etude de l`activite immunomodulante de peptides issus des

ARNAUD JACQUOT
ETUDE DE L'ACTIVITE IMMUNOMODULANTE DE
PEPTIDES ISSUS DES PROTÉINES DU
LACTOSERUM BOVIN
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de Maîtrise en Sciences et Technologie des Aliments
pour l'obtention du grade de maître es sciences (M. Se.)
DÉPARTEMENT DES SCIENCES DES ALIMENTS ET DE NUTRITION
FACULTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
DÉCEMBRE 2007
© Arnaud Jacquot, 2007
I
RÉSUMÉ
De nombreuses études ex vivo et in vivo ont montré que certaines protéines du lactosérum
(P-lactoglobuline, oc-lactalbumine et lactoferrine) et que des ingrédients à base de protéines
du lactosérum (WPC, WPI) peuvent influencer la réponse immunitaire. Plusieurs études ex
vivo ont aussi montré que des hydrolysats enzymatiques des protéines du lactosérum
possèdent une activité immunomodulante, suggérant ainsi la libération de peptides
bioactifs. Dans cette étude, des peptides issus de la P-lactoglobuline (p-Lg) et de l'alactalbumine (a-La) ont été sélectionnés sur la base de leurs propriétés physico-chimiques,
puis préparés par synthèse chimique. Les propriétés immunomodulantes de ces peptides ont
ensuite été évaluées ex vivo, en mesurant leurs effets à différentes concentrations (10-2000
ug.mL"') sur la prolifération de splénocytes murins, en absence et en présence d'un
mitogène (Concanavaline A). L'effet sur la sécrétion des cytokines (IL-4, IL-2, IL-10 et
IFN-y) de certains peptides (p-Lg f 15-20, f55-60, fl 39-148) a aussi été étudié, avec et sans
ConA.
Les résultats ont montré que le peptide p-Lg 178-83 ne possède aucun effet sur la
prolifération des cellules, alors que d'autres peptides (P-Lg fl 5-20, f55-60, f84-91, f92-105,
H39-148, fl42-148 et a-La 10-16) stimulent plus ou moins fortement la prolifération des
splénocytes. Trois peptides ont montré un effet inhibiteur sur la croissance des cellules: le
P-Lg fl-8 semble affecter l'intégrité des cellules à fortes concentrations, alors que l'effet
inhibiteur des peptides P-Lg f"102-105 et a-La f104-108 semble plutôt associé à leur faible
solubilité à fortes concentrations, ce qui affecterait la croissance des cellules. L'étude des
corrélations
entre
les
caractéristiques
physico-chimiques
et
les
propriétés
immunostimulantes des peptides a suggéré que la charge positive, l'hydrophobicité et la
taille
des peptides
pourraient jouer
un
rôle
important
dans
leurs
propriétés
immunomodulantes. Le dosage des cytokines a révélé un effet différent de chacun des
peptides étudié sur la sécrétion cytokinique, suggérant un mode d'action différent de ces
derniers sur la stimulation de la prolifération des splénocytes. Ces résultats suggèrent donc
que certains peptides trouvés dans la séquence primaire des protéines majeures du
lactosérum posséderaient un effet sur la réponse immunitaire spécifique.
II
AVANT-PROPOS
Je tiens à remercier le Dr. Sylvie Gauthier pour m'avoir accueilli au sein de son équipe de
recherche et de m'avoir offert
l'opportunité d'approfondir
l'ensemble de mes
connaissances, tout au long de ce projet. Ses encadrements académiques et professionnels
ont été des atouts indispensables pour mener à bien ce projet de recherche. Je remercie
également mon Co-Directeur, le Dr. Rejean Drouin, pour son expertise scientifique et ses
conseils durant ce projet.
Je désire remercier l'organisme subventionnaire représenté par l'Action Concertée Fonds
Nature et Technologies (FQRNT-AEE-MAPAQ-MIC) qui a financé ce projet et qui m'a
soutenu financièrement tout au long de mes études graduées.
Je remercie également l'ensemble de l'équipe du laboratoire de Sylvie Gauthier, et
particulièrement le Dr Alicia Montoni, le Dr Samira Roufik et le Dr Éric Lamiot pour leur
grande disponibilité à mon égard, ainsi que pour leurs apports scientifiques et personnels
exceptionnels.
Je voudrais tout particulièrement remercier ma famille pour leur soutien perpétuel et le
dévouement dont ils ont toujours fait preuve à mon égard. Je les remercie de m'avoir
toujours dirigé dans la bonne direction et de m'avoir soutenu tout au long de ce projet
personnel. Merci pour m'avoir transmis le goût d'apprendre et de m'avoir donner les
moyens d'aller au bout de mes ambitions.
Je remercie Géraldine pour sa présence à mes côtés, et de m'avoir donner cette envie d'aller
toujours plus loin ensemble.
Enfin, je voudrais adresser de sincères remerciements à tous mes amis proches pour tout ce
qu'ils m'ont apporté au quotidien, pour leur sincérité et pour le soutien dont ils ont toujours
fait preuve envers moi.
III
TABLE DES MATIÈRES
RÉSUMÉ
AVANT-PROPOS
TABLE DES MATIÈRES
LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES FIGURES
I
II
III
V
VII
IX
INTRODUCTION GÉNÉRALE
1
CHAPITRE I: REVUE DE LITTERATURE
5
1. LE LAIT BOVIN
1.1. Les protéines du lactosérum
6
6
1.2. Ingrédients commerciaux à base de protéines du lactosérum
11
1.3. Hydrolysats enzymatiques des protéines du lactosérum
14
1.4. Peptides bioactifs issus des protéines du lactosérum
17
2. LE SYSTÈME IMMUNITAIRE
23
2.1. Description générale
23
2.2. La réponse immunitaire spécifique
24
2.3. Méthodes d'évaluation de la réponse immunitaire spécifique
30
3. LES EFFETS DE LA P-LACTOGLOBULINE, L'O-LACTALBUMINE ET DE LEURS PEPTIDES
SUR LE SYSTÈME IMMUNITAIRE
34
3.1. Effets des protéines du lactosérum sur le système immunitaire
34
3.2. Effets des hydrolysats de protéines du lactosérum sur le système immunitaire....39
3.3. Effets des peptides issus de la P-Lg et de l'a-La sur le système immunitaire
4. BUT, HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS
44
46
IV
CHAPITRE II: IMMUNOMODULATING EFFECTS OF PEPTIDES FROM BLACTOGLOBULINE AND a-LACTALBUMINE
48
1. RÉSUMÉ
49
2. ABSTRACT
50
3. INTRODUCTION
51
4. MATERIALS AND METHODS
53
4.1. Peptides
53
4.2. Ex vivo murine splenocyte prolifération assay
53
4.3. Cytokine analysis
54
4.4. Statistical analysis
54
5. RESULTS
55
5.1. Effects of peptides on ex vivo splenocytes prolifération
55
5.2. Effects of peptides on ex vivo cytokine sécrétion
65
6. DISCUSSION
68
7. CONCLUSION
71
CONCLUSION GÉNÉRALE
72
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
75
V
LISTE DES ABREVIATIONS
a-La: a-lactalbumine
p-Lg: p-lactoglobuline
AAB: Acides aminés branchés
AAE: Acides aminés essentiels
ACE: Angiotensin-converting enzyme
BSA: Bovine sérum albumin
CA: Caséine
CEI: Chromatographie d'échange ionique
CMH: Complexe majeur d'histocompatibilité
ConA: Concanavalin A
CPA: Cellule présentatrice d'antigène
CPL: Concentré de protéine de lactosérum
CPP: Cell penetrating peptide
ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay
GMP: Glycomacropeptide
GSH: Glutathion
H^avi-: Hydrophobicity
HDP: Host defence peptide
IFN: Interféron
Ig(s): Immunoglobuline(s)
IL: Interleukine
IPL: Isolât de protéines du lactosérum
IS/SI: Indice de stimulation/stimulation index
LB: Lymphocyte B
Lf: Lactoferrine
Lfc: Lactoferricine
LPS: Lipopolysaccharide
LT: Lymphocyte T
MF: Microfiltration
MW: Molecular weight
PHA: Phytohemagglutinine
PP: Protéose peptone
SI): Standard déviation
TGF: Transforming growth factor (Facteur de croissance transformant)
Th: Lymphocyte T helper (LT auxiliaire)
TNF: Tumor necrosis factor (Facteur nécrosant des tumeurs)
T reg: Cellules T régulatrices
WPC: Whey protein concentrate
WPI: Whey protein isolate
VII
LISTE DES TABLEAUX
CHAPITRE I
TABLEAU
1.1:
Composition protéiquedu lactosérum bovin
8
TABLEAU
1.2:
Composition en protéines de différents ingrédients à base de protéines du
lactosérum
13
14
TABLEAU
1.3:
Proportions relatives en AAE et AAB de la (3-Lg, l'oc-Laetd'un IPL
TABLEAU
1.4:
Exemples d'ingrédients commerciaux à base de protéines du lactosérum et
du type d'allégations associées à ces produits
15
TABLEAU
1.5:
Peptides bioactifs issus de l'hydrolyse de la (3-Lg bovine
20
TABLEAU
1.6:
Peptides bioactifs issus de l'hydrolyse l'oc-La bovine
21
TABLEAU
1.7:
Exemple du type de réponses immunes au niveau de la muqueuse
intestinale
27
TABLEAU
1.8:
Effets ex vivo ou in vivo des CPLs et IPLs sur le système immunitaire. ...35
TABLEAU
1.9:
Effets ex vivo des protéines individuelles du lactosérum sur le système
immunitaire
TABLEAU
1.10: Effets ex vivo d'hydrolysats de protéines du lactosérum sur le système
immunitaire
TABLEAU
36
40
1.11: Effets ex vivo de fractions peptidiques issus d'hydrolysats de protéines du
lactosérum sur le système immunitaire
43
VIII
CHAPITRE II
TABLE
2.1:
Physicochemical characteristics of the peptides studied
TABLE
2.2:
Stimulation indices measured for peptides from B-Lg and a-La on the
prolifération of resting murine splenocytes
TABLE
2.3:
2.4:
2.5:
59
Coefficients of détermination (r ) calculated from the relationship between
the stimulation indices and some physicochemical parameters
TABLE
58
Stimulation indices measured for peptides from B-Lg and a-La on the
prolifération of murine splenocytes in the présence of Concavanalin A
TABLE
56
64
Cytokine sécrétion measured in the supernatants of cultured murine
splenocytes by ELISA
66
IX
LISTE DES FIGURES
CHAPITRE I
FIGURE
1.1:
Schématisation générale des voies de différenciation des lymphocytes T ...25
FIGURE
1.2:
Modèle simplifié des échanges cytokiniques existants entre les lymphocytes
FIGURE
1.3:
Thl et Th2 et leurs effets sur la différenciation lymphocytaire
29
Principe du dosage ELISA
33
CHAPITRE II
FIGURE
2.1:
Stimulation indices measured for the peptide P-Lg f78-83 on the
prolifération of resting- and ConA-stimulated splenocytes
FIGURE
2.2:
Pictures of resting- and ConA-stimulated murine splenocytes in the absence
or présence of peptide P-Lg f78-83
FIGURE
2.3:
55
57
Stimulation indices measured for the peptides P-Lg fl 5-20, P-Lg f55-60, (3Lg fl 39-148 and P-Lg fl-8 showing the four différent behaviours of the
peptides on the prolifération of resting murine splenocytes and ConAstimulated splenocytes
FIGURE
2.4:
61
Pictures of resting murine splenocytes after incubation in the présence of the
peptides p-Lg fl-8, p-Lg fl02-105, and a-La fl04-108
62
I
INTRODUCTION GÉNÉRALE
«De tes aliments tu feras tes médicaments et de tes médicaments tu feras tes aliments»
Hippocrate, 400 ans avant J.C.
Depuis plusieurs années, une importante évolution de la perception des consommateurs et
des instances gouvernementales de nombreux pays s'est produite vis à vis de
l'alimentation, laquelle est dorénavant considérée comme étroitement liée à la qualité de
vie et la santé des individus. De nouvelles classes de produits sont ainsi apparues: les
nutraceutiques et les aliments fonctionnels. Il n'existe pas de définition universellement
reconnue pour ce type de produits, mais Santé Canada définit un nutraceutique comme
étant un produit « fabriqué à partir d'aliments, mais vendu sous forme de pilules ou de
poudres (potions) ou sous d'autres formes médicinales qui ne sont pas généralement
associées à des aliments, et il s'est avéré avoir un effet physiologique bénéfique ou assurer
une protection contre les maladies chroniques ». Les aliments fonctionnel sont, quand à
eux, définis comme étant «des aliments semblables en apparence aux aliments
conventionnels, qui font partie de l'alimentation normale et qui procurent des bienfaits
physiologiques démontrés et/ou réduisent le risque de maladie chronique au-delà des
fonctions nutritionnelles de base» (Santé Canada, 1998; Statistique Canada, 2007).
De études de consommation menées au Canada portent à croire que les consommateurs
sont de plus en plus sensibilisés aux aliments fonctionnels et aux nutraceutiques et qu'ils
apprécient les avantages potentiels pour la santé de ces aliments et ingrédients (West et al.,
2002; Agriculture et Agroalimentaire Canada, 2004; Santé Canada, 2005, 2006). Au
Canada, entre 2002 et 2004, il a été observé une croissance de 32% du nombre
d'entreprises fabriquant des nutraceutiques, une augmentation de 15% du chiffre d'affaire
de ces entreprises et une augmentation de 43% des exportations (Statistique Canada, 2007).
Cependant, le Canada ne représente qu'approximativement 3% du marché international,
dont la majeure partie est destinée à l'exportation (Jarvis et al., 2001). La croissance des
nutraceutiques a été assez limitée au Canada du fait des obstacles réglementaires liés au
développement de l'industrie des nutraceutiques et des aliments fonctionnels. En effet, le
2
1er janvier 2004, Santé Canada approuvait pour les nutraceutiques le règlement sur les
produits de santé naturels en vertu de la Loi sur les aliments et drogues. Les produits
assujettis à ce règlement sont les remèdes à base de plantes médicinales, les remèdes
homéopathiques, les vitamines et minéraux, les remèdes traditionnels, les probiotiques, les
acides aminés et les acides gras essentiels (Santé Canada, 2007). La possibilité de faire des
allégations santé a eu un effet positif sur les ventes de nutraceutiques sur le marché
intérieur chez 41% des entreprises et un effet positif sur le développement de nouveaux
produits pour 39% de ces entreprises. En revanche, seulement 22% des entreprises ont
enregistré un effet positif sur les ventes à l'exportation. Il semblerait donc que la capacité
de faire des allégations santé au sujet des nutraceutiques, visés par le règlement sur les
produits de santé naturels, a été perçue comme ayant un effet plus positif sur les ventes du
marché intérieur et sur le développement de produits que sur les ventes à l'exportation
(Statistique Canada, 2007).
Dans le secteur des nutraceutiques, certaines protéines d'origine alimentaire trouvent
aujourd'hui de nombreuses applications en raison de leurs effets sur la santé. La modulation
de la fonction immunitaire par le régime alimentaire représente actuellement une
perspective attrayante et non invasive pour optimiser l'immunité chez l'humain et animal,
et ainsi améliorer la santé des individus (Gill et al., 2001; Rutherfurd-Markwick & Gill,
2005). A cet effet, les protéines du lactosérum bovin sont potentiellement intéressantes pour
l'élaboration d'ingrédients immunomodulants. En effet, des études ex vivo (Wong et al.,
1997, 1998; Miyauchi et al., 1997; Pecquet et al., 1999; Cross & Gill, 1999; Brix et al.,
2003; Mahmud et al., 2004; Mercier et al., 2004; Prioult et al, 2004; Rutherfurd-Markwick
& Gill, 2005; Saint-Sauveur et al., 2007) ont démontré que certains ingrédients à base de
protéines de lactosérum (ex: concentrés et isolats de protéines de lactosérum), de même que
certaines des protéines individuelles du lactosérum (ex: (i-lactoglobuline, a-lactalbumine,
lactoferrine) ou leurs peptides peuvent moduler plus ou moins fortement la réponse immune
spécifique (prolifération lymphocytaire, production d'anticorps, expression de certaines
cytokines).
3
D'autres travaux ont également mis en évidence la capacité d'hydrolysats de protéines de
lactosérum, avec ou sans fractionnement des mélanges peptidiques, à moduler certaines
fonctions du système immunitaire (Miyauchi et al., 1997; Wong et al., 1998; Mahmud et
al., 2004; Mercier et al., 2004; Prioux et al., 2004; Biziulevicius et al., 2006; Saint-Sauveur
et al., 2007). Les travaux de Mercier et al. (2004) et Saint-Sauveur et al. (2007) ont ainsi
démontré que des concentrés de protéines de lactosérum et leurs hydrolysats enzymatiques
stimulaient la prolifération de splénocytes murins. Après fractionnement des hydrolysats,
ces auteurs ont également observé que certaines fractions peptidiques stimulaient plus
fortement la prolifération des splénocytes, suggérant ainsi que certains peptides contenus
dans les hydrolysats enzymatiques de ces protéines seraient responsables des effets
observés. Les travaux de Prioult et al. (2004) ont aussi mis en avant le potentiel
immunomodulant de certaines fractions peptidiques obtenues suite à l'hydrolyse de la (3-Lg
par la trypsine, la chymotrypsine et les peptidases de la souche Lactobacillus paracasei.
Quelques études ont également permis d'identifier certains peptides issus des protéines
laitières (ex: caséines, lactoferrine) qui possèdent un pouvoir immunomodulant, mais très
peu de ces peptides ont été identifiés à partir des deux protéines majeures du lactosérum: la
p-lactoglobuline ((3-Lg) et l'a-lactalbumine (a-La) (Korhonen & Pihlanto-Leppâlâ, 2006).
A ce jour, seulement deux peptides présents dans la séquence primaire de l'a-La (f50-51 et
f 18-20) ont été identifiés comme possédant un potentiel immunostimulant sur la
prolifération de lymphocytes sanguins humains (Kayser & Meisel, 1996). Une stimulation
de la réponse immunitaire non spécifique (Berthou et al., 1987) et une protection contre les
infections à Klebsiella pneumoniae (Fiat et al., 1993) ont également été montrées pour le
peptide a-La f51-53.
Jusqu'à présent, très peu d'études ont donc été réalisées pour démontrer que l'activité
immunomodulante des hydrolysats de protéines du lactosérum était associée à l'action de
certains peptides spécifiques libérés lors de leur hydrolyse, alors que de nombreuses
hypothèses ont été émises à ce sujet (Chatterton et al., 2006; Gauthier et al., 2006;
Sindayikengera & Xia, 2006a; Zimecki & Kruzel, 2007). De plus, très peu d'études ont été
réalisées afin de vérifier si les propriétés immunomodulantes de ces peptides avaient aussi
-I
un impact sur la sécrétion des cytokines. En fait, seuls les travaux de Prioult et al. (2004) et
Sauveur et al. (2007) ont démontré que des fractions peptidiques issues des protéines de
lactosérum modulaient de façon significative la sécrétion de certaines cytokines (IL-4, IL10, IL-2 et IFN-y). Le présent travail visait donc à étudier les propriétés immunomodulantes
de certains peptides issus des protéines majeures du lactosérum (p-Lg et a-La) dans un
modèle ex vivo de prolifération de splénocytes murins, puis à mesurer leur impact sur la
sécrétion cytokinique.
Dans la prochaine section, une revue de littérature présentera les caractéristiques générales
du lactosérum bovin, de ses hydrolysats enzymatiques et des peptides qui les composent.
Un descriptif général de la réponse immunitaire sera ensuite présenté pour décrire les
composantes de ce système complexe. Enfin, un récapitulatif de ce qui est connu sur l'effet
sur le système immunitaire de peptides bioactifs issus des protéines majeures du lactosérum
bovin (p-Lg et a-La) sera présenté. Finalement, la dernière section sera consacrée à la
présentation du but, de l'hypothèse et des objectifs à la base de ce projet de maîtrise. À
noter que l'ensemble des articles scientifiques cités dans le mémoire est présenté à la toute
fin du document, dans la section «Références bibliographiques».
5
CHAPITRE I:
REVUE DE LITTERATURE
6
1. LE LAIT BOVIN
Le lait bovin est produit en réponse à la mise bas d'un veau nouveau-né et constitue
l'aliment le mieux adapté à ses besoins (Cayot & Lorient, 1998). Chez les mammifères, il
se compose principalement d'eau (87%) et de 4 fractions (Sindayikengera & Xia, 2005;
Zimecki & Kruzel, 2007): une fraction lipidique (4%), protéique (3,2%), glucidique (5%) et
minérale (0,7%). La fraction protéique du lait se subdivise en deux grands groupes de
protéines : les caséines et les protéines du lactosérum. Les caséines se définissent comme la
fraction protéique insoluble du lait, obtenue par précipitation à pH 4,6 et à 20°C. Elles
représentent environ 80% des protéines totales du lait et sont organisées sous la forme de
micelles (Jouan, 2002). Le lactosérum contient, quand à lui, les 20% restants des protéines
du lait (Zimecki & Kruzel, 2007). Les protéines du lactosérum se définissent comme étant
la fraction protéique demeurant soluble lors de la précipitation à pH acide du lait (Walstra
& Jenness, 1984), ou après la séparation des caséines par l'action enzymatique de la présure
ou de la chymosine lors de la fabrication fromagère (Debry, 2001 ).
Le lactosérum a longtemps été considéré comme un sous-produit de l'industrie laitière
(Marshall, 2004; Chatterton et al., 2006). Depuis plusieurs années, de nombreuses études
ont toutefois démontré que le lactosérum contient des composantes protéiques bioactives ce
qui a mené à une valorisation intensive du lactosérum et de ses protéines. Les protéines du
lactosérum sont donc devenues une matière particulièrement intéressante pour le domaine
des nutraceutiques. Plusieurs ingrédients à base de ces protéines sont donc maintenant
disponibles sur le marché où ils trouvent des applications dans le secteur des produits de
santé naturels.
1.1. Les protéines du lactosérum
Les principales protéines trouvées dans le lactosérum sont la P-lactoglobuline ((3-Lg), l'alactalbumine (a-La), les immunoglobulines (Igs), l'albumine sérique bovine (BSA) et la
lactoferrine (Lf) (Jouan, 2002; Korhonen & Pihlanto-Leppalâ, 2007). La (i-Lg et l'oc-La
représentent 70 à 80% des protéines du lactosérum (Chatterton et al., 2006) et sont donc
considérées comme les protéines majeures de ce produit.
7
À l'échelle industrielle, les protéines du lactosérum sont généralement obtenues à partir
d'un lactosérum dérivé de la fabrication fromagère (Patel & Kilara, 1990). Par conséquent,
le lactosérum contient aussi des peptides issus des caséines comme les protéoses peptones
(PP) et le glycomacropeptide (GMP). Ces peptides jouent un rôle important dans les
propriétés des ingrédients à base de protéines de lactosérum du fait de leur propre
bioactivité (Zimecki & Kruzel, 2007). Le Tableau 1.1 présente la composition en protéines
et peptides du lactosérum, de même que certaines de leurs caractéristiques physicochimiques. Il faut cependant noter que les concentrations de ces protéines dans le
lactosérum sont dépendantes du type de lactosérum (doux ou acide), de la source laitière
(bovin, caprin ou ovin), de la période de l'année, du type d'alimentation animale, de l'étape
de lactation, ou encore, de la qualité des procédés de fabrication (Madureira et al., 2007).
