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CHAPITRE G
THERAPIE GENIQUE
PRINCIPES et APPLICATIONS
EN UROLOGIE
" Si toute invention physique ou chimique est un blasphème, toute invention biologique est une perversion…
`
il n’en est guère qui, à l’origine, n’ait semblé indécente ou hors nature "
J.B.S Haldane
1021
PLAN
III. UTILISATION EN PATHOLOGIE
VESICALE
INTRODUCTION
1. STRATÉGIE CORRECTIVE
2. STRATÉGIE CYTOTOXIQUE
3. STRATÉGIE ANTI-SENS
4. STRATÉGIE D’IMMUNOMODULATRICE
A. PRINCIPES DE THERAPIE
GENIQUE
I. DEFINITION
IV. UTILISATION EN PATHOLOGIE
TESTICULAIRE
II. MODALITES DE LA THERAPIE
GENIQUE
1. THÉRAPIES
V. UTILISATION EN PATHOLOGIE
RENALE
GÉNIQUES SOMATIQUE ET GERMI -
NALE
2. STRATÉGIES DE THÉRAPIE GÉNIQUE
3. THÉRAPIES GÉNIQUES IN VIVO
4. VECTEURS DE THÉRAPIE
ET EX VIVO
GÉNIQUE
1. STRATÉGIE CORRECTIVE
2. STRATÉGIE CYTOTOXIQUE
3. STRATÉGIE ANTI-SENS
4. STRATÉGIE IMMUNOMODULATRICE
5. MÉTHODES DE DÉLIVRANCE
B. APPLICATIONS DE LA
THERAPIE GENIQUE A
LA CANCEROLOGIE
UROLOGIQUE
I. STRATEGIES THERAPEUTIQUES
C.UTILISATION EN
PATHOLOGIE BENIGNE
I. PATHOLOGIE RENALE
1. POLYKYSTOSE RÉNALE
2. GLOMÉRULONÉPHRITES
3. INSUFFISANCE RÉNALE CHRONIQUE
1. STRATÉGIE CORRECTIVE ET PROTECTRICE
2. STRATÉGIE CYTOTOXIQUE ET
II. IMPUISSANCE
SUICIDE
3. STRATÉGIE ANTI-SENS
III. STENOSES URETERALE ET
URETHRALE
4. STRATÉGIE D’IMMUNOMODULATRICE
II. UTILISATION EN PATHOLOGIE
PROSTATIQUE
D. TRANSPLANTATION
1. STRATÉGIE CORRECTIVE
2. STRATÉGIE CYTOTOXIQUE
E. CONCLUSION
3. STRATÉGIE D’IMMUNOMODULATRICE
1022
THERAPIE GENIQUE
PRINCIPES et APPLICATIONS
en UROLOGIE
A. PRINCIPES DE THERAPIE
GENIQUE
INTRODUCTION
¨Si l’on considère le but d’un médicament comme
la restitution d’une fonction par ticulière du
corps, alors l’ADN doit être tenu comme le médicament absolu.¨ [1]. Cet aphorisme a guidé le formidable développement de la thérapie génique, dont
les champs d’application ne cessent de s’étendre et
les protocoles cliniques de se multiplier. La thérapie
génique est en passe actuellement de se constituer en
spécialité à part entière. C’est en 1944 qu’eurent lieu
les premières expériences de transfert de gènes
(transduction), avec la transformation de bactéries
par introduction d’un gène hétérologue. En 1968, les
premières cellules de mammifères furent transformées par des gènes viraux alors qu’un congrès de
thérapie génique consacré aux maladies génétiques
(hémoglobinopathies e t maladie de LESCHNYHAN) se tenait dès 1971. En 1990, la thérapie
génique acquit sa popularité auprès des médias généralistes avec le premier essai clinique pratiqué chez
l’Homme, sous la coordination de W.F. ANDERSON [2]. A ce jour, près de 400 protocoles cliniques
sont en cours, incluant plus de 3500 patients à travers le monde. Ces travaux ont mobilisé, uniquement aux Etats-Unis, 200 millions de dollars du secteur public et une somme équivalente du secteur
privé [3].
Après en avoir rappelé les principes, nous passerons
en revue les principales applications de la thérapie
génique aux domaines de l’urologie.
I. DEFINITION (FIG. 1)
La thérapie génique est basée sur le transfert de
gène. Cette technique consiste en l’introduction dans
une cellule, dite cible, d’un matériel génétique
constitué d’un gène sous la dépendance d’une
séquence de régulation. Cette séquence de régulation
est habituellement un promoteur. Le gène est introduit soit directement sous forme d’ADN nu, soit
grâce à un vecteur, dans le génome duquel il est
généralement inséré. L’expression de ce gène modifiera les propriétés fonctionnelles de la cellule, appelée alors cellule transduite. Cette expression, soit
restaurera une fonction perdue ou altérée, soit lui
fera acquérir une fonction nouvelle.
II. MODALITES DE LA THERAPIE
GENIQUE
1. THÉRAPIES
GÉNIQUES SOMATIQUE ET GERMI -
NALE
L’attitude encore prévalente considère la thérapie
génique somatique (le transfert de gène au seul
patient et non à sa descendance) comme un mode
1023
Figure 1: Les acteurs de la Thérapie Génique: la thérapie génique suppose le transfert d’un gène dans une cellule.
Ce gène sera alors exprimé dans la cellule transduite
thérapeutique classique, dont il convient de déterminer le rapport entre ses risques et ses bénéfices. La
thérapie génique germinale ou embryonnaire n’est
pas encore validée, pour des considérations essentiellement éthiques. Toutefois, une demande récente
d’approbation d’un protocole de thérapie génique
fœtale humaine, aux U.S.A., risque de remettre en
cause ce principe de précaution [4]. Ce protocole,
dont le promoteur est cette fois encore W.F.
ANDERSON, a pour but de soigner l’alpha-thalassémie et surtout le SCID (déficit immunitaire combiné par déficit en enzyme ADA), lequel a fait l’objet du premier protocole d’essai clinique humain.
fonction cellulaire est moins spécialisée. Si la protéine anormale est, par exemple, sécrétée, son anomalie peut alors être corrigée à distance (c’est le cas des
maladies lysosomales [5]).
Ainsi deux types de protocoles peuvent-ils être grossièrement individualisés.
a) Protocoles de marquage cellulaire (Fig.2)
2. STRATÉGIES DE THÉRAPIE GÉNIQUE
De tels protocoles permettent, soit de suivre le devenir d’une cellule et de sa descendance, soit d’évaluer
une voie d’administration, un vecteur ou la durée
d’expression du transgène. Il s’agit donc de protocoles de compréhension, qui, in vivo, s’inscrivent uniquement dans le cadre d’essais de phase I. Il ne s’agit
aucunement de protocoles à visée thérapeutique [6].
La thérapie génique consiste en la modification
fonctionnelle d’une cellule, et certaines de ses
applications sont d’une mise au point particulièrement délicate. Lorsque l’anomalie à corriger touche
des cellules hautement différenciées, elles sont les
seules cibles possibles. Par exemple, la correction de
la ß-thalassémie ne s’entend que par l’implantation
du gène de la ß-globine dans les pro-géniteurs
hématopoïétiques. Il est des cas plus simples, où la
Ils consistent à insérer un gène hétérologue, dit gène
rapporteur, dans le génome de la cellule cible. La
traduction de ce gène, en une protéine facilement
repérable, marque la cellule transduite, “l’estampille” en quelque sorte, et permet de la détecter spécifiquement dans le temps ou l’espace. Outre les
gènes de la luciférase et de la «green fluorescent protein» (GFP), le gène le plus couramment utilisé est
lac-Z, le gène de la ß-galactosidase d’escherichia
1024
1
2
3
4
5
Figure 2 : Essai de thérapie génique en utilisant un gène rapporteur, la ß-galactosidase. Le marquage peut être spécifique des
cellules épithéliales prostatiques (1 à 4) ou des fibroblastes. (5).
1025
Coli. Il transforme un substrat (ß-Gal) en un colorant
bleu, qui peut rester confiné au noyau cellulaire lors
de l’adjonction au gène d’un signal de localisation
nucléaire (nls), augmentant encore la spécificité du
marquage.
b) Protocoles thérapeutiques
Ils reposent sur l’introduction dans le génome de la
cellule cible d’un gène hétérologue à prétention thérapeutique, dit gène effecteur. Avec les progrès du
projet de séquençage du génome humain, leur
nombre, déjà pléthorique, ne cesse de croître.
