D1-UE7-Doray-mutations_génétiques-27.03.17-pdf
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UE7 - Génétique Pr Doray Date : 27/03/15 Promo : 2015-2016 Plage horaire : 08h30-10h30 Enseignant : Dr Doray Ronéistes : AHMADALLI Farah DER KASBARIAN Léa Les mutations géniques I. Introduction II. Mutations acquises et constitutionnelles III.Les différents types de variations génomiques IV.Micro-lésions du génome V. Interprétation des données mutationnelles VI. La mucoviscidose NE PAS APPRENDRE LES NOMBRES Page 1 sur 26 I. Introduction On va s’intéresser à tout ce qui concerne les mutations de gènes, les différents types de mutations : on parle de mutations géniques et non génétiques. A l’échelle moléculaire, le patrimoine génétique peut se présenter sous la forme de : Chromosomes (enroulé), ADN non enroulé L’ADN est une double hélice constituée de bases : Puriques (cytosine et thymine), Pyrimidiques (adénine et guanine). Les gènes sont les constituants de notre ADN. Ils vont avoir un rôle extrêmement important, notamment dans le développement embryonnaire et le fonctionnement de nos cellules. Cette diapo montre que 97% à 98% de gènes sont communs à des espèces aussi différentes au premier abord que la drosophile; or finalement nos séquences d’ADN sont assez proches. Chez la bactérie, les gènes (assez proches de ceux de l’Homme) rendent compte de la quasi-totalité de l’ADN (intermédiaire chez la drosophile), tandis que chez l’Homme les gènes constituent une infime partie de l’ADN. Ils sont en effet sépares par de l’ADN non-codant (en jaune), très peu présent chez la bactérie, plus chez la drosophile. La constitution du gène elle-même est différente selon les espèces. Mais pour certains gènes intervenant dans le métabolisme de base, si l’on regarde uniquement la partie codante (= les exons), la séquence est vraiment très proche : c’est la constitution au niveau de l’ADN qui diffère. Page 2 sur 26 En résumé Si l’on compare la bactérie, la drosophile et l’Homme au niveau de leurs séquences codantes (gènes), on observe de grandes similitudes. Mais leurs génomes ne sont pas constitués de la même façon : la bactérie a un génome compact, dense et majoritairement constitué de gènes. Chez l’Homme, la majorité du génome est constituée de séquences non codantes (présence d’exons, à l’origine de l’ARN et de la protéine et d’introns, beaucoup plus longs). Les introns n’existent pas chez la bactérie. Cet ADN non codant chez l’Homme va amener de la variabilité ; les introns vont permettre l’expression différentielle des gènes selon l’organe et selon la chronologie. 1.Le génome humain Environ 30 000 gènes, soit 5% du génome seulement avec : - 20% exons ou séquences codant pour des ARN fonctionnels : - 20 364 gènes : environ 200 000 exons donnent 200 000 ARNm puis protéines, - 9 673 petits ARN fonctionnels auront une fonction propre sans traduction (ARNt, ARNr, microARN…). - 80% d’introns : séquences non codantes intra-géniques (rôle important dans l’expression des gènes). → Séquences codantes en minorité; le rôle des introns n’a pas encore totalement été élucidé. Le reste… (95% du génome) avec des : - Séquences « non-codantes » conservées entre les espèces (drosophile, mammifères), - Séquences répétées non-codantes non-conservées (LINE, SINE, autres), - Séquences non répétées non-codantes non-conservées (y en a plein), - Hétérochromatine centromérique (constitue le centromère, ADN non-codant qui occupe une place relativement importante). Page 3 sur 26 ! L’ADN codant est donc extrêmement minoritaire, tout le reste étant de l’ADN non codant, répétitif. Les années à venir vont nous permettre de savoir à quoi servent ces variations d’ADN répétitif, certainement un rôle dans la prédisposition ou la protection à/de certaines maladies. En effet : parfois des mutations dans l’ADN non-codant dans certaines pathologies qui va avoir un impact direct sur l’expression de certains gènes, mais pour l’instant cela reste très minoritaire. Séquence typique (« canonique ») = séquence d’ADN typique du patrimoine génétique humain, établie en 2001 à partir d’un pool d’ADNs (de témoins, non-malades, par petits fragments) avec 99% de la séquence totale établie. Cette séquence représente en quelque sorte une moyenne. La séquence canonique est théorique. Il y a de très nombreux variants entre les individus (cela ne correspond ni à votre génome ni au mien) : - 10% de notre génome est variable, - Personne ne possède la même séquence canonique, - Entre 2 individus, 1 différence toutes les 1 000 pb. -> très utile en médecine légale Donc on est tous mutants, mais pas tous porteurs de maladies génétiques ! En CGH array, on trouve souvent une variation; mais on a tous des variations; cela n’explique pas forcement la pathologie. En médecine légale, grâce aux empreintes génétiques, si l’on n’était pas tous différents, l’ADN d’un suspect ne pourrait être identifié ! Il faut donc faire la différence entre ce qui est variable et amène une pathologie ou ce qui relève simplement d’une diversité. Page 4 sur 26 2.Définitions Mutation : tout changement intervenu dans la séquence de l’ADN sans préjuger de sa pathogénicité (qui entraîne ou pas une maladie). On parle ainsi de « variant » (en anglais HGV = Human Genetic Variation). Ces termes sont employés par les biologistes moléculaires. Mais en génétique humaine, on parle de mutation lors de mutation pathogène et de variant lors de modification de séquence (pathogène ou pas). Parmi les variants génétiques, certains sont communs, d’autres rares. Ils sont définis par la fréquence de l’allèle minoritaire : - Variants communs >1% dans la population = polymorphismes (définition stricte : variant commun retrouvé dans plus d’1% de la population considérée, pas pathogène mais peut participer à la prédisposition). - Variants rares <1% dans la population, la majorité de ces mutations sont silencieuses (ne donnent pas de pathologie). Ces variations sont des moteurs de l’évolution au niveau génomique, constituent la source de diversité entre individus. Une minorité est à l’origine des maladies génétiques monogéniques : mucovisidose, myopathie de Duchenne (le variant correspond a une mutation : gêne CF de la mucoviscidose), et des variants donnant des prédispositions génétiques aux maladies multi-factorielles : mutation délétère ou pathogène. Mais la majorité des variants sont neutres = aucun effet Les conséquences d’une variation dépendent de son effet fonctionnel (au niveau de l’ARNm, protéine) : - Aucune conséquence : neutre, - Amélioration d’une fonction (diversité, évolution) : a permis l’adaptation, - Altération d’une fonction (effet pathogène). 