La (3-Lg est la protéine la plus abondante dans le lactosérum bovin (50%) et a été
découverte pour la première fois en 1934 (Madureira et al., 2007). Cette protéine est
généralement absente dans le lait humain (Sindayikengera & Xia, 2005; Chatterton et al.,
2006), bien que quelques études suggèrent sa présence en faible quantité (Hambraeus &
Lônnerdal, 2003). Dans le lait de vache, elle est constituée d'une seule chaîne peptidique de
162 acides aminés stabilisée par 2 ponts disulfures intra-chaînes qui impliquent les résidus
d'acides aminés 106-119 et 66-160 (Papiz et al., 1986; Monaco et al., 1987), et d'un
groupement thiol libre en position 121 ou 119 (McKenzie et al., 1972; Kinsella, 1988).
Plusieurs variants génétiques existent pour cette protéine, dont le plus commun est le
variant génétique A (Madureira et al., 2007). Cette protéine globulaire présente la capacité
d'interagir avec diverses petites molécules hydrophobes ce qui lui confère une fonction
biologique potentielle de transporteur moléculaire (Hambling et al., 1992; Sawyer et al.,
1999; Jameson et al., 2002). Plusieurs autres propriétés biologiques ont été attribuées à la
[}-Lg ou ses peptides, dont les principales ont été revues par Chatterton et al. (2006):
inhibition de l'ACE, activité antimicrobienne, inhibition de l'adhésion de pathogènes,
activité anti-cancérigène, effet hypocholestérolémiant et activité opioïde.
Tableau 1.1: Composition protéique du lactosérum bovin3.
NOMBRE
D'ACIDES AMINÉS
ASSE MOLÉCULAmE
POINT
ISOÉLECTRIQUEb
CONCENTRATION
TENEUI
(Da)
(g-L-1)
(%)
P-Lg
162
18 400
5,35-5,49
3,3
52,5
a-La
123
14 200
4,2-4,5
1,2
22,5
BSA
582
66 300
4,7-4.9
0.3
7,5
Ig(s)
variable
150 000-1 000 000
5,5-8,3
0.5-1,0
12,5
Lf
700
80 000
8,4-9,0
0,1
1.5
PP
variable
4 000-40 000
ndc
0,8
nd
64
8 000
<3,8
1,2
3,0
PROTÉINES
GMP
Tiré de Korhonen & Pihlanto-Leppâlâ (2007), Madureira et al. (2007) et Zimecki & Kruzel (2007).
Tiré de Etzel (2004) et Beaulieu et al. (2006).
nd: non déterminé.
1
9
L'a-La est une petite protéine qui représente environ 20% des protéines du lactosérum. Elle
est donc considérée comme la seconde protéine majeure du lactosérum (Zimecki & Kruzel,
2007). Il existe 3 variants génétiques pour cette protéine: les variants A, B et C (Fox, 1989).
Elle se caractérise en tant que métalloprotéine du fait de sa capacité à fixer le calcium de
façon particulière, mais aussi le zinc et d'autres ions métalliques. La fixation de ces ions
métalliques se ferait au niveau de la séquence a-La f79-88 de la protéine, laquelle contient
5 résidus aspartate (Permyakov & Berliner, 2000). Cette protéine joue également un rôle
biologique au niveau de la synthèse du lactose (De Wit, 1989) et elle présente de fortes
analogies avec le lysozyme sans pour autant partager les propriétés bactéricides de ce
dernier (Jouan, 2002). Tout comme la (3-Lg, l'a-La possède de nombreuses propriétés
biologiques majoritairement associées aux peptides contenus dans sa séquence et libérés
lors de l'hydrolyse de la protéine. Les principales propriétés biologiques connues de l'a-La
et ses peptides ont également été revues par Chatterton et al. (2006): inhibition de l'ACE,
activité anti-cancérigène, activité antimicrobienne, activité opioïde, activité anti-stress,
amélioration des capacités cognitives et amélioration du sommeil. Cette protéine majeure
du lactosérum possède également des propriétés immunomodulantes qui seront décrites
dans la troisième partie de cette revue de littérature.
Les immunoglobulines (Igs) sont des glycoprotéines qui représentent environ 10% des
protéines totales du lactosérum (Zimecki & Kruzel, 2007). Leur teneur est cependant
beaucoup plus élevée dans le colostrum (20-150 g.L" ) (Korhonen & Pihlanto-Leppalâ,
2007). Le lactosérum contient 4 des 5 classes d'Igs soit les IgG, IgA, IgM et IgE. Ce sont
les IgG qui sont présentes en plus forte proportion (80% des Igs totales). Ces protéines
anticorps ont pour principal rôle d'assurer la transmission de l'immunité passive de la mère
au nouveau-né (Jouan, 2002). Les Igs du lactosérum sont donc potentiellement
intéressantes pour le traitement de certaines pathologies observées chez les nouveaux-nés
ce qui fait de leur extraction/purification une perspective industrielle intéressante (Pessala
et al., 2006). Par exemple, Pessala et al. (2006) ont établi un protocole permettant la
purification à 80% des Igs présentes dans un concentré commercial de protéines du
lactosérum bovin.
10
La BSA représente 7% des protéines du lactosérum (Zimecki & Kruzel, 2007). Elle est
formée d'une seule chaîne poiypeptidique de 580 acides aminés stabilisée par 17 ponts
disultures. Grâce à sa capacité de liaisons réversibles, elle joue un rôle de transporteur de
molécules et d'ions divers: colorants, médicaments, acides gras, métaux divalents, etc.
(Jouan, 2002). La BSA possède aussi des propriétés antioxydantes et immunostimulantes
reconnues du fait de sa richesse en groupes glutamylcystéine dans sa séquence (rares dans
les protéines alimentaires), ce qui lui confère un rôle important sur le système de synthèse
et d'activation du glutathion (Bounous et al., 1989; Bounous & Gold, 1991; Bounous,
2000). En effet, le glutathion (GSH) est un tripeptide qui joue un rôle primordial dans la
stabilité des membranes cellulaires et dans la protection des cellules contre les radiations et
les radicaux libres. Cette molécule est également cruciale dans le fonctionnement et
l'activation de nombreuses cellules, dont les lymphocytes B et T (Wong & Watson, 1995).
La lactoferrine (Lf) est une glycoprotéine de 689 acides aminés dont la teneur dans le
lactosérum bovin est de 0,10 g.L" , soit environ 1% des protéines totales du lactosérum
(Zimecki & Kruzel, 2007). Elle possède une grande affinité pour le fer, fixant 2 atomes de
fer par molécule, et se retrouve sous forme saturée en fer (20-25%) dans des conditions
physiologiques normales (Chan & Li-Chan, 2007). Cette aptitude à fixer le fer lui confère
des propriétés bactériostatiques importantes, car elle limite la disponibilité de cet ion
essentiel au développement de nombreuses bactéries (Lônnerdal, 2004). La lactoferrine
existe sous forme endogène, en constituant par exemple une des composantes majeures des
granules secondaires des neutrophiles (Paul-Eugène et al., 1993), mais aussi sous forme
exogène de par sa présence dans certaines sécrétions telles que le lait, les larmes, le mucus
et la salive (Masson et al., 1966). Les principales propriétés biologiques de la Lf ont été
revues par Zimecki & Kruzel (2007): propriétés antibactériennes, antifongiques,
antiparasitaires, anti-cancérigènes, immunorégulatrices et anti-inflammatoires.
Cette
protéine possède également des propriétés anti-virales et permet d'améliorer l'absorption
des nutriments dans l'intestin du jeune enfant (Lônnerdal, 2004). Certaines propriétés
biologiques sont exercées par la lactoferricine (Lfc), un peptide libéré lors de l'hydrolyse de
la lactoferrine par la pepsine et dans des conditions acides (Gifford et al., 2005). Ce peptide
est donc produit de façon naturelle lors de la digestion gastrique de la lactoferrine. Les
Il
propriétés de la Lfc ont été revues par Gifford et al. (2005): propriétés antibactériennes,
antifongiques, antiparasitaires, antivirales, anti-cancérigènes et immunomodulantes.
Enfin, tel que souligné précédemment, le lactosérum bovin contient aussi des peptides
comme la fraction PP ou le GMP. Ces peptides possèdent aussi des propriétés biologiques
susceptibles d'influencer certaines fonctions de l'organisme. Les PP sont des peptides issus
pour la plupart de l'hydrolyse trypsique de la caséine B (CA-B). On distingue 3 types de
protéose-peptones: la protéose-peptone 5 (CA-B fl -105), la protéose-peptone 8 lente (CA-B
f29-107) et la protéose-peptone 8 rapide (CA-B fl-28). Le GMP, quand à lui, est un peptide
correspondant aux résidus fl06-169 de la caséine K. Il est issu de l'hydrolyse du lien
Pheios-Metioô de la caséine K suivant l'action de la présure, et sa nature hydrophile explique
sa présence dans le lactosérum après la coagulation du lait (Cayot & Lorient, 1998). Les
propriétés biologiques du GMP ont été revues par Brody (2000) et Zimecki & Kruzel
(2007): prévient les infections bactériennes et virales, améliore la croissance des
bifidobactéries, neutralise les endotoxines et intervient dans la modulation du système
immunitaire. Le GMP possède plusieurs actions sur le système immunitaire et ces
propriétés ont été revues par Gauthier et al. (2006); le GMP serait notamment impliqué
dans l'inhibition de certaines voies de l'immunité spécifique (prolifération lymphocytaire,
production de certains anticorps et sécrétion de cytokines). Cependant, plusieurs résultats
contradictoires existent encore à ce niveau et des études complémentaires seront
nécessaires pour confirmer ces effets.
1.2. Ingrédients commerciaux à base de protéines du lactosérum
En raison de la faible quantité de protéines (~1%) dans le lactosérum liquide issus de la
fabrication fromagère, plusieurs procédés industriels ont été développés dans les années 70
afin de les concentrer. Ces procédés sont généralement basés sur la séparation sélective des
composants en agissant via leurs différentes caractéristiques physico-chimiques telles que
leur pi, leur masse moléculaire, leur charge, etc. (Korhonen & Pihlanto-Leppâlâ, 2007).
Les techniques de filtration membranaire (ultrafiltration et microfiltration) ont permis la
production à grande échelle de produits concentrés en protéines du lactosérum et dont la
12
teneur protéique peut atteindre jusqu'à 90-92%). Il existe ainsi sur le marché des concentrés
de protéines de lactosérum (CPLs) contenant 35, 50, 65 et 80%> de protéines. Lorsque le
taux protéique est supérieur à 90%, ces produits sont alors considérés comme des isolats de
protéine de lactosérum (IPLs) (Madureira et al., 2007). Toutefois, l'intérêt actuel suscité par
certaines protéines du lactosérum a également conduit les industriels à modifier leurs
procédés de fabrication de manière à extraire préférentiellement certaines composantes.
Ainsi, plusieurs CPLs ou IPLs trouvés sur le marché présentent maintenant des
compositions très variables, dont la quantité relative des protéines s'éloigne souvent de la
composition initiale du lactosérum. De plus, la composition chimique et les propriétés
biologiques et fonctionnelles (stabilité, adhésion, pouvoir de fixation, pouvoir émulsifiant,
etc.) de ces ingrédients sont en partie affectées par les procédés de séparation (Korhonen &
Pihlanto-Leppàlâ, 2007). Par exemple, le traitement thermique du lactosérum dénature l'ocLa, laquelle peut ensuite être éliminée par l'intermédiaire d'une précipitation (Huffman &
Harper, 1999).
La mise à l'échelle industrielle de la chromatographie d'échange ionique (CEI) a également
permis la production d'isolats de protéines de lactosérum (IPLs), des ingrédients avec des
teneurs en protéines supérieures à 95%. Ces ingrédients sont plus onéreux que les CPLs,
mais représentent une source de protéines de lactosérum peu dénaturées et de très grande
qualité (Etzel, 2004). De plus, la CEI est également utilisée pour purifier plusieurs
composantes protéiques du lactosérum telles que la (3-Lg, l'a-La, la Lf, le GMP et les Igs
(Yoshida et al., 1991; Fukumoto et al., 1994; Outinen et al., 1996). Ces ingrédients trouvent
aujourd'hui de nombreuses applications dans le domaine des nutraceutiques.
Les CPLs et IPLs présentent des compositions en protéines très différentes du fait des
différents procédés technologiques utilisés pour leur fabrication. Le Tableau 1.2 présente la
composition en protéines de plusieurs types d'ingrédients commerciaux. La différence
repose majoritairement sur le contenu en GMP des produits. De façon générale, les IPLs
obtenus par microfiltration contiennent entre 20 et 30% de GMP, alors que ceux préparés
par échange ionique ne contiennent pas de GMP.
[3
Tableau 1.2: Composition en protéines de différents ingrédients à base de protéines du
lactosérum8.
PROTÉINE
(%)
a
CPL
Lactosérum doux
IPL
Lactosérum acide Microfiltration Echange ionique
p-Lg
52
65
60
80
a-La
15
21
22
14
BSA
2
4
2
3
Ig
5
10
5
3
GMP
26
0
21
0
Adapté de Huffman & Harper (1999).
De nombreux travaux ont démontré que l'activité biologique des ingrédients à base de
protéines de lactosérum variait de façon importante selon leur mode de fabrication, ce qui
est certainement attribuable à l'hétérogénéité de la composition finale de ces ingrédients,
notamment en GMP. Par exemple, nous avons vu précédemment que le GMP possède
plusieurs actions sur la modulation du système immunitaire (Gauthier et al., 2006). Ce
peptide possède donc probablement une implication sur les propriétés immunomodulantes
observées lors d'études portant sur les ingrédients à base de protéines du lactosérum; il est
donc important de ne pas négliger la présence de ce constituant au moment de
l'interprétation des résultats et de caractériser sa présence dans les produits étudiés.
Du point de vue nutritionnel, la composition variée et équilibrée en acides aminés des
protéines de lactosérum, ainsi que leur bonne digestibilité/biodisponibilité, font partie des
facteurs qui expliquent leur intérêt nutritionnel (De Wit, 1998; Sindayikengera & Xia,
2006b). Considérées dans leur ensemble, les protéines du lactosérum possèdent la totalité
des acides aminés essentiels (AAE) et dans de fortes proportions, comparé aux protéines de
sources végétales telle que le soja, le blé et le mais (Walzem et al., 2002; Marshall, 2004).
La qualité nutritionnellc de ces protéines repose également sur leur teneur en acides aminés
branchés (AAB) (Etzel, 2004; Marshall, 2004). En outre, cette caractéristique s'applique
particulièrement dans le cas des deux protéines majeures du lactosérum, la (3-Lg et l'oc-La,
14
comme le montre le Tableau 1.3 qui présente la teneur en AAE et AAB de ces deux
protéines et d'un 1PL obtenu par CEI.
Tableau 1.3: Proportions relatives en AAE et AAB de la P-Lg, l'a-La et d'un IPL".
ACIDES AMINÉS
p-Lg
a-La
IPLb
AAB(%)
25,1
21,0
21,2
AAE(%)
48,1
47,2
42,7
a
Adapté de Etzel (2004).
IPL obtenu par chromatographie d'échange ionique.
Les AAB jouent un rôle majeur dans le métabolisme au niveau de la synthèse protéique et
de la production d'énergie; ces acides aminés sont donc très recherchés dans le secteur des
produits destinés aux sportifs (Etzel, 2004). Le marché actuel des ingrédients à base de
protéines de lactosérum offre de nombreux produits qui visent des applications également
dans d'autres domaines de la nutrition ou de la santé. À titre d'exemple, le Tableau 1.4
présente certains de ces produits, leur fabricant, ainsi que les allégations attribuées à chacun
de ces produits.
1.3. Hydrolysats enzymatiques des protéines du lactosérum
Au cours de leur passage dans le tractus gastro-intestinal, les protéines alimentaires sont
dégradées par hydrolyse enzymatique grâce aux enzymes de la digestion (pepsine, trypsine,
chymotrypsine et autres) et par l'intermédiaire des bactéries intestinales (Prioult et al.
2004). L'hydrolyse enzymatique se définit généralement comme un procédé biochimique
qui consiste à couper certaines liaisons peptidiques présentes dans la structure primaire des
protéines, et ce, par l'intermédiaire de protéases spécifiques. L'hydrolysat protéique se
caractérise alors comme un mélange de peptides de poids moléculaires variables et d'acides
aminés libres. L'hydrolyse enzymatique, dans le cas des protéines du lactosérum, vise
particulièrement à modifier de façon plus ou moins importante leurs propriétés technofonctionnelles et/ou nutritionnelles (Mahmoud, 1994; Panyam & Kilara, 1996; Clémente,
2000; Foegeding et al., 2002). La modification d'une protéine par traitement enzymatique
induit nécessairement un changement de structure et de conformation de la protéine
d'origine,
ce
qui
provoque
des
conséquences
importantes
sur
les
propriétés
physicochimiques et fonctionnelles de cette dernière (Sindayikengera & Xia, 2006a).
Tableau 1.4: Exemples d'ingrédients commerciaux à base de protéines du lactosérum et du type d'allégations associées à ces
produits3.
FABRICE
VTE DE PRODUIT
ALLÉGATION
IPL hydrolyse
Réduction de la pression artérielle
Davisco
USA
Fraction purifiée
Prévient les caries dentaires
Protège contre les virus et bactéries
Influence la coagulation sanguine
Davisco
USA
CPL
Excellente source de protéines
Glanbia
USA
Améliore le niveau d'énergie et le sommeil
DMV International
Pays-Bas
Fraction peptidique purifiée
Réduction de la pression artérielle
DMV International
Pays-Bas
Capolac
Ingrédient laitier
Améliore l'absorption des minéraux
Aria Foods Ingrédients
Suède
PeptoPro
Hydrolysat protéique
Améliore les performances sportives
Améliore la récupération musculaire
DSM Food Specialties
Pays-Bas
Fraction purifiée
Aide à la relaxation et au sommeil
Borculo Domo Ingrédients
Pays-Bas
BioZate
BioPure-GMP
Avonlac™
Cysteine Peption Fraction peptidique purifiée
C12 Peption
Vivinal Alpha
a
Adapté de Korhonen et Pihlanto-Leppâlâ (2006).
U\
16
En comparaison avec les hydrolyses acides ou alcalines, l'hydrolyse enzymatique fait appel
à des protéases spécifiques qui mènent à la libération de certaines séquences peptidiques
selon les protéases utilisées, ce qui rend ce type de procédé plus reproductible. Les peptides
ainsi formés possèdent une masse moléculaire inférieure à celle de la protéine d'origine, de
même qu'une conformation plus simple qui se limite généralement à une structure
secondaire. Les propriétés physicochimiques des peptides libérés dépendent alors de leur
séquence en acides aminés (Sindayikengera & Xia, 2006a).
L'efficacité de la réaction d'hydrolyse et les propriétés finales de l'hydrolysat protéique
reposent sur de nombreux facteurs, dont la nature du substrat protéique, la spécificité de
l'enzyme utilisée, les conditions du milieu réactionnel (pH, température, force ionique, ratio
enzyme:substrat) et la durée de la réaction (Camacho et al., 1998). De ce fait, les conditions
du milieu réactionnel sont généralement ajustées en fonction du substrat et de l'enzyme
sélectionnés. En fait, la spécificité de l'enzyme est le critère principalement utilisé pour
exercer un certain contrôle sur le profil des peptides libérés. Les endoprotéases de sources
animales (ex: pancréatine, trypsine, chymotrypsine), végétales (ex: papaine, bromeline) et
bactériennes (ex: alcalase, neutrase) sont les enzymes les plus utilisées pour la fabrication
des hydrolysats protciques à l'échelle industrielle, bien que certaines préparations
enzymatiqucs contiennent également des exoprotéases (ex: flavourzyme, debiterase)
destinées à réduire l'amertume des hydrolysats protéiques (Mercier, 2003).
Dans la littérature, les hydrolysats de protéines du lactosérum ou leurs peptides sont
associés à plusieurs types d'activités biologiques. Toutefois, il existe une certaine confusion
dans la littérature entre les activités biologiques des protéines intactes et celles des
hydrolysats ou des peptides issus des protéines du lactosérum. Par exemple, au niveau des
propriétés antihypertensives, la (5-Lg intacte possède une très faible activité d'inhibition de
l'ACE, de l'ordre de 9,6% (Mullally et al., 1997a, b), alors que certains ouvrages et articles
scientifiques lui confèrent cette activité (Jouan, 2002; Chatterton et al., 2006). Dans les
faits, il existe effectivement plusieurs peptides contenus dans la séquence primaire de la (3Lg qui présentent une forte activité d'inhibition de FACE (70-95%), mais qui sont obtenus
17
uniquement suite à l'hydrolyse de cette protéine (Mullally et al., 1997a, b; Abubakar et al.,
1998; Pihlanto-Leppalâ et al., 1998; Vermeirssen et al. 2002; Murakami et al., 2004).
1.4. Peptides bioactifs issus des protéines du lactosérum
Les peptides bioactifs se définissent comme des «fragments spécifiques contenus dans la
séquence primaire des protéines et qui possèdent un effet sur les fonctions ou conditions
corporelles, et qui pourraient éventuellement avoir une influence sur la santé» (Kitts &
Weiler, 2003). Les protéines du lactosérum sont une source importante de peptides bioactifs
qui possèdent diverses propriétés physiologiques et certains de ces peptides peuvent même
être multiionctionnels (Meisel, 2004). Cette nouvelle notion d'activité biologique des
peptides a changé de façon considérable la perception de la qualité nutritive des protéines,
puisque ces derniers sont maintenant considérés comme pouvant influencer certaines
fonctions métaboliques de l'organisme (Sindayikengera & Xia, 2006b). Selon Korhonen et
Pihlanto-Leppalâ (2007), la libération de peptides à partir d'une protéine laitière peut se
produire principalement de 4 façons: 1) hydrolyse de la protéine par les enzymes
digestives; 2) hydrolyse de la protéine par les microorganismes protéolytiques du tube
digestif; 3) action d'enzymes exogènes extraites chez l'animal, les microorganismes ou les
plantes; 4) protéolyse via les protéases présentes dans le lait. À noter que des peptides
peuvent aussi être libérés par hydrolyse chimique (acide ou alcaline), mais ce type de
procédé est peu spécifique et mène généralement à une proportion élevée en acides aminés
libres dans les hydrolysats (Sindayikengera & Xia, 2006a). Physiologiquement, les peptides
sont produits à partir des protéines alimentaires au cours de la digestion gastro-intestinale,
mais aussi produits et modifiées lors de la fermentation du bol alimentaire par les enzymes
protéolytiques issues des bactéries de la flore intestinale (Korhonen & Pihlanto-Leppalâ,
2007).
De façon générale, les peptides bioactifs possèdent de courtes séquences en acides aminés,
variant en général de 2 à 20 acides aminés (Pihlanto-Leppâllâ, 2001; Maes et al., 2004).
Ces peptides sont inactifs lorsqu'ils sont contenus dans la protéine d'origine, i.e. avant leur
libération par hydrolyse (Korhonen & Pihlanto-Leppalâ, 2006). Il existe de nombreux
modes d'action par lesquels les peptides bioactifs peuvent exercer leurs activités
IX
physiologiques (transduction via un récepteur cellulaire, endocytose, action intracellulaire,
etc.). Selon Sindayikengera & Xia (2005), les di- et tripeptides sont facilement absorbés au
niveau intestinal, mais les mécanismes permettant de traverser la paroi intestinale ne sont
pas entièrement élucidés pour les peptides possédant plus de 3 acides aminés.