La cancérologie est le terrain de prédilection de la
thérapie génique, car il a été jugé éthique d’y tester,
dans des protocoles cliniques, des techniques incomplètement validées. De plus, la rareté des modèles
animaux, dans cette pathologie, explique que les
études sur l’animal y aient été moins achevées que
pour les formes galéniques traditionnelles.
Les maladies génétiques héréditaires représentent
historiquement le premier terrain d’application de la
thérapie génique [1]. Treize pour cent des protocoles
cliniques concernent les déficits enzymatiques héréditaires uniques (monozygotes).
3. THÉRAPIES GÉNIQUES IN VIVO
ET EX VIVO
(Fig. 3)
La procédure in vivo consiste à administrer le matériel génétique directement dans le tissu cible au sein
de l’organisme (comme pour la mucoviscidose). Sa
simplicité n’est souvent qu’apparente et son inconvénient majeur est de risquer d’exposer la totalité de
l’organisme au vecteur [7].
Dans la procédure ex vivo, les cellules cibles sont
modifiées en dehors de l’organisme où elles sont
ensuite réimplantées (dans le cas de la moelle osseuse
par exemple). On attend de l’imposante lourdeur des
manipulations alors nécessaires une transduction à la
toxicité diminuée et au rendement augmenté.
4. VECTEURS DE THÉRAPIE GÉNIQUE
a) Généralités
Le gène doit être, en règle générale, véhiculé jusqu’à
la cellule cible par un vecteur (Tableau 1). Celui-ci,
viral ou inerte, doit être sûr et efficace, c’est à dire
promouvoir l’interaction spécifique avec la cellule
cible (ciblage cellulaire), la pénétration intra-cytoplasmique et le transport du gène jusqu’au noyau [8,
9, 10].
2
1
3
4
Figure 3: La thérapie génique in vitro sert à valider le principe d’efficacité et de spécificité. Une fois cette étape franchie, l’op tion de thérapie génique in vivo suppose une mise en contact direct du vecteur avec l’organe cible, alors que l’option ex vivo pro pose une étape intermédiaire in vitro avant ré-implantation des cellules cibles.
1026
Tableau 1: Caractéristiques des principaux vecteurs de gènes (d’après F.W. Anderson et P. Moullier).
TYPE
YPEDE
DEVECTEUR
VECTEUR
T
RÉTROVIRUS
ÉTROVIRUS
R
ADÉNOVIRUS
DÉNOVIRUS
A
ADENOVIRUS
DENOVIRUS
A
--
HERPES
ERPESVIRUS
VIRUS
H
LIPOSOMES
IPOSOMES
L
ASSOCIATEDVIRUS
VIRUS
ASSOCIATED
(AAV)
(AAV)
Taille maximale du gène
transportable (en kilobases)
Limitée
(8 kb)
35 kb
Limitée
(4,8 kb)
30 kb
Limitée
TITRE DE
FAIBLE.
ELEVÉ.
ELEVÉ.
FAIBLE.
ELEVÉ.
Cellules cibles
Seulemement
en division
active
Quiescente
ou
en division
Quiescente ou
en division
Quiescente ou
en division
Quiescente ou
en division
Administration
ex vivo ou
in vivo
ex vivo ou
in vivo
ex vivo ou
in vivo
ex vivo ou
in vivo
ex vivo ou
in vivo
Expression du gène
Stable
Transitoire
Probablement
stable
Transitoire
Transitoire
Taux d’expression
du gène
Modéré
Elevé
Modéré
Modéré
Modéré
Risques
Probablement
mutagène
Très
immunogène
Probablement
mutagène
Probablement
mutagène,
neuro-toxicité
Néant
Avantages
- Pénétration
efficace
- Absence de
séquence
sauvage
résiduelle
- Peu
immunogènes
- Tropisme large.
- Capacité de
transport élevée
- Titres de
solution élevés
- Non pathogènes
- Absence de
séquence sauvage
résiduelle
- Titres de
solution élevés
- Tropisme
neurologique
- Non toxiques
- Non
pathogènes
- Titres de
solution élevés
Immunité pré-existante
chez l’hôte
Non
Oui
Oui
Oui
Non
Recombinaison avec
l’hôte
Improbable
Possible
Improbable
Possible
Improbable
Recombinaison avec
un virus sauvage
Improbable
Possible
Possible
Possible
Improbable
LA SOLUTION .
1027
La pathologie guide le choix du vecteur. Une maladie héréditaire contraint à la correction à vie. Le
vecteur se devra d’être efficace pour atteindre, soit
un grand nombre de cellules matures à longue durée
de vie (comme les hépatocytes), soit de rares cellules
souches capables de reconstituer l’ensemble du tissu
(comme les cellules souches hématopoïétiques). Il
devra, de plus, permettre l’intégration dans le
génome de la cellule hôte pour assurer une expression stable du gène transduit, longtemps après son
transfert. En revanche, une maladie acquise ne peut
nécessiter qu’une expression transitoire. Le vecteur
doit remplir les mêmes conditions d’efficacité de
transduction, mais son expression extra-chromosomique (episomale) est suffisante, dispensant théoriquement d’une intégration au génome hôte (une
expression épisomale s’éteint progressivement, car
elle ne se transmet qu’à une des deux cellules filles
après division de la cellule infectée).
d’amputation du génome viral (délétion) présente
deux avantages. Premièrement, elle fournit de l’espace pour insére r le gène à transporte r.
Deuxièmement, elle rend le vecteur défectif pour
toute réplication en dehors de sa lignée d’encapsidation. Toutefois cette sécurité n’est pas absolue. Le
vecteur peut retrouver ses capacités de multiplication, s’il infecte une cellule, déjà infectée par le virus
sous sa forme sauvage. Ce risque, quoi que très
faible, incite à tendre vers une délétion maximale du
génome des vecteurs (Tableau 1).
Enfin, quel que soit le vecteur, sa production industrielle doit être non seulement fiable, mais aussi rentable au regard du marché potentiel (Fig. 4).
Ies rétrovirus sont les vecteurs choisis dans 37% des
protocoles cliniques [11]. Ils sont généralement dérivés des rétrovirus de la leucémie murine (MLV),
notamment le virus de MOLONEY [12]. Ce sont de
petits virus à ARN simple brin. Ils sont délétés de la
région “gag-pol-env” codant pour les protéines
enzymatiques et structurales. Ils possèdent une propriété d’intégration obligatoire dans le génome de la
cellule dans laquelle ils pénètrent, mais uniquement
si celle-ci est en cours de division. Une fois le génome du virus intégré, la transcription du gène qu’ils
portent peut fonctionner de manière autonome, si on
lui a associé un promoteur spécifique [12, 13].
Tous ces objectifs sont, à l’évidence, difficiles à
atteindre, car l’organisme humain a développé,
depuis plusieurs milliers, voire millions d’années, un
système de protection contre toute introduction
d’ADN étranger dans son génome. Seuls les virus
ont acquis la propriété de déjouer ce système, c’est
pourquoi la majorité des vecteurs est issue de cette
famille. Les vecteurs viraux utilisent les capacités
naturelles des virus à pénétrer dans les cellules et à
transférer dans le noyau leur matériel génétique. Les
virus sauvages se multiplient et se propagent au
détriment des cellules qu’ils infectent. Pour supprimer leur faculté délétère de multiplication, il a fallu
les transformer, en substituant la région de leur
gé nome indispensable à leur réplication.
Parallèlement, cette région indispensable substituée,
est introduite dans le génome d’une lignée cellulaire,
choisie pour ses capacités à être infectée par le type
de virus considéré (lignée dite permissive pour le
virus). Cette lignée devient ainsi “transcomplémentaire” pour le génome viral modifié et sera appelée
lignée d’encapsidation (c’est à dire que le virus y
trouvera le complément de son génome tronqué).
Elle sera utilisée pour assurer la production du vecteur, qui aura donc à sa disposition les protéines
nécessaires à sa réplication, que son génome, amputé, n’est plus capable de traduire. Cette technique
Il est à noter que le choix de la lignée d’encapsidation est essentiel, car les lignées d’origine murine
produisent des vecteurs très immunogènes (car ils
portent des protéines de Souris). Ils sont donc rapidement éliminés, contrairement aux vecteurs produits dans des lignées de primates ou humaines.
b) Les Rétrovirus (Fig. 5a et 5d).
