BRCA1 - ginova

Recherche des mutations germinales