Actuellement, de nombreux travaux tentent de définir les différents modes d'action de ces
peptides en ayant souvent recours aux outils de la protéomique et autres technologies
associées (O'Donnell et al., 2004). Toutefois, jusqu'à présent, le mode d'action des
peptides bioactifs est connu pour un nombre limité d'entre eux. Néanmoins, il est certain
que le mode d'action de ces peptides n'est pas unique et varie selon le type d'activité
physiologique qu'ils induisent dans l'organisme. Par exemple, le pouvoir antibactérien de
la Lfc s'exercerait par la fixation du peptide au niveau de la membrane bactérienne, ce qui
lui permettait ensuite de traverser cette membrane pour agir sur certaines cibles (Gifford et
al., 2005). En revanche, les propriétés anti-inflammatoires de la Lfc résulteraient de sa
fixation aux endotoxines libérées par certains antigènes, suivie de leur neutralisation. Ce
blocage empêcherait l'activation des cellules immunitaires, la sécrétion d'interleukines (IL)
et la sécrétion du facteur nécrosant des tumeurs a (tumor necrosis factor-a, TNF-a) qui
induisent la réponse inflammatoire (Gifford et al., 2005). Cet exemple illustre bien qu'un
peptide peut être multifonctionnel et exprimer ses différentes propriétés biologiques par le
biais de différents mécanismes.
Quelques études se sont plus particulièrement intéressées aux modes d'action des Cell
penetrating peptides (CPP). Nous décrirons succinctement le mode d'action de cette
catégorie de peptides qui pourraient être un modèle intéressant pour les peptides de notre
étude puisque certains d'entre eux présentent les mêmes caractéristiques physicochimiques. Il a été démontré que les CPP sont généralement constitués de moins de 30
acides aminés, chargés positivement à pH 7, sont hydrophobes ou amphiphiles sans pour
autant avoir une séquence commune en acides aminés (Zorko & Langel, 2005). Ces
peptides présentent la capacité de traverser la membrane des cellules, sans dépense
énergétique et sans se lier à un récepteur membranaire (Zorko & Langel, 2005). Par contre,
il semblerait que la pénétration de ces peptides à l'intérieur des cellules se fasse via une
interaction avec la matrice extracellulaire dans un premier temps, puis par endocytose. Une
19
fois dans la cellule, les CPP agiraient de façon sélective sur des voies de signalisation qui
demeurent encore inconnues pour la plupart (Pujals et al., 2006). L'intérêt des CPP repose
actuellement sur la perspective de les utiliser comme vecteur pour le transport de molécules
thérapeutiques normalement inaptes à traverser la membrane cellulaire et ce, afin de
permettre à ces molécules d'exercer leurs effets physiologiques sur leurs cibles (Gupta et
al., 2005). Ce type de mode d'action pourrait éventuellement expliquer l'activité biologique
de certains peptides issus des protéines du lactosérum, bien que cela n'ait encore jamais été
démontré.
Dans la littérature, il existe de nombreux travaux (ex vivo et in vivo) portant sur la
bioactivité des peptides issus de l'hydrolyse des protéines du lactosérum. Les Tableaux 1.5
et 1.6 présentent une synthèse des informations connues à ce jour sur les peptides bioactifs
issus de l'hydrolyse des deux protéines majeures du lactosérum qui sont à la base de notre
projet de recherche: la (i-Lg et l'oc-La. Ces deux Tableaux permettent de démontrer que la
trypsine et la chymotrypsine (enzymes pancréatiques), de même que la pepsine (enzyme
gastrique), sont fréquemment associées à la libération de séquences peptidiques bioactives.
Puisque ces enzymes sont aussi sécrétées lors de la digestion gastro-intestinale, il est
possible d'envisager la libération in vivo de ces peptides dans le tube digestif, après
ingestion des protéines de lactosérum. Néanmoins, les actions combinées et à des doses
variables de ces enzymes dans l'estomac et l'intestin, associées à l'action des protéases
sécrétées par la flore intestinale, ne permettent pas de garantir le maintien de l'intégrité
structurale des peptides bioactifs et par conséquent, leurs effets physiologiques dans
l'organisme. Seules des études chez l'animal ou chez l'humain peuvent confirmer le
potentiel réel des peptides à détenir une activité biologique, et ce, dans une optique de
commercialisation de ces derniers à titre d'ingrédients nutraceutiques.
Tableau 1.5: Peptides bioactifs issus de l'hydrolyse de la (3-Lg
Séquence
P-Lgf9-14
P-Lg fl5-19
p-Lg fl5-20
P-Lg A5-20
P-Lg A9-29
P-Lg C2-25
P-Lg C5-40
P-Lg 02-40
P-Lg f42-46
P-Lg F71-75
P-Lg f78-80
P-Lg H8-83
P-Lg f81-83
P-Lg f92-100
P-Lg f94-100
P-Lg fl 02-105
P-Lg fl 02-105
P-Lg fl 06-111
P-Lg fl 42-145
P-Lg A42-146
P-Lg ÏÏ42-146
P-Lg A42-148
P-Lg A45-149
P-Lg A46-149
P-Lg A46-149
/inea
Nom particulier
Mode d'obtention
Activité biologique
Références
aucun
aucun
aucun
LGDT2
aucun
aucun
LGTD4
aucun
aucun
aucun
P-lactosin A
LGDT1
aucun
LGTD3
aucun
P-lactorphin
(3-lactorphin
aucun
P-lactosin B
aucun
aucun
Lactokinin
aucun
(3-lactotensin
P-lactotensin
Trypsine
Pepsine, Trypsine, Chymotrypsine
Trypsine, Pepsine
Trypsine
Corolase PP
Trypsine
Trypsine
Trypsine
Corolase PP
Trypsine
Proteinase K
Trypsine
Trypsine
Trypsine
Pepsine, Trypsine, Chymotrypsine
Synthèse chimique
Synthèse chimique
Pepsine, Trypsine, Chymotrypsine
Synthèse chimique
Pepsine, Trypsine, Chymotrypsine
Trypsine
Trypsine
Corolase PP
Synthèse chimique
Chymotrypsine
Inhibiteur de l'ACE
Inhibiteur de l'ACE
Inhibiteur de l'ACE
Antibactérien
Antioxydant
Inhibiteur de l'ACE
Antibactérien
Inhibiteur de l'ACE
Antioxydant
Hypocholestérolémiant
Inhibiteur de l'ACE
Antibactérien
Inhibiteur de l'ACE
Antibactérien
Inhibiteur de l'ACE
Inhibiteur de l'ACE
Opioïde
Inhibiteur de l'ACE
Inhibiteur de l'ACE
Inhibiteur de l'ACE
Hypocholestérolémiant
Inhibiteur de l'ACE
Antioxydant
Inhibiteur de l'ACE
Hypocholestérolémiant
Pihlanto-Leppâlâ et al., 1998
Pihlanto-Leppâlâ et al., 2000
Pihlanto-Leppàlâ et al., 1998
Pellegrinietal.,2001
Hernândez-Ledesma et al., 2005
Pihlanto-Leppâlâ et al., 2000
Pellegrinietal.,2001
Pihlanto-Leppâlâ et al., 2000
Hernândez-Ledesma et al., 2005
Nagaoka et al., 2001
Abubakar et al., 1998
Pellegrinietal.,2001
Pihlanto-Leppâlâ et al., 2000
Pellegrinietal.,2001
Pihlanto-Leppâlâ et al., 2000
Mullally et al., 1996; Murakami et al., 2004
Yoshikawa et al., 1986; Sipola et al., 2002
Pihlanto-Leppâlâ et al., 2000
Murakami et al., 2004
Pihlanto-Leppâlâ et al., 2000
Nagaoka et al., 2001
Mullally et al., 1997b
Hernândez-Ledesma et al., 2005
Mullally et al., 1996; Pihlanto et a!., 1998
Yamauchi et al., 2003
Adapté de Gauthier & Pouliot (2003) et Chatterton et al. (2006).
Tableau 1.6: Peptides bioactifs issus de l'hydrolyse de l'oc-La bovine3.
Séquence peptidique
a-La
a-La
a-La
a-La
a-La
a-La
a-La
a-La
a-La
a-La
a-La
a-La
a-La
a-La
a-La
fl-5
fl8-19
fl8-20
fl7-31S-S109-114b
A8-19
f50-51
f50-51
f50-52
f50-53
f50-53
f51-53
f52-53
f61-68S-S75-80b
f99-108
fl 04-108
a-La fl 05-110
a
b
Nom particulier
Mode d'obtention
Activité biologique
Références
LDT1
Immunopeptide
Immunopeptide
LDT2
aucun
aucun
Immunopeptide
aucun
a-lactorphin
a-lactorphin
aucun
aucun
LDC
aucun
Trypsine
Synthèse chimique
Synthèse chimique
Trypsine
Synthèse chimique
Synthèse chimique
Synthèse chimique
Pepsine, Trypsine, Chymotrypsine
Pepsine
Synthèse chimique
Synthèse chimique
Synthèse chimique
Chymotrypsine
Trypsine
Trypsine
Antibactérien
Immunostimulant
Immunostimulant
Antibactérien
Inhibiteur de l'ACE
Inhibiteur de l'ACE
Immunostimulant
Inhibiteur de l'ACE
Inhibiteur de l'ACE
Opioïde
Immunomodulant
Inhibiteur de l'ACE
Antibactérien
Inhibiteur de l'ACE
Inhibiteur de l'ACE
Pellegrini et al., 1999
Kayser & Meisel, 1996
Kayser & Meisel, 1996
Pellegrini et al., 1999
Mullally et al., 1996
Mullally et al., 1996
Kayser & Meisel, 1996
Pihlanto-Leppàlà et al., 2000
Nurminen et al., 2000
Yoshikawa et al., 1986
Fiat et al., 1993
Mullally et al., 1996
Pellegrini et al., 1999
Pihlanto-Leppâlà et al., 2000
Pihlanto-Leppâlà et al., 2000
Fermentation, Pepsine, Tryspine
Inhibiteur de l'ACE
Pihlanto-Leppâlà et al., 1998
aucun
aucun
Adapté de Gauthier & Pouliot (2003) et Chatterton et al. (2006).
Pont disulfure.
?:?.
Les Tableaux 1.5 et 1.6 permettent de démontrer qu'un même peptide peut posséder
plusieurs effets physiologiques, tel que précisé précédemment. Par exemple, le peptide pLg fl 5-20 possède à la fois une activité antimicrobienne et d'inhibition de l'ACE (Tableau
1.5). Néanmoins, les propriétés multifonctionnelles de certains peptides restent encore à
être démontrées in vivo. Enfin, ces Tableaux montrent que les principales activités
biologiques identifiées à ce jour dans le cas des peptides issus de la p-Lg et de l'a-La sont
celles de l'inhibition de l'enzyme de conversion de l'angiotensine I (ACE) et le pouvoir
antimicrobien.
Par contre, on peut clairement entrevoir que très peu de données existent sur des peptides
possédant des propriétés immunomodulantes, les «immunopeptides». Pourtant, dans une
récente revue, Korhonen & Pihlanto-Leppalâ (2007) rapportent que les peptides dérivés de
l'hydrolyse des protéines du lactosérum améliorent la fonction immunitaire, la prolifération
lymphocytaire, la synthèse d'anticorps et la régulation cytokinique. En réalité, les peptides
qui ont vraiment été identifiés à ce jour comme possédant un pouvoir immunostimulant
proviennent surtout de la lactoferrine, des caséines et du GMP (Gill et al., 2000; Gauthier et
al., 2006). L'étude des propriétés immunomodulantes des peptides issus des protéines de
lactosérum demeure donc, encore aujourd'hui, un domaine de recherche peu exploré.
23
2. LE SYSTÈME IMMUNITAIRE
2.1. Description générale
Pour se protéger contre son environnement et les agressions extérieures, les organismes
vivants possèdent un système de défense biologique: le système immunitaire. La fonction
physiologique primordiale du système immunitaire est la défense contre les infections
microbiennes, mais cette définition est restrictive puisqu'une variété de substances
étrangères non infectieuses peuvent également induire des réponses immunitaires (Abbas &
Lichtman, 2005). Les substances immunogènes, appelées antigènes, peuvent être détruites
et éliminées par le biais de deux mécanismes principaux:
l'immunité innée (naturelle);
l'immunité spécifique (acquise).
L'immunité innée est un mécanisme de défense non spécifique qui répond rapidement et
qui permet de lutter contre une très grande variété d'antigènes. L'immunité spécifique,
quant à elle, est un moyen de défense reposant sur la reconnaissance et l'élimination
spécifique et ciblée d'un antigène. La réponse du système immunitaire implique trois
processus: la reconnaissance de la particule étrangère, sa destruction, et enfin, la régulation
de la réponse immunitaire à l'aide de cellules spécialisées et de médiateurs (cytokines).
Dans les deux types de mécanismes, les réponses immunes sont liées à l'activation de
cellule souches naïves pluripotentes (non différenciées) présentes dans la moelle osseuse:
les leucocytes. Une fois activés, les leucocytes se différencient pour donner:
les cellules de l'immunité innée: les polynucléaires, les macrophages, les cellules
tueuses naturelles (NK) et les cellules dendritiques;
les cellules de l'immunité spécifique: les lymphocytes B et T.
Les travaux menés au cours de ce projet de maîtrise ont ciblé l'étude des propriétés
immunomodulantes de peptides issus de protéines laitières (a-La et P-Lg) sur la réponse du
système immunitaire spécifique exclusivement (prolifération lymphocytaire et sécrétion de
cytokines). La section suivante sera donc consacrée à la description de certaines des voies
biologiques qui sont impliquées dans ces aspects de la réponse immunitaire spécifique.
24
2.2. La réponse immunitaire spécifique
2.2.1. La différenciation et la prolifération lymphocytaire
Les lymphocytes sont les cellules effectrices
de l'immunité spécifique et leur
immunocompétence dépend de leur capacité à synthétiser un récepteur membranaire
reconnaissant spécifiquement un antigène (Amrouche, 2005). Ces cellules proviennent de la
différenciation des cellules naïves (non différenciées), présentes dans les organes
lymphoïdes primaires (moelle osseuse et thymus), en lymphocytes effecteurs. Une fois
différenciées, ces cellules vont migrer vers les organes lymphoïdes secondaires (ganglions,
rate, tissus lymphoïdes associés aux muqueuses) qui représentent des tissus organisés dans
lesquels aura lieu l'initiation de la réponse immune spécifique (Janeway & Travers, 1997).
Les lymphocytes sont catégorisés en deux grands types:
les lymphocytes B (LB), dont la maturation a lieu dans la moelle osseuse;
les lymphocytes T (LT), dont la maturation a lieu dans le thymus.
Une fois les leucocytes différenciés en LB ou LT, les cellules migrent entre les tissus via le
sang et le système lymphatique, où elles accomplissent leur maturation (Prioult, 2003).
La réponse immunitaire spécifique se manifeste par l'intermédiaire de deux grands types de
mécanismes:
l'immunité à médiation humorale, véhiculée par les LB et caractérisée par la
production d'anticorps;
l'immunité à médiation cellulaire, véhiculée par les LT et caractérisée par la sécrétion
de cytokines.
Une substance immunogène est capable de stimuler la réponse immunitaire humorale, la
réponse à médiation cellulaire, ou les deux types de réponse de façon simultanée
(Chamberlain, 2002). Concernant l'immunité à médiation cellulaire, l'activation des
cellules T naïves non matures (ThO) repose sur la reconnaissance d'un fragment peptidique
étranger, complexé à une molécule de CMH (Complexe majeur d'histocompatibilité), et sur
la délivrance simultanée d'un signal co-transducteur par une cellule présentatrice
d'antigène (CPA).
25
Les CPA sont soit des LB, des macrophages ou des cellules dendritiques. L'activation des
cellules ThO par les CPA stimule ensuite leur prolifération et leur différentiation en cellules
T effectrices. Selon la nature et l'origine du fragment peptidique présenté par la CPA, les
cellules ThO peuvent se différencier en deux grands types de cellules T (voir Figure 1.1):
les cellules T cytotoxiques, portant le récepteur C D / ;
les cellules T auxiliaires (T helper, Th), portant le récepteur C D / .
Les récepteurs C D / et C D / sont spécifiques à chacun de ces types de lymphocytes et sont
donc utilisés dans la caractérisation des phénotypes cellulaires (ex: cytométrie de flux).
Les lymphocytes ThO synthétisent des cytokines (voir partie 2.2.2) qui induisent leur
croissance, leur prolifération et leur différenciation
en plusieurs sous-classes de
lymphocytes T C D / , appelés lymphocytes T auxiliaires (LT helper,Thl ou Th2) ou
cellules T régulatrices (T reg) (voir Figure 1.1).
LT cytotoxiques
Immunité cellulaire
Immunité humorale
Homéostasie immunitaire
Figure 1.1:
Schématisation générale des voies de différenciation des lymphocytes T.
CPA: Cellule Présentatrice d'Antigène; Te: Lymphocyte T cytotoxique; Th:
Lymphocyte T helper; T reg: Cellules T régulatrices.
Les cellules Thl dirigent l'immunité cellulaire qui a pour but l'élimination des pathogènes
intracellulaires (ex: virus), les cellules cancéreuses, et la prévention des réactions
26
d'hypersensibilité de la peau (Pulendran, 2004). Les cellules Th2 dirigent, quand à elle,
l'immunité à médiation humorale, permettant ainsi la destruction des organismes
extracellulaires grâce aux anticorps sécrétés. Les cellules T régulatrices font partie d'une
sous-classe de lymphocytes qui a été décrites assez récemment (Allez & Mayer, 2004; Van
Amelsfort et al., 2004; Rook & Brunet, 2005; Mottet & Golshayan, 2007). Les T reg (Tr et
Th3) se distinguent des cellules Thl et Th2 par leur phénotype (CD4+CD25+), leur fonction
immunosuppressive et leurs profils en cytokines. Ces cellules jouent un rôle important dans
le maintien de la tolérance et peuvent être induites à la fois contre les antigènes bactériens,
viraux et parasitaires. Les T reg jouent surtout un rôle primordial dans le maintien de
l'homéostasie (équilibre) immunitaire, en régulant à la fois les Thl responsables de
l'immunité à médiation cellulaire et les Th2 responsables de l'immunité à médiation
humorale. Lorsque l'équilibre entre les cellules Thl ou Th2 est affecté, il se produit des
réponses immunitaires anormales qui se traduisent soit par des maladies auto-immunes
(type Thl) ou des allergies (type Th2). Cette sous-classe de lymphocytes T reg est donc
particulièrement importante à considérer puisque ces cellules sont impliquées dans le
respect de l'équilibre immunitaire, en contrôlant le développement et/ou les fonctions des
Thl etTh2.
2.2.2. Les cytokines
Les cytokines sont des médiateurs chimiques assurant la communication entre les cellules
et qui ont une influence importante sur la régulation du système immunitaire. Ce sont des
glycoprotéines sécrétées en cascade par les cellules immunitaires en réponse à un stimulus.
Elles' modulent l'immunité, l'inflammation et l'hématopoïèse. Les cytokines agissent
rapidement et à de très faibles concentrations sur les cellules cibles. Elles se lient
spécifiquement à un récepteur membranaire par lequel un signal (activation de tyrosine
kinase) est transmis à la cellule pour induire l'expression d'un gène (Townsend &
McKenzie, 2000; Ollier, 2004).
Les cytokines impliquées dans la réponse immunitaire spécifique sont généralement de la
classe des interleukines (IL), des interférons (IFN), des chimiokines (substances
chimiotactiques) ou du facteur nécrosant des tumeurs (TNF). Chacune des sous-classes de
27
lymphocytes synthétise des profils différents de cytokines, leur permettant ainsi de réaliser
leurs fonctions propres (Letterio & Roberts, 1998). Les cellules effectrices (Thl ou Th2)
produisent en particulier des cytokines soit «pro-inflammatoires» (ex: IL-2, IFN-y), soit
«anti-inflammatoires» (ex: IL-4, IL-10). L'analyse des profils de sécrétion cytokinique
permet donc de refléter le type de réponse immunitaire engagée (voir Tableau 1.7):
les cellules Thl
induisent une réponse à médiation cellulaire en sécrétant
principalement de l'IFN-y, l'IL-2 et le TNF-0;
les cellules Th2 induisent une réponse à médiation humorale (IgG, IgM et IgE) en
stimulant les lymphocytes B et en produisant de l'IL-3, IL-4, IL-5, IL-10 et IL-13;
les cellules Th3 font partie des cellules T régulatrices qui interviennent en sécrétant
du facteur de croissance transformant (transforming growth factor-$, TGF-p) qui
stimule la sécrétion d'IgA.
Les immunoglobulines (Igs) produites par les lymphocytes B dépendent des cytokines
synthétisées par les cellules T. Par exemple, les lymphocytes B produisent des IgE en
présence d'IL-4 (Vercelli et al., 1990), des IgGl en présence d'IL-5 (Mizoguchi et al.,
1999), des IgG2a en présence dTFN-yet d'IL-2 (Gougeon, 1996), et des IgA en présence
de TGF-P (Van Vlasselaer et al., 1992). Ainsi, la présence d'IgE et d'IgGl dans le sérum
traduit une activation des cellules Th2, alors que la présence d'IgG2a reflète plutôt
Factivation des cellules Thl.
Tableau 1.7: Exemple du type de réponses immunes au niveau de la muqueuse
intestinale1'.
Profil tic cytokines
IFN-y
IL-4
TGF-p
IL-10
Communication isotypique
Thl
Th2
++++
_
-
i i i i
+/-
+/++
IgG2a
IgGl/IgE
IgA
Thl
Thl/Th2
Th2
Suppression
Adapté de Kaminogawa (1996) et Amrouche (2005).
a
Th3 (T reg)
+/+/++++
+/-
28
2.2.3. Modélisation générale de la réponse immunitaire spécifique
Harber et al. (2000) ont proposé une schématisation générale des relations cellulaires et des
échanges cytokiniques impliqués lors de la réponse immunitaire spécifique (voir Figure
1.2). Ce modèle propose d'associer la sécrétion des cytokines IL-2, IFN-y, TNF-oc et IL-12
à une stimulation de la voie de différenciation lymphocytaire Thl, alors que la sécrétion des
cytokines IL-4, IL-5, et IL-10 est plutôt associée à une stimulation de la voie lymphocytaire
Th2. Lorsque la voie Th2 est activée, une stimulation des LB est également engagée, ce qui
induit la sécrétion d'Ig(s).
Il est aussi intéressant de noter que la diminution du taux de glutathion chez les cellules
présentatrices d'antigène change la réponse immunitaire spécifique chez la souris en
déplaçant une réponse de type Thl vers une réponse de type Th2 (Peterson et al., 1998;
Lothian et al., 2006). 11 semble donc que le taux de glutathion chez les CPA soit
directement corrélé avec la voie activée au niveau des LT auxiliaires. Le dosage de ce
peptide pourrait donc être un indicateur intéressant utilisé en parallèle du dosage des
cytokines afin de déterminer la voie privilégiée au cours de la réponse immune spécifique.
En conclusion, l'activation de la réponse immunitaire spécifique par une substance
antigénique produit une modulation de la prolifération lymphocytaire et de la sécrétion de
certaines cytokines, et ce, de façon spécifique par rapport à la substance antigénique
impliquée. L'étude de la fluctuation de ces paramètres est donc une voie d'investigation
particulièrement intéressante pour émettre des hypothèses sur le type de réponse
immunitaire enclenchée par les peptides que l'on souhaite étudier. Un bref descriptif des
techniques existantes permettant une évaluation qualitative et quantitative de ces
paramètres sera donc présenté dans la section suivante.