Les avantages de ces virus sont une grande efficacité d’intégration et une stabilité d’expression, même
après division de la cellule infectée.
Leurs inconvénients sont nombreux, sans être rédhibitoires. L’impossibilité d’infe cter des c ellules
quiescentes ou à renouvellement lent est un vrai handicap, que n’auraient pas les membres de la famille
des lentivirus (dont les plus connus sont les VIH 1 et
2 [14]. Toutefois, aucun résultat probant en la matière n’a été publié [15]. Leur incapacité à véhiculer de
longs inserts est en revanche en voie de solution
[16], de même que leur production à des titres significativement élevés. En outre, toutes les cellules
cibles, y compris en division, n’expriment pas toujours très fortement les récepteurs au MLV [17]. Des
cellules situées sur leur voie d’administration peuvent, en revanche, exprimer ces mêmes récepteurs et
1028
Gène
thérapeutique
Virus amputé de son
gène de réplication
Cellule permissive
Gène viral de
réplication
Cellule transduite
VIrus THérapeutique
Capsule virale vide
Lignée d’encapsulation
Production de virus thérapeutiques
Figure 4: La production de virus thérapeutiques est réalisée in vitro et par complémentation afin de supprimer leurs propriétés
pathogènes d’origine.
1029
ainsi “consommer” le vecteur si celui-ci les infecte.
De plus, ils présentent une sensibilité particulière au
complément sérique. Ces deux particularités expliquent, en partie, qu’ils soient surtout utilisés dans
des protocoles ex vivo. Mais le risque majeur qu’ils
présentent est l’induction d’une tumeur dans l’organisme qu’ils infectent. Deux mécanismes sont incriminés. Premièrement, si l’on utilise accidentellement un lot contenant un virus compétent, ou si le
virus défectif se recombine avec un virus sauvage
déjà présent dans la cellule [18], l’organisme hôte
peut être soumis aux mêmes risques que ceux d’une
infection sauvage. Mais ce risque est considéré
comme très faible [19, 20]. Deuxièmement, l’intégration aléatoire du vecteur dans une région dite sensible du génome peut réactiver l’expression d’un
oncogène, ou altérer celle d’un gène suppresseur de
tumeurs. Ces éventualités, non seulement, n’ont
jamais été observées expérimentalement,ce qui peut
être expliqué par le fait que l’engagement dans la
voie tumorale nécessite une accumulation de mutations [21].
c) Les Adénovirus (Fig. 5b, 5c)
Les adénovirus sont utilisés dans 20% des protocoles
cliniques [11]. Virus à ADN bicaténaire de grande
taille, leur génome complexe est délété des régions
nécessaires à la réplication (E1, E2, E3 et plus
récemment E4 [22]). Leur production peut atteindre
des quantités élevées, mais elle sera d’autant moins
efficace que la délétion du génome sera étendue. De
plus, certaines séquences du génome adénoviral
masquent l’infection au système immunitaire, alors
que d’autres séquences participent à la stabilité de
l’ensemble du génome transduit dans la cellule hôte
[23]. Malgré cela, la production d’adénovirus très
remaniés permet de tendre vers le vecteur “idéal”
[24, 25, 26, 27].
Leurs avantages reposent sur une grande capacité de
transport, tant par la longueur des inserts, que par la
grande variété des types cellulaires infectables,
quelque soit leur état de prolifération. Leurs qualités
en font des candidats de choix pour la thérapie
génique in vivo.
En revanche, si un grand nombre de types cellulaires
sont permissifs pour les adénovirus, leur sensibilité à
l’infection est faible, rendant nécessaire le recours à
des titres de solutions virales élevés. Or les fortes
concentrations virales sont toxiques (par l’intermédiaire de leur capsule) pour les cellules exposées.
L’expression, par les cellules hôtes, de peptides
viraux les rend responsables de l’acquisition d’une
immunité humorale qui limitera la ré-administration
du même type de vecteur [28, 29, 30]. Cet inconvénient majeur a conduit à produire des virus dits «gutless» [31], c’est à dire n’exprimant plus d’antigènes
viraux. Les résultats sont très contradictoires chez
l’animal (l’immunogénicité et la stabilité d’expression variant en fonction de l’origine exacte du vecteur, de la nature du tissu cible et de la nature de l’insert). Même ceux obtenus chez le primate sont peu
transposables chez l’homme. Enfin, il a été attribué
aux adénovirus recombinants la capacité d’induire
l’apoptose (ensemble bien défini de phénomènes
biologiques assimilables à la mort cellulaire par suicide) [32]. Cette immunogénicité des adénovirus a
été responsable du premier et seul décès recensé en
thérapie génique qui lui soit directement imputable .
d) Les autres vecteurs viraux (AAV, Herpès virus,
virus Hybrides).
Les virus associés aux adénovirus (AAV) sont des
Parvovirus, virus à ADN simple brin non pathogènes
pour l’homme, que l’on estime présents dans 80% de
la population. Ils sont utilisés dans 0,9% des protocoles cliniques et sont spontanément déficients pour
la réplication. Pour toutefois mener celle-ci à bien,
ils doivent être aidés par un adéno ou un herpès
virus. Ils peuvent infecter des cellules quiescentes,
mais alors ils ne s’y intègrent pas. Lorsqu’ils s’intègrent, à l’état sauvage, c’est dans une région
constante du chromosome 19. Cette capacité est perdue par les AAV recombinants [33], qui s’intègrent
avec une faible efficacité et dont l’activité du transgène est alors dépendante de facteurs exogènes, difficilement utilisables en clinique [34].
Les herpès virus sont surtout intéressants pour leur
neurotropisme, mais ils sont d’un maniement difficile.
Un gros potentiel réside, en fait, dans les systèmes
hybrides, où un vecteur adénoviral, à la manière
d’un cheval de Troie, serait utilisé pour transporter
un vecteur rétroviral dans une cellule non permissive pour les rétrovirus [35].
e) Les vecteurs non viraux (Fig. 6)
Ce sont les vecteurs chimiques et les liposomes [36,
37, 38, 39], qui, en se liant à l’ADN, provoquent sa
condensation. Leur internalisation, ou pénétration
intra-cellulaire, se fait par des mécanismes naturels
1030
Capside
Enveloppe
Capside
ARN
Figure 5a : Un rétrovirus. Virus à ARN avec
envellope lipidique
Figure 5c: Un adénovirus. Virus à ADN sans enve loppe
Figure 5d : Rétrovirus recombinant
Figure 5b: Constuction d’un adénovirus recombinant
1031
LES ADÉNOVIRUS SONT-ILS DANGEREUX ?
Les circonstances du premier décès imputable directement à la thérapie génique, survenu en Septembre
1999, doivent être expliquées. Ce jeune patient était
atteint d’un déficit congénital en ornitine carbamyl
transférase ou OCT (enzyme hépatique du cycle de
dégradation de l’azote). Il participait à un essai de
phase I qui testait un adénovirus défectif porteur du
gène de l’OCT. Il reçut, à cette occasion, la plus forte
dose virale du protocole, ce qui déclencha une réaction
immunitaire généralisée si intense qu’elle lui fut fatale
en 72 heures.
Cet accident fut à l’origine de la fermeture du centre
universitaire où il eut lieu et de la défiance que subit,
actuellement, la thérapie génique dans son ensemble.
Un procès fut intenté, dont le jugement infligea de
lourdes amendes au centre d’expérimentation. Les
expérimentateurs furent reconnus coupables, premièrement, de ne pas avoir déclaré, chez deux patients précédant, l’élévation anormale des transaminases et,
deuxièmement, d’avoir transgressé deux règles du protocole de recherche. En effet, ils avaient, tout de même,
administré le virus, bien que l’amoniémie du patient fut
au delà des normes définies. De plus, la solution ne fut
pas injectée en intra-veineux, selon le protocole enregistré, mais directement dans l’artère hépatique afin,
ironie du sort, d’en limiter la diffusion systémique.
Si ce décès ne marque pas le coup d’arrêt des essais cliniques de thérapie génique, il a toutefois mis en évidence la fréquence des conflits entre les chercheurs et
les industriels. De nombreux expérimentateurs institutionnels sont aussi salariés, actionnaires, voire présidents d’entreprises de bio-technologie. Il en résulte un
risque de collusion, de confusion d’intérêts entre scientifiques et financiers, qui peuvent être préjudiciables à
la rigueur avec laquelle sont menés certains protocoles.
