Genie_Gen-6-ThérapieGénique.pdf Thérapie génique : Stratégies et vecteurs Principe : utiliser l'ADN comme médicament. Certaines maladies sont dues à une altération du génome : Maladies génétiques : myopathies, mucoviscidose, immunodéficience Maladies acquises : cancers, infections L'apport d'un gène fonctionnel peut alors rétablir la fonction déficiente 1 Présentation générale 1.1 Définition de la thérapie génique A form of molecular medicine based on the addition of a corrected copy of a gene to the somatic celles of an individual in order to cure or alleviate his disease. This strategy may provide new treatments for a large number of inherited diseases in the near future. 1.2 Pathologies concernées – – maladies monogénétiques maladies plurigénétiques (plus difficiles à traiter) 2 populations cellulaires cibles : – – ¢ souches accessibles ¢ entièrement différenciées, post-mitotiques à durée de vie longue 1.3 Historique 1989 : 1er transfert de gène pour le traitement de mélanome (Rosenberg) 1990 : 1er essai de thérapie génique approuvée patiente atteinte d'immunodéficience : défaut dans le gène codant l'adénosine désaminase (ADA). Traitement par les cellules sanguines de la patiente préalablement transfectées avec un gène ADA sain (Blaese, Calver, Anderson). Juin 2007 : 1346 essais de thérapie génique en cours dans 28 pays (essais cliniques ou approuvés) La plupart d'entre eux sont en phase 1 en majorité concernant les cancers et maladies monogéniques. Genie_Gen-6-ThérapieGénique.pdf 2 Méthodes pour la thérapie génique somatique Transfert du gène dans les cellules somatiques ex vivo (le plus fréquemment)) Application pour les tissus accessibles Inection in vivo au niveau de l'organe cible localement : plasmide nu : gene gun injection localement dans un tissu : vecteurs viraux recombinant systémique : ADN empaqueté (liposome...) 2.1 Traitement in vivo de la mucoviscidose Maladie génétique due à la mutation du gène CFTR Utilisation d'un aérosol de particules virales recombinées pour action locale au niveau pulmonaire. Fréquence 2.2 Vecteurs utilisés en thérapie génique Adénovirus Rétrovirus ADN/plasmide nu Liposome 2.2.1 Vecteurs viraux Propriétés d'un vecteur viral idéal : – n'induit pas de pathologie 8 – production facile et reproductible à haute concentration (> 10 particules virales/mL) – expression génique à long terme par insertion dans le génome ou expression épisomique persistante. – Expression génique régulable – Expression tissu-spécifique – Immunogénicité faible 2.2.2 Adénovirus Virus à ADN double brin linéaire de 30 à 38 kb Structure eicosahédrique (20 faces), au moins 10 protéines différentes Génome adénoviral code 11 protéines différentes Gènes précoces E Gènes tardifs L ITR : inverted terminal repeat : importantes L'adénovirus comme vecteur de thérapie génique 1ère génération : délétion de E1, E3 mais gènes viraux encore nombreux => réaction immunitaire 2e génération : délétion de davantage de gènes viraux mais toujours petite réaction immunitaire gutless : suppression des différents gènes. Pour produire des adénovirus gutless, il faut utiliser des adénovirus helper => problème pour la séparation des adénovirus recombinants des adénovirus helper => choix orienté vers des stratégies permettant de déléter le génome : utilisation de la stratégie CreLox (cf TD) Genie_Gen-6-ThérapieGénique.pdf 2.2.3 Rétrovirus Famille de virus enveloppés à ARN trouvés chez tous les vertébrés – γ – rétrovirus : virus simples ne sont efficaces que sur les cellules en division, pas sur les cellules quiescentes LTR – – ψ Gag Pol LTR Env Lentivirus Spumavirus (inefficace sur les cellules quiescentes) } Organisation plus complexe avec gag, pol et env + d'autres gènes codant des protéines virales Réplication des virus sauvages Vecteur dérivé de MoMLV (virus de la leucémie murine de Moloney) Remplacement des gènes Gag, pol et env par le gène thérapeutique Encapsidation du gène thérapeutique dans la capside et l'enveloppe virale Production de virus recombinants dans les ¢ d'empaquetage Vecteurs dérivés du lentivirus Transfection possible de cellules quiescentes Avantages et inconvénients de vecteurs viraux en thérapie génique => développement de vecteurs non viraux pour le transfert de gènes. 3 Production à l'échelle industrielle Titres viraux élevés Infection de cellules quiescentes ou en division Non intégration dans le génome de la cellule hôte Taux d'expression élevé – idéal pour la transfection transitoire de cellules Tropisme large mais possibilité de cibler la nature des protéines présentes sur la capside et donc de cibler le virus Réaction du système immunitaire quasiment absente pour les vecteurs gutless si purification correcte