes sont permises (mais pas nécessaires)
Répondre à une seule des deux questions A ou B
A) Les réactions cellulaires sont fortement régulé à différents niveaux. Répondre a tous
les points suivants en utilisant des exemples concrets.
La vitesse d'une réaction enzymatique dans une cellule peut être modifié en changeant quels
paramètres de l'enzyme ?
Est-il possible de réguler le métabolisme au niveau de toutes les réactions, ou cértaines
réactions sont elles plus propices à la régulation que d'autres ?
L'activité enzymatique dans une cellule peut être modulée sur différentes échelles de temps :
expliquez les méthodes utilisées par les cellules pour une modulation rapide et pour une
modulation plus lente.
Dans la régulation nous avons vu de multiples protéines avec la même fonction, mais
également des protéines avec de multiples fonctions. Expliquez comment chacune de ces
organisations aide à la régulation.
B) Une levure dans un mileu qui contient du glucose est les bases nucleotidique, mais pas
d'oxygène, est en train de fabriquer des molécules d'ARN et d'ADN.
Quel est le bilan pour fabriquer l'ARN pppUpGpUpGpGpGpUpG à partir de glucose, ATP,
uracile, guanine et NADP+ ?
•La fabrication ADN utilise autant d'ATP que la fabrication d'ARN, les ribonucleotides
sont convertis en désoxy-ribonuclotides utilisant un équivalent de NADPH par
l'enzyme RNR.
Environ combien d'ATP sont nécessaire pour fabriquer l'ADN de la genome d'une bacterie
(~4Mbp en longeur) ?
Si la réplication de l'ADN prend 20 minutes combien de molécules d'ATP par second sont
utilisées ?
Si tout l'ATP, et également une partie des nucléotides, vienne de la fermentation du glucose
combien de molécules de glucose sont utilisés par seconde pour faire de l'ADN ?

Biochimie (Réactions Cellulaires)
2012-2013
Correction
D'abord, quelques points importants... Il faut répondre aux questions posées et non pas
aux questions que vous auriez voulu que je pose !!! Beaucoup entre vous ont perdu des
points à cause de cela. Si vous ne comprenez pas les mots dans les questions
demandez aux surveillants, c'est bête de répondre à côté car vous n'avez pas compris.
A) Les réactions cellulaires sont fortement régulées à différents niveaux. Répondre à tous
les points suivants en utilisant des exemples concrets.
La vitesse d'une réaction enzymatique dans une cellule peut être modifié en changeant quels
paramètres de l'enzyme ?
Les paramètres de l'enzyme qui peuvent être modifiées sont sa capacité catalytique
(kcat) et son affinité (Km), c'est a dire l'activité de l'enzyme présent (ce que nous
avons vu avec le phospho-fructo-kinase et les effets de ATP etc). Il est également
possible d'agir sur la quantité d'enzyme ou son accessibilité.
Est-il possible de réguler le métabolisme au niveau de toutes les réactions, ou certaines
réactions sont elles plus propices à la régulation que d'autres ?
Certains réactions sont plus propices a la régulation que d'autres. En effet pour une
régulation efficace il faut agir sur des réactions hors-équilibre (G << 0 ). Par exemple
le phospho-fructo-kinase (G = -21.2 kJ mol-1).
L'activité enzymatique dans une cellule peut être modulée sur différentes échelles de temps :
expliquez les méthodes utilisées par les cellules pour une modulation rapide et pour une
modulation plus lente.
Pour une régulation rapide les cellules changent l'activité des enzymes présents. Cela
se fait principalement par deux méthodes différentes : la liaison d'inhibiteurs (tel l'ATP
sur phosphofructokinase) ou alternativement la modification chimique de l'enzyme
(comme la phosphorylation de PFK2 par la Protéine Kinase A ou de Mth1 par Yck1).
Pour une régulation plus lente les cellules changent la quantité d'enzyme présent. Cela
se fait en modifiant la vitesse de synthèse (induction/répression de gènes) comme nous
l'avons vu pour les transporteurs de glucose Hxt1-4, ou alternativement en jouant sur
la dégradation des protéines avec l'ubiquitinylation.
Dans la régulation nous avons vu de multiples protéines avec la même fonction, mais
également des protéines avec de multiples fonctions. Expliquez comment chacune de ces
organisations aide à la régulation.
Une exemple de multiples protéines avec la même fonction sont des multiples
transporteurs de glucose (Hxt1-4 et au delà) qui sont tous des transporteurs passifs de
glucose. Cependant ils n'ont pas tous les mêmes caractéristiques cinétiques (Km et