Ce risque est encore renforcé par le coût particulièrement élevé de ces expérimentations et la nécessité de
trouver des fonds pour les mener à bien.
Cet accident est déplorable, mais l’évaluation de ses
conséquences doit être prudente. Il s’agit du tout premier événement sérieux enregistré, alors que plus de
3500 patients participent, ou ont participé à de tels pro-
1032
tocoles. Et ce chiffre serait à interpréter à la lumière des
accidents déplorés lors des essais cliniques de médicaments “puissants”. De nombreux experts concluent
qu’à l’avenir, non seulement, les expérimentations
humaines de thérapie génique devront être plus sévèrement contrôlées, mais encore, que les patients inclus
dans ces protocoles devront impérativement souffrir de
pathologies extrêmement sévères et lourdement handicapantes, ou avoir une espérance de vie limitée.
RÉFÉRENCES:
-
S. LEHRMAN. Virus treatment questioned after
gene therapy death. Nature 1999; 401: 517.
-
P. SMAGLIK. Tighter watch urged on adenoviral
vectors. Nature 1999; 402: 707.
-
V. BARBOUR. The balance of risk and benefit in
gene-therapy trials. Lancet 2000; 355: 384.
-
M. BALTER. Gene therapy on trial. Science 2000;
288: 951.
B. APPLICATIONS DE LA
THERAPIE GENIQUE A
LA CANCEROLOGIE
UROLOGIQUE
Figure 6 : Les vecteurs non viraux du type liposome.
de la cellule hôte (endocytose non spécifique). Cette
internalisation est médiée par un ligand naturel
(transférine, asialoglycoprotéine). L’expression de
leurs transgènes est transitoire car ils ne s’intègrent
pas.
Peu toxiques et produits en masse, ils sont très séduisants pour les administrations répétées et sont les
vecteurs de 17% des protocoles cliniques [11].
Toutefois, ils atteignent difficilement le noyau et
sont victimes d’une très forte captation hépatique
[40].
Le développement de la thérapie génique nécessite
la mise au point de modèles. Il s’agit, au mieux,
d’animaux reproduisant la maladie humaine, issus
de la sélection naturelle ou de manipulations génétiques (animaux transgéniques). Les gros animaux
présentent l’avantage d’évaluer plus fidèlement la
faisabilité d’un passage à l’homme en matière de
toxicologie et de tester les risques associés à des
voies de délivrance spé cifique s. Mais peu de
modèles sont disponibles pour la pathologie cancéreuse (et pour le SIDA). L’extrapolation expérimentale est difficile pour ce qui concerne l’efficacité de
la transduction et la réponse immunitaire de l’hôte.
Les essais thérapeutiques les plus connus pour le
traitement des maladies héréditaires sont les protocoles ex vivo contre le déficit en adénosine deaminase [46, 47] et contre l’hypercholestérolémie familiale par déficit en récepteur des LDL [48, 49] ainsi que
les protocole in vivo contre la mucoviscidose [50]et,
depuis peu, contre le SCID qui est le premier protocole clinique couronné de succès [51, 52].
5. MÉTHODES DE DÉLIVRANCE
Si les voies d’administration sont spécifiques de
chaque organe, les méthodes de délivrances du gène
doivent idéalement être les moins agressives possible s, à l’ima ge des technique s urologiques
modernes.
Plusieurs moyens physiques d’optimisation de la
transfection ont été décrits: le canon à gènes [41],
l’électroporation [42], la sonication [43] et le laser
[44] et la transfection photo-chimique [45].
Toutefois, 27% des protocoles cliniques utilisent une
injection intra-tumorale, 16,5% une injection intraveineuse et 12% sous-cutanée [11].
I. STRATEGIES THERAPEUTIQUES
1. STRATÉGIE CORRECTIVE ET PROTECTRICE
Malgré l’identification d’anomalies génétiques dans
les tumeurs urologiques (mettant en cause des oncogènes et des gènes suppresseurs de tumeurs) et le
succès de protocoles in vitro, deux obstacles s’opposent à une approche par thérapie génique corrective
exclusive. En effet, la multiplicité des altérations
génétiques impliquées dans l’établissement des
tumeurs spontanées, d’une part, et l’hétérogénéité
génétique des différentes populations cellulaires
composant une tumeur spontanée, d’autre part,
1033
nécessitent de transduire un très grand nombre de
cellules au sein de ces tumeurs pour en enrayer
l’évolution.
La stratégie protectrice ne permet pas encore de prévenir l’entrée dans la voie de la cancérogénèse, mais
peut déjà protéger des tissus normaux vis à vis des
effets secondaires de traitements chimio-ou radiothérapeutiques [53].
2. STRATÉGIE CYTOTOXIQUE ET
(FIG . 7)
SUICIDE
La thérapie génique cytotoxique intéresse 12% des
protocoles cliniques. Elle est essentiellement basée
sur la transduction de cellules malades par des
gènes codant pour des enzymes capables de transformer une pro-drogue en une drogue cytotoxique. Ni le gène, c’est à dire l’enzyme, ni la prodrogue ne sont toxiques séparément.
Les plus utilisés sont les gènes de la thymidine-kinase (TK) de l’herpès virus et celui de la cytosine deaminase d’escherichia Coli. Après son introduction
dans une cellule cible du gène TK, le gancyclovir
Cimevan“, administré par voie galénique classique,
est métabolisé en un analogue purique qui s’incorpore à l’ADN cellulaire au cours de sa synthèse.
Ceci bloque la réplication et provoque la mort cellulaire. Ce métabolite toxique se diffuse dans les cellules environnantes non infectées, qui en subissent
alors les mêmes conséquences. Cet effet de voisinage (effet «by stander») amplifie indirectement le rendement de la transduction [54]. Le gène de la cytosine deaminase permettra, à la cellule dans laquelle il
est introduit, de transformer le 5-Fluorocytosine non
toxique en 5-Fluorouracil, avec, là aussi, un effet de
voisinage [55]. Ce gène a surtout été utilisé pour
détruire les métastases hépatiques, mais il semble
qu’il induise aussi une résistance tumorale au 5Fluorouracil [56].
Cette stratégie cytotoxique peut être considérée
comme spécifique, d’abord en ciblant les cellules
tumorales avec le vecteur (par spécificité de liaison
vecteur-cellule, ou par injection intra-tumorale) et
ensuite en adjoignant au gène “suicide” un promoteur spécifique du tissu cible (par exemple le promoteur du PSA dans le cas de la prostate) [57, 58].
Une approche différente utilise un virus modifié,
directement toxique pour les cellules qu’il infecte, si
celles-ci présentent une mutation du gène “chef d’or-
chestre” du suicide cellulaire (p53). Cette méthode a
permis le premier succès de la thérapie génique en
cancérologie. Cette voie, en cours de développement
dans notre laboratoire, s’est montrée efficace in vitro
sur des lignées de cancers prostatiques (résultats non
publiés).
3. STRATÉGIE ANTI-SENS (FIG . 8)
L’ADN est une double hélice faite de deux brins où
chaque base nucléotidique est spécifiquement liée,
en vis à vis, à sa base correspondante selon le code
génétique. On appelle cela l’appariement. Ainsi, les
deux brins sont dits complémentaires. Pour permettre la synthèse protéique, l’hélice d’ADN
s’ouvre au niveau d’un gène. Les bases nucléotidiques de l’ADN vont alors s’appareiller à des bases
complémentaires libres situées dans le noyau. Ces
bases vont ainsi former un brin, unique et court, qui
est complémentaire du gène intéressé; c’est la transcription de l’ADN en ARN messager. L’ARN messager sort du noyau vers les ribosomes où il va de
nouveau s’appareiller, mais cette fois avec des
nucléotides portant les différents acides aminés:
c’est l’ARN de transfert. La transformation du code
génétique de l’ARN en protéine s’appelle la traduction [59].
La stratégie anti-sens consiste à masquer le code
génétique de l’ARN messager. On introduit, dans
le noyau de la cellule cible, un nouveau gène, copie
conforme en miroir du gène dont on veut inhiber
l’expression. La transcription de ce gène “copie”
fournira de l’ARN messager, lui aussi copie inverse
de l’ARN à neutraliser, c’est à dire qu’il lui sera
complémentaire. Il résulte de la présence concomitante de ces deux brins d’ARN complémentaires un
appariement qui va masquer le code génétique du
gène à inhiber. L’ARN ne peut alors plus être traduit
en protéine [60].