3.Etiologie D’ou viennent ces mutations ? On a une exposition permanente de l’ADN à des agressions : - Exogènes (radiations, agents génotoxiques environnementaux), - Endogènes (radicaux libres impliques dans le vieillissement …). Erreurs de réplications et accidents de recombinaison (ADN polymérase se trompe parfois en remplaçant une base par une autre ou en rajoutant tout un tas de bases), Machinerie de réparation cellulaire : corrige la plupart des anomalies mais si échappement (si problème dans la machinerie ou trop de radiations : UV, rayons X), la machinerie de réparation est débordée et n’a pas les moyens de corriger cette erreur), il y aura une mutation. Ex : xeroderma pigmentosum : (+++ dans l’Océan Indien) : gène XP dont l’objectif est de réparer l’ADN double brin suite notamment aux agressions UV. Si mutation dans ce gène -> anomalies de réparation cellulaire et les enfants atteints developpent plus facilement des tumeurs au niveau cutanée et des cataractes précoce : ils doivent se protéger entièrement du soleil Syndrome de Cockayne : maladie génique autosomique récessive Anomalies de la machinerie de réparation cellulaire -> désordres neurologiques et tumeurs précoces Page 5 sur 26 Plus fréquent à La Réunion du a une mutation spécifique que l’on retrouve (3 enfants à La Réunion en 3 ans vs 3 enfants à Strasbourg en 15 ans). Maladie de la réparation cellulaire qui se caractérise par : Gros retard de croissance intra-utérin qui s’aggrave à la naissance. Ils ont un poids de 2,5kg à la - naissance et un retard de croissance phénoménal à 2 ans. - A 2/3 mois, un visage normal puis à l’âge de 2 ans un visage oedematieux avec des joues creuses, des yeux enfoncés. Plus de graisse péri-orbitaire, fonte de tissu adipeux (élément diagnostic). Atteinte cérébrale cognitive très importanté associée à un retard de croissance. - Après exposition au soleil : coups de soleil (même si crème solaire) avec un aspect érythémateux traduisant une sensibilité cutanée ++ aux rayons UV. Ces coups de soleils entrainent des erreurs au niveau cellulaire, notamment au niveau de la peau, des erreurs qui ne sont pas corrigées et donnent une peau fine, atrophique : c’est une mauvaise réparation.. Le pronostic vital est engagé entre la première et la deuxième décennies. En résumé Le syndrome de Cockayne est une affection responsable d’un retard de croissance extrêmement sévère pdt la période prénatale, mais également post-natale avec des enfants de plus en plus maigres et petits, un périmètre crânien qui grandit très mal au cours de la 1e année de vie. Ces enfants vont avoir un gros retard neurologique avec une atrophie cérébrale progressive. Mais ce qui fait surtout penser à ce type de pathologie, c’est la photosensibilité de ces enfants (avec cataracte précoce). C’est une maladie épouvantable, pas si rare que ça à La Réunion.C’est une maladie autosomique récessive, avec des mutations dans un gène impliqué dans la réparation de l’ADN (ces enfants sont très mal protégés des UV). II. Mutations acquises et constitutionnelles 1.Mutations acquises = somatiques Mutations apparues dans une cellule somatique d’un tissu (pas présente initialement au nv de l’oeuf). Acquises car non-présentes initialement dans le génome de la cellule. Peuvent être à l’origine d’un clone cellulaire porteur de la mutation, ne concernent qu’un seul ou quelques tissus. On peut en retrouver dans certaines cellules sanguines, au niveau du rein, de l’oeil : elles se multiplient tout au long de la vie, peuvent perdre le contrôle. Elles sont impliquées dans le cancer, notamment lorsque la cellule ne rentre pas en apoptose. Non-transmissibles à la descendance (sauf si ces mutations ont lieu dans les cellules germinales). Impliquées dans la formation de cellules tumorales. Dans tout cancer on aura des mutations somatiques 2.Mutations constitutionnelles - Mutations apparues avant ou au cours de la fécondation. Soit nouvellement apparues (parents non-porteurs : exemple lors de la formation de l’œuf), Page 6 sur 26 - Soit transmises de génération en génération (voir mode transmission, maladie autosomique dominante). Mutations apparues lors de premières divisions du zygote donc nouvellement apparues. Présentes dans toutes les cellules somatiques ET germinales de l’individu. Transmissibles (à la génération suivante). Mutation « de novo » ou « néo-mutation» (absente chez les parents, grands-parents, apparue dans une des gamètes des parents) : mais cette mutation (touchant toutes ses cellules) est transmissible à la génération suivante (avant fécondation, pendant les premières divisions du zygote 2/4/6/8 cellules; après c’est une mutation somatique). ! Etude de Nature qui montre le taux de néo-mutations chez le nouveau-né en fonction de l’âge des parents. En fonction de l’âge de la mère, le risque chromosomique augmente (anomalie de disjonction chromosomique du à la quiescence des ovocytes tout au long de la vie). En fonction de l’âge du père, c’est le risque de mutations de novo génique (en particulier pour des maladies dominantes) qui augmente. Dans le trio 1, on voit que le père a 22 ans et la mère 19 : quand on regarde les mutations de novo chez l’enfant il y en 48 ( 39 viennent du père, 