■?})
Figure 1.2:
Modèle simplifié des échanges cytokiniques existants entre les lymphocytes
Thl et Th2 et leurs effets sur la différenciation lymphocytaire. Le modèle
montre les cytokines produites par chaque type cellulaire et leurs actions
régulatrices positives (+) ou négatives (-). Tiré de Harber et al. (2000).
10
2.3. Méthodes d'évaluation de la réponse immunitaire spécifique
2.3.1. Mesure de la prolifération lymphocytaire
Pour évaluer le pouvoir immunomodulant de certaines molécules, il est possible de recourir
à la culture de lymphocytes prélevés à partir d'organes lymphoïdes chez les animaux. Une
fois ces lymphocytes mis en culture, la (les) molécule(s) dont on veut tester les propriétés
immunomodulantes sont ajoutée(s) dans le milieu pendant une durée contrôlée. Certains
paramètres peuvent ensuite être quantifiés, tels que le taux de la prolifération cellulaire des
lymphocytes et/ou le taux et le type de cytokines ou d'anticorps sécrétées dans le milieu
extracellulaire (surnageant). Des techniques existent pour quantifier la prolifération
lymphocytaire, mais il reste assez difficile de discriminer qualitativement les cellules à
l'origine de la modulation (lymphocytes B ou Thl, Th2 ou T cytotoxique), sans séparer
spécifiquement ces sous-populations cellulaires. Néanmoins, il est possible d'évaluer la
prolifération lymphocytaire en absence et en présence de certains mitogènes qui stimulent
préférentiellement la population lymphocytaire que l'on désire étudier. Les mitogènes les
plus utilisés sont: le lipopolysaccaride (LPS), la toxine tétanique, la phytohemagglutinine
(PHA) et la concanavaline A (ConA). Ces molécules stimulent plus ou moins
spécifiquement la prolifération des lymphocytes T ou B:
le LPS permet une stimulation sélective des LB (Manakil et al., 2007);
la toxine tétanique (Manakil et al., 2007), la ConA (Chi-Kyeong et al., 2007) et la
PHA (Janossy & Greaves, 1971) permettent une stimulation sélective des LT,
laquelle induit par la suite la prolifération des LB.
Il existe également des systèmes de tri par billes magnétiques qui permettent la purification
des différents types cellulaires, des organites intracellulaires, mais aussi de composantes
biologiques tels que les protéines ou les acides nucléiques (Ghiringhelli & Schmitt, 2004).
Il est ainsi possible d'utiliser ce type de méthode pour obtenir des cultures purifiées de
lymphocytes B ou T. Cependant, il faut noter que les études portant sur des populations
lymphocytaires isolées excluent tous les effets découlant des interactions entre les cellules,
ce qui représente un problème important dans des systèmes ou ce type d'échange est
omniprésent, comme dans le cas du système immunitaire.
31
Les techniques de mesure du taux de prolifération cellulaire font régulièrement appel aux
approches méthodologiques suivantes:
Ajout dans le milieu de culture d'un marqueur ( FI-Thymidine, Bromodeoxyuridine)
qui s'intègre aux séquences d'ADN au cours de la division cellulaire à la place de la
molécule naturellement présente (Thymidine, Uridine) (Gratzner, 1982). La
quantification du marqueur incorporé permet alors de mesurer le taux de
prolifération cellulaire qui a eu lieu durant le temps d'incubation des cellules avec la
(les) molécule(s) testée(s);
Reconnaissance par des anticorps monoclonaux des antigènes synthétisés durant les
phases de division du cycle cellulaire (Gerdes et al., 1983, 1984);
Adjonction de rouge neutre, dont la densité optique varie en fonction du nombre de
cellules présentes dans le milieu (mesure de l'absorbance à 550 nm) (Kull &
Cuatrecasas, 1983);
Mesure du potentiel d'oxydoréduction du milieu par des sels de tétrazolium
(indicateur de la croissance cellulaire). La prolifération cellulaire engendre la
production de métabolites cellulaires (augmentation des ratios NADPH/NADP,
FADH/FAD, FMNH/FMN et NADH/NAD) provoquant ainsi une réduction du
milieu intracellulaire (Mossmann, 1983). Cette réduction peut être mesurée par
l'utilisation de sels de tétrazolium (MTT, XTT, MTS) qui représentent toutefois une
toxicité pour les cellules et qui posent des problèmes de solubilité;
Utilisation d'une solution d'AlamarBlueIM (Ahmed et al., 1994; Zhi-Jun et al.,
1997), basée sur le même principe que celui des sels de tétrazolium. Ce produit est
également réduit par l'environnement intracellulaire réducteur des cellules qui
prolifèrent. L'intensité de fluorescence des surnageants contenant cette solution est
affectée par le changement du potentiel d'oxydoréduction provoqué par la
prolifération des cellules. Elle est mesurée par fluorométrie (longueur d'onde
d'excitation à 544 nm et longueur d'onde d'émission à 590 nm) et permet ainsi de
quantifier le degré de prolifération cellulaire. L'avantage majeur de ce produit est
qu'il n'affecte pas la viabilité cellulaire et n'interfère pas avec la production des
anticorps (Ahmed et al., 1994).
v>
2.3.2. Le dosage des cytokines
Outre la mesure de la prolifération cellulaire, il est possible de caractériser le type de
réponse immunitaire provoqué par une substance en évaluant le profil cytokinique des
sérums physiologiques (approche in vivo) ou des surnageants de culture cellulaire
(approche in vitro, ex vivo). Dans notre approche, nous ciblerons uniquement les techniques
expérimentales ex vivo car elles seront retenues pour notre modèle d'étude.
De nombreuses techniques permettent de caractériser et quantifier l'expression cytokinique.
Il est possible de mesurer l'expression de l'ARN correspondant à la cytokine ciblée (ex:
PCR, RT-PCR), de mesurer l'expression de la protéine cytokinique dans le milieu
intracellulaire (ex: Western Blot), ou encore de mesurer sa présence dans les surnageants de
culture cellulaire (ex: dosage ELISA, immunoprécipitation). Dans notre étude, la méthode
ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) «sandwich» a été retenue pour effectuer le
dosage des cytokines dans les surnageants de culture cellulaire. Cette méthode présente les
avantages d'être très quantitative, sensible et spécifique; tous ces paramètres sont très
importants à considérer dans une étude. Cette méthode (voir Figure 1.3) repose sur la
reconnaissance d'un antigène (la cytokine recherchée) par un anticorps qui lui est
spécifique (anticorps primaire monoclonal) et qui est fixé aux parois des puits d'une
microplaque. E'échantillons à étudier (surnageant, sérum, plasma, etc.) est ensuite ajouté,
puis des «enzymes anticorps» (anticorps secondaires polyclonaux) sont ajoutées (après
lavage). Ces enzymes anticorps vont reconnaître l'antigène fixé aux anticorps primaires.
L'anticorps secondaire est couplé à la biotine qui va elle-même reconnaître spécifiquement
le dernier composé ajouté, soit la streptavidine conjugée à la peroxidase. La peroxidase est
une enzyme qui provoque une réaction colorimétrique après l'ajout du substrat
tetramethylbenzidine (LMB) dans les puits, et l'intensité de cette réaction est ensuite
mesurée par spectrophotométrie.
33
HRP-Linked Antibody
DeieciionAiHiboclv
■P""
4M-"
«■M*-'
wBP!'
Sandwich El Isa
Figure 1.3:
Principe du dosage ELISA (Cell Signaling Technology, 2007)
M
3. LES EFFETS DE LA (3-LACTOGLOBULINE, L'OC-LACTALBUMINE ET DE LEURS
PEPTIDES SUR LE SYSTÈME IMMUNITAIRE
La littérature scientifique compte de nombreux travaux qui se sont intéressés aux propriétés
bioactives des protéines du lactosérum bovin. Il est reconnu aujourd'hui que les protéines
du lactosérum et leurs hydrolysats possèdent des propriétés immunomodulantes chez les
humains et les animaux (Wong et al., 1997; Pihlanto-Leppâlâ & Korhonen, 2003; Marshall,
2004). En effet, les protéines majeures du lactosérum sont en mesure d'améliorer la
fonction
immunitaire en influençant
plus ou moins directement la prolifération
lymphocytaire et la sécrétion d'anticorps et/ou de cytokines (Gill et al., 2000; Korhonen &
Pihlanto-Leppâlâ, 2006). Cependant, très peu de travaux ont étudié les propriétés
immunomodulantes des peptides issus de l'hydrolyse de la (3-Lg et de Pa-La, bien que
plusieurs auteurs aient émis des hypothèses au sujet de la présence d'immunopeptides dans
la séquence primaire de ces deux protéines (Chatterton et al., 2006; Gauthier et al., 2006;
Sindayikengera & Xia, 2006a; Zimecki & Kruzel, 2007). Dans cette section, les études
portant plus particulièrement sur les protéines p-Lg et a-La et sur l'évaluation ex vivo de la
réponse immunitaire spécifique ont été retenues, puisque notre étude s'est essentiellement
intéressée aux effets sur la modulation du système immunitaire spécifique de peptides issus
de ces 2 protéines. Quelques conclusions des travaux qui se sont intéressés à l'évaluation de
l'immunité non spécifique seront également présentées.
3.1. Effets des protéines du lactosérum sur le système immunitaire
De nombreux travaux se sont intéressés aux propriétés immunomodulantes de produits
commerciaux à base d'extraits de protéines de lactosérum bovin (CPLs, IPLs) qui sont
intéressants vis-à-vis de notre étude du fait de la présence majoritaire de la (3-Lg et Pa-La
dans ces produits. Les protéines du lactosérum sont cependant présentes en mélange, ce qui
rend difficile l'identification sélective des constituants responsables des effets observés.
Dans ce cas, les effets peuvent provenir d'une ou plusieurs protéines ou des interactions
entre les différentes protéines et/ou peptides présents dans le lactosérum. Les Tableaux 1.8
et 1.9 résument les principales et plus récentes études qui ont porté sur l'étude des effets
des CPLs/IPLs (Tableau 1.8) et des protéines individuelles (Tableau 1.9) du lactosérum sur
le système immunitaire.
Tableau 1.8: Effets ex vivo et in vivo des CPLs et IPLs sur le système immunitaire.
PRODUITS
MF-IPL3
TYPE DE MODÈLE
Prolifération de splénocytes murins
Sécrétion de cytokines
EFFETS OBSERVÉS (CONCENTRATION EFFECTRICE)
î prolifération (1000-4000 ug.mL"1)
[ prolifération (500-4000 ug.mL"1 + ConA)
i sécrétion IL-4 (4000 ug.mL"1 + ConA)
| sécrétion IL-10 (4000 ^g.mL"1 + ConA)
! sécrétion IFN-y(4000 ug.mL"' + ConA)
RÉFÉRENCES
Saint-Sauveur et al.
2007
RutherfurdMarkwick & Gill.
2005
IMUCARECPL „ ....
Prolifération de splénocytes murins
IMUCARE CPL: î prolifération (diète de 8 jours)
CHEESE CPL: aucun effet sur la prolifération (diète de 4 et 8 jours)
CEI-IPL"
MF-IPL A et B
Prolifération de splénocytes murins
CEI-IPL: i prolifération (200 ug.mL"1)
MF-IPL: î prolifération (100 ug.mL"1)
Mercier et al,
2004
Prolifération de splénocytes murins
| prolifération (400-1600 ug.mL"1 + ConA)
Cross & Gill,
1999
CPL
CHEESE CPL
a
1
Prolifération de lymphocytes sanguins ovins Aucun effet sur la prolifération (1-1000 ug.mL" + ConA ou LPS)
Aucun effet sur la sécrétion IFN-y (6,25-400 ug.mL"1 + ConA)
Sécrétion d'IFN-y
Sécrétion de cytokines par les macrophages Aucun effet sur la sécrétion IL-l(î et TNF-oc (6.25-400 ug.mL"1 + LPS)
MF-IPL: IPL obtenu par microfïltration (MF).
CEI-IPL: IPL obtenu par chromatographie échangeuse d'ions.
b
Wong et al.,
1997
Tableau 1.9: Effets ex vivo des protéines i
PROTÉINES
a-La
P-Lg
BSA
Lf
du lactosérum sur le système immunitaire.
TYPE DE MODÈLE
EFFETS OBSERVÉS (CONCENTRATION EFFECTRICE)
RÉFÉRENCES
Prolifération de splénocytes murins
a-La, P-Lg. BSA: aucun effet (100 ug.mL"1 )
Lf: l prolifération (100 ug.mL"1)
Mercier et al.. 2004
P-Lg
Prolifération de splénocytes murins
Incubation
Incubation
Incubation
Incubation
Mahmud et al., 2004
P-Lg
Prolifération de splénocytes murins
Aucun effet sur la prolifération (100, 2000 ug.mL"1)
a-La
BSA
P-Lg
Prolifération de splénocytes murins
Prolifération de lymphocytes
Sécrétion de cytokines
Dosage de glutathione (GSH)
a-La: aucun effet sur prolifération (500-5000 ug.mL"1); | GSH (1000 ug.mL"')
BSA: aucun effet sur prolifération (500-5000 ug.mL"1) et GSH (1000 ug.mL"1)
P-Lg non purifiée: î prolifération (500-5000 ug.mL"1); î GSH (1000 ug.mL"1)
P-Lg non purifiée: î sécrétion TNF-a, IL-10, IL-6 et IL-ip (1000 ug.mL"1)
P-Lg purifiée: J, prolifération/GSH comparé à p-Lg non purifiée (1000 ug.mL"1)
P-Lg purifiée: j sécrétion TNF-a, IL-10, IL-6 et IL-lp" (1000 ug.mL"1)
P-Lg
Prolifération de splénocytes murins
Sécrétion de cytokines
l prolifération (2500-5000 ug.mL"1)
| sécrétion IL-2 et IFN-y, î sécrétion IL-10 (2500 ug.mL"1)
P-Lg
Prolifération de splénocytes murins
Production d'IaM
î prolifération (10"" moI.L"1)
î sécrétion IgM (10° mol.L"1)
Wongetal.. 1998
a-La
BSA
Lf
Prolifération de lymphocytes ovins
Sécrétion d'IFN-y
Sécrétion de cytokines (macrophages)
a-La et BSA: aucun effet sur la prolifération (1-1000 ug.mL"1 + ConA ou LPS)
a-La et BSA: aucun effet sur la sécrétion IFN-y (6,25-400 ug.mL"1 - ConA)
a-La: î sécrétion IL-1 (3 par les macrophages (6,25-400 ug.mL"1 + LPS)
BSA: aucun effet sur sécrétion IL-lp" et TNF-a (6.25-400 ug.mL"1 + LPS)
Lf: i prolifération (1-1000 ug.mL"1 + ConA)
Lf: i sécrétion IFN-y (6,25-400 ug.mL"1 + LPS)
Wongetal., 1997
Lf
Prolifération de splénocytes murins
l prolifération (1-100 ug.mL"1)
I prolifération (1-100 ug.mL"1 + ConA, PHA ou LPS)
12h: f
48h: î
72h: f
96h: f
prolifération
prolifération
prolifération
prolifération
(500 ug.mL" )
(50-500 ug.mL"1)
(10-500 ug.mL"1)
(50-500 ug.mL"1)
Prioult et al, 2004
Brix et al., 2003
Pecquet et al., 1999
Miyauchi et al., 1997
37
Le Tableau 1.8 permet de voir que les concentrés et isolats de protéines du lactosérum
possèdent une influence marquée sur la modulation de la réponse par les splénocytes,
notamment au niveau de la prolifération des splénocytes et de la sécrétion des cytokines.
Ces résultats laissent entrevoir que des protéines ou peptides présents dans ces produits
commerciaux auraient un effet sur la modulation du système immunitaire spécifique.
Le Tableau 1.9 montre que la majorité des travaux qui ont étudié l'effet des protéines
majeures du lactosérum sur la modulation du système immunitaire ont porté sur la protéine
majeure du lactosérum: la P-Lg. Par contre, peu de travaux ont étudié les effets
immunomodulants de l'oc-La sur le système immunitaire (Beaulieu et al., 2006). En accord
avec les travaux de Wong et al. (1997) et Mercier et al. (2004), les travaux de Brix et al.
(2003) ont montré que l'a-La ne possédait pas d'effet sur la prolifération des splénocytes
murins, ni sur celle des lymphocytes mésentériques. En revanche, il est intéressant de
souligner que Brix et al. (2003) ont également montré que l'a-La diminuait sensiblement le
taux intracellulaire de GSH, lequel est reconnu aujourd'hui comme étant un indicateur de
l'immunostimulation (Exner et al., 2000; Brix et al., 2003).
Le Tableau 1.9 montre également que des controverses existent concernant les effets de la
P-Lg sur la modulation du système immunitaire. En effet, les travaux de Wong et al. (1998)
et Mahmud et al. (2004) ont montré que la P-Lg stimulait la prolifération des splénocytes
murins, alors que ceux de Prioult et al. (2004) et Mercier et al. (2004) ont conclu que cette
protéine n'influençait pas la prolifération de ces cellules. Les travaux de Brix et al. (2003)
ont également montré que la P-Lg purifiée ne stimulait pas la prolifération et la sécrétion de
certaines cytokines par les splénocytes murins. Enfin, Pecquet et al. (1999) ont montré un
effet inhibiteur de la p-Lg sur la prolifération des splénocytes murins, ainsi qu'une
modulation de la sécrétion cytokinique (voir Tableau 1.9). Néanmoins, cette étude n'a pas
vérifié si la diminution de la prolifération était causée par une éventuelle cytotoxicité de la
P-Lg à forte concentration (>2500 ug.mL" ), laquelle se répercuterait certainement aussi sur
la mesure de la sécrétion cytokinique. Ces contradictions sur les effets immunomodulants
de la P-Lg peuvent être liées en partie au mode d'obtention et de fabrication des extraits
protéiques testés, étant donné que le procédé de fabrication a un impact direct sur la
38
composition qualitative et quantitative des extraits obtenus (Rutherfurd-Marwick & Gill,
2005), mais aussi sur les conditions expérimentales variables utilisées dans les différentes
études pour la mesure de la prolifération des cellules.
D'autres études ont également montré l'intervention indirecte des protéines du lactosérum
dans la modulation du système immunitaire. En effet, il a été montré que la (3-Lg joue un
rôle majeur dans le transport de petites molécules hydrophobes, dont l'acide rétinoique qui
est un modulateur reconnu de la réponse lymphocytaire (Guimont et al., 1997; Gill et al.,
2000). La P-Lg possède donc ici un rôle indirect sur la modulation de la réponse
immunitaire du fait de sa fonction de transporteur de molécules. D'autre part, Eiounous
(2000), Bounous & Gold (1991) et Bounous et al. (1989) ont montré que la cystéine est un
acide aminé essentiel pour la synthèse du glutathion. Comme mentionné précédemment, ce
tripeptide est nécessaire pour l'activation de nombreuses cellules telles que les lymphocytes
(Bounous et al., 1989; Wong et al., 1997). Les protéines de lactosérum contenant une forte
proportion de cystéine, elles pourraient jouer un rôle important sur la formation du
glutathion et par conséquent, sur la modulation de la prolifération lymphocytaire (Bounous
& Gold, 1991; Wong et al., 1997; Marshall, 2004). En fait, l'a-La et la p-Lg possèdent
respectivement 8 et 5 résidus cystéine dans leur séquence primaire, ce qui en font de très
bonnes sources de cystéine pour la synthèse du glutathion (Pihlanto-Leppâlâ & Korhonen,
2003). Ces deux protéines pourraient donc agir sur la modulation du système immunitaire
par le biais de la régulation de la synthèse et la conversion intracellulaire du glutathion.
Cette hypothèse a été vérifiée par Brix et al. (2003) tel que présenté dans le Tableau 1.9.
Enfin, soulignons que la modulation du taux de glutathion dans les CPA influence
également le type de voie immunitaire engagée lors de la réponse immunitaire spécifique
(Thl/Th2) (Lothian et al., 2006). Son dosage pourrait donc être un indicateur intéressant à
utiliser dans des études ultérieures pour déterminer l'influence de certaines molécules sur
l'immunomodulation et les voies lymphocytaires privilégiées.
Tous ces éléments témoignent donc que le lactosérum est composé de protéines aux
propriétés immunomodulatrices marquées. Cependant, des controverses persistent toujours
concernant le rôle individuel joué par les protéines majeures du lactosérum bovin,
39
notamment concernant la P-Lg. De nouvelles études sont donc nécessaires pour s'assurer
de l'implication réelle des protéines individuelles du lactosérum dans les effets observés.
Toutefois, tel que discuté précédemment, les contradictions observées dans la littérature
peuvent facilement s'expliquer par l'utilisation de différents procédés de fabrications, mais
aussi par les différentes approches méthodologiques utilisées dans les différentes études. La
sélection des échantillons protéiques, l'origine des lymphocytes (rate, plaques de Peyer,
sang), les paramètres de mesure de la prolifération cellulaire (utilisation de mitogène,
souche de souris, mode de détection de la prolifération, etc.) sont tous des facteurs pouvant
être à l'origine des variations observées. La contamination par des endotoxines (ex: LPS)
de certaines des préparations protéiques commerciales utilisées dans ces études peut
également être mis en cause (Gauthier et al., 2006). En effet, les travaux de Brix et al.
(2003) ont démontré que le pouvoir immunostimulant de certaines préparations
commerciales de P-Lg n'était pas causé uniquement par cette protéine, mais aussi par la
contamination des produits par des endotoxines qui ont un effet marqué sur la réponse
immunitaire. En outre, le LPS est une endotoxine et un contaminant du lait possédant un
effet mitogène reconnu sur la prolifération cellulaire (Petsch & Anspach, 2000; Brix et al.,
2003). Les travaux de Wong et al. (1998) ont d'ailleurs démontré l'absence de LPS dans
leur préparation commerciale de p-Lg en utilisant un inhibiteur de cette molécule, la
polymyxine B (Jacobs & Morrisson, 1977; Srimal et al., 1996). Cette vérification leur a
ainsi permis de confirmer que la stimulation de la prolifération des splénocytes murins et
l'augmentation de la sécrétion des IgM n'étaient pas causées par le LPS. Néanmoins, la
présence d'autres endotoxines dans les préparations commerciales de P-Lg n'a jamais été
vérifiée si bien qu'il est encore difficile d'attribuer les effets immunomodulants de la P-Lg
à la protéine seule, à moins de s'assurer de l'absence de contaminants dans les produits
(Brix et al., 2003).
3.2. Effets des hydrolysats de protéines du lactosérum sur le système immunitaire
Plusieurs travaux se sont attardés à démontrer que les hydrolysats de protéines de
lactosérum bovin possèdent un effet sur la modulation du système immunitaire. Le Tableau
1.10 illustre une synthèse des résultats obtenus dans les études les plus récentes et
marquantes sur le sujet.
Tableau 1.10: Effets ex vivo d'hydrolysats de protéines du lactosérum sur le système immunitaire.