4. STRATÉGIE
9B)
IMMUNOMODULATRICE
(FIG. 9A ,
L’hypothèse thérapeutique a été construite à partir
de l’obtention de “vaccins” anti-tumoraux chez
l’animal [61]. Elle suppose que la sur-expression
d’un antigène hétérologue par la tumeur, ou d’une
cytokine dans le micro-environnement tumoral,
pourraient aider le système immunitaire à reconnaître les antigènes tumoraux spécifiques et à éliminer ainsi la tumeur.
1034
ADENOVIRUS
se objective n’a progressé pendant les 5 mois de surveillance. Ces résultats sont bien supérieurs à ceux
obtenus avec la seule chimiothérapie. De plus, le virus
ONYX-015 ne s’est répliqué que dans la tumeur; aucune trace n’en fut retrouvée dans aucun autre organe.
E1B «A smart killer»
Les Adénovirus sauvages détournent la synthèse protéique de la cellule qu’ils infectent, se répliquent et
lysent cette cellule. La protéine régulatrice virale E1B
se lie à la protéine cellulaire p53, afin de l’inactiver et
de promouvoir la réplication virale. Sans la protéine
E1B, un Adénovirus est incapable de se répliquer; cette
caractéristique est utilisée pour construire les vecteurs
adénoviraux.
Ces résultats constituent le premier succès d’un protocole de thérapie génique en cancérologie. L’association
de thérapeutiques classiques et d’un transfert de gène
est une voie très prometteuse qui permet de potentialiser l’efficacité de deux stratégies d’action. L’avenir de
la thérapie génique en cancérologie passe probablement par de telles associations, tout le moins, tant que
durera la phase de mise au point de vecteurs performants.
Des chercheurs ont étudié un Adénovirus présentant
une mutation du gène de la protéine E1B. Ce virus est
appelé ONYX-015; non seulement il peut se répliquer
dans les cellules dont la protéine p53 est anormale,
mais encore il est inoffensif pour les cellules dont la
protéine p53 est normale. Ces observations ont été à la
base du traitement expérimental de 30 patients en récidive d’un cancer épidermoïde de la sphère ORL. En
effet, une mutation du gène p53 est mise en évidence
dans 47 à 70% de ces tumeurs. Le protocole thérapeutique associait une chimiothérapie systémique (cisplatine et 5-fluorouracil) et une injection intra-tumorale
unique du virus ONYX-015.
RÉFÉRENCES.
W.F. ANDERSON : Gene therapy scores against cancer. Nature Med 2000; 6: 862-3.
F.R. KHURI, J. NEMUNAITIS, I. GANLY et col : A
controlled trial of intratumoral ONYX-015, a selectively replicating adenovirus, in combination with cisplatin and 5-fluorouracil in patients with recurrent
head and neck cancer. Nature Med 2000; 6: 879-85.
Une réponse objective a été obtenue chez 63% des
patients, avec 26,5% de réponses complètes. Des
tumeurs jusqu’à 10 centimètres de diamètre ont totalement disparu. Aucun des patients ayant eu une répon-
1035
mais qui est soumise au médicament actif par effet de
voisinage (effet “by stander”)
Figure 7 : Stratégie suicide de thérapie génique. Le gène transduit code le plus souvent pour une enzyme de conversion d’un
pro-médicament en médicament cytotoxique.
1036
Figure 8: Stratégie anti-sens de thérapie génique. Le gène transduit code pour un ARNm miroir (ou anti-sens) qui reconnait
son image (ARNm sens) et bloque la traduction ou synthèse protéique.
1037
Figure 9a :Thérapie génique stratégie immunomodulatricepar sur-expression antigénique
Figure 9b : Stratégie immunomodulatrice par production de cytokines
1038
La procédure consiste à prélever des cellules tumorales et à les cultiver. On y transfère ex vivo, à l’aide
de rétro-virus, le gène thérapeutique [62], on les
irradie (pour leur faire perdre toute capacité de réplication) et on les réinjecte (en sous cutané ou dans la
tumeur) [63]. Ce protocole a initialement été utilisé
pour traiter les mélanomes et les cancers du sein
(puis les adénocarcinomes rénaux, vésicaux et prostatiques), permettant ainsi d’observer une diminution de la taille tumorale [64, 65].
Mais cette technique est d’une grande complexité
[66]. En vue de la simplifier, donc de la fiabiliser,
des protocoles in vivo, par injection intra-tumorale,
ont été développés avec succès [67]. Des essais de
phase I, pour la sur-expression de l’Il-2 et du GMCSF [68], ont montré l’absence d’effet secondaire
dans les cancers du rein et de la prostate [69].
II. UTILISATION EN PATHOLOGIE
PROSTATIQUE
Plusieurs voies d’administration in vivo ont été testées, la meilleure rentabilité étant obtenue par injection intra-prostatique directe [70].
Les principales caractéristiques des protocoles cliniques sont rappelées dans le tableau 2.
1. STRATÉGIE CORRECTIVE.
Le gène p53 est la clef de voûte du système de sauvegarde cellulaire en cas d’altération de l’ADN
nucléaire, si bien qu’il est désigné comme le “gendarme” du génome. Il présente des mutations dans
environ la moitié des tumeurs solides.
En effet, 60% des lignées de cancer de prostate utilisées in vitro pour la recherche présentent de telles
mutations [71]. Chez la Souris athymique (nude
mouse), la transfection du gène p53 sauvage dans
des xénogreffes de lignées p53 déficientes a résulté
en une décroissance de tumorigénicité et de prolifération cellulaire [72].
Toutefois, 80% des formes sporadiques de cancer de
prostate sont indemnes d’altérations de p53, tempérant ainsi l’interprétation de ces résultats. Ainsi, une
étude s’est fixée pour but de corriger les altérations
de p16, protéine impliquée dans le système de sauvegarde orchestré par p53. Elle a permis une diminution in vitro et in vivo, chez la Souris nude, de la
prolifération cellulaire et de l’augmentation de survie des animaux traitées [73].
2. STRATÉGIE CYTOTOXIQUE .
L’injection du gène thymidine kinase (TK), dans une
tumeur sous-cutanée chez le Rat, a montré une inhibition de croissance tumorale [74]. La même procédure, dans un modèle de Souris, a mis en évidence
l’inhibition de métastases pulmonaires, avec un effet
immunomodulateur grâce aux cellules natural killer
[75, 76]. Ces résultats ont justifié un essai de phase I
pour tester l’injection intra-prostatique directe d’un
adénovirus porteur du gène TK (Adv-HSV-TK) [68].
Cette méthode a prouvé sa sûreté pour les patients et
le personnel soignant.
L’isolement du promoteur du PSA [78, 79, 80] a permis de montrer son androgéno-dépendance et sa spécificité pour les cellules épithéliales prostatiques, in
vitro et in vivo [58, 81, 82, 83]. Ainsi, a-t-on réalisé
une construction PSA-HSV-TK, c’est à dire un gène
TK dont l’expression, sous la dépendance du promoteur du PSA, est strictement confinée à l’épithélium
prostatique. Cette construction, insérée dans un adénovirus (Adv-PSA-HSV-TK), a été délivrée dans des
modèles murin sous-cutanés d’une lignée androgéno-dépendante (PC3), très agressive et d’une lignée
mieux différenciée (LnCaP). Son efficacité a été
prouvée sur la diminution de la croissance tumorale
et l’augmentation de survie des animaux [84, 85].
Des protocoles de phase I sont en cours, où le promoteur du PSA régule l’expression intra-prostatique
de gènes cytotoxiques (TK et cytosine deaminase
entre autre) [86, 87, 88, 89]. L’un d’entre eux [89]
est parvenu à démontrer l’inocuité d’une telle istratégie par injection intra-prostatique, chez des
patients en récidive locale après irradiation. Trois
patients ont vu leur taux de PSA décroître de 50%
pendant 6 ou 12 mois. Par ailleurs, l’injection répétée d’un Adv-HSV-TK, en intra-prostatique chez 52
patients présentant un adénocarcinome localisé, ne
s’est compliquée que d’effets secondaires transitoires [90].