9 de la mère). La majorité n’aura aucun effet, mais il peut y avoir une mutation survenant dans un gène d’importance qui ne va pas fonctionner et cela va être responsable d’une maladie. Globalement c’est lié à l’âge : dans le trio 5, le père 40 ans et la mère 39 ans il y a 106 mutations qui sont apparues chez l’individu, dont une majorité vient du père (91). A chaque génération, on a de nouvelles mutations, de nouveaux variants, la majorité ne feront rien et la totalité n’auront aucune conséquence du point de vue médical; mais parmi les 100 mutations, il y en aura peutêtre une qui va entrainer une pathologie. On le voit bien en clinique avec l’achondroplasie (revu en TD). Dans l’achondroplasie (autosomique dominante), sujet évident qui présente un nanisme : le diagnostic est immédiat (1m20 pour une femme et 1m30 pour les hommes). Les parents ne sont pas atteints, mais ils ont un enfant malade. On remarque que c’est lié aux gamètes du père, dont l’âge est assez avancé (45 ans/50 ans). La majorité de ces néo-mutations sont apparues au niveau du gamète et viennent du père. Page 7 sur 26 Mutations germinales : surviennent lors de la méiose dans une cellule germinale, le plus souvent dans un gamète paternel. Elle est transmissible à la génération suivante qui va l’avoir dans toutes ses cellules. Toujours parmi les mutations constitutionnelles, il y a les mutations germinales : mutations survenant lors de la méiose dans une cellule germinale (gamète parental, paternel). Elle est forcément présente de façon constitutionnelle chez l’individu issu de ce gamète, porteur d’une mutation de novo, non présente dans les cellules somatiques du parent qui lui a transmis cette mutation. Myopathie de Duchenne : mosaique germinale : risque de 10% : Récessive liée à l’X. Si une femme a un garçon A. atteint et qu’on essaie de trouver l’origine il se peut fortement qu’on ne retrouve rien chez la mère si on étude son génome au niveau de ses cellules sanguines. Il ne faut pas alors faussement rassurer la femme en lui disant que ca ne se reproduira pas pour ses autres grossesses. Il se peut que cette mutation chez son garçon A soit une mutation de novo mais il se peut aussi que cette mutation ne soit présente que dans les cellules germinales de cette femme sous forme de mosaique germinale. Et il existe plusieurs maladies dominantes liées à l’X présente chez l’enfant et où on ne retrouve rien chez les parents car les mutations ne sont pas présentes au niveau des cellules somatiques mais seulement au niveau des cellules germinales et parfois même sur une partie mais pas la totalité des cellules germinales : c’est la mosaïque germinale. Page 8 sur 26 III.Les différents types de variations génomique (= types de human genomic variations) MACROLESIONS Nous allons voir différents types de polymorphismes : 1.CNVs (Copy Number Variations) Une autre classe de polymorphisme : les CNVs Variations du nombre d’exemplaires contigus (3 à 4 au lieu d’une) de grands segments génomiques (perte ou gain de fragments > 1000 nt à plusieurs Mb) dans un endroit du génome. 15% du génome humain est représenté par ces CNVs dont la quantité peut varier. Pour 1 individu : env. 700 délétions de CNV + duplications : difficile à évaluer car moins pathogène, elle ne donne aucun signe on doit être aussi à 700, dont 40 impliquent des gènes. Est-ce que cela va avoir un effet pathogène ? Cela on ne sait pas ! La CGH-Array permet de mettre en évidence ces CNVs jusqu’a plusieurs megabases Ces CNV sont référencés dans bases de données (> 65 000 CNVs) qui nous permettent de dire si c’est pathogène ou pas. (Tien un tel est retrouvé chez des suets sains et d’autres récurrents dans une patho) Pas retenir les nombres exacts (juste savoir qu’on en a beaucoup) 2.InDels (passe vite ) Ce sont des insertions ou des délétions moins grandes qu’un CNV : segments <1000 nt. >1.500.000 indels répertoriés. Pour 1 individu : 350 000 indels donc porteurs de très nombreux indels (les chiffres ne sont pas à retenir) dont 500 impliquent des gènes (pathogène ou non, c’est à voir !). Ce sont de petits segments de notre génome (200/300), supplémentaires (insertions) ou manquants (délétions). En CGH Array on n’arrive pas à les mettre en évidence. 3.Polymorphismes de répétition Retrouvés dans l’ADN non-codant. Utilisées en médecine légale. C’est une séquence répétée en tandem de nombreuses fois, à partir de motifs de longueur variable (de quelques unes à plusieurs centaines de bases). Par exemple, un motif de 15 nucléotides répété 2 fois chez un 1 er individu et 5 fois chez un autre. Suivant la taille, on les nomme différemment : - Microsatellites (di-tri nucléotides) fréquents +++, diagnostic on s’en sert beaucoup. Principe de la médecine légale (on va tester 200/300 à des régions diverses du génome, tel endroit CA répétés 4 fois, GC répétés 10 fois et si l’on a dans un autre génome la même région ou un CA répété 10 fois et GC répété 4 fois, on ne parle probablement pas du même individu. Page 9 sur 26 Ces microsatellites viennent de la maman et du papa, du coup dans la fratrie est -e qu’on a les mêmes ? Normalement ils sont hérités, donc identiques mais peuvent parfois muter et subir une mutation par hasard. On a les chromosomes suivants : permet de determiner l’origine parentale (maternelle ou paternelle) d’une mutation Chromosome 1 (parent 1) |(CA) rep 15 | (GC) rep 10 Chromosome 1 (parent 2) | (CA) rep 20 | (GC) rep 15 - Mini-satellites (motifs répétés de 10 à 20 nt), - Satellites, - Méga-satellites (centaines de bases répétées). Ce sont ces polymorphismes de répétition dont on se sert pour différencier des individus d’une même famille. Ce qui est différent, polymorphe ce n’est pas la séquence mais le nombre de répétition ! On se sert plutôt des micro-satellites IV.Micro-lésions du génome 1.Généralités Ce sont des anomalies à l’échelle du gène (séquence codante ou non-codante) : - Substitution (change 1 base en une