2
24>26 novembre 2016
LILLE GRAND PALAIS
Idéalement l’échantillon ne devrait pas être
contaminé par de la litière ou sol/plantes…
Remplacer la litière par du papier journal est
conseillé. Alternativement un écouvillon rectal
peut être utilisé. La quantité de selles et donc
de bactéries prélevées à l’aide d’un écouvillon
étant nettement inferieure à celle d’un échan-
tillon de selles, il paraît plus probable d’obtenir
un faux négatif qu’avec des selles fraîches. Ils
sont à placer directement dans un milieu de
transport présent dans un tube stérile. Deux
à trois grammes de selles fraiches conservés
entre 4 et 8°C jusqu’au moment de l’envoi au
laboratoire suffisent.
Modalités de transport
Même si, en pratique, les laboratoires d’ana-
lyses vétérinaires n’exigent pas de milieu de
transport pour les selles fraîches, il est quand
même conseillé pour ce type de prélèvement.
En effet, les bactéries sont sensibles aux varia-
tions de température, de pH, de pression en
oxygène et sont détruites dans un environne-
ment qui ne leur est pas favorable et doivent
donc être conservées dans des milieux adap-
tés. Les écouvillons rectaux sont systémati-
quement envoyés avec un milieu de transport
bactérien classique dans un tube ou un sachet
hermétique de transport, stériles.
Pour résumer, voici quelques principes qui
sont recommandés pour le transport et la
conservation des échantillons :
Les échantillons devraient être envoyés au
laboratoire sous couvert du froid (+4°C) dans
les 24 à 48 heures après leur collecte.
Les milieux de transport pour les selles
fraîches sont fortement recommandés : Cary
Blair, Amies ou Stuart,...
Il faut éviter les écarts de température, l’expo-
sition à la lumière et à l’oxygène atmosphé-
rique des prélèvements.
Techniques parallèles à la coproculture
Cytologie
La cytologie peut également donner des ren-
seignements précieux incitant à la réalisation
d’une coproculture. Les selles sont étalées en
couche très fine. Si l’échantillon est trop épais,
la coloration ne sera pas optimale. On peut
aussi prélever les selles à l’aide d’un coton tige
que l’on aura introduit dans le rectum puis que
l’on fera rouler sur la lame. La lame est ensuite
séchée à l’air libre (un sèche-cheveux peut
aussi être utilisé au besoin pour accélérer le
séchage) pour préserver la morphologie cel-
lulaire. Les colorations utilisées sont des colo-
rations rapides (Diff-Quick®) ou de Wright-
Giemsa. Les morphologies cellulaires et les
bactéries sont le mieux appréciées au plus
fort grossissement avec immersion. D’autres
colorations peuvent être utilisées selon la
suspicion du clinicien. Si une diarrhée d’ori-
gine bactérienne est fortement suspectée une
coloration de Gram sera préférée.
Un nombre important de polynucléaires neu-
trophiles sur un frottis fécal, lors de diarrhée
hémorragique plaide en faveur d’une origine
bactérienne impliquant un germe invasif (en
particulier une salmonella ). La visualisation
de spores en forme « d’épingle à nourrice
» oriente vers une recherche de Clostridium
perfringens lors de la coproculture. La sporu-
lation de C. perfringens est en effet co régulée
à la production d’entérotoxines. La présence
de bactéries en forme d’ « aile de mouette »
au frottis fécal oriente vers une suspicion de
campylobactériose.
Immunodétection de toxines (ELISA)
Les souches entérotoxinogènes de Clostridium
perfringens et Clostridium difficile produisent
des toxines responsables de l’apparition de la
diarrhée par un mécanisme d’hypersécrétion.
Elles peuvent être détectées dans les selles
des chiens et chats atteints de diarrhée et
ainsi, couplées à la coproculture, renforcer la
suspicion de diarrhée causée par ces germes.
Les tests immunologiques peuvent se faire,
soit sur les selles, soit sur les souches bac-
tériennes isolées par la coproculture. Toutes
les souches de clostridies ne sont pas toxi-
nogènes, il est alors essentiel de déterminer
si celles qui ont été isolées à la coproculture
le sont ou non. En l’absence de standardisa-
tion des méthodes de détection de toxines de
Clostridium dans les selles, la découverte de
toxines A ou B de C. difficile ne constitue pas
une preuve d’infection et doit généralement
être combinée aux résultats de culture.