D’autre s stra tégies mérite nt d’être citées, bien
qu’elles ne se soient pas montrées probantes tant in
vivo qu’in vitro. Un adénovirus a été modifié, afin
qu’il ne puisse se répliquer que dans les cellules
prostatiques, où il est cytolytique [91]. Une étude de
phase I a testé, dans des métastases osseuses, un
gène suicide sous le contrôle du promoteur de l’ostéocalcine [92] ou de la kallikréine 2 [93], ainsi que
sous celui d’un promoteur sensible à la chaleur, permettant de commander l’expression du gène en
chauffant le tissu infecté [94].
1039
Tableau 2 : Protocoles cliniques de thérapie génique du cancer de prostate (selon M.S. Steiner).
Phase du protocole
Type de vecteur
Gène transféré
Mode de transfert
Type stratégie
Lieu de transfert
I/II
Rétrovirus
GM-CSF
Ex vivo
Protectrice
I/II
Rétrovirus
I 1-2 + INF-
Ex vivo
Immunomodulatrice
I
Rétrovirus
myc anti-sens
In vivo
Intra-prostatique
Anti-sens
I
Pox virus
PSA
In vivo
Intra-dermique
Immunomodulatrice
I
AAV et Liposome
Il-2
Ex vivo
Immunomodulatrice
I
Adénovirus
HSV-TK
In vivo
Intra-prostatique
Cytotoxique
I
Pox virus
PSA
In vivo
Intra-dermique
Immunomodulatrice
I/II
Pox virus
PSA
In vivo
Intra-dermique
Immunomodulatrice
I
Liposome
Il-2
In vivo
Intra-tumoral
Immunomodulatrice
I
Adénovirus
HSV-TK
In vivo
Intra-prostatique
Cytotoxique
I
Adénovirus
p53
In vivo
Intra-tumoral
Cytotoxique
I/II
Rétrovirus
GM-CSF
Ex vivo
Protectrice
I/II
Adénovirus
p53
In vivo
Intra-prostatique
Cytotoxique
I/II
Adénovirus
HSV-TK
In vivo
Intra-prostatique
Cytotoxique
I/II
Pox virus Il-2
Non précisé
Immunomodulatrice
I/II
Adénovirus
p16
In vivo
Intra-prostatique
Cytotoxique
I
Adénovirus
HSV-TK sous
la dépendance
du promoteur
de l’ostéocalcine
In vivo
Intra-tumoral
Cytotoxique
I
Adénovirus
Réplication virale
lytique dans les
cellules exprimant
le PSA
In vivo
Intra-prostatique
Cytotoxique
1040
3. STRATÉGIE IMMUNOMODULATRICE
1. STRATÉGIE CORRECTIVE
Le gène de l’Interféron- , cytokine fortement impliquée dans les phénomènes inflammatoires, a été
testé en transfection rétrovirale hétéro et orthotopique sur la lignée PC3, très métastatique. Il a été
observé une réduction de l’indice de prolifération
cellulaire, une diminution du potentiel métastatique
de la tumeur et une diminution de la néo-angiogénèse, phénomènes accompagnés d’un effet “by stander“ [95].
Les cibles potentielles sont nombreuses [106].
Quant à la transfection adénovirale du gène du
“Tumor Necrosis Factor ” (TNF- ) elle sensibilise
les cellules PC3 à la radiothérapie [96].
Dans un modèle sous-cutané (lignée MatLyLu) chez
le Rat Dunning (R3327), la transfection rétrovirale
du gène de l’Il-2 ex vivo a permis la disparition de la
tumeur et l’obtention d’une vaccination anti-tumorale [97]. Le GM-CSF s’est montré aussi efficace pour
conférer une immunité anti-tumorale [98]. Toutefois,
l’efficacité est moindre dans les modèles orthotopiques [99]. Un protocole de thérapie génique ex
vivo est en cours de phase I; il consiste en l’injection
de cellules d’une lignée prostatique humaine
(LNCaP) irradiées et modifiées pour produire à la
fois de l’IL-2 et de l’INF- [100]. Selon le même raisonnement, un protocole de phase I a obtenu une
réponse lymphocytaire B et T après vaccination par
des cellules prostatiques autologues irradiées et
modifiées pour produire du GM-CSF [101]. L’essai,
probablement le plus intéressant, a utilisé un adénovirus porteur du gène de l’interleukine 2 (Il-2), chez
des Souris porteuses d’une tumeur orthotopique et
de métastases pulmonaires. L’injection du virus dans
la tumeur primitive a amené, non seulement une
réduction de 50% de la tumeur primitive et un allongement de la survie des animaux, mais encore une
disparition des métastases pulmonaires [102].
III. UTILISATION EN PATHOLOGIE
VESICALE
La voie d’administration intra-vésicale est simple,
malgré l’importante quantité de vecteur qu’elle nécessite. Mais l’infection rétrovirale est faible [103] et les
lignées tumorales n’expriment que peu de récepteurs
membranaires aux adénovirus [104]. La récente
obtention d’une amélioration du rendement de l’infection adénovirale reste à confirmer [105].
Des altérations du gène du rétinoblastome (Rb, gène
suppresseur de tumeurs) sont impliquées dans le
développement tumoral vésical [107, 108]. Ainsi,
une stratégie de remplacement par un Adv-Rb, dans
une lignée déficiente, a permis une diminution de la
synthèse d’ADN et de la prolifération cellulaire.
Mais certaines lignées transfectées avec le gène Rb
restent malignes [109]. Ces observations sont en
faveur du caractère tardif des altérations de Rb, qui
ne seraient que les marqueurs d’une agressivité
tumorale particulière, et par là même, n’en feraient
pas des cibles idéales [110, 111].
En revanche, les altérations du gène p53 sont des
événements précoces de la tumorigénèse vésicale
[112]. Un Adv-p53 s’est montré efficace, non seulement in vitro, mais aussi en injection intra-tumorale,
dans un modèle sous-cutané murin, sur la diminution
de la croissance tumorale et sur l’augmentation de la
survie [113].
La protéine p21, comme p16, est impliquée dans le
système de sauvegarde cellulaire commandé par
p53. Le gène p21 est exprimé de façon très hétérogène par les cellules vésicales tumorales. Ainsi, la
surexpression de p21, porté par un adénovirus, a
stoppé la croissance tumorale (sans toutefois induire
de mort cellulaire) [114].
2. STRATÉGIE CYTOTOXIQUE .
La transduction du gène TK a diminué d’un facteur
dix le taille tumorale dans des modèles murins [115,
116]. Ces résultats ont été confirmés avec un AdvHSV-TK en administration orthotopique. Mais l’infection se limitait aux couches superficielles [117].
3. STRATÉGIE ANTI-SENS
L’expression de l’oncogène c-myc est responsable
de la résistance au cisplatine. Elle est corrélée à la
progression des tumeurs de vessie. La transfection
du gène anti-sens de c-myc a permis de restaurer une
sensibilité au cisplatine à une lignée cellulaire vésicale tumorale exprimant c-myc [118]. Ce protocole
apparaît très prometteur.
4. STRATÉGIE IMMUNOMODULATRICE .
Des travaux initiaux ont montré qu’un BCG modifié
pouvait exprimer le gène de l’Il-2 [119, 120].
1041
Depuis, des preuves de l’efficacité d’une combinaison d’immunothérapie intra-vésicale standard et de
thérapie génique se sont accumulées [121, 122].
L’étude d’un modèle murin othotopique a fourni des
résultats prometteurs. Le protocole consistait en la
transduction ex vivo par des liposomes porteurs soit
du gène de l’Il-2, soit du gène de la protéine B7 du
complexe majeur d’histocompatibilité. Les cellules
étaie nt ensuite réinjectées en intra-péritoné al.
L’expression du gène de l’Il-2 doublait la survie des
animaux. La co-expression des gènes de l’Il-2 et
d’HLA-B7 obtenait 75% de rémission complète
durable et la durée de survie des animaux était supérieure à celle observée lors de l’expression isolée du
gène de l’Il-2 [123]. La production locale d’Il-2, par
infection ex vivo avec un rétrovirus, présente un effet
antitumoral sur un modèle murin de xénogreffe. Cet
effet, potentialisé par la co-injection d’Il-18, serait
médié par l’INF- [124]. L’administration intra-vésicale d’un Herpès virus-Il-2 a permis une infection
efficace et l’obtention de taux urinaires élevés d’Il-2
[125].
Un essai de phase I, avec administration intra-vésicale de Pox virus, chez des patients devant subir une
cystectomie, a confirmé l’absence de toxicité, l’efficacité de l’infection et l’importance de la réponse
inflammatoire induite [126].