autre) - Insertions et/ou délétions d’un ou quelques nucléotides, - Insertions et/ou délétions de quelques dizaines à centaines de nucléotides, - Mutations instables (voir cours) par répétitions de di-tri nucléotides, - Plus rarement : inversions (par exemple l’hémophilie A avec inversion d’un intron), mutagénèse induite par des éléments mobiles… 2.Principaux types de micro-lésions Substitutions (type le plus fréquent : 70% des mutations) Remplacement d’un nucléotide par un autre : ✓ Transition : remplacement (Adénine ou Guanine) par l’autre purine ou d’une pyrimidine (Cytosine ou Thymine) par l’autre pyrimidine, ✓ Transversion : changement d’une pyrimidine en purine ou inversement. Page 10 sur 26 Mécanismes de survenue : ✓ Erreurs du système de réparation +++(comme syndrome de Cockayne, votre ADN est expose a des radiations, des UV, etc), ✓ Erreurs de réplication ayant échappé au système de réparation, ✓ Perturbations biochimiques dues à des agents physiques ou chimiques ou produits par le métabolisme endogène. Parmi ces susbstitutions, on identifie lesSNPs : Single Nucleotide Polymorphisms Polymorphismes de substitution au niveau d’un nucléotide : variation de séquence ponctuelle Très nombreux (>107 par génome humain) et répartis dans tout le génome (environ 1SNP tous les 300 pb) : - dont env. 25.000 SNP dans les exons, - plus de 2500 mutations non-synonymes/ individu, - 25 000 SNP dont 10 à 30 variations délétères rares (< 0.5%). La plupart des SNP ne sont pas délétères et apporte plus de 80% de la variabilité d’expression génétique. Ces SNP sont référencés dans des bases de données (on sait qu’à tel endroit du génome on va retrouver préférentiellement une variation). Servent donc à l’identification en médecine légale. Ces SNP auront des effets différents selon l’endroit où ils sont localisés : - Régions non-codantes (introns ou ADN extragénique) : fréquents et stables dans la population, avec des différences ethno-géographiques +++, ils ne seront pas associés à un caractère pathogène - Régions codantes (exons) : cela peut n’avoir aucun effet car le code génétique est dégénéré, parfois, CGG c’est la même chose que CTG et cela donne le même acide aminé malgré le changement d’une base; aucune conséquence. Mais s’il y a une modification de séquence ARNm ± modification de la séquence protéique, variants ou mutations délétères. - Région régulatrice (promoteur en amont du gène, interrupteur du gène allumé/éteint en fonction de nos stades : puberté, adolescence, etc) qui pourra entraîner des modifications de la traduction : soit gène + transcrit soit moins transcrit ; peut entrainer une extinction du gène. La majorité de ces SNP sera sans effet. Page 11 sur 26 Insertions et/ou délétions d’un ou quelques nucléotides Accidents de « dérapage réplicatif » impliquant les ADN polymérases (erreur lors de la réplication de l’ADN lorsqu’elles voient 30 CAG au lieu de 5 parce qu’elles doivent tout recopier : elles se plantent et on aura peut-être 100 CAG), notamment au niveau de certaines séquences répétées : soit elles oublient de recopier certaines bases, ou inverse elles repassent à un endroit où elles étaient déjà passées et recopient des bases en plus : insertion. Insertion (gain) et/ou délétion (perte) d’un ou de quelques nt supplémentaires par rapport à la séquence initiale. Insertions et/ou délétions de 10aines à 100aines de nucléotides - Impliquent des fragments, voire la totalité d’un ou de plusieurs exons et/ou introns. - Mécanismes : réparation incomplète de lésions de l’ADN ou anomalies de recombinaison ou de réplication (attention ici ce n’est plus l’ADN polymérase qui est en jeu, c’est vraiment une erreur de réparation). Ces insertions et délétions sont moins fréquentes que les substitutions ! Mutations instables (on le verra dans un autre cours) Page 12 sur 26 3.Conséquences des microlésions Les conséquences délétères des microlésions du génome dépendent essentiellement de leur localisation et de leur type. On a deux grandes catégories d’effets délétères : perte et gain de fonction. Ces effets délétères ont un impact fonctionnel au niveau de l’ARN messager et/ou de la protéine. Perte de fonction (prot fabriquée mais effet nul) - Effet délétère au niveau de l’ARN messager : régulation de la transcription par altération de la maturation de l’ARNm (notamment épissage) ou par altération de la stabilité de l’ARNm entraînant sa destruction. Ceci va conduire à une diminution ou absence complète de production de la protéine active. (myopathie de Duchenne : mutations -> souvent instabilité de l’ARNm -> absence de protéine) - Effet délétère au niveau de la protéine (ARNm est correcte) ✓ qui peut être produite mais instable et dégradée : effet délétère se manifeste si le niveau résiduel (= la quantité) de protéine fonctionnelle passe en-dessous d’un seuil. C’est la cause majoritaire des maladies autosomiques récessives (classiquement) : la présence d’une seule copie mutée sera insuffisante pour franchir le seuil. Ex : hémophilie : ARN normal mais pas de protéine ou protéine diminuée : protéine<1% : hémophilie majeure ; prot > 10% hémophilie mineure avec peu de signes Il nous faut les deux allèles, les deux formes du gène pour arriver à fabriquer la protéine en quantité suffisamment importante pour avoir un effet. Si vous êtes hétérozygotes sains, vous n’en produisez que la moitié, mais 50% suffisent, il n’y a pas de signe. Si vous avez les deux gènes mutés, vous n’en produisez quasiment plus, vous passez en-dessous d’un seuil, là la maladie apparaît. Il y a une grande diversité de mutations au niveau du gène : hétérogénéité allélique. ✓ qui peut être produite mais non fonctionnelle (pas dégradé) : «haploinsuffisance». On a un effet délétère dominant : la présence d’une seule copie mutée est suffisante pour franchir le seuil «haploinsuffisance» et être responsable de l’anomalie. Retrouvé dans les maladies autosomiques dominantes : 1 