La principale toxine de C. perfringens est la
toxine A, c’est donc celle qui fait l’objet des
techniques de détections disponibles. L’enté-
rotoxine de type A peut être détectée par la
méthode ELISA ou la méthode d’agglutination
passive. Cette dernière n’est pas conseillée
en raison des nombreux faux positifs générés
en comparaison de la technique ELISA. Les
échantillons fécaux analysés par cette tech-
nique doivent idéalement être analysés le plus
vite possible pour réduire le risque de faux né-
gatifs. Un milieu tampon de stabilisation peut
être ajouté à l’échantillon fécal lors de délais
pressentis.
Le potentiel pathogène de C. difficile est dû
principalement a deux toxines : A et B. Cer-
taines souches pathogènes peuvent être
négative pour la toxine A et positives pour la
B. La plupart des tests disponibles détectent
uniquement la toxine A. Les tests permettant
de détecter la toxine B sont rarement utilisés
en raison de leur coût élevé et des délais asso-
ciés. En raison du grand nombre de faux posi-
tifs associé au test ELISA, idéalement un dia-
gnostic de diarrhée due a C. devrait être basé
non seulement sur l’isolement de toxines A
ou/et B mais aussi sur la démonstration de la
présence de C par culture ou PCR. Le nombre
de faux positifs associé au test ELISA sur les
selles canines peut être expliqué par une liai-
son non spécifique de certaines protéines pré-
sentes dans les selles aux anticorps utilisés
dans le test.
Le nombre important de faux négatifs
lorsqu’on utilise le test ELISA (en raison
d’une faible sensibilité) sur les selles canines
est expliqué par trois facteurs importants: la
présence de certains inhibiteurs fécaux, la
présence de protéases fécales dégradant les
toxines et la présence de la toxine à des ni-
veaux inférieurs au seuil de détection du test.
Escherichia coli peut produire de nombreuses
toxines (7), les toxines relevantes en matière
de diarrhée sont: les toxines entérotoxino-
gènes (ECET) et vérotoxinogènes (ECVT). Les
recherches de toxines des différents patho-
types d’Escherichia coli ne se font pas de ma-
nière routinière dans les laboratoires d’ana-
lyses vétérinaires mais plutôt dans le cadre
d’études épidémiologiques.
PCR
Des méthodes génomiques peuvent être uti-
lisées pour détecter les gènes codant pour les
toxines bactériennes mais aussi pour d’autres
gènes directement en lien avec le pouvoir
pathogène de la bactérie. Les méthodes molé-
culaires permettent ainsi d’identifier l’agent
pathogène directement dans l’échantillon, de
distinguer des souches toxinogènes de celles
qui ne le sont pas et de distinguer des facteurs
de virulence spécifiques à certains agents. Ces
méthodes ont souvent une haute sensibilité et
spécificité. En revanche, étant donné qu’elles
détectent aussi bien organismes morts que
vivants et que la plupart ne sont pas quantita-
tives, ces méthodes ne peuvent remplacer la
coproculture.
Interprétation
Examen direct
Coloration Gram, cytologie
Il permet :
Identification (suspicion) de certaines bacté-
ries (Campylobacter)
Identification d’un déséquilibre de la flore,
normalement constituée majoritairement de
bacilles à Gram négatif. L’appréciation globale
du déséquilibre de la flore microbienne intesti-
nale peut se faire à l’examen direct après colo-
ration de Gram. Cet examen doit être inter-
prété en fonction de l’espèce animale, de son
âge, de l’alimentation, des commémoratifs...
La perturbation de la flore physiologique peut
se faire par l’appréciation semi-quantitative
du nombre de bactéries ou par la présence de
certaines bactéries normalement absentes.
L’examen direct n’est pas une numération
mais on peut considérer que la lecture d’une
coloration standard effectuée par un person-
nel compétent donne une bonne appréciation
semi- quantitative des populations bacté-
riennes. Ainsi on peut observer une proliféra-
tion importante des populations bactériennes
dans leur ensemble ou de certaines d’entre
elles seulement, conséquence d’une rupture
de l’équilibre de la flore endogène intestinale.