IV. UTILISATION EN PATHOLOGIE
TESTICULAIRE
En dépit des anomalies génétiques répertoriées dans
les cancer testiculaires [127, 128, 129], la compréhension de leur tumorogénèse n’en est qu’à ses
débuts.
Si les protocoles de chimiothérapie permettent des
taux de guérison élevés, ils sont grevés d’une toxicité médullaire notable. Or, l’introduction ex vivo du
gène de résistance à la chimiothérapie (gène MDR1) dans des cellules souches hématopoïétiques peut
prévenir de telles complications [86].
Pour autant, il n’est pas prouvé que l’utilisation de
plus fortes doses améliorerait les résultats des chimiothérapies. De plus, l’absence de progrès à court
terme dans la prévention de leurs autres complications reste un facteur limitant.
V. UTILISATION EN PATHOLOGIE
RÉNALE
La complexité de l’organe autorise plusieurs voies
d’administration des vecteurs: artérielle, veineuse
rétrograde, urétérale rétrograde, sous-capsulaire et
intra-parenchymateuse. L’administration systémique
est, elle aussi, envisageable depuis l’identification de
séquences spécifiques à l’endothélium rénal [130]. Il
apparaît nécessaire de choisir la voie appropriée en
fonction du type cellulaire choisi comme cible.
Les techniques ex vivo sont l’apanage des études
physiopathologiques, quel que soit le type de cellule
considéré.
L’injection intra-artérielle directe d’un liposome a
permis la transfection de 15% des cellules glomérulaires [131]. Un liposome cationique, injecté par
voie urétérale rétrograde, a faiblement infecté les
cellules tubulaires [132, 133], suffisamment toutefois pour corriger transitoirement un déficit en anhydrase carbonique dans un modèle animal [134].
Si les rétrovirus n’ont montré aucune efficacité dans
les reins normaux, les adénovirus s’y sont révélés, en
revanche, très intéressants. Leur administration urétérale rétrograde fournit une infection tubulaire marquée [135]. L’injection artérielle sans clampage ne
donne qu’une faible infection tubulaire, alors que le
clampage avec réfrigération et utilisation de vasodilatateurs permet une infection des cellules de la médullaire externe [136]. Deux équipes ont utilisé une technique de perfusion continue de solution virale sur rein
isolé, porcin pendant 12 heures et humain pendant 48
heures. L’infection a intéressé, chez le Porc, les cellules glomérulaires [137] et, chez l’Homme, les cellules tubulaires, surtout corticales [138].
1. STRATÉGIE CORRECTIVE.
Le cancer du rein est un modèle privilégié de thérapie génique corrective grâce aux progrès dans la
compréhension des mécanismes moléculaires de sa
cancérogénèse et à l’implication dans celle-ci des
altérations du gène de la maladie de VON HIPPELLINDAU (gène VHL) [139, 140, 141]. Certaines
mutations avérées de ce gène ne conduisent pas systématiquement au développement d’une tumeur
[142]. Elles impliquent d’autres facteurs génétiques
ou des facteurs épigéniques [143], qui restent tout de
1042
même fidèle au modèle de KNUDSON. Toutefois,
l’inactivation fonctionnelle ou la perte des deux
allèles du gène VHL sont observées dans la majorité
des cancers du rein à cellules claires [144]. La perte
d’hétérozygotie au locus VHL suggère que l’inactivation de la protéine du gène VHL est une étape précoce de l’établissement de ces tumeurs, conférant au
gène VHL le rôle de gardien «gatekeeper» de la voie
de la transformation (par analogie avec le rôle du
gène APC dans la carcinogénèse colo-rectale). Le
gène VHL est impliqué dans le développement et la
différenciation des tubules rénaux. Il régule le
niveau d’expression de nombreux facteurs de croissance (VEGF, le transporteur de glucose GLUT-1,
PDGF, TGFß, …). Ces régulations expliquent le
caractère hyper-vasculaire de ces tumeurs et permet
de leur supposer un rôle dans la réponse au stress,
comme le stress lié à une diminution de la pression
partielle en oxygène. La production de haut niveaux
de VEGF et de GLUT-1 en conditions normoxiques
par les cellules ayant perdu les deux allèles VHL
renforce cette hypothèse (R1). Seule la réintroduction de la forme sauvage du gène VHL dans ces cellules permet de retrouver une production de VEGF
et de GLUT-1 inductible par l’hypoxie. L’ hypervascularisation de ces tumeurs résulterait bien de la
production de ces facteurs angiogéniques, normalement induits par l’hypoxie sous le contrôle du gène
VHL. De même, la réintroduction, au moyen d’un
liposome, du gène VHL dans une lignée de cancer
du rein déficiente a supprimé spécifiquement la
croissance des cellules rénales cancéreuses [145].
Le gène p53 a aussi été impliqué dans la cancérogénèse rénale. Sa transduction par un liposome a, in
vitro, diminué la croissance tumorale et a, in vivo
dans un modèle de xénogreffe murine, diminué le
nombre de métastases pulmonaires, sans qu’aucun
effet sur la tumeur primitive ne soit mis en évidence
[146]. L’administration systémique du liposome-p53
ne transduit pas significativement la tumeur primitive du fait d’une importante captation hépatique
[147]. Un Adv-p53, injecté dans une tumeur (lignée
Renca) chez le Rat, a diminué la prolifération cellulaire avec un effet «by stander» [148].
2. STRATÉGIE CYTOTOXIQUE .
Parce que le cancer du rein est très richement vascularisé, la stratégie cytotoxique est axée sur l’inhibition de l’angiogénèse tumorale. L’expression du
gène de l’endostatine [149], dans un modèle de
xénogreffe, s’est montrée efficace. Les cellules de la
lignée humaine SN16PM6 sont très tumorigènes et
très métasatiques lorsqu’elles sont utilisées en xénogreffes. Toutefois, après leur infection ex vivo par un
rétrovirus porteur du gène NOS (codant pour l’enzyme productrice du monoxyde d’azote), cette lignée
ne peut donner que de petites tumeurs ne métastasant
pratiquement pas [150].
3. STRATÉGIE ANTI-SENS .
Le gène Pax-2 joue un rôle clé dans l’embryogénèse
rénale et urétérale. L’inhibition de l’expression de
Pax-2, in vitro, par un nucléotide anti-sens a diminué
la prolifération d’une lignée tumorale rénale humaine [151].
4. STRATÉGIE IMMUNOMODULATRICE .
La voie de l’immunomodulation a été ouverte par
l’administration de la protéine Il-2 en clinique
humaine [152].
Une première approche, chez le Rat, montra l’inhibition de la croissance tumorale lors de la co-injection de cellules de lignées tumorales et de ces mêmes
cellules transduites ex vivo par le gène de l’Il-2
[153]. L’efficacité était plus grande lors de la production intra-tumorale d’Il-2, que lors de sa sécrétion à distance. Une étude, de phase I/II, utilise un
plasmide comme vecteur du gène de l’Il-2. Son
administration dans des tumeurs primitives, ayant
métastasé, a montré l’inocuité de ces injections.
Deux patients sur 18 ont eu leur maladie stabilisée
[154]). D’autre part, une équipe a, toujours lors d’un
essai de phase I, obtenu, par leucophérèse, des lymphocytes T spécialisés dans la sécrétion de cytokines
appelés cytokine induced killers (CIK). Ils les ont
transformés à l’aide d’un plasmide afin qu’ils produisent de l’Il-2. Ils ont ensuite réinjecté ces CIK
transformés dans le sang périphérique de patients
porteurs de cancers rénaux métastatiques chez qui ils
avaient été prélevés. Ils ont alors observé une augmentation des taux sériques d’INF- , de TGF-ß et de
GM-CSF, ainsi qu’un accroissement des lymphocytes CD3+, sans effet secondaire [155].
Des approches de vaccinations anti-tumorales par Il4, HLA-B7 et INF- se sont toutes montrées prometteuses [156]. Un protocole de phase I chez
l’Homme a montré l’absence de toxicité de la thérapie génique ex vivo par transfection rétrovirale du
gène du GM-CSF dans des cellules de cancer de
1043
rein. De plus, une réponse partielle a été enregisrée
chez un des patients [157].
Enfin, une étude mérite une attention toute particulière. Des tumeurs, établies chez la Souris à partir de
la lignée Renca, ont été traitées par le gène de l’Il-12
porté par un vecteur non viral: un polymère de vinyl.