allèle normal et un muté, la protéine est produite mais non fonctionnelle. Il suffit de cette seule copie mutée pour franchir le seuil de l’anormalité, et on aura des signes. Gain de fonction - Effet délétère lié à l’acquisition d’une nouvelle fonction délétère pour la cellule. - Cause majoritaire des maladies dominantes. - Résulte habituellement d’un effet délétère au niveau de la protéine : ✓ Effet dominant négatif : le produit protéique de l’allèle muté antagonise (empêche la fonction) le produit de l’allèle normal (en particulier lorsque le produit du gène agit sous la forme de dimère ou polymère). Page 13 sur 26 ✓ Effet toxique : la mutation conduit à l’acquisition d’une nouvelle fonction cellulaire délétère, ou suite à un excès de fonctionnement cellulaire) Dans le syndrome de Wolf-Hirschhorn, c’est une délétion au niveau du chromosome 4 (4p16) : soit on le voit déjà, soit il faut faire de la FISH (retard de croissance, microcéphalie..). L’achondroplasie, c’est la maladie d’un gène, c’est plus petit. Le gène de l’achondroplasie est au niveau de la région 4p16, la mutation de l’achondroplasie est une mutation de ce type là, gain de fonction. Quand on est dans cette région 4p16, avec une perte de fonction, comme dans le syndrome de WolfHirschhorn, on a un phénotype complètement différent. Pour avoir l’achondroplasie, il y a gain de fonction, finalement une mutation qui fait que votre protéine a un effet différent . Exemple de maladie avec gain de fonction : la drépanocytose : La drépanocytose est une maladie qui correspond à une anémie falciforme. Hémoglobine = 2 chaines alpha globines + 2 chaines bêtaglobines. Dans la drépanocytose on a quasiment toujours la même mutation (99%) donc le diagnostic est simple : au niveau du gène de la bêtaglobine, codon 6, une glutamine est remplacé par une valine = β 6Glu-Val. La protéine est toujours produite mais elle est anormale : en forme de faucille. L’homozygote mutant, du fait de cette mutation, ne peut plus transporter l’O2 (hémoglobine anormale). Les globules rouges qui portent ces hémoglobines anormales auront une forme en faucille, d’où l’expression d’ « anémie falciforme ». Page 14 sur 26 Ce n’est pas un défaut de synthèse de l’hémoglobine, mais une hémoglobine anormale qui fait que les GR prennent cette forme. Ils auront du mal à circuler dans les vaisseaux, ils forment des thrombus au niveau des petits vaisseaux, capillaires : risque de nécrose. L’organisme se dit « je détruis ». On aura une hypertrophie de la rate (cimetière des GR), hypersplénie or attention rate = protection infection. Comme on détruit nos GR, on aura également une anémie. Autrefois, la drépanocytose était considérée comme une pathologie extrêmement grave, maintenant on sait la prendre en charge, notamment en hydratant et en évitant certaines complications et infections. Le pronostic est meilleur, mais l’espérance de vie est de 40-50%. On s’était souvent posé la question : qu’est-ce qui fait que cette maladie pourtant grave et létale à court terme a malgré tout une fréquence en hétérozygote HbS supérieure à 10% dans certaines populations humaines? Réponse : c’est une maladie qui touche principalement l’Afrique noire. On s’est aperçu que les hétérozygotes HbS résistaient mieux au paludisme. C’est ce qui a permis la survie de cette population. Donc on voit que la forme HbS a une « nouvelle fonction » vis-à-vis du paludisme. C’est ce qui explique le grand nombre d’hétérozygotes dans ces régions où le paludisme est très fréquent. A l’état homozygote, cette mutation est extrêmement délétère, responsable de l’anémie falciforme. ! Conséquences des micro-lésions en fonction de leur type → Mutation de type isosémantique ou synonyme (en particulier pour les substitutions) : le codon muté code pour le même acide aminé car le code génétique est dégénéré. A priori sans effet pathogène : « mutation silencieuse » Ces mutations constituent une part importante des polymorphismes de type SNPs Parfois effet délétère : résulte non pas d’une modification directe de la séquence protéique mais d’un effet délétère de la mutation génomique sur un motif de séquence nucléotidique = Effet sur un motif impliqué dans l’épissage, Page 15 sur 26 Motif impliqué dans la régulation du niveau d’expression. → Mutation de type insertions et/ou délétions de nucléotide en séquence codante. L’effet dépend de la conséquence sur le cadre de lecture : o o o o Si mutation multiple de 3 nucléotides : pas de décalage, suivant la localisation au niveau de la protéine : toléré ou délétère (notamment si codon stop). Si mutation non-multiple de 3 nucléotides : décalage du cadre de lecture, survenue prématurée d’un codon stop avec = synthèse d’une protéine tronquée, instable et dégradée (effet perte de fonction) ou avec un effet dominant négatif (effet gain de fonction). Lésions délétères localisée en séquence codante (majorité), avec un effet direct sur la séquence en acides aminés de la protéine correspondante. Mutation de type faux-sens (FS) : le codon muté code un autre AA. P eut être tolérée par la cellule : pas d’effet pathogène (un acide remplacé par un autre acide très proche, exemple : Leu => Ile), on parle de polymorphisme (SNP). Il peut également y avoir un effet délétère : altération du repliement protéique, de la stabilité protéique, de domaines fonctionnels, de sites d’interaction avec d’autres protéines… de type perte de fonction ou gain de fonction. o Mutation de type non-sens (NS) : le codon muté code un codon stop. Codante ou noncodante avec effet délétère immédiat sur la régulation d’expression de la protéine. Une mutation n’est pas forcément pathogène. → Microlésions en séquence non codante Introns et régions inter-géniques : 95% du génome (junk DNA ou ADN poubelle). Ces régions sont importantes car comportent des séquences régulatrices essentielles pour l’expression des gènes. Les micro-lésions en séquence non-codante sont de même type