PRODUIT
HYDROLYSE
ENZYMES
UTILISÉES
TYPE DE MODÈLE
EFFETS OBSERVÉS (CONCENTRATION EFFECTRICE)
RÉFÉRENCES
MF-IPL
Trypsine
+
Chymotrypsine
Prolifération de splénocytes murins
Sécrétion de cytokines
î prolifération (500-4000 ug.mL"1)
î prolifération (2000-4000 ug.mL"1 + ConA)
î sécrétion IFN-y (4000 ug.mL"1 + ConA)
Saint-Sauveur et al.,
2007
a-La
P-Lg
BSA
Trypsine
chymotrypsine
Pepsine
Pancréatine
Phagocytose de macrophages murins
î de la phagocytose pour tous les d'hydrolysats
(1000 ug d'hydrolysat/g masse corporelle, 5 jours)
Biziulevicius et al,
2006
Prolifération de splénocytes murins
CEI-IPL: î prolifération (2000 ug.mL"1)
MF-IPL: î prolifération (2000 ug.mL"1)
Mercier et al., 2004
Mercier et al., 2004
CEI-IPL
MF-IPL
Trypsine
Chymotrypsine
a-La
P-Lg
Lf
BSA
Trypsine
+
Chymotrypsine
Prolifération de splénocytes murins
Aucun effet (2000 ug.mL" )
P-Lg
Pepsine
Trypsine
Chymotrypsine
Pancréatine
Prolifération de splénocytes murins
î prolifération (10-500 ug.mL"1)
P-Lg
Lactobacillus
paracasei
Prolifération de splénocytes murins
Sécrétion de cytokines
Aucun effet sur prolifération (100,2000 ug.mL"1)
Aucun effet sur sécrétion IFN-y/IL-10 (2000 ug.mL"1)
| sécrétion IL-4 (2000 ug.mL"1)
P-Lg
Trypsine
Production dTgM
î sécrétion IgM (10"5 mol.L"1)
Prolifération de splénocytes murins
Production dTgM, IgG et IgA
î
î
î
î
Lf
Pepsine
prolifération (10-1000 ug.mL"1)
prolifération (10-1000 ug.mL"1 + ConA/PHA)
prolifération (1000 ug.mL"1 + LPS)
sécrétion IgM, IgG et IgA (100, 1000 ug.mL"1)
Mahmud et al., 2004
Prioult et al., 2004
Wongetal., 1998
Miyauchi étal., 1997
o
41
Les résultats des travaux présentés dans le Tableau 1.10 soulèvent une controverse
importante concernant l'impact de l'hydrolyse sur le pouvoir immunomodulant des
hydrolysats de protéines du lactosérum. En effet, les travaux de Mercier et al. (2004) ont
montré que des hydrolysats obtenus par un mélange trypsine/chymotrypsine des protéines
a-La, P-Lg, Lf et BSA ne possédaient aucun effet sur la prolifération des splénocytes. Les
résultats de Prioux et al. (2004) ont également montré que l'hydrolyse de la P-Lg par les
exoprotéases de la souche Lactobacillus paracasei produisait des hydrolysats qui n'avaient
aucun effet sur la prolifération des splénocytes. En revanche, les travaux de Mahmud et al.
(2004) ont démontré que des hydrolysats trypsique, pepsique, chymotrypsique ou
pancréatique de la P-Lg augmentaient la prolifération des splénocytes murins de façon
significative et ce, par rapport à la stimulation observée pour la P-Lg intacte. Encore ici, les
différences observées peuvent toutefois être attribuées aux différents procédés utilisés pour
la fabrication des produits testés, de même qu'aux différentes approches expérimentales
utilisées. Entre autres, les enzymes utilisées pour l'hydrolyse des protéines sont souvent
différentes d'une étude à l'autre, ainsi que les concentrations protéiques qui sont utilisées
dans les essais (voir Tableau 1.10).
Il est aussi intéressant de noter que Phydrolysat pepsique de la Lf possède un effet
immunostimulant sur la prolifération des splénocytes murins, alors que la lactoferrine
intacte produit plutôt une inhibition fortement marquée de ces mêmes cellules (Miyauchi et
al., 1996). Ce résultat suggère donc que l'hydrolyse d'une protéine peut modifier
totalement ses effets physiologiques, au point de lui conférer un effet inverse à celui
observé avant hydrolyse. Néanmoins, il demeure très difficile de prévoir l'effet d'un
peptide ou d'un mélange de peptides issus d'une protéine ou d'un mélange protéique.
Les travaux réalisés sur les effets immunomodulants des hydrolysats protéiques (Tableau
1.10) ont toutefois amené les chercheurs à émettre l'hypothèse que des immunopeptides
seraient contenus dans la séquence primaire des protéines majeures du lactosérum et que
ces derniers pouvaient être libérés lors de l'hydrolyse de ces protéines. Quelques travaux
ont donc étudié les effets de fractions peptidiques issues d'hydrolysats de protéines du
lactosérum en vue de vérifier l'impact des caractéristiques physicochimiques des peptides
42
sur les effets observés (Mercier et al., 2004; Prioult et al., 2004; Saint-Sauveur et al., 2007).
Une synthèse des résultats obtenus dans ces études est présentée dans le Tableau 1.11. Ces
résultats indiquent que des fractions peptidiques obtenues de la séparation d'hydrolysats
complexes présentent des effets significatifs sur la prolifération des splénocytes et la
sécrétion de certaines cytokines. Cela laisse clairement entrevoir que certains peptides
contenus dans ces fractions seraient impliqués dans la modulation du système immunitaire.
Enfin, soulignons que les travaux de Biziulevicius et al. (2006) sont intéressants dans la
mesure où ces auteurs ont suggéré une corrélation entre le pouvoir antimicrobien
(activation de l'autolyse bactérienne) et la modulation du système immunitaire non
spécifique (augmentation de la phagocytose) et ce, en étudiant 20 hydrolysats de protéines
alimentaires dont 3 issus des protéines du lactosérum (a-La, P-Lg, BSA). Des analyses de
régression entre le pouvoir antimicrobien et immunomodulant des différents hydrolysats
ont permis de montrer des relations étroites entre ces deux fonctions physiologiques. Ces
résultats suggèrent donc que certains des peptides libérés par hydrolyse des protéines
alimentaires pourraient non seulement posséder une activité antibactérienne, mais aussi une
activité immunomodulante. Cette hypothèse est d'autant plus réaliste que les peptides
antibactériens sont de réels acteurs de l'immunité innée (naturelle) puisqu'ils ont pour effet
de défendre l'organisme contre les bactéries, les virus et les moisissures (Radek & Gallo,
2007).
Précédemment, nous avons décrit les Cell penetrating peptides (CPP) comme des
molécules constituées de moins de 30 acides aminés, chargées positivement à pH 7 et
hydrophobes
ou
amphiphiles
(Zorko
&
Langel,
2005).
Ces
caractéristiques
physicochimiques se retrouvent non seulement chez certains des peptides antimicrobiens
connus, mais pourraient également être libérés suivant une hydrolyse de la a-La et la P-Lg
par la trypsine et/ou la chymotrypsine dans des conditions spécifiques. Actuellement, les
peptides antimicrobiens font l'objet de nombreux travaux de recherche qui ont pour objectif
d'intégrer ces molécules parmi l'arsenal des agents thérapeutiques anti-infectieux de
demain (Andrès & Dimarcq, 2004). Il n'est donc pas utopique d'envisager une perspective
semblable dans le cas des immunopeptides isolés à partir des protéines du lactosérum.
Tableau 1.11: Effets ex vivo de fractions peptidiques i
PRODUIT
HYDROLYSE
ENZYMES
LTTLISÉES
-^
_,.
.
Chymotrypsine
MF-IPL
AetB
P" L §
Trypsine
+
Chymotrypsine
Trypsine
+
,
^^ .
y
yp
+/L. paracasef
TYPE DE MODÈLE
d'hydrolysats de protéines du lactosérum sur le système immunitaire.
EFFETS OBSERVÉS (CONCENTRATION EFFECTRICE)
RÉFÉRENCES
Prolifération de splénocytes murins
Sécrétion de cytokines
FI: î sécrétion IL-2 (4000 ug.mL"1 + ConA)
F2: î sécrétion IL-4 (4000 ug.mL"1 + ConA)
F2: î prolifération (4000 ug.mL"1 + ConA)
F1,F2: î sécrétion IFN-y(4000 ug.mL"1)
F1,F3: î prolifération (2000-4000 ug.mL"1 + ConA)
FI, F2, F3: î prolifération (500-4000 ug.mL"1)
FI, F2, F3: î sécrétion IL-2 (4000 ug.mL'1)
FI, F2, F3: î sécrétion IFN-y (4000 ug.mL"1 + ConA)
Saint-Sauveur
et al., 2007
Prolifération de splénocytes murins
F2, F3, F4: î prolifération (MF-IPL A, 0,5 ug.mL"1)
FI, F2, F3: î prolifération ( MF-IPL B, 0,5 ug.mL'1)
Mercier et al..
2004
Prolifération de splénocytes murins
Sécrétion de cytokines
Trypsine + Chymotrypsine:
Fraction acide: | prolifération (2000 ug.mL"1)
Fraction acide: f sécrétion IFN-y
Fraction basique: î prolifération (2000 ug.mL"1)
Fraction basique: [ sécrétion IL-4 (2000 ug.mL"1)
Trypsine + Chymotrypsine + L. paracasei:
Fraction acide: J. prolifération (2000 ug.mL" )
Fraction acide: [ sécrétion IFN-y/IL-4; f sécrétion IL-10 (2000 ug.mL"1)
Fraction basique: f prolifération (2000 ug.mL"1)
Fraction basique: aucun effet sur sécrétion (100. 2000 ug.mL"1)
Prioult et al..
2004
"L. paracaseï. Lactobacillus paracasei
■4^
44
3.3. Effets des peptides issus de la p-Lg et de l'a-La sur le système immunitaire
De nombreuses études rapportent la présence d'immunopeptides dans la séquence primaire
des caséines (Gill et al., 2000; Pihlanto-Leppâlâ & Korhonen, 2003; Sindayikengera & Xia,
2005). Plusieurs immunopeptides ont également été identifiés dans le lactosérum, tel que le
GMP, un peptide naturellement présent dans le lactosérum et dont les propriétés
immunomodulantes ont été revues par Gauthier et al. (2006): modulation de la prolifération
de lymphocytes, inhibition de la sécrétion de certains anticorps, modulation de la sécrétion
cytokinique.
De
nombreux
travaux
ont
également
porté
sur
les
propriétés
immunomodulantes de la lactoferricine, un peptide libéré par hydrolyse pepsique de la
lactoferrine. Gifford et al. (2005) et Gauthier et al. (2006) ont d'ailleurs revu les propriétés
de cet immunopeptide: anti-inflammatoire, inhibition de l'activation du complément,
activation de gènes impliqués dans la défense immunitaire, neutralisation d'endotoxines,
modulation de la sécrétion cytokinique, stimulation de la phagocytose.
Toutefois, jusqu'à présent, seulement trois peptides ont été identifiés dans la séquence
primaire des protéines majeures du lactosérum bovin (Berthou et al., 1987; Fiat et al., 1993,
Kayser & Meisel, 1996). En outre, Kayser & Meisel (1996) ont démontré que le dipeptide
Tyr-Gly et le tripeptide Tyr-GIy-Gly, préparés par synthèse chimique, possèdent un
potentiel immunostimulant sur la prolifération ex vivo de lymphocytes sanguins
périphériques humains pré-stimulés par la ConA. Ces deux peptides sont à la fois contenus
dans la séquence primaire de l'a-La et de la caséine K (Meisel, 1997) et correspondent aux
fragments peptidiques suivants de l'a-La:
-
dipeptide Tyr-Gly: a-La fl 8-19 et a-La f50-51
-
tripeptide Tyr-GIy-Gly: a-La fl 8-20
Dans le cas du peptide Tyr-Gly, il a été démontré qu'il permettait d'augmenter la
prolifération des lymphocytes sanguins de 93% à la concentration de 10"9 mol.L' , alors que
cette augmentation était plus forte pour le tripeptide Tyr-GIy-Gly, soit de 74% à la
concentration de 10"'2 mol.L"1 (Meisel, 1997). Berthou et al. (1987) ont également
démontré que le tripeptide Gly-Leu-Phe stimule l'immunité innée à de faibles doses (0,3-30
umol.L ) et ce, en augmentant la phagocytose des globules rouges de mouton par les
45
macrophages intrapéritonéaux de souris. Ce peptide est contenu dans la séquence primaire
des caséines (3 et K humaines, mais aussi dans celle de l'a-La bovine, correspondant alors
au fragment a-La f51-53. La capacité de ce peptide à stimuler la phagocytose a aussi été
confirmée chez des macrophages humains (Gattegno et al., 1988; Fiat et al., 1993). En fait,
ce peptide permettrait d'augmenter l'adhésion et l'internalisation des globules rouges par
les monocytes et les macrophages humains de façon dose-dépendante et ce, à partir d'une
concentration de 0,2 u.mol.L"'. Ce même peptide a aussi été démontré pour protéger contre
les infections à Klebsiella pneumoniae suivant son injection par voie intraveineuse ou souscutanée à partir d'une dose de 1 mg.kg"1 (Fiat et al., 1993).
L'ensemble de ces informations démontre donc qu'il existe de nombreuses contradictions
dans la littérature scientifique concernant les effets des protéines du lactosérum sur le
système immunitaire, bien que la majorité des études aient démontrée un pouvoir
immunomodulant marqué de ces protéines seules ou en mélange, hydrolysées puis
fractionnées. Loutefois, jusqu'à ce jour, très peu de peptides issus de la [3-Lg et l'a-La ont
été identifiés comme étant des immunopeptides, bien que plusieurs études permettent
d'envisager que ces protéines contiendraient d'autres peptides en mesure d'influencer le
système immunitaire. En effet, le potentiel immunomodulateur des concentrés et isolats de
protéines du lactosérum, des hydrolysats de protéines de lactosérum et des protéines
individuelles (3-Lg/a-La semble assez évident au regard de toutes ces études. Il est donc
logique d'envisager la présence d'immunopeptides dans la séquence primaire des deux
protéines
majeures
du
lactosérum
bovin.
De ce
fait,
l'étude
des
propriétés
immunomodulantes de peptides issus de la (3-Lg et l'a-La parait un terrain d'investigation
scientifique tout à fait pertinent.
46
4. BUT, HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS
Grâce aux connaissances actuelles, il est possible d'affirmer que certaines protéines du
lactosérum bovin et leurs produits d'hydrolyse peuvent potentiellement moduler la réponse
du système immunitaire.. En effet, plusieurs travaux ont permis de démontrer que des
hydrolysats de protéines de lactosérum induisent une modulation significative de la réponse
immune spécifique. Or, ces hydrolysats sont des mélanges complexes de peptides issus
principalement des deux protéines majeures du lactosérum que sont l'a-La et la (3-Lg et
dont les propriétés physico-chimiques sont très différentes (taille, charge, hydrophobicité).
Par contre, jusqu'à présent, très peu de travaux ont étudié les effets sur la réponse immune
spécifique de ces peptides sous forme individuelle. Le but de ce travail de recherche était
donc d'étudier l'activité immunomodulante de certaines séquences peptidiques issues de la
(3-Lg et l'a-La et ce, en vue de vérifier l'hypothèse de recherche suivante:
Certains peptides contenus dans la séquence primaire des protéines majeures du
lactosérum bovin (J3-Lg et os-La) peuvent stimuler la prolifération de splénocytes murins
et moduler la sécrétion de certaines cytokines.
Pour atteindre le but de ce travail et vérifier notre hypothèse de recherche, les objectifs
suivants ont été définis:
1. Sélectionner des peptides contenus dans la séquence primaire de la (3-Lg et l'a-La
pouvant théoriquement être libérés par hydrolyse enzymatique de ces protéines à
l'aide d'un mélange trypsine/chymotrypsine (enzymes gastro-intestinales), mais
aussi sur la base de leurs caractéristiques physico-chimiques différentes.
2. Étudier l'effet ex vivo de ces peptides sur la prolifération de splénocytes murins.
3. Étudier l'effet des peptides identifiés comme stimulant la prolifération des
splénocytes sur la sécrétion des cytokines IL-2 et IFN-y (voie Thl) et IL-4, IL-10
(voie Th2).
47
Le prochain chapitre du mémoire est consacré à la présentation des résultats obtenus dans le
cadre de ce projet de recherche. Ce chapitre a été rédigé en anglais sous la forme d'un
article scientifique qui sera soumis ultérieurement à la revue scientifique International
Dairy Journal.
Enfin, soulignons qu'une conclusion générale est présentée à la suite du chapitre II, laquelle
résume les principaux résultats obtenus dans le cadre de ce projet de recherche et présente
certaines perspectives émanant des nouvelles connaissances acquises dans le cadre de ce
projet de recherche.
48
CHAPITRE II:
IMMUNOMODULATING EFFECTS OF
PEPTIDES FROM p-LACTOGLOBULINE AND
a-LACTALBUMINE
4')
1. RÉSUMÉ
Onze peptides issus de la (3-lactoglobuline (P-Lg) et de l'a-lactalbumine (a-La) ont été
sélectionnés sur la base de leurs propriétés physico-chimiques et leur libération théorique à
partir de ces protéines suite à une hydrolyse par la trypsine et/ou chymotrypsine. Ces
peptides ont été préparés par synthèse chimique, puis leurs propriétés immunomodulantes
ont été évaluées ex vivo en mesurant leurs effets à différentes concentrations sur la
prolifération de splénocytes murins et ce, en absence et en présence d'un mitogène
(concanavaline A). Le peptide (3-Lg f78-83 n'a montré aucun effet sur la prolifération des
cellules, alors que sept peptides ((3-Lg fl5-20, f55-60, f84-91, f92-105, A39-148, 042-148
et a-La flO-16) ont montré une stimulation plus ou moins forte de la prolifération des
splénocytes. Lrois peptides ((3-Lg fl-8, f102-105 et a-La fl04-108) ont montré un effet
inhibiteur sur la croissance des cellules. Des corrélations établies entre les caractéristiques
physico-chimiques des peptides et leurs propriétés immunostimulantes ont révélé
l'importance des facteurs suivants: charge positive, hydrophobicité et taille des peptides.
Les effets sur la sécrétion cytokinique (IL-4, IL-10, 1L-2 et IFN-y) ont également été
mesuré en absence et en présence du mitogène (ConA) pour les peptides (3-Lg fl 5-20, f5560 et fl39-148, lesquels étaient les plus représentatifs des différents profils de prolifération
des splénocytes préalablement obtenus. Les effets de ces peptides sur la sécrétion des
cytokines ont montré des profils d'inhibition et/ou de stimulation variés. Ces résultats
suggèrent donc que certains peptides trouvés dans la séquence primaire des protéines
majeures du lactosérum posséderaient une activité immunomodulante sur la réponse
immunitaire spécifique.
50
2. ABSTRACT
Eleven peptides from pMactoglobulin and a-lactalbumin were selected according to their
physicochemical characteristics and their theoretical release from thèse proteins by trypsin
and/or chymotrypsin hydrolysis. Thèse peptides were chemically synthesised then their
immunomodulating properties were evaluated ex vivo by measuring their effects at différent
concentrations on murine splenocyte prolifération, in absence and présence of a mitogen
(concanavalin A). The peptide (3-Lg f78-83 had no effect on cell prolifération while seven
peptides ((3-Lg H5-20, f55-60, f84-91, 192-105, A39-148, fl42-148 and a-La 110-16)
stimulated the prolifération of splenocytes at différent degrees. Three peptides (p-Lg fl-8,
p-Lg fl 02-105 and a-La f 104-108) showed a decreasing effect on the cell growth.
Corrélations established between physicochemical parameters of the peptides and their
immunostimulating properties revealed the importance of the following parameters:
positive charge, hydrophobicity and size of the peptides. Effects on cytokine sécrétion (IL4, IL-10, IL-2, IFN-y) were measured with and without the présence of the mitogen for
peptides p-Lg fl 5-20, f55-60 and fl 39-148, which had lead to différent cells stimulating
prolifération profiles. Effects on cytokine release showed various inhibiting and/or
stimulating profiles. Thèse results thus suggest that some peptides encrypted in the primary
séquence of the major whey proteins may hâve an immunomodulating effect on the spécifie
immune response.
51
3. INTRODUCTION
Bovine milk proteins are well-known to exert several physiological functions and to contain
numerous bioactive peptides, which are encrypted within their primary séquence.
Biological activities identified to date for milk peptides included antioxidative,
antihypertensive,
antimicrobial,
opioid,
mineral-carrying
and
immunomodulatory
(Korhonen & Pihlanto-Leppàlà, 2007; Zimecki & Kruzel, 2007).
Both in vitro and in vivo studies hâve demonstrated that some whey protein-based
ingrédients (WPC, WPI) and individual whey proteins such as (3-lactoglobulin ((3-Lg), alactalbumin (a-La) and lactoferrin (Lf) can influence the immune response (RutherfurdMarkwick & GUI, 2005, Gauthier et al., 2006; Korhonen & Pihlanto-Leppala, 2006; SaintSauveur et al., 2007; Zimecki & Kruzel, 2007). Several studies hâve also shown that whey
protein enzymatic hydrolysates possess immunomodulating effect,
suggesting the
enzymatic release of bioactive peptides from thèse proteins (Biziulevicius et al, 2006;
Gauthier et al., 2006; Biziulevicius & Kazlauskaitè, 2006, 2007; Saint-Sauveur et al.,
2007). The immunomodulating potential of peptides fractions isolated from whey protein
enzymatic hydrolysates was also demonstrated (Mercier et al., 2004; Prioult et al., 2004;
Saint-Sauveur et al., 2007). However, few studies hâve evaluated the effect of peptides
présent in the primary séquence of the major whey proteins on the modulation of the
immune system. To date, only four peptides contained in bovine and humai) caseins, but
also corresponding to spécifie régions of the primary séquence of a-La, were identified as
immunopeptides. The peptide Gly-Leu-Phe, corresponding to séquence a-La f51-53, was
identified to stimulate the phagocytosis of sheep red blood cells (Berthou et al., 1987).
Peptides Tyr-Gly (a-La fl8-19 and a-La f50-51) and Tyr-Gly-Gly (a-La f 18-20) were also
shown to significantly enhance the prolifération of human peripheral blood lymphocytes
(Kayser & Meisel, 1996).
The présent study focussed at investigating the effect of some peptides from (3-Lg and a-La
on prolifération of resting- and Concanavalin A (ConA)-stimulated murine splenocytes.
The peptides were chemically synthesised and selected according to their physicochemical
52
characteristics (amino acid composition, molecular weight, hydrophobicity and charge) and
their theoretical release from native whey proteins by trypsin/chymotrypsin hydrolysis in
order to simulate the gastrointestinal digestion. The peptides showing différent cell
stimulating profiles were also selected to evaluate their effects on the sécrétion of
interleukin (IL)-2, IL-4, IL-10 and interferon-gamma (IFN-y).
53
4. MATERIALS AND METHODS
4.1. Peptides
Peptides were chemically synthesised by the Eastern Québec Peptide Synthesis Facility
(Sainte-Foy, QC, Canada) using a peptide synthesizer Applied Biosystems (Model 433A,
Foster City, CA, USA). Ail the peptides had a degree of purity higher than 80%.