L’expression d’Il-12 a entraîné l’augmentation de
l’infiltration tumorale par des cellules natural killer,
des lymphocytes CD4+ et CD8+, ainsi que la surexpression des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité. Non seulement 50% des animaux traités ont rejeté leur tumeur, mais encore il fut alors
impossible d’établir de nouvelles tumeurs Renca
chez les Souris répondeuses. Elles étaient immunisées contre cette lignée cellulaire [158].
La fibrose interstitielle et glomérulaire observée
dans les glomérulonéphrites chroniques reste non
réversible malgré les différentes stratégies déployées
[164].
3. INSUFFISANCE RÉNALE CHRONIQUE.
Le maintien d’un taux d’hématocrite de base satisfaisant peut être obtenu par thérapie génique corrective, en exprimant ex situ (dans le foie ou la moelle
osseuse) le gène de l’érythropoïétine [165, 166, 167,
168, 169]. L’administration intra-musculaire du gène
de l’érythropoïétine féline, porté par un AAV, augmente le taux d’hématocrite de chats normaux pendant 7 semaines [170].
II. IMPUISSANCE
C.UTILISATION EN
PATHOLOGIE BENIGNE
Bien qu’aucune anomalie génétique spécifique ne
soit impliquée dans les troubles de l’érection, la thérapie génique n’est pas pour autant exclue de leur
prise en charge thérapeutique.
I. PATHOLOGIE RENALE
La verge, isolable temporairement de la vascularisation systémique par simple garrottage à sa base, est
un organe facilement accessible à l’administration
de solutions virales. Son faible débit sanguin augmente le temps de contact entre vecteur et endothélium et participe à une expression prolongée du
transcrit.
1. POLYKYSTOSE
RÉNALE.
L’identification des gènes PKD 1 et 2 a suscité des
espoirs de thérapie génique correctrice de la polykystose rénale [159, 160]. Mais la longueur du gène
PKD 1 (13 Kb) et la nécessité d’une transfection
stable et intense restent des obstacles non encore
franchis.
Le Rat Han:SPRD est un excellent modèle de polykystose rénale dominante [161]. Non seulement l’injection intra-artérielle d’un adénovirus est parvenue
à y infecter certains kystes, mais encore, son administration urétérale rétrograde a permis une infection
intense du parenchyme, prédominante dans les zones
les plus touchées par la maladie [162].
Les protocoles ont pour but de rétablir l’équilibre
entre la contraction et la relaxation musculaire.
Ainsi, l’injection intra-caverneuse d’ADN nu,
codant pour un canal potassique (hSlo), a permis
l’augmentation significative de la pression intracaverneuse, pendant l’érection et ce pour une durée
de 1 à 3 mois [171, 172].
L’injection intra-caverneuse, chez le Rat, de l’ADN
nu du gène NOS a conduit à l’amélioration de la
qualité des érections [173].
2. GLOMÉRULONÉPHRITES .
L’implication de médiateurs de l’inflammation et de
cytokines dans la physiopathologie des glomérulonéphrites aiguë est établie. Parmi eux, le TGF-ß est
prépondérant. Or la décorine est une protéine chélatrice, qui, fixant le TGF-ß libre, diminue ses effets
biologiques. L’expression ex situ du gène de la décorine (dans la moelle osseuse) a eut un effet positif
dans un modèle de glomérulonéphrite aiguë [163].
III. STENOSES URÉTÉRALE ET
URÉTHRALE
Le transfert, dans la paroi artérielle, de gènes inhibant l’hyperplasie intimale a ouvert une nouvelle
voie dans le traitement de la re-sténose après dilatation des sténoses athéromateuses [174]. Or, le déve1044
loppement d’une fibrose exubérante, entravant la
cicatrisation des fibres musculaires, est responsable
des échecs (40 à 50%) du traitement endo-urologique des sténoses urétérales. Il est donc apparu que
la production locale, par thérapie génique, de facteurs inhibant cette fibrose était une option de choix.
Sur un modèle original de re-sténose urétérale chez
le Porc [175], un adénovirus a été délivré par voie
endo-urétérale au cours même de la dilatation de la
sténose. Cette procédure a permis l’expression, dans
des cellules stromales enserrées par la fibrose, du
gène porté par l’adénovirus [176] Par analogie, sur
un modèle original de sténose uréthrale chez le lapin,
la même procédure a montré la faisabilité du transfert de gène au sein de la fibrose par un vecteur,
adéno ou rétroviral [177]. Ces résultats laissent
entrevoir des perspectives novatrices pour le traitement des processus fibrotiques pathogènes, tant urétéraux qu’uréthraux.
D. TRANSPLANTATION
La prévention du rejet par thérapie génique présente
l’avantage de pouvoir produire la molécule in situ,
limitant ses complications somatiques et réduisant
les doses nécessaires [178].
La première stratégie a été de bloquer la réponse
lymphocytaire T par sur-expression du ligand de Fas
dans le transplant [179]. En effet, le gène Fas est
activé au cours de l’activation lymphocytaire T.
Dans ces conditions, la liaison de Fas avec son
ligand est inductrice d’apoptose [180], alors que la
co-expression de Fas et de son ligand, observée dans
le rein normal, n’y induit pas d’apoptose [181]. Mais
cette même co-expression, lorsqu’elle a lieu dans les
îlots pancréatiques b, induit, cette fois encore, une
apoptose [182]. De plus, l’expression isolée du
ligand de Fas, dans les îlots pancréatiques, induit une
infiltration neutrophilique massive qui les détruit
[183].
Le blocage lymphocytaire T peut être obtenu par le
blocage de leur co-stimulation. Cette co-stimulation
est essentiellement induite par l’interaction entre la
protéine HLA-B7, exprimée par les macrophages
activés, avec la protéine CTLA4, exprimée par les
lymphocytes T. Le masquage d’HLA-B7 par des
protéines solubles, obtenues par fusion de CTLA4
avec une immunoglobuline, a prolongé la prise de
greffes allo et xénogèniques [184]. Un foie allogénique, transfecté par le gène de la protéine de fusion
CTLA4-immunoglobuline porté par un adénovirus,
a été protégé du rejet [185]. Cette même stratégie a
connu un succès semblable dans un modèle de transplantation pancréatique [186].
Une autre stratégie de tolérance consiste à faire
exprimer chez le receveur, avant la transplantation,
les protéines du CMH I ou II du donneur. La réinjection de fibroblastes, transfectés ex vivo par les
gènes du CMH du donneur, a induit une suppression
de la réponse immunitaire dans la transplantation
cardiaque a llogénique c hez la Souris [187].
L’injection intra-thymique, chez le receveur, de
myoblastes, transfectés par les gènes du CMH I du
donneur, a permis une suppression immune spécifique lors de la transplantation allogénique chez le
Rat [188].
Enfin, l’expression du gène du TGF-ß1, par un transplant cardiaque, a allongé significativement sa tolérance en allogreffe chez la Souris, sans altérer pour
autant l’immunité systémique [189]. Cette stratégie
a obtenu les mêmes résultats sur la survie de greffes
d’îlots pancréatiques [190, 191].
E. CONCLUSION
Cet aperçu confirme la place grandissante que prend
la thérapie génique dans les domaines d’application
de l’urologie.
S’il est fréquent d’entendre qu’aucun protocole clinique de thérapie génique n’a prouvé d’efficacité
thérapeutique, en dehors d’anecdotiques améliorations individuelles, il ne faut pas omettre de rappeler
que plus de 77% de ces protocoles sont en phase I,
c’est à dire, et par définition, des études de faisabilité, de pharmacocinétique et de toxicologie. Ils
n’étaient donc pas élaborés en vue de prouver leur
potentiel thérapeutique. Cependant, le premier succès semble bien avoir été obtenu par une équipe
française [52].
Bien avant qu’un patient ait pu être guéri grâce à
elle, la thérapie génique avait déjà largement participé à la compréhension de nombreux processus biologiques et l’un de ses mérites les plus remarquables
est de rapprocher chercheurs fondamentalistes et cliniciens.
1045
Et les cliniciens auront, eux aussi, très bientôt à leur
disposition cette nouvelle arme thérapeutique qui, si
elle n’est encore qu’une forme galénique, est appelée à devenir, lorsque la régulation fine des gènes et
la réparation de l’ADN seront maîtrisés, le véritable
“médicament absolu”.
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