que celles retrouvées en séquence codante : substitution ou délétion/insertion. Et elles vont avoir le même type d’effet : - Effet délétère de régulation de la transcription (mutation du promoteur, d’enhancer, de silencer), - Effet délétère sur la maturation de l’ARNm (et surtout épissage), - Effet délétère sur la stabilité de l’ARNm. Page 16 sur 26 Ces mutations sont très fréquentes au vu de la proportion de séquences non-codantes. Malheureusement on ne sait pas les rechercher par séquençage classique : d’où l’intérêt du séquençage haut débit. Ces mutations nous gênent beaucoup. Lorsqu’on rend un résultat de génétique moléculaire, on ne retrouve pas de mutations au niveau du gène. Tout simplement parce qu’on a recherché seulement au niveau des exons. Les introns sont très difficiles à étudier. C’est là que le séquençage haut débit nous permet d’être plus performant. V. Interprétation des données mutationnelles 1.Nomenclature des mutations Il existe une nomenclature officielle internationale pour la description des données mutationnelles : http://www.hgvs.org/mutnomen.Elle permet une description précise des variations de séquences d’un gène sur les plans génomique, transcriptionnel (ARNm) et protéique. Elle permet de décrire la localisation de la variation de séquence par rapport à la séquence codante sur le plan génomique (indiqué par c) ou sur le plan de l’ARNm (indiqué par r) du gène et le changement induit. En supplément, l’effet théorique attendu au niveau protéique est indiqué entre parenthèse, précédé de « p ». Il faudra indiquer la séquence de référence. Exemple : patient porteur de deux mutations à l’état hétérozygote dans le gène de la dysferline (gène impliqué dans certaines myopathies : séquence de référence GenBank NM_003494.2). Ce patient a une mutation au niveau des exons 9 et 18 : Exon 9 : c.895G>T (p.Gly299Trp) HTZ : substitution d’une Guanine par une Thymine dans l’exon 9 du gène de la dysferline responsable du remplacement d’un AA glycine par un AA tryptophane en position 299 de la séquence protéique (mutation Faux-Sens) Exon 18 : c.1617C>G (p.Tyr539*) HTZ : substitution d’une Cytosine par une Guanine dans l’exon 18 du gène de la dysferline responsable du remplacement d’un AA tyrosine par un codon STOP en position 539 de la séquence protéique (mutation non-sens). 2.Interprétation de données mutationnelles 2 situations possibles → variation de séquence préalablement décrite. → variation de séquence non-préalablement décrite. Consultation de bases de données mutationnelles : on rentre la variation écrite avec la bonne nomenclature et si elle a été préalablement décrite, on saura à quel phénotype elle correspond. (Portail de la plupart des bases de données http://www.hgvs.org). - Variation de séquence préalablement décrite : - Caractère délétère confirmé au préalable chez d’autres patients, - Sans effet pathogène dans la population générale (polymorphisme). Variation de séquence non préalablement décrite : o Situation plus difficile, o Type de mutation (NS, FS), o Etude de la ségrégation dans la famille, o Recherche de la variation dans une population, o Tests fonctionnels mais difficile en pratique courante, Page 17 sur 26 o Développement d’outils bio-informatiques permettant la modélisation et la prédiction de l’effet fonctionnel de variations de séquences : incontournable et primordial avec l’avènement des techniques d’analyse moléculaire à haut débit. Elle nous permet de dire si la mutation est conservée ou non au sein de l’évolution : si c’est un AA conservé au sein des espèces qui se retrouve muté, on a beaucoup plus de chance que ça soit pathogène. Parfois on n’arrive pas à conclure. VI. La mucovisicidose A. Généralités La plus fréquente des maladies génétiques, elle est autosomique récessive avec une prévalence de 1/2500 naissances. La fréquence des hétérozygotes (c’est-à-dire des porteurs sains) dans la population est de 1/25. Le mécanisme est une altération de la protéine CFTR (canal chlore) qui a une fonction de régulation des flux hydroélectrolytiques transmembranaires et de la qualité des sécrétions exocrines et entraine ainsi des atteintes classiques broncho-pulmonaire, digestive, ORL et secondairement cardiaque, métabolique ou endocrinienne. (influence le pronostic) B. Signes et symptômes 1) Atteinte broncho-pulmonaire - Poumons normaux à la naissance - Stade initial(1ers mois de vie): toux chronique, bronchites récidivantes (à partir de 3 bronchiolites = asthme du nourrisson), dyspnée. - Stade évolué : pneumopathie, dyspnée d’effort ou de repos, hémoptysies (atteinte de l'alvéole pulmonaire) - Colonisation précoce par 3 germes : Staphylococcus Aureus, Haemophilus Influenzae et Pseudomonas Aeruginosa marque un tournant pronostique : risque d’infection chronique. (de +en+ résistants aux atb) - Exploration fonctionnelle respiratoire → syndrome obstructif, distal au début, puis global → syndrome restrictif à un stade tardif (8-10 ans) 2) Atteinte digestive Occlusion basse néonatale - iléus méconial (occlusion intestinale du nouveau-né), pathognomonique : retard (> 36h de vie) ou absence d’émission du méconium, syndrome occlusif.. On fait dans ce cas un lavement aux produits de contraste hydrosolubles (diagnostic et souvent thérapeutique) ou intervenir chirurgicalement. L'occlusion néonatale est le 1er signe évocateur de la mucoviscidose, si pendant la grossesse on voit une hyper-échogénicité intestinale (due à l'accumulation de mucus dans l'intestin) on va devoir surveiller à la naissance que les premières matières fécales (méconium) soient correctement éliminées. Ces dernières étant très épaisses et visqueuses. La mucoviscidose, la trisomie 21 ou les infections virales peuvent être à l'origine de cette hyper-échogénicité. Une occlusion néonatale chez un nouveau-né sans malformation anatomique est une mucoviscidose jusqu'à preuve du contraire. Page 18 sur 26 Pancréas - atteinte constante (mauvaise