4.2. Ex vivo murine splenocvte prolifération assav
The splenocytes were isolated from 6- to 12-weeks-old female BALB/c mice (Charles
River, St-Constant, QC, Canada) and cultured in the absence and présence of suboptimal
concentration of concanavalin A (ConA, 0.5 u.g.mL~ ) using exactly the same conditions as
those previously described by Saint-Sauveur et al. (2007). For the peptides, they were
solubilized in complète RPMI médium, agitated overnight at 4°C then the solutions were
adjusted to pH 7. Thereafter, the peptide solutions were added at various final
concentrations (10-2000 u,g.mL" , protein basis) to the wells of 96-well round-bottomed
microplates, which were incubated at 37°C at 80% relative humidity in a 5% CO2
atmosphère for 72 h (with ConA) or 96 h (without ConA), as previously described by SaintSauveur et al. (2007) with a mixture of peptides. Cell prolifération was evaluated by the
réduction of the fluorochrome Alamar blue™ (BioSource international, Camarillo, CA,
USA), which was added into the wells for the last 24 h of the incubation periods (Zhi-Jun et
al., 1997). The fluorescence of the supernatants was monitored at an excitation wavelength
of 560 nm and an émission wavelength of 590 nm using a fluorometer (Fluoroscan Ascent,
Thermo Electron Inc., Milford, MA, USA). The assays were performed in triplicate (three
wells per sample) and data are expressed as stimulation indices (SI) and were calculated
using the following équations:
SI (without ConA) =
SI (with ConA) -
Fluorescence..,,. ,..„„,„ - Fluorescencem„rii„m
ce s + sample
medlum
"
Fluorescencecens - Fluorescencemedium
Fluorescence
ceiis + sampie+ConA - F|uorescencemedium + ConA
Fluorescencece||S - Fluorescencemedium
1]
54
4.3. Cytokine analysis
The supernatants from 72 h-splenocyte cultures were collected and their cytokine
content was measured. The optimal incubation times were determined from preliminary
assays with a mixture of peptides (Saint-Sauver et al., 2007). The levels of IL-4, IL-10 and
IFN-y were determined using commercial ELISA kits (BioLegend, San Diego, CA, USA)
according to the manufacturera instructions. IL-2 levels were also measured by ELISA
using a commercial kit (BioSource International, Camarillo, CA, USA) according to the
manufacturer's instructions. The results are the means of four or more assays (three wells
per sample). The détection limits for IL-2, IL-4, IL-10 and IFN-y were <8.0, <1.0, <30.0
and <4.0 pg.mL"1, respectively.
4.4. Statistical analysis
Différences between samples and their respective controls in the spleen cell prolifération
(Table 2.2 and 2.3) and cytokine assays (Table 2.4) were determined by one-way analysis
of variance (ANOVA) and using the Dunnett's t test with the significance set atp < 0.05 or
p<0.01.
55
5. RESULTS
5.1. Effects of peptides on ex vivo splenocytes prolifération
Eleven peptides from (3-Lg and oc-La were selected according to their physicochemical
characteristics (amino acid composition, molecular weight, net charge at pH 7 and
hydrophobicity) and their theoretical release from native proteins by trypsin/chymotrypsin
hydrolysis to simulate the gastrointestinal digestion (Table 2.1). The selected peptides hâve
molecular weight (MW) ranging from 555 to 1730 Da, are neutral, negatively or positively
charged at pH 7.0, hâve isoelectric point varying from 4.4 to 11.0 and différent
hydrophobicity values (0.95 to 2.58).
From the eleven peptides under study, only the séquence P-Lg f78-83 resulted in no effect
on the prolifération of resting- and ConA-stimulated murine splenocytes at ail the
concentrations studied (Fig. 2.1 A and B).
3.0
A
?.!>
2.0
SU.5
T
1.0
.
T,, .
„ ,,T ,,
, ,T,
_L
_L
().!,
().()
3.0
2.5
2.0
B
i
SI 1.5
I.O
0.5
0.0
Cells
Figure 2.1:
100
500
1000
Concentration (\ig mL"1)
2000
Stimulation indices (SI) measured for the peptide (3-Lg f78-83 at différent
concentrations (10-2000 ug.mL"1) on the prolifération of A) resting- and B)
ConA (0.5 ug.mL" ) -stimulated splenocytes. Data are expressed as means ±
SD(/?>4).
Table 2.1:
Physicochemical characteristics of the peptides studied
1-1
PEPTIDE
AMINO ACID SEQUENCE
M W ( D A )
V
'
NET CHARGE AT DH 7
ISOELECTRIC POINT*
,,.
*AVE
.
(KCAL PER RESIDUE)
V
p-Lg f78-83
(K)CIPAVFK
673.85
+1
8.75
2.03
p-Lgfl-8
LIVTQTMK
933.17
+1
8.75
1.34
p-Lg fl 5-20
(K)VAGTWY
695.77
0
5.49
1.46
P-Lg f55-60
(L)EILLQK
742.91
c
6.10
1.54
P-Lgf84-91
(K)IDALNENK
916.00
-1
4.37
0.95
P-Lg f92-105
(K)VLVLDTDYKKYLLF
1730.08
G
5.93
1.77
P-Lg fl 02-105
(K)YLLF
554.69
0
5.52
2.58
P-Lg H 39-148
(K)ALKALPMHIR
1149.46
+2
11.00
1.54
P-Lg fl 42-148
(K)ALPMHIR
837.05
+1
9.80
1.54
a-La fl 0-16
(F)RELKDLK
901.07
+1
8.59
1.22
(Y)WLAHK
653.78
+1
8.76
1.53
a-La fl 04-108
Theoretical mass and isoelectric point were obtained from ExPASy Proteomics Server.
Average hydrophobicity was calculated according to the method of Bigelow (1967).
Amino acid before the peptidic séquence is shown in parenthèses.
1
•-r\
57
Microscopic observations of resting- and ConA-stimulated cells, with and without the
présence of the highest concentration (2000 u.g.mL~') of the peptide p-Lg f78-83, also
showed that this peptide had no effect on the appearance of cultured cells (Fig. 2 A to D).
Consequently, this peptide was included in ail the other prolifération assays at a
concentration of 10 ug.mL'1 and used as control for the statistical analysis.
Figure 2.2:
Pictures of murine splenocytes: A) Cells after 96 h of incubation
without ConA (4X); B) Cells after 96 h of incubation without ConA
in the présence of 2000 lag.mL"1 of peptide p-Lg f78-83 (4X); C)
Cells after 72 h of incubation in the présence of 0.5 ug.mL"1 of
ConA (4X); D) Cells after 72 h of incubation in the présence of 0.5
Ug.mL"1 of ConA and 2000 ug.mL"1 of peptide p-Lg f78-83 (4X).
The effects of the peptides on the prolifération of resting- and ConA-stimulated murine
splenocytes, expressed as stimulation index (SI), are presented in Tables 2.2 and 2.3,
respectively. The majority of the peptides stimulated at various degrees the prolifération of
resting murine splenocytes (Table 2.2), generally with increasing concentrations (10-2000
ug.mL"1) of the peptides in the médium, except for the peptides P-Lg fl-8 and fl 02-105,
and a-La f 104-108 for which a decrease of cells prolifération was observed in the same
conditions (Table 2.2).
Table 2.2:
Stimulation indices (SI), expressed as means (n > 4), measured for peptides from B-Lg and a-La on
the prolifération (96 h) of resting murine splenocytes.
PEPTIDE CONCENTRATION
(fig-mL1)
PEPTIDE
CONTROL
10
100
500
1000
2000
B-Lgfl-8
0.99
0.98
0.73**'a
0.47**
0.50**
0.18**
B-Lg fl 5-20
1.02
1.01
1.12*
1.46**
1.65**
1.42**
B-Lg f55-60
1.04
1.05
1.09
1.16
1.54**
1.54**
B-Lg f84-91
1.00
0.99
1.08
1.20*
1.22*
1.27**
B-Lg f92-105
0.98
1.00
1.07
1.15**
1.31**
1.55**
B-Lg fl 02-105
0.99
1.00
0.94
0.07**
0.10**
0.10**
B-Lgfl39-148
0.98
1.08*
1.17**
1.35**
1.53**
1 77**
B-Lg H42-148
1.00
1.16
1.17
1.37**
1.61**
1 73**
a-La fl 0-16
1.11
1.06
1.19
1.47**
1.81**
j 97**
a-La fl 04-108
1.01
0.99
1.06
1.11*
0.66**
0.07**
Significant différences (* p<0.05; **,/?<0.01) between the samples and the control (peptide B-Lg f78-83 at 10 ug.mL"1).
oc
Table 2.3:
Stimulation indices (SI), expressed as means (n > 4), measured for peptides from p-Lg and a-La on
the prolifération (72 h) of murine splenocytes in the présence of Concavanalin A (ConA, 0.5 ug.mL"1).
PEPTIDE CONCENTRATION
PEPTIDE
CONTROL
10
a
Oig.mL"1)
100
500
1000
2000
2.63**
1.16**
0.75**
0.24**
B-Lgfl-8
1.87
2.20*'
B-Lg fl 5-20
1.68
1.65
1.71
1.67
1.78
1.77
B-Lg f55-60
1.93
1.96
1.92
1.98
1.93
2.34**
B-Lg f84-91
2.10
2.20
2.27
2.24
2.18
2.16
B-Lg f92-105
1.91
1.92
1.92
2.27**
2.37**
2.69**
B-Lg fl 02-105
1.72
1.63
1.35**
0.10**
0.10**
0.11**
B-Lgfl39-148
2.10
2.28
2.24
2.36*
2.62**
2.73**
B-Lg fl 42-148
2.10
2.32
2.30
2.36
2.49**
2.63**
a-La fl 0-16
1.93
1.85
1.95
1.95
2.08
2.26**
a-La fl 04-108
1.72
1.68
1.75
1.69
1.25**
0.16**
a
Significant différences (* /?<0.05; ** p<0.0\) between the samples and the control (peptide B-Lg f78-83 at 10
ug.mL"1 + ConA at 0.5 (ig.mL"1).
60
The same tendencies were also observed for the prolifération of ConA-stimulated murine
splenocytes (Table 2.3) but the results are generally only significant for the highest
concentrations, indicating a lower stimulating effect of the peptides in the présence of
ConA. In fact, four types of behaviour on the prolifération of murine splenocytes were
observed with the peptides that were illustrated in Fig. 2.3 for the most représentative
peptide included in each group. The séquence p-Lg fl 5-20 is the only peptide that
stimulâtes the prolifération of resting cells (Fig. 3) with a bell-shaped response with
increasing concentrations ranging from 100 to 2000 lig.mL" . The significant decrease of SI
value at the highest concentration studied (2000 u.g.mL"') might be explained by a lost of
solubility of the peptide at this concentration considering its absence of charge at pH 7.0
and its relatively high hydrophobicity value of 1.46 (Table 2.1). In ConA-stimulated cells
(Fig. 2.3 B), the stimulating effect of this peptide was lost as well as its bell-shaped
response. The séquence (3-Lg f55-60 is also the only peptide that produced a plateau effect
in terms of stimulation of the prolifération of resting cells at both highest concentrations
studied (1000-2000 fig.mL"1). However, this plateau disappeared in ConA-stimulated cells
(Fig. 2.3 B) although a significant stimulating effect remained at the highest concentration
studied (2000 fig.mL"1). The séquence P-Lg fl39-148 is représentative of a group of other
peptides (p-Lg «4-91, f92-105, H42-148 and a-La flO-16), which stimulated the
prolifération of resting cells in a dose-dependent manner but at various degrees depending
of the peptide. The most stimulating peptides of this group were the séquences P-Lg fl39148, A42-148 and a-La f 10-16 for which the highest SI values were measured from 500 to
2000 n'g.mL (Table 2.2). Among this group, the séquence P-Lg fl 39-148 was the most
potent peptide leading to significant différence in comparison with the control even at the
lowest concentration studied (10 ug.mL"1). In ConA-stimulated cells (Fig. 2.3 B), the
stimulating effect of the peptides p-Lg A39-148 (Fig. 2.3 B) and 192-105 (Table 2.3)
remained highly significant for the highest concentrations studied (500-2000 ug.mL"1),
while this effect decreased for the peptides P-Lg H42-148 and a-La fl()-16 and
disappeared for the peptide p-Lg f84-91 (Table 2.3).
61
3.5
3.0
p-Lg f 15-20
2.5
si
; j .o
**
1.5
1
I.O
0.5
0.0
10
100
500
1000
2000
10
P-Lg f 139-148
3.0
2.0
l.!>
1.0
0.5
0.0
**
3.0
**
**
I
2000
n-LS
1.5
**
().!.
0.0
100
500
1000
Concentration (pg m l ' )
2000
10
3.5
f15 20
3.0
P-Lg f55-60
4c*
:>.'.,
2.0
i
1.5
'
|
SI
:-.()
I.5
1.0
l.o
()..'.
o.s
0.0
0.0
lo
I00
500
1000
2000
"
3.5
3.0
100
500
1000
Concentration (\jg m L ' )
P-L9 f1-8
1.0
■A.:>
SI
2000
2.0
SI
*
10
3.5
1000
;>.:,
2.5
si
500
3.5
3.5
3.0
100
:t:>
P-Lg f 139-148
M
*
2.5
**
3.0
','.!,
|
nul
p-Lg f 1-8**
10
100
X
500
1000
2000
2.0
2.0
SI
SI
1.5
1.5
1.0
1.0
0.5
O..',
0.0
_■
10
lyl'
*,*
0.0
100
500
1000
c o n r entrf tioi i ( M 9 m L 1)
2000
10
100
500
1000
Concentration (pg mL"1)
2000
Figure 2.3: Stimulation indices (SI) measured for the peptides P-Lg fl 5-20, P-Lg f55-60, p-Lg
fl39-148 and P-Lg fl-8 at différent concentrations (10-2000 ug.mL"') showing the
four différent behaviours of the peptides on the prolifération of A) resting murine
splenocytes and B) ConA (0.5 ug.mL"')-stimulated splenocytes. Data were
reproduced from Tables 2.2 and 2.3.
62
The last group of peptides included the séquences (î-Lg fl-8, fl 02-105 and a-La 1T 04-108
for which a decrease in cells prolifération was observed with increasing concentrations both
in resting- (Table 2.2) and ConA-stimulated cells (Table 2.3). The decreased of cell
prolifération in the présence of thèses peptides might be associated with either cytotoxicity
or lack of solubility leading to a toxic effect. The prolifération profile of the peptide f}-Lg
fl-8 was illustrated in Fig. 2.3 while Fig. 2.4 showed microscopic pictures of cells in the
présence of the three peptides.
Figure 2.4:
Pictures of resting murine splenocytes after 96 h of incubation in the
présence of 2000 mj.mL"1 of the peptides A) (3-Lg fl-8 (100X), B) 0-Lg
F102-105 (4X), and C) a-La A04-108 (4X).
For the séquence (î-Lg fl-8 (Fig. 2.4 A), the microscopic observation of resting cells
(stained with tryptan blue then observed on Malassez chamber) at the end of the incubation
period (96 h) revealed the présence of cell débris, indicating that this peptide seems to
affect the integrity of cells at high concentration. In fact, very few cells remain intact
suggesting a possible cytotoxic effect of this peptide on murine splenocytes. In the case of
the peptides (3-Lg fl 02-105 and a-La fl 04-108, a white precipitate was observed in the
bottom of microplate-wells with increasing peptide concentrations (Fig. 2.4 B and C),
suggesting instead a lack of solubility of thèse peptides in the RPMI médium leading to an
indirect toxic effect on splenocytes. Both peptides are mainly (a-La fl 04-108) or
exclusively ((5-Lg f 102-105) composed of hydrophobic amino acids (Table 2.1) that might
explain their poor solubility at high concentration. In fact, SI values measured with
increasing concentrations of thèse peptides, both in resting- and ConA-stimulated cells
(fables 2.2 and 2.3), seemed to reflect their différent solubility since SI values drastically
63
decrease at 500 ^g.mL"1 for the peptide P-Lg fl 02-105 whereas this decrease is less
pronounced for the peptide a-La fl 04-108.
In order to establish some corrélations between the physicochemical parameters of the
peptides (Table 2.1) and their stimulating effect on murine splenocyte prolifération (Tables
2.2 and 2.3), linear and/or polynomial régression analyses were performed using the SI
values obtained at the three optimal concentrations tested (500-2000 ixg.mL"1) for ail the
peptides, except for the control peptide (p-Lg 178-83) and those for which an
inhibiting/toxic effect was observed (a-La fl 04-108, p-Lg fl-8 and fl 02-105). For thèse
corrélations, the peptide concentrations were expressed either on protein basis or molarity
basis to take into account the différent molecular weight of each peptide. The most
significant (>0.5) coefficients of détermination (r2) obtained for ail the conditions studied
were presented in Table 2.4. Hydrophobicity and positive charge of the peptides are related
to their stimulating effect on murine splenocytes. The most significant corrélations were of
polynomial type for both parameters and the r2 values varied from 0.50 to 0.88.
Hydrophobicity seems to better correlate with peptide concentrations expressed on molarity
basis since r values higher than 0.5 were obtained both for resting- and ConA-stimulated
cells at the three optimal peptide concentrations studied. This resuit suggested that
hydrophobicity is also related to the length of the peptides. For this parameter, the
corrélations indicated that a hydrophobicity value of about 1.8 lead the highest stimulating
effect (resuit not shown). Conversely, the number of positive charge better correlated with
peptide concentrations expressed on protein basis, suggesting that the length of the peptides
is lest important for this parameter. Nevertheless, for ail the conditions studied, highest SI
values were obtained with peptides bearing two to three positive charges (resuit not
shown).
The highest rz values (0.80-0.98) were obtained for both the molecular weight and the total
number of amino acids of the peptides, which are interrelated parameters. The corrélations
were of linear type and showed that higher is the length of the peptide and higher is their
stimulating effect (resuit not shown). As expected, thèse corrélations prevailed only by
expressing peptide concentrations on a molarity basis.
Table 2.4:
Coefficients of détermination (r ) calculated from the relationship between the stimulation indices and some
physicochemical parameters of the peptides studied3 at the three optimal concentrations, which were expressed
either as protein or molarity basis.
PEPTIDE CONCENTRATIONS
Olg.mL"1, PROTEIN BASIS)
WITHOUTCONA
500
PARAMETER
a
1000
PEPTIDE CONCENTRATIONS
Oig.mL'1, MOLARITY BASIS1*)
WrraouT CONA
W I T H CONA
500
2000
1000
2000
W I T H CONA
500
1000
2000
500
1000
2000
0.50P
0.75P
0.68P
0.88P
0.51P
0.50P
0.50P
tiqjave
0.60PC
0.83P 0.60P
_d
0.51P
0.50P
Charge +
0.60P
0.51P 0.52P
0.80P 0.59P 0.80P
-
-
MW
-
-
0.92L
0.86L
0.86L
0.97L 0.95L
0.97L
AAe
_
-
0.90L
0.80L
0.81L
0.98L 0.97L
0.96L
. -
Peptides included in the analyses of régression were a-La flO-16, p-Lg fl5-20, B-Lg f55-60, p-Lg f84-91, p-Lg f92-105,
B-Lg fl39-148 and p-Lg fl42-148. Physicochemical parameters used for thèse analyses are those reported in Table 2.1.
For each peptide, the concentrations in ug.mL"1 were calculated in molarity then the ratio Sl/molarity was used for the
analyses of régression.
c
Type of analysis of régression: P, polynomial; L, linear.
Represented r value lower than 0.5.
e
Total number of amino acids.
65
Overall, thèse results thus suggested that a long hydrophobic peptide bearing 2-3 positive
charges has a higher potential to stimulate the prolifération of murine splenocytes and the
immune system. However, thèse corrélations give no information on the impact of the
position of hydrophobicity and/or positive charge on the peptides that is probably also an
important parameter to consider for their effect on the cells.
5.2. Effects of peptides on ex vivo cytokine sécrétion
The three peptides séquences that previously showed différent prolifération profiles (fi-Lg
fl 5-20, f55-60, and fl 39-148) were selected to evaluate their effects on the ex vivo release
of two Thl (IL-2 and IFN-y) and two Th2 (IL-4 and IL-10) related cytokine profiles
(Mosmann & Sad, 1996). Cytokine analyses were performed at concentration leading to
optimal spleen cells prolifération of peptides (3-Lg fl5-20 (1000 u.g.mL~'), P-Lg f55-60
(2000 ug.mL"1) and p-Lg fl 39-148 (2000 ug.mL"1) as reported in Tables 2.2 and 2.3. The
séquence P-Lg 178-83, resulting in no effect on the cytokine sécrétion of resting- and
ConA-stimulated murine splenocytes (results not shown), was used as control at
concentration of 10 ug.mL"1 for statistical analyses.
The effects of the three selected peptides on cytokine sécrétion from splenocytes cultured in
the absence and présence of 0.5 fag.mL"1 of ConA are shown in Table 2.5. The séquence pLg fl5-20 slightly stimulated the sécrétion of IL-4 (Th2) and to a higher degree the
sécrétion of IFN-y (Thl) by resting spleen cells. However, the significant stimulating effect
of this peptide on IL-4 sécrétion hâve to be interpret with caution since the value is very
low and near of the détection limit for this cytokine (<1.0 pg.mL"1). In ConA-stimulated
cells, this peptide had no significant effect on cytokine sécrétion although the amount of
IFN-y secreted in the supernatant of cells culture is relatively higher than the amount
measured for the control. The stimulation of IFN-y by this peptide may be related to the
présence of T lymphocytes (-90%) in the isolated spleen cells, as demonstrated by SaintSauveur et al. (2007), who also showed that peptide fractions with acidic and neutral
isoelectric point stimulated the sécrétion of this cytokine.
Table 2.5:
CYTOKINES
Cytokine :sécrétion measured in the supematants of cultured murine splenocytes by ELISA (means, n >4).
MURINE SPLENOCYTES CULTURED WITHOUT CONA
MURINE SPLENOCYTES CULTURED WITH CONA
1
(pg.mL )
CONTROL
B-Lg A5-20
B-Lg f55-60
B-Lg A39-148
CONTROL
B-Lg A5-20
B-Lg f55-60
B-Lg A39-1
IL-4
<1.0
2 ] **a
<1.0
<1.0
4.4
4.7
2.2**
3 Q**
IL-10
<30.0
<30.0
<30.0
<30.0
<30.0
<30.0
<30.0
<30.0
IL-2
10.0
13.5
<8.0
9.3
15.6
14.1
9 ç**
15.8
IFN-Y
:.;
63.9**
<4.0*
81.3**
252.9
329.7
242.3
717.5**
Cells were incubated for 72 h or 96 h without or with Concanavalin A (ConA, 0.5 ug.mL"1) respectivelv, and in the présence of the
peptides p-Lg A5-20 (1000 ag-mL"1), P-Lg f55-60 (2000 ug.mL"]) or P-Lg fl39-148 (2000 ug.mL"1).
a
Significant différences (* p<0.05; ** p>0.0\) between the samples and the control (peptide p-Lg f78-83 at 10 (jg.mL"1 with or
without ConA at 0.5 ug.mL"1).
(.7
The séquence P-Lg f55-60 slightly inhibited the release of IFN-y by resting spleen cells
while it slightly inhibited the sécrétion of IL-4 and IL-2 in ConA-stimulated cells.
However, ail of thèse values are under or near the détection limit of the cytokines and could
be interpreting with caution. Finally, the peptide P-Lg ÏÏ39-148 strongly enhanced the
release of IFN-y in both resting- and ConA-stimulated splenocytes, whereas a slight
inhibition of IL-4 sécrétion was observed in ConA-stimulated cells. Again, the inhibitory
effect of this peptide on IL-4 sécrétion could be interpreted with caution since the value is
near the détection limit of this cytokine. Nevertheless, the effect on IFN-y sécrétion of the
peptide P-Lg fl 39-148 may indicate a preferential effect on T-cells.
68
6. DISCUSSION
The présent study highiights potential immunomodulatory effects of some new bioactive
peptides encrypted in the primary séquence of the major two whey proteins, a-La and [iLg. Thèse peptides were demonstrated to stimulate the murine splenocyte prolifération and
cytokine sécrétion at différent degrees on both resting- and ConA-stimulated murine
splenocytes. The phenotype of murine splenocytes in the absence and présence of
suboptimal concentration of ConA (0.5 ug.mL"1) was characterized by Saint-Sauveur et al.