absorption des graisses), très souvent symptomatique : diarrhée chronique de mal digestion des graisses avec stéatorrhée (selles abondantes, graisseuses, nauséabondes) entraînant un retard staturo-pondéral, une carence en vitamines liposolubles ADEK, acides gras essentiels et oligoéléments. - rarement : pancréatite aiguë. - biologie : stéatorrhée, tubage gastrique avec étude des sécrétions pancréatiques. - Traitement de substitution par gélules (enzymes digestives manquantes) et il faudra un régime protéique et glucidique plus important. Hépatobiliaire - Nouveau-né : ictère cholestasique persistant (bon pronostic) - Enfant mais surtout l'adolescent : cirrhose biliaire, fibrose hépatique, lithiases vésiculaires… → conditionnent de façon très importante le pronostic 3) Atteinte métabolique - Intolérance au glucose (pancréas endocrine) - Diabète type I lié a l’atteinte pancréatique le plus souvent. - Retard pubertaire lié à une insuffisance hormonale (surtout du point de vue nutritionnel) 4) Atteinte génitale - Stérilité masculine (95% des cas) par atteinte des canaux déférents On a souvent des consultations d'hommes pour infertilité. Ce n'est pas une agénésie des canaux déférents mais une atrésie qui entraîne une azoospermie excrétoire : c'est à dire que les spermatozoïdes sont correctement produits mais pas excrétés. Cela peut être la seule manifestation de la mucoviscidose. Mais attention ce couple dont le père a juste cette anomalie peut quand même avoir un enfant atteint de la mucoviscidose, il faudra absolument rechercher chez les parents. 5) Atteinte ORL - Polypose sinusienne - Sinusite chronique, bronchite chronique fréquentes 6) Atteinte cardiaque - Atteinte du myocarde pouvant entraîner une myocardiopathie C. Diagnostic Cette pathologie est dépistée de façon systématique à la naissance (depuis 2003) mais ça n'est pas valable partout. Par exemple à Mayotte ce n'est pas encore mis en place. - Test de dépistage avant 1 mois : trypsine immunoréactive sanguine (à 3j de vie, en même temps que le dépistage de la phénylcétonurie, de l’hypothyroïdie de la drépanocytose et de l’hyperplasie congénitale des surrénales). On ne dose pas chez les prématurés, car ce n’est pas valable. Si cette trypsine immunoréactive est modifiée, on craint une éventuelle mucoviscidose, on ira dans ce cas à la biologie moléculaire. - Test de la sueur (à partir de 4 kg, vers 5-6mois) : dosage du Cl- sudoral après application de pilocarpine au niveau du front (entraîne une réaction cutanée faisant apparaitre la sueur). Pathologique si Cl> 60 mEq/l à 2 reprises car justement le canal chlore est atteint du coup on aura un excès de chlore au niveau cutané. Dosé généralement chez ces enfants qui font des bronchiolites à répétition. - Diagnostic de certitude : recherche des mutations. Page 19 sur 26 - Diagnostic prénatal → si mutations préalablement identifiées chez l'enfant et parents hétérozygotes : biopsie de trophoblaste dès 12 SA, amniocentèse dès 16 SA (ça nous permet d'avoir des cellules avec l'ADN et on va regarder au niveau du gène quelles mutations il possède, on le fait s'il y a des ATCD ou des signes à l'écho) → Présence de signes échographiques : intestin hyperéchogène → Recherche de mutations chez les parents → Dosage des enzymes digestives dans liquide amniotique (caryotype + recherche virale) + mutations D. Evolution - Médiane de survie = 40 ans (elle était de 20 ans avant les années 2000) C'est extrêmement variable selon la forme de la mucoviscidose. Elle cite une anecdote d'un homme qui a consulté dernièrement pour bronchopathie chronique qui fume beaucoup et un diabète. Elle pensait que ça serait intéressant pour la famille et les risques possibles, elle n'y croyait pas trop mais au final c'était le cas. - Décès par insuffisance respiratoire chronique - Facteurs de gravité = Digestifs (dénutrition, cirrhose avec hypertension portale et insuffisance hépatique chronique, résection du grêle, hémorragie digestive par Hypertension portale) = Respiratoires (Insuffisance respiratoire chronique, pneumothorax et pneumo médiastin, infections à Pyocyanique, à virus, à aspergillus) = Myocardiopathie E. Traitement 1) Mesures générales - ALD 30 = les patients sont donc pris en charge à 100% pour tout ce qui concerne la mucoviscidose. - Associations de malades (donne vraiment des aides au quotidien) - Prise en charge multidisciplinaire, soutien psychologique, maintien du cadre familial, insertion scolaire, sports non violents, éducation (toux, auto-kiné). 2) Respiratoire - Kiné respiratoire 2 fois par jour, même en l’absence de symptômes. - Aérosols ou mucolytiques avant les séances pour dilater les bronches. - Antibiotiques : cures adaptées, chambre implantable à discuter car infection chronique à Pyocyanique très compliquée et impossible à éradiquer (au départ par voie orale mais après implantation de chambre, surtout pour aminosides) - Intercure : aérosols d’antibiotiques, alternance Bactrim-Ciflox. - Oxygénothérapie selon épreuves fonctionnelles respiratoires, gaz du sang. - Vaccinations normales + grippe + pneumocoque - Si atélectasie persistante : broncho-aspiration. - Inhalations : bronchodilatateurs ou corticoïdes selon EFR Aérosols de DNAse [Pulmozyne] : fluidification bronchique - Transplantation pulmonaire si IRpC sévère (greffe cardiopulmonaire ou bipulmonaire) si pas le choix 3) Nutrition - Régime hypercalorique (130%) - Enzymes pancréatiques gastroprotégées [Créon] : on donne à ces patients les enzymes que leur pancréas n’est plus capable de produire, pour empêcher les stéatorrhées et diarrhées (mais c'est quand même pas normal) - Vitamines, oligoéléments - Augmenter les apports sodés si forte chaleur ou gastro-entérite. - Nutrition entérale nocturne si anorexie et stagnation pondérale. Page 20 sur 26 - Traitement anti RGO Bien surveiller car dénutrition impacte vraiment le pronostic des patients. 