(2007) using flow cytometry. Splenocyte population was demonstrated to be mainly
composed by lymphocytes (-90%), in both resting- and ConA-stimulated spleen cells, with
roughly 45% B cells and 44% T cells including T-helper and T-cytotoxic cells. As expected
for a T-cell mitogen, they also demonstrated a very slight but non significant increase in Tcell population in the présence of ConA, mainly for CD4+/CD25+ and CD8+/CD25+, probably
because the use of very low mitogen concentration. The évaluation of the immune response
modulation in our study thus especially targeted the cellular and humoral spécifie immune
responses, which were mainly supported by T- and B-lymphocytes, respectively.
From the eleven peptides under study only the peptide p-Lg f78-83 showed no effect at any
concentration, both on splenocyte prolifération and cytokine sécrétion. Seven peptides (pLg f 15-20, f55-60, f84-91, f92-105, fl39-148, H42-148, a-La flO-16) were found to
stimulate cells prolifération at various degrees depending on the peptide concentration and
the présence or absence of ConA. Our results obtained using pure peptides are in
accordance with previous data published using peptide mixtures. Saint-Sauveur et al.
(2007) studied peptide fractions isolated from a whey protein digest prepared and
investigated under similar conditions than those used in the présent study. They showed
that the stimulating effect on murine splenocytes generally increased with the concentration
of tested molécules and this effect was less pronounced in the présence of ConA.
The new biological activity of the peptides studied as cell prolifération promoters supports
the view that many bioactive peptides are multifunctional (Meisel, 2004). In fact, from the
various peptides investigated in our study (Table 2.1), many of those hâve been already
w
reported to hâve other biological activities. For example, the peptide p-Lg fl 5-20 was
demonstrated to hâve antihypertensive (Pihlanto-Leppalà et al., 1998) and antimicrobial
effects (Pellegrini et al., 2001), peptide p-Lg fl02-105 (pMactorphin) is recognised to hâve
antihypertensive (MuUally et al., 1996) and opioid (Yoshikawa et al., 1986) activities, and
the séquences P-Lg fl 42-148 (lactokinin) and a-La H04-108 are well-known to exert
antihypertensive activity (MuUally et al., 1997b; Pihlanto-Leppàlâ, 2000). The mechanism
by which the peptides identified to stimulate cells prolifération is unknown but could be
associated to host defence peptides (HDP) recently described by several authors (Andrès &
Dimarcq, 2004; Allaker, 2007; Radek & Gallo, 2007). Thèse peptides hâve a broad
spectrum activity on the innate immunity against bacterial, fungal and viral pathogens that
quickly eradicated pathogens through spécifie biochemical mechanisms (Andrès &
Dimarcq, 2004, Radek & Gallo, 2007). HDP are considered to hâve both direct
antimicrobial activities (membrane and metabolic perturbations) and ability to direct a
prolonged cellular and humoral responses such as B-cell activation, antibody production, Tcytotoxic and natural-killer cells killing, and T-helper cell function (Andrès & Dimarcq,
2004; Allaker, 2007; Radek & Gallo, 2007). This strong link between antimicrobial and
immunomodulaiting activities was also suggested by Biziulevicius et al. (2006) and
Biziulevicius & Kazlauskaitè (2006, 2007). In fact, thèse authors hâve demonstrated that 20
food proteins digested with gastrointestinal proteinases (trypsin, a-chymotrypsin, pepsin
and pancreatin), including a-La and P-Lg, enhanced the phagocytosing capacity of
peritoneal macrophages and exerted ex vivo antimicrobial activity towards 24 microbial
strains. However, antimicrobial activity does not seem to be always related to their
immunomodulating effect since the séquence P-Lg f78-83 was identified to hâve
bactericidal activity by Pellegrini et al. (2001) while no effect on spleen cells prolifération
and cytokine sécrétion was observed for this peptide in our study.
Three peptides were showed herein to induce a decrease in cells prolifération, the peptide
P-Lg fl-8 probably from a cytotoxic effect on cell integrity and both peptides P-Lg f 102105 and a-La fl04-108 probably from their lack of solubility at the highest concentrations
studied. Although the mechanism of action of the peptide P-Lg fl-8 can not be elucidated
in the présent study, the récent work of Penn el al. (2007) could suggest a cytotoxic effect
70
for this peptide. Thèse authors showed that a rat food digested by rat intestinal luminal fluid
is more cytotoxic for human neutrophils than intestinal fluid alone or undigested food. The
treatment of intestinal fluid with broad-spectrum protease inhibitors confirmed the rôle of
proteases in the release of toxic factors. Moreover, filtering the luminal fluid through
hydrophobic filters resulted in a drop of toxic factors. Overall, thèse results suggested that
hydrophobic peptide(s) released from intestinal proteases might be the toxic factors.
Interestingly, both peptides (3-Lg fl-8 and fl 02-105 are the most hydrophobic peptides
(fable 2.1) investigated in our study and are theoretically released by digestive enzymes
(trypsin and/or chymotrypsin). Peptide cytotoxicity of the three séquences (|3-Lg fl-8, f 102105 and a-La f104-108) should also be confirmed in future works, using stronger analytical
methods and approaches (e.g. flow cytometry, propidium iodide coloration).
The effect of the three selected peptides (p-Lg fl5-20, f55-66 and fl 39-148) on cytokine
sécrétion profiles (Thl and Th2) revealed that some peptides released by digestive enzymes
from P-Lg can modulate mainly the cellular immunity responses, as it was demonstrated by
Saint-Sauveur et al. (2007) for mixture of peptides isolated from a whey protein digest.
However, incubation times of peptides used for resting- and ConA-stimulated cells were
the same than that proposed by Saint-Sauveur et al. (2007) for a mixture of peptides. Thèse
times could be not optimal for cytokine analysis of individual peptides. The results also
showed the difficulty to interpret adequately the effects of peptides on cytokine sécrétion in
a mixture of cells such as splenocytes. To better elucidate the mechanism of action of foodderived peptides it might be important to work on purified cell phenotype. This can
probably enhance the understanding of the action of food-derived peptides on the immune
System.
71
7. CONCLUSION
Thèse results confirmed that several peptides encrypted in the primary séquence of a-La
and (î-Lg and theoretically released by digestive enzymes may influence the ex vivo
spécifie immune response through the modulation of the splenocyte prolifération and
cytokine sécrétion. They also supported the concept of multifunctional properties of foodderived peptides. It was also demonstrated that immunostimulating effect of peptides seems
to be related to some physicochemical characteristics such as positive charge,
hydrophobicity and the length of the peptides. Finally, this work highlighted the relevance
of evaluating the effect of food-derived peptides on immune System by using purified cell
phenotype or in vivo study in order to better understand their mechanism of action.
11
CONCLUSION GÉNÉRALE
Cette étude avait pour but d'étudier l'activité immunomodulante de peptides issus des
principales protéines du lactosérum bovin, la P-lactoglobuline et l'a-lactalbumine, en
mesurant leur impact sur la modulation de la réponse immunitaire spécifique à partir de
splénocytes murins. Onze peptides ont été sélectionnés sur la base de leurs propriétés
physico-chimiques, mais aussi en raison de leur hydrolyse théorique par les principales
enzymes pancréatiques (trypsine/chymotryspine) et ce, de manière à simuler leur libération
in vivo au cours de la digestion gastro-intestinale. L'hypothèse à la base de ce travail
proposait que certains peptides contenus dans la séquence primaire des protéines majeures
du lactosérum bovin (P-Lg et a-La) pouvaient stimuler la prolifération de splénocytes
murins et moduler la sécrétion de certaines cytokines.
Les résultats de cette étude ont permis de démontrer que les séquences primaires des
protéines majeures du lactosérum bovin contenaient des peptides susceptibles de moduler la
réponse immunitaire spécifique et ce, en stimulant ou inhibant la prolifération ex vivo de
splénocytes murins et la sécrétion de certaines cytokines (IL-4, IL-10, IL-2 et IFN-y) par
ces cellules. Parmi les peptides étudiés, sept (p-Lg H5-20, f55-60, «4-91, «2-105, fl39148, fl42-148 et a-La flO-16) ont exercé un effet stimulant sur la prolifération des
splénocytes (/><0,05 ou 0,01), mais à des degrés divers selon les différentes concentrations
étudiées (10-2000 u.g.mL"'). Le peptide P-Lg f78-83 n'a présenté aucun effet à toutes les
concentrations étudiées, autant sur la prolifération lymphocytaire que sur la sécrétion des
cytokines; ce peptide a donc été utilisé comme peptide contrôle pour les analyses
statistiques. Enfin, trois peptides (P-Lg fl-8, fl02-105 et a-La fl04-108) ont montré un
effet inhibiteur marqué sur la croissance des cellules. L'effet inhibiteur du peptide P-Lg fl8 a été associé à un effet cytotoxique qui semble affecter l'intégrité des cellules, alors que
l'inhibition causée par les peptides P-Lg fl02-l05 et a-La fl04-108 s'expliquerait plutôt
par leur forte hydrophobicité qui réduit leur solubilité dans les milieux de culture à fortes
concentrations. L'analyse des corrélations entre les indices de stimulation des peptides et
leurs caractéristiques physico-chimiques a révélé que leur potentiel immunostimulant serait
73
majoritairement associé à la charge positive des peptides, leur hydrophobicité et la taille des
séquences peptidiques. Ces résultats ont permis de soulever l'hypothèse que des liens
pourraient exister entre les peptides immunostimulants et certains types de peptides, comme
les Cell penetrating peptides (CPP) ou les Hosl defence peptides (HDP), qui présentent des
similitudes au niveau des caractéristiques physico-chimiques importantes à leurs activités.
De plus, nos travaux ont permis de confirmer l'hypothèse déjà émise dans la littérature que
certains peptides bioactifs possèdent des propriétés multifonctionnelles comme dans le cas
des séquences peptidiques p-Lg fl5-20 (antihypertensif,
antimicrobien), fi 02-105
(antihypertensif, opioïde), fl42-148 (antihypertensif), et a-La fl04-108 (antihypertensif).
Les effets sur la sécrétion des cytokines par les peptides (3-Lg fl 5-20 (1000 ug.mL"1), f5560 (2000 ug.mL"1) et fl 39-148 (2000 ug.mL"1), en absence ou en présence de ConA (0,5
ug.mL"1), ont démontré des profils d'inhibition et/ou stimulation plus ou moins marqués
(/?<0,05 ou 0,01) et variés. Le peptide p-Lg fl 5-20 a montré une très légère stimulation de
la sécrétion d'IL-4 (voie Th2), mais une stimulation plus marquée de la sécrétion d'IFN-y
(Thl) et ce, en absence de ConA. Cependant, la stimulation de la sécrétion d'IL-4 doit être
considéré avec prudence étant donné que les valeurs obtenues étaient toujours proches de la
limite inférieure de détection (<1.0 pg.mL" ) du dosage de cette cytokine. Lorsque le
peptide (3-Lg fl 5-20 a été évalué en présence de ConA, aucun effet significatif n'a été
observé sur la sécrétion des cytokines, même si les valeurs obtenues dans le cadre du
dosage de IFN-y étaient légèrement supérieures à celle obtenues pour le contrôle (P-Lg 17883 à 10 ug.mL"1). La séquence P-Lg f55-60 a, quand à elle, montré une légère inhibition de
la sécrétion d'IFN-y par les splénocytes murins en absence de ConA, alors qu'une faible
inhibition de la sécrétion d'IL-4 et d'IL-2 a plutôt été observée en présence de ConA.
Néanmoins, ces résultats doivent aussi être interprétés avec précaution car les valeurs
obtenues étaient très proches de la limite inférieure de détection de ces trois cytokines.
Enfin, les résultats obtenus à partir de la séquence p-Lg fl 39-148 ont démontré une forte
stimulation de la sécrétion d'IFN-y en absence et en présence de ConA, alors qu'une légère
inhibition de la sécrétion d'IL-4 a été observée pour les splénocytes cultivés en présence de
ConA. Toutefois, l'inhibition de la sécrétion d'IL-4 en présence de ConA était également
basée sur des valeurs proches de la valeur de détection limite de cette cytokine. Néanmoins,
74
les valeurs obtenues pour le peptide (i-Lg A39-148 sur la sécrétion d'IFN-y permettent de
suggérer que ce peptide agirait préférentiellement sur les LT. L'ensemble des résultats sur
le dosage de ces 4 cytokines suggère donc que certains peptides potentiellement libérés par
les enzymes digestives lors de la digestion gastro-intestinale seraient susceptibles de
moduler l'immunité à médiation cellulaire tel que précédemment observé dans les travaux
de Saint-Sauveur et al. (2007) à partir de mélange de peptides isolés d'un hydrolysat de
protéines de lactosérum. Cependant des études in vivo seraient indispensables pour vérifier
que ces effets sont maintenus dans un système physiologique animal. D'autre part, ces
résultats montrent qu'il est difficile d'interpréter les effets de peptides sur la sécrétion
cytokinique à partir de cultures cellulaires constituées de mélange de cellules de phénotypes
variés, comme cela est le cas avec le modèle d'étude des splénocytes.
Cette étude a donc permis de confirmer notre hypothèse selon laquelle certains peptides
contenus dans la séquence primaire des protéines majeures du lactosérum bovin ((î-Lg et ocLa) sont en mesure d'influencer la prolifération de splénocytes murins et la sécrétion de
certaines cytokines. Bien que l'étude des analyses de corrélation suggère que certaines
caractéristiques physico-chimiques semblent liées à l'activité immunostimulante des
peptides étudiés, de nouveaux travaux seront nécessaires pour confirmer cet aspect. En
outre, il serait intéressant de mener des études sur les mécanismes d'action de ces peptides,
notamment en étudiant leurs effets sur des phénotypes cellulaires purifiées de manière à
pouvoir préciser les types cellulaires impliqués dans la modulation de la réponse
immunitaire. Des études visant à identifier les récepteurs membranaires impliqués dans la
réponse immune de ces peptides seraient également une voie d'étude intéressante en vue de
préciser leurs mécanismes d'action. Finalement, une étude in vivo à partir d'un modèle
animal permettrait de vérifier si les propriétés immunomodulantes de ces peptides sont
conservées lors de leur transit gastro-intestinal et ainsi, de valider leur potentiel pour des
applications dans le domaine des produits de santé naturels.
7S
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Abbas, A.K. & Lichtman, A.H (2005). Cellular and molecular immunology, fifth édition.
Editor Elsevier Saunders, Philadelphia, 562 pages.
Abubakar, A., Saito, T., Kitazawa, H., Kawai, Y. & Itoh, T. (1998). Structural analysis
of new antihypertensive peptides from cheese whey protein by proteinase K
digestion. Journal ofDairy Science, 81, 3131-3138.
Agriculture et Agroalimentaire Canada (2004). Demande de produits alimentaires
propices à la santé et au bien-être. Page URL: http://www4.agr.gc.ca/AAFCAAC/display-afficher.do?id=1173276530547&lang=fi,
date de consultation:
06/06/2007.
Ahmed, S.A., Gogal, R.M. & Walsh, J.E. (1994). A new rapid and non-radioactive assay
to monitor and détermine the prolifération of lymphocytes: an alternative to
[3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods, 170, 211224.
Allaker, R.P. (2007). Host defence peptides-a bridge between the innate and adaptative
immune responses. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and
Hygiène (in press).
Allez, M. & Mayer, L. (2004). Regulatory T cells: peace keepers in the gut. Injlammatory
Bowel Discases, 10, 666-676.
Amrouche, T. (2005). Contribution à l'étude du pouvoir immunomodulateur des
bifidobactéries: analyse in vitro et étude ex vivo des mécanismes moléculaires
impliqués. Thèse de doctorat, Université Laval, Québec, 175 pages.
Andrès, E. & Dimarcq, J.L. (2004). Peptides antimicrobiens cationiques: de l'étude de
l'immunité innée à la production de médicaments. La Revue de Médecine Interne,
25, 629-635.
Bcaulieu, J., Dupont, C. & Lemieux, P. (2006). Whey proteins and peptides: bénéficiai
effects on immune health. Therapy, 3, 69-78.
Berthou, J., Migliore-Samour, D., Lifchitz, A., Delettré, J., Floc'h, F. & Jolies, P.
(1987). Immunostimulating properties and three-dimensional structure of two
tripeptide from human and cow caseins. Fédération of European Biochemical
Societies Le tiers, 218, 55.
70
Bigelow, C. C. (1967). On the average hydrophobicity of proteins and the relation between
it and protein structure. Journal ofTheoretical Biology, 16, 187-211.
Biziulevicius, G.A. & Kaziauskaitè, J. (2006). Following Hippocrates' advice 'Let food
be thy medicine and medicine be thy food': an alternative method for évaluation of
the immunostimulatory potential of food proteins. Médical Hypothèses, 68, 712713.
Biziulevicius, G.A. & Kaziauskaitè, J. (2007). Pushing 'bad bugs' into committing
suicide: activation of microbial autolysis within the gut using food-grade substances
as a prospective method for the treatment of intestinal infections and/or immunity
enhancement. Médical Hypothèses, 69, 1161-1162.
Biziulevicius, G.A., Kislukhina, O.V., Kaziauskaitè, J. & Zukaitè, V. (2006). Foodprotein enzymatic hydrolysates possess both antimicrobial and immunostimulatory
activities: a 'cause and effect' theory of bifunctionality. FEMS Immunology and
Médical Microhiology, 46, 131-138.
Bounous, G., Batist, G. & Gold, P. (1989). Immunoenhancing property of dietary whey
protein in mice: rôle of glutathione. Clinical and Invesdgative Médecine, 12, 154161.
Bounous, G. & Gold, P. (1991). The biological activity of undenatured whey proteins: rôle
of glutathione. Clinical and Investigative Medicine, 14, 296-309.
Bounous, G. (2000). Whey protein concentrate (WPC) and glutathione modulation in
cancer treatment. Anticancer Research, 20, 4785-4792.
Brix, S., Bovetto, L., Fritschc, R., Barkholt, V. & Frokiaer, H. (2003).
Immunostimulatory potential of (3-lactoglobulin préparations: effects caused by
endotoxin contamination. The Journal of Allergy and Clinical Immunology, 112,
1216-1222.
Brody, E.P. (2000). Biological activities of bovine glycomacropeptide. British Journal of
Nutrition, 84, S39-S46.
Camacho, F., Gonzâles-Tello, P. & Guadix, E.M. (1998). Influence of enzymes, pH and
température on the kinetics of whey protein hydrolysis. Food Science and
Technology International, 4, 79-84.
Cayot, P. & Lorient, D. (1998). Structures et technofonctions des protéines du lait. Edition
Lavoisier technique et documentation, Paris, 363 pages.
77
Cell
Signaling Technology (2007). PathScan™ Sandwich ELISA. Page
http://www.cellsignal.com/ddt/elisa.html, date de consultation: 02/09/2007.
URL:
Chamberlain, P. (2002). Immunogenicity of therapeutic proteins. Part 1: causes and
clinical manifestations of immunogenicity. The Regulatory Review, 5, 4-9.
Chan, J.C.K. & Li-Chan, E.C.Y. (2007). Production of lactoferricin and other cationic
peptides from food grade bovine lactoferrin with various iron saturation levels.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, 493-501.
Chatterton, D.E.W., Smithers, G., Roupas, P. & Brodkorb, A. (2006). Bioactivity of plactoglobulin and a-lactalbumin-technological implication for processing.
International Dairy Journal, 16, 1229-1240.
Chi-Kyeong, K., Hirose, Y., Sakudo, A., Takeyama, N., Kang, C.B., Taniuchi, Y.,
Matsumoto, Y., Itohara, S., Sakaguchi, S. & Onodera, T. (2007). Reduced
response of splenocytes after mitogen-stimulation in the prion protein (PrP) genedeficient mouse: PrPLP/Doppel production and cérébral degeneration. Biochemical
and Biophysical Research Communications, 35H, 469-474.
Clémente, A. (2000). Enzymatic protein hydrolysates in human nutrition. Trends in Food
Science and Technology, 11, 254-262.
Cross, M.L. & Gill, H.S. (1999). Modulation of immune function by a modified bovine
whey protein concentrate. Immunology and Cell Biology, 77, 345-350.
Debry, G. (2001). Lait, nutrition et santé. Edition Lavoisier technique et documentation,
Paris, 566 pages.
De Wit, J.N. (1989). Functionnal properties of whey proteins. In: Development in dairy
chemistry-4. Functional milk proteins. Editor Fox P.F., Londres: Elsevier Applied
Science, pages 285-321.
De Wit, J.N. (1998). Nutritional and functional characteristics of whey proteins in food
products. Journal of Dairy Science, 81, 597-608.
Etzel, M.R. (2004). The emerging rôle of dairy proteins and bioactive peptides in nutrition
and health. Manufacture and use of dairy protein fractions. Journal of Nutrition,
134, 996S-1002S.
Exner, R., Wessner, B., Manhart, N. & Roth, E. (2000). Therapeutic potential of
glutathione. Wien Klin Wochenschr, 112, 610-616.
78
Fiat, A.M., Miglore-Samour, D., Jolies, P., Drouet, L., Bal dit Sollier, C. & Caen, J.
(1993). Biologically active peptides from milk proteins with emphasis on two
examples concerning antithrombic and immunomodulationg activities. Journal of
Dairy Science, 76, 301-310.
Foegeding, E.A., Davis, J.P., Doucet, D. & McGuffcy, K. (2002). Advances in modifying
and understanding whey protein functionnaly. Trends in Food Science and
Technology, 13, 151-159.
Fox, P.F. (1989). The milk protein system. In: Developments in dairy chernistry-4.
Functional milk proteins. Editor Fox P.F., New York: Elsevier Applied Science,
pages 1-54.
Fukumoto, L.R., Li-Chan, E., Kwan, L. & Nakai, S. (1994). Isolation of
immunoglobulins from cheese whey using ultrafiltration and immobilized métal
affinity chromatography. Food Research International, 27, 335-348.
Gattegno, L., Migliore-Samour, D., Saffar, L. & Jolies, P. (1988). Enhancement of
phagocytic activity of human monocytic-macrophagic cells by immunostimulating
peptides from human casein. Immunology Letters, 18, 27.
Gauthier, S.F. & Pouliot, Y. (2003). Functional and biological properties of peptides
obtained by enzymatic hydrolysis of whey proteins. Journal of Dairy Science, 86,
78-87.
Gauthier, S.F., Pouliot, Y. & Saint-Sauveur, D. (2006). Immunomodulatory peptides
obtained by the enzymatic hydrolysis of whey proteins. International Dairy
Journal, 16, 1315-1323.
Gerdes, J., Lemke, H., Baisch, H., Wacker, H.H., Schwab, U. & Stein, H. (1984). Cell
cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by
the monoclonal antibody YÀ-61. Journal of Immunology, 133, 1710-1715.
Gerdes, J., Schwab, U., Lemke, H. & Stein, H. (1983). Production of a mouse
monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell
prolifération. International Journal of Cancer, 31, 13-20.
Ghiringhelli, F. & Schmitt, E. (2004). Tri par billes magnétiques, techniques et exemple
du tri des lymphocytes T régulateurs CD25+ chez le rat: microbilles et cytométrie: de
l'analyse cellulaire à l'analyse moléculaire. Annales de Biologie Clinique, 62, 7378.
79
Cifford, J.L., Hunter, H.N. & Vogel, H.J. (2005). Lactoferricin: a lactoferrin-derived
peptide with antimicrobial, antiviral, antitumor and immunological properties.
Cellular and Molecular Life Science, 62, 2588-2598.
GUI, H.S., Darragh, A.J. & Cross, M.L. (2001). Optimizing immunity and gut function in
the elderly. The Journal of Nutrition, Health & Aging, 5, 80-91.