4) Thérapie génique - Objectif = apporter le gène fonctionnel aux cellules afin de permettre la synthèse de la protéine - Gène introduit grâce à des vecteurs d’origine virale (adénovirus) ou synthétiques (liposomes). - Plus d’une vingtaine d’essais réalisés en Europe et aux EU : résultats encourageants mais modestes gène transféré, bien toléré mais transitoire (en effet les cellules de la muqueuse respiratoire ont un renouvellement très rapide). On est donc encore au stade expérimental concernant la thérapie génique, mais on peut espérer des avancées dans le futur. La difficulté est que c'est une maladie générale qui n'atteint pas que le poumon et difficile de faire arriver l'allèle normal du gène au niveau des différentes cellules. Les cellules pulmonaires sont en plus difficiles d'accès car dans l'alvéole pulmonaire, profond. F. Gène et protéine - Gène CF : 250 kb sur le chromosome 7 en 7q31 - >1200 mutations identifiées sur ce gène. Cela rend compliqué la recherche : on a pas identifié toutes les mutations et l'objectif c'est de regarder tout le gène, ça prend beaucoup de temps alors si c'est un enfant ça va, si c'est un nourrisson avec un intestin hyperéchogène le temps presse. Ce n'est pas comme la drépanocytose où c’est toujours la même mutation). - Code la protéine CFTR → Cystic Fibrosis Conductance Regulator → Régulateur transmembranaire → Rôle de canal pour l’ion chlorure dans les cellules épithéliales → 1480 AA Mutations Mutations les plus fréquentes du gène CF observées grâce à une étude collaborative en France - ΔF508 : 67,18% (plus de 2/3) - G542X : 2,86 % - N1303K : 2,10% … L’origine ethnique peut influencer sur les mutations (il y a deux mutations en plus à rechercher systématiquement chez les patients réunionnais). La seule mutation à retenir est la ΔF508. - Protéine CFTR = protéine complexe servant de canal ionique - Constituée de plusieurs domaines - Assure le transport du chlore à travers la membrane des cellules épithéliales, c'est-à-dire des cellules situées à la superficie des bronches, des canaux pancréatiques, hépatiques, des canaux déférents, des canaux des glandes sudoripares Page 21 sur 26 G. Structure de la protéine H. Mutations affectant CFTR Très peu commenté En gros c'est une protétine complexe avec plein de domaines Besoin d'ATP pour fonctionner Ne pas apprendre les différentes classes Elle veut qu'on retienne le principe elle s'en fout que classe 1 = synthèse, classe 2 = maturat°… Elle les met mais faut retenir ce qui est atteint pas que telle classe fait ça. Retenez le principe. Page 22 sur 26 Classe 1 : défaut de synthèse au niveau de l’ARNm. Classe 2 : défaut de maturation de l’ARNm (Pas de maturation au niveau de l’appareil de Golgi). Classe 3 : défaut d’activation de l’ARNm. Classe 4 : le canal arrive bien en position transmembranaire mais défaut de conductance. Classe 5 : Pas assez de protéines qui arrivent au niveau transmembranaire. Classe 6 : Le canal est bien en position transmembranaire qui arrive bien à faire passer le chlore mais avec une moindre efficacité. 1) Classe 1 Protéine absente, perte de conductance au chlore. → Mutation qui affecte la production de la protéine. Il n’y a pas de transcription du gène en ARNm stable. CFTR n’est donc pas produite → Mutation non-sens → Mutations de décalage de la phase de lecture → Environ 50% des mutations du canal CFTR affectent la synthèse de l’ARNm. 2) Classe 2 Protéine reste localisée dans le cytoplasme → Mutations perturbant les processus de maturation cellulaire de la protéine → Exemple de la mutation ΔF508 (elle ne s'appelle plus comme ça carla classification a changé mais on va continuer à l'appeler comme ça) Page 23 sur 26 3) Classe 3 - Mutations entraînant un défaut de régulation du canal chlore - Mutations au niveau des sites de fixation à l’ATP NBF1 et NBF2 - La protéine mutée est correctement synthétisée et localisée mais ne peut pas être activée ou à une fonction de canal CL- anormale - La mutation G551D est incluse - fréquente 4) Classe 4 - Anomalie de conduction - Mutations altérant la conductance et les mécanismes d’ouverture et de fermeture du canal (sélectivité ionique). - Ce sont des mutations des régions transmembranaires (la protéine est bien en place mais les transports des différents ions (sauf Cl-) vont être modifiés). Page 24 sur 26 5) Classe 5 - Diminution du nombre de canaux chlore par défaut de synthèse des protéines CFTR - Défaut d’épissage altérant la stabilité de l’ARN messager CFTR et diminution de la quantité de protéine fonctionnelle On peut avoir un phénotype très peu présent. 6) Classe 6 - Diminution du nombre de canaux chlore - Mutations affectant la stabilité de la protéine, les protéines arrivent jusqu’à la membrane mais la majorité d’entre elle sont éliminés à ce niveau. Page 25 sur 26 I. Génotype et phénotype - Maladie autosomique récessive→ Phénotype s’exprime si 2 allèles CFTR portent une mutation entraînant une perte de fonction de la protéine CFTR. → Perte de fonction de la protéine CFTR plus ou moins grave selon le type de mutation. → Toutes les combinaisons sont possibles - Fonction pulmonaire, âge de début et taux de Cl- dans la sueur peu corrélés à un génotype particulier. - Relation génotype / phénotype très difficile pour la grande majorité des mutations. Il y a en effet différentes combinaisons de mutations possibles, de différentes classes, qui rendent assez complexe une prédiction phénotypique. Toutes les combinaisons sont possibles, c'est très très variable. - ΔF508 → plus de la moitié des patients : Forme classique (forme grave qui se manifeste dès la petite enfance) Malade homozygote (exemple : ΔF508 en deux exemplaires, le cas le plus fréquent) On peut également avoir 2 mutations du gène mais différentes entre elles, dans ce cas on parlera d’hétérozygotie composite. → Si hétérozygote composite ΔF508 / A455E : Atteinte pulmonaire modérée (fréq à la réunion) - R117H → forme adulte avec atteinte des canaux déférents Page 26 sur 26