GUI, H.S., Doull, F., Rutherfurd-Markwick, K.J. & Cross, M.L. (2000).
Immunoregulatory peptides in bovine milk. British Journal of Nutrition, 84, 111 —
1117.
Gougcon, M.L. (1996). Cytokines et lymphocytes B: l'action conjointe des cytokines. In:
Les cytokines, 2ème édition. Edition Masson, Cavaillon J.M., Paris, 589 pages.
Gratzner, H.G. (1982). Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: a new
reagent for détection of DNA replication. Science, 21 H, 474-475.
Guimont, C , Marchai!, E., Girardet, J.M. & Linden, G. (1997). Biologically active
factors in bovine milk and dairy byproducts, influence on cell culture. Critical
Reviews in Food Science and Nutrition, 374, 393-410.
Gupta, B., Levchenko, T.S. & Torchilin, V.P. (2005). Intracellular delivery of large
molécule and small particles by cell-penetrating proteins and peptides. Advanced
Drug Delivery Reviews, 57, 637-651.
Hambling, S.G., McAlpine, A. S. & Sawyer, L. (1992). P-lactoglobulin. In: Advanced
dairy chemistry-1: proteins. Editor Fox P.F., New-York: Elsevier Applied Science,
pages 141-189.
Hambraeus, L. & Lônnerdal, B. (2003). Nutritional aspects of milk proteins. In:
Advanced dairy chemistry-1: proteins. Editor Fox P.F., London: Elsevier Applied
Science, pages 457-490.
Harber, M., Sundstedt, A. & Wraith, D. (2000). A simplified mode! of the possible
interactions between polarised T helper 1 (Thl) and Th2 responses. Expert Reviews
in Molecular Medicine. Page URL:
http://iournals.cambridue.om/fulltext content/ERM/ERM2 09/S146239940000214
3supQ08.html. date de consultation: 11/05/2007.
Hernândez-Ledesma, B., Dâvalos, A., Bartalomé, B. & Amigo, L. (2005). Préparation of
antioxidant enzymatic hydrolysates firom a-lactalbumin and P-lactoglobulin.
Identification of active peptides by HPLC-MS/MS. Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 53, 588-593.
80
Huffman, L.M. & Harper, W.J. (1999). Symposium: marketing dairy value through
technology: maximizing the value of milk through séparation technologies. Journal
of Dairy Science, 82, 2238-2244.
Jacobs, D.M. & Morrisson, D.C. (1977). Inhibition of the mitogenic response to
lipopolysaccharide (LPS) in mouse spleen cells by polymyxin B. Journal of
Immunology, 118, 21-27.
Jameson, G.B., Adams, J.J. & Creamer, L.K. (2002). Flexibility, functionality and
hydrophobicity of bovine (î-lactoglobulin. International Dairy Journal, 12, 319329.
Janeway, C.A. & Travers, P. (1997). Immunobiologie, 2nd édition. Edition De Boeck
Université, Bruxelles, 581 pages.
Janossy, G. & Greaves, M.F. (1971). Lymphocyte activation I. Response of T and B
lymphocytes to phytomitogens. Clinical and Expérimental Immunology, 9, 483-498.
Jarvis, D., McDonald, K., Marcotte, M., Smith, B. & Stanford, L. (2001). Business and
market impact of the food and drugs act and régulations on functional foods in
Canada. Commissioned by Agriculture and Agri-Food Canada to Intersect Alliance
Inc. Ottawa, Ontario. Page URL: www.aar.t>c.ca/food/nff/bitstudy/resultse.html,
date de consultation: 10/07/2007.
Jouan, P. (2002). Lactoprotéines et lactopeptides: propriétés biologiques. Edition INRA,
Paris, 127 pages.
Kaminogawa, S. (1996). Food allergy, oral tolérance and immunomodulation-their
molecular and cellular mechanisms. Bioseience Biotechnology and Biochemistry,
60, 1749-1756.
Kayser, H. & Meisel, H. (1996). Stimulation of human peripheral blood lymphocytes by
bioactive peptides derivedfirombovine milk proteins. FEBS Letters, 383, 18-20.
Kinsella, J.E. (1988). Protein modification: effects on functional properties and
digestibility. In: Milk proteins: nutritional, clinical, functional and technological
aspects. Editors Barth C. A. & Schilmme E., New York: Steinkopff Verlag,
Springer-Verlag, pages 179-191.
Kitts, D.D. & Weiler, K. (2003). Bioactive proteins and peptides from food sources.
Applications of bioprocesses used in isolation and recovery. Current
Pharmaeeutical Design, 9, 1309-1323.
Kl
Korhonen, H. & Pihlanto-Leppâlâ, A. (2006). Bioactive peptides: production and
functionality. International Dairy Journal, 16, 945-960.
Korhonen, H. & Pihlanto-Leppâlâ, A. (2007). Technological options for the production
of health-promoting proteins and peptides derived from milk and colostrum.
Current Pharmaceutical Design, 13, 829-843.
Kull, F.C. & Cuatrecasas, P. (1983). Estimation of cell number by neutral red content.
Applications for proliferative and survival assays. Applied Biochemistry and
Biotechnology, 8, 97-103.
Letterio, J.J. & Roberts, A.B. (1998). Régulation of immune responses by TGF-p\ Annual
Reviews of Immunology, 16, 137-161.
Lônnerdal, B. (2004). Human milk proteins: key components for the biological activity of
human milk. Advances in Expérimental Medicine and Biology, 554, 11-25.
Lothian, J.B., Grey, V. & Lands, L.C. (2006). Effect of whey protein to modulate
immune response in children with atopic asthma. International Journal of Food
Sciences and Nutrition, 57, 204-211.
Madureira, A.R., Pereira, CL, Cornes, A.M.P., Pintado, M.E. & Malcata, F.X. (2007).
Bovine whey proteins-overview on the main biological properties. Food Research
International (in press).
Maes, W., Van Camp, J., Vermeissen, V., Hemeryck, M., Ketelslegers, J.M.,
Schrezenmeir, J., Van Oosteveldt, P. & Huyghebaert, A. (2004). Influence of the
lactokinin Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg (ALPMHIR) on the release of endothelin-1
by endothelial cells. Regulatory Peptides, 118, 105-109.
Mahmoud, M.I. (1994). Physicochemical and functional properties of protein hydrolysates
in nutritional products. Food Technology, 48, 89-95.
Mahmud, R., Matn, M.A. & Otani, H. (2004). Mitogenic effect of bovine P-lactoglobulin
and its proteolytic digests on mouse spleen resting cells. Pakistan Journal of
Biological Sciences, 7, 2045-2050.
Manakil, J.F., Seymour, G.J. & Bartold, P.M. (2007). Effect of cytokine and antigen
stimulation on peripheral blood lymphocyte syndecan-1 expression. Oral
Microbiology and Immunology, 22, 212-216.
Marshall, K. (2004). Therapeutic applications of whey protein. Alternative Médecine
Review, 9, 136-156.
82
Masson, P.L., Heremans, J.F. & Dive, C. (1966). An iron-binding protein common to
many external sécrétions. Clinica Chimica Acta, 14, 735-739.
McKenzie, H.A., Ralston, G.B. & Shaw, D.C. (1972). Location of sulfhydryl and
disulfïde groups in bovine (5-lactoglobulin and effects of urea. Biochemislry, 11,
4539-4547.
Meisel, H. (1997). Biochemical properties of bioactive peptides derived from milk
proteins: potential nutraceuticals for food and pharmaccuticals applications.
Livestocks Production Science, 50, 125-138.
Meisel, H. (2004). Multifunctional peptides encrypted in milk proteins. Biofactors, 21, 5561.
Mercier, A. (2003). Étude in vitro du potentiel immunomodulant de différents produits à
base de protéines de lactosérum. Mémoire de Maîtrise, Université Laval, Québec,
88 pages.
Mercier, A., Gauthier, S.F. & Fliss, I. (2004). Immunomodulating effects of whey
proteins and their enzymatic digests. International Dairy Journal, 14, 175-183.
Miyauchi, H., Kaino, A., Shinoda, 1., Fukuwatari, Y. & Hayasawa, H. (1997).
Immunomodulatory effect of bovine lactoferrine pepsin hydrolysate on murine
splenocytes and Peyer's patch cells. Journal of Dairy Science, H0, 2330-2339.
Mizoguchi, C , Uehara, S., Akira, S. & Takatsu, K. (1999). IL-5 induces IgGl isotype
switch recombination in mouse CD38 activated slgD-positive B lymphocytes.
Journal of lmmunology, 162, 2812-2819.
Monaco, H.L., Zanotti, G., Spadon, P., Bolognesi, M., Sawyer, L. & Eliopoulos, E.E.
(1987). Crystal structure of the trigonal form of bovine (3-lactoglobulin and its
complex with retinol at 2.5 Â resolution. Journal of Molecular Biology, 197, 695706.
Mossmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
application to prolifération and cytotoxicity assays. Journal of Immunological
Melhods, 65, 55-63.
Mosmann, T. R. & Sad, S. (1996). The expanding universe of T-cell subsets: Thl, Th2
and more, lmmunology Today, 17, 138-146.
Mottet, C. & Golshayan, D. (2007). CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells: from basic to
potential therapeutic use. Swiss Médical Weekly, 137, 625-634.
83
Mullally, M.M., Meisel, H. & Fitzgerald, R.J. (1996). Synthetic peptides corresponding
to a-lactalbumin and (3-lactoglobulin séquences with angiotensin-I-converting
enzyme inhibitory activity. Biological Chemistry Hoppe-Seyler, 377, 259-260.
Mullally, M.M., Meisel, H. & Fitzgerald, R.J. (1997a). Angiotensin-I-converting enzyme
inhibitory activities of gastric and pancreatic proteinase digests of whey proteins.
International Dairy Journal, 7, 299-303.
Mullally, M.M., Meisel, H. & Fitzgerald, R.J. (1997b). Identification of a novel
angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptide corresponding to a tryptic
fragment of bovine pMactoglobulin. FEBS Letters, 402, 99-101.
Murakami, M., Tonouchi, H., Takahashi, R., Kitazawa, H., Kawai Y., Negishi, H. &
Saito, T. (2004). Structural analysis of a new anti-hypertensive peptide ((3-lactosin
B) isolated from a commercial whey product. Journal of Dairy Science, 87, 19671974.
Nagaoka, S., Futamura, Y., Miwa, K., Awano, T., Yamauchi, K., Kanamaru, Y.,
Tadashi, K. & Kuwata, T. (2001). Identification of novel hypocholesterolemic
peptides derived from bovine milk (î-lactoglobulin. Biochemical and Biophysical
Research Communications, 281, 11-17.
Nurminen, M.L., Sipola, M., Kaarto, H., Pihlanto-Leppâlâ, A., Piilola, K., Korpela,
R., Tossavainen, O., Korhonen, H. & Vapaatalo, H. (2000). a-Lactorphin lowers
blood pressure measured by radiotelemetry in normotensive and spontaneously
hypertensive rats. Life Science, 66, 1535-1543.
O'Donnell, R., Holland, J.VV., Deeth, C.H. & Alewood, P. (2004). Milk proteomics.
International Dairy Journal, 14, 1013-1023.
Ollier, W.E. (2004). Cytokine gènes and disease susceptibility. Cylokine, 28, 174-178.
Outinen, M., Tossavainen, O., Tupasela, T., Koskela, P., Koskinen, H., Rantamaki, P.,
Syvaoja, E.L., Antila, P. & Kankare, V. (1996). Fractionation of proteins from
whey with différent pilot scale processes. Lebensmittel-Wissenschaft UndTechnologie, 29, 411-417.
Panyam, D. & Kilara, A. (1996). Enhancing the functionality of food proteins by
enzymatic modification. Trends in Food Science and Technology, 7, 120-125.
84
Papiz, M.Z., Sawyer, L., Eliopoulos, E.E., North, A.C.T., Findlay, J.B.C.,
Sivaprasadarao, R., Jones, T.A., Newcomer, M.E. & Kraulis, P.J. (1986). The
structure of P-lactoglobulin and its similarity to plasma retinol-binding protein.
Nature, 324, 383-385.
Patel, M.T. & Kilara, A. (1990). Studies on whey protein concentrâtes. 1. Compositional
and thermal properties. Journal of Dairy Science, 73, 1439-1449.
Paul-Eugène, N., Dugas, B., Kolb, J.P., Damais, C , Braquet, P., Paubert-Braquet, M.
& Rialland, J.P. (1993). Effets immunomodulateurs et anti-oxydants de la
lactoferrine bovine chez l'homme. Comptes Rendus de l'Académie des Sciences,
316, 113-119.
Pecquet, S., Pfeifer, A., Gauldie, S. & Fritsche, R. (1999). Immunoglobulin E
suppression and cytokine modulation in mice orally tolerized to fî-lactoglobulin.
Immunology, 96, 278-285.
Pcllegrini, A., Dcttling, C , Thomas, U. & Hunziker, P. (2001). Isolation and
characterization of four bactericidal domains in the bovine P-lactoglobulin.
Biochimica et Biophysica Acta, 1526, 131-140.
Pellegrini, A., Thomas, U., Bramaz, N., Hunziker, P. & Von Fellenbcrg, R. (1999).
Isolation and identification of three bactericidal domains in the bovine alactalbumin molécule. Biochimica et Biophysica Acta, 1426, 439-448.
Penn, A.H., Hugli, T.E. & Schmid-Schônbein, G.W. (2007). Pancreatic enzymes
generate cytotoxics mediators in the intestine. Shock, 27, 296-304.
Permyakov, E.A. & Berliner, L.J. (2000). a-Lactalbumin: structure and function. FEBS
Lelters, 473, 269-274.
Pessala, B.C.C., Torres, R., Batalla, P., Fuentes, M., Mateo, C , Fernândez-Lafuentc,
R. & Guisân, J.M. (2006). Simple purification of immunoglobulins from whey
proteins concentrate. Biotechnology Progress, 22, 590-594.
Peterson, J.D., Herzenberg, L.A., Vasquez, K. & Waltenbaugh, C. (1998). Glutathione
levels in antigen-presenting cells modulate Thl versus Th2 response patterns.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,
95, 3071-3076.
Petsch, D. & Anspach, F.B. (2000). Endotoxin removal from protein solutions. Journal of
Biotechnology, 76, 97-119.
85
Pihlanto-Lcppâlâ, A. (2001). Bioactive peptides derived from bovine whey proteins:
opioid and ACE-inhibitory peptides. Trends in Food Science & Technology, 11,
347-356.
Pihlanto-Lcppâlâ, A. & Korhonen, H. (2003). Bioactive peptides and proteins. In:
Advances in food and nutrition research. Editor Taylor S.L., London: Elsevier
Académie Press, pages 175-276.
Pihlanto-Leppâlâ, A., Koskinen, P., Tupasel, K. & Korhonen, H. (2000). Angiotensin-Iconverting enzyme inhibitory properties of whey protein digests: concentration and
characterization of active peptides. Journal ofDairy Research, 67, 53-64.
Pihlanto-Leppâlâ, A., Rokka, T. & Korhonen, H. (1998). Angiotensin-I-converting
enzyme inhibitory peptides derived from bovine milk proteins. International Dairy
Journal, 8, 325-331.
Prioult, G. (2003). Effet des probiotiques sur l'induction et le maintien de la tolérance orale
à la P-lactoglobuline chez la souris et étude de leurs mécanismes d'action. Thèse de
doctorat, Université Laval, Québec, 172 pages.
Prioult, G., Pecquet, S. & Fliss, I. (2004). Stimulation of interleukin-10 production by
acidic (3-lactoglobulin-derived peptides hydrolysed with Lactohacillus paracasei
NCC2461 peptidases. Clinical and Diagnostic Lahoratory Immunology, 11, 266271.
Pujals, S., Fernândez-Carneado, J., Lôpez-Iglesias, C , Kogan, M.,1. & Giralt, E.
(2006). Mechanistic aspects of CPP-mediated intracellular drug delivery: relevance
of CPP self-assembly. Biochimica et Biophysica Acta, 1758, 264-279.
Pulendran, B. (2004). Modulating Th|/Tli2 responses with microbes, dendritic cells, and
pathogen récognition receptors. Immunology Research, 29, 187-196.
Radck, K. & Gallo, R. (2007). Antimicrobial peptides: natural effectors of the innate
immune system. Seminars in Immunopathology, 29, 27-43.
Rook, G.A. & Brunet, L.R. (2005). Microbes, immunoregulation, and the gut. Gui, 54,
317-320.
Rutherfurd-Markwick, K.J. & Gill, H.S. (2005). Immunomodulating activity of protein
concentrâtes derived from bovine milk whey in mice. Nutrition Research, 25, 157166.
86
Saint-Sauveur, D., Gauthier, S.F., Boutin, Y. & Montoni, A. (2007).
Immunomodulating properties of a whey protein isolate, its enzymatic digest and
peptide fractions (in press).
Santé Canada (1998). «Produits nutraceutiques/aliments fonctionnels et les allégations
relatives aux effets sur la santé liées aux aliments». Programme des produits
thérapeutiques et Direction des aliments de la Direction générale de la protection de
la santé. Section 2.2. Page URL:
http://www.hc-sc.ac.ca/fn-an/labeletiquet/nutrition/claims-reclam/nutra-funct foods-nutra-fonct aliment_f.html.. date
de consultation: 20/05/2007.
Santé Canada (2005). Sondage de référence auprès des consommateurs sur les produits de
santé naturels, mars 2005. Rapport définitif, sondage réalisé par Ipsos-Reid. Page
URL: http://www.hc-sc.ac.ca/dhp-mps/pubs/natur/ena cons survey fhtml. date de
consultation: 20/05/2007.
Santé Canada (2006). Analyse du financement de l'innovation et de la commercialisation
des aliments fonctionnels et des nutraceutiques dans le secteur canadien 1956-2006.
Page URL: http://dsp-Dsd.pwasc.acca/Collection/Statcan/21-601-MIF/21-601MIF2006079.pdf.. date de consultation: 21/05/2007.
Santé Canada (2007). Médicaments et produits de santé: produits de santé naturels. Page
URL:
http://www.hc-sc.ac.ca/dhp-mps/prodnatur/index_f.html.,
date
de
consultation : 21/05/2007.
Sawyer, L., Kontopidis, G. & Wu, S.Y. (1999). (3-lactoglobulin-a three-dimensional
perspective. International Journal of Food Science and Technology, 34, 409-418.
Sindayikengera, S. & Xia, W. (2005). Milk biologically active components as
nutraceuticals: review. Critical Review in Food Science and Nutrition, 45, 645-656.
Sindayikengera, S. & Xia, W. (2006a). Enzymatic hydrolysis of whey proteins by two
différent proteases and their effect on the functional properties of resulting protein
hydrolysate. Journal ofFood Biochemistry, 30, 77-97.
Sindayikengera, S. & Xia, W. (2006b). Nutritional évaluation of caseins and whey
proteins and their hydrolysates from protamex. Journal of Zhejiang University
Science B, 7, 90-98.
Sipola, M., Finckenberg, P., Vapaatalo, H., Pihlanto-Lepâllâ, A., Korhonen, H.,
Korpela, R. & Nurminen, M.L. (2002). a-Lactorphin and (î-lactorphin improve
arterial function in spontaneously hypertensive rats. Life Sciences, 71, 1245-1253.
87
Srimal, S., Surolia, N., Balasubramanian, S. & Surolia, A. (1996). Titration calorimetric
studies to elucidate the specificity of the interaction of polymyxin B with
lipopolysaccharides and lipids A. The Biochemical Journal 315, 679-686.
Statistique Canada (2007). Résultats de l'Enquête sur les aliments fonctionnels et les
nutraceutiques-2005. Page URL:
http://www.statcan.ca/francais/freepub/88F0006XIF/88F0006XIF2007003.pdf. date
de consultation: 11/06/2007.
Townsend, M.J. & McKcnzie, A. N. (2000). Unravelling the net ? cytokines and diseases.
Journal ofCell Sciences, 113, 3549-3550.
Van Amelsfort, J.M., Jacobs, K.M., Bijlsma, J.W., Lafeber, F.P. & Taams, L.S.
(2004). CD4CD25 F regulatory T cells in rheumatoid arthritis: différences in the
présence, phenotype, and function between peripheral blood and synovial fluid.
Arlhritis Rheumatism, 50, 2775-2785
Van Vlasselaer, P., Punnonen, J. & de Vries, J.E. (1992). Transforming growth factorbeta directs IgA switching in human B cells. Journal of Immunology, 148, 20622067.
Vercelli, D., Jabara, H.H., Lauener, R.P. & Geha, R.S. (1990). IL-4 inhibits the
synthesis of IFN-y and induces the synthesis of IgE in human mixed lymphocyte
cultures. The Journal of Immunology, 144, 570-573.
Vermeirssen, V., Van Camp, J. & Verstraete, W. (2002). Optimisation and validation of
an angiotensin-converting enzyme inhibition assay for the screening of bioactive
peptides. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 51, 75-87.
Walstra, P. & Jenness, R. (1984). Proteins. In: Dairy chemistry and physics. Editors
Walstra P. and Jenness R., New York: Wiley, pages. 114-122.
Walzem, R.L., Dillard, C.J. & German, J.B. (2002). Whey components: millennia of
évolution create functionalities for mammalian nutrition: what we know and what
we overlooking. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 42, 353-375.
West, G.E., Gendron, C , Larue, B. & Lambert, R. (2002). «Consumers' valuation of
functional properties of foods: results from a Canada-wide survey». Canadian
Journal of Agricultural Economies, 50, 541-558.
Wong, C.W. & Watson, D.L. (1995). Immunomodulatory effects of dietary whey proteins
in mice. Journal of Dairy Research, 62, 359-368.
88
Wong, C.W., Seow, H.F., Husband, A.J., Regester, C.O. & Watson, D.L. (1997).
Effects of purified bovine whey factors on cellular imnuine fonctions in ruminants.
Veterinary Immunology and Immunopathology, 56, 85-86.
Wong, K.F., Middleton, N., Montgomery, M., Dey, M. & Carr, R.I. (1998).
Immunostimulation of murine spleen cells by materials associated with bovine milk
protein fractions. Journal of Dairy Science, 81, 1825-1832.
Yamauchi, R., Ohinata, K. & Yoshikawa, M. (2003). p-lactotensin and neurotensin
rapidly reduce sérum cholestérol viaNT2 receptor. Peptides, 24, 1955-1961.
Yoshida, S., Ye-Xiuyun & Nishiumi, T. (1991). The binding ability of alpha-lactalbumin
and beta-lactoglobulin to mutagenic heterocyclic aminés. Journal of Dairy Science,
74, 3741-3745.
Yoshikawa, M., Tani, F., Yoshimura, T. & Chiba, H. (1986). Opioid peptides from milk
proteins. Agricultural and Biological Chemistry, 50, 2419-2421.
Zhi-Jun, Y., Sriranganathan, N., Vaught, T., Arastu, S.K. & Ahmed, S.A. (1997). A
dye-based lymphocyte prolifération assay that permits multiple immunological
analyses: mRNA, cytogenetic, apoptosis, and immunophenotyping studies. Journal
of Immunological Methods, 210, 25-39.
Zimecki, M. & Kruzel, M.L. (2007). Milk-derived proteins and peptides of potential
therapeutic and nutritive value. Journal of Expérimental Therapeutics and
Oncology, 6, 89-106.
Zorko, M. & Langel, U. (2005). Cell-penetrating peptides: mechanism and kinetics of
cargo delivery. AdvancedDrug Delivery Reviews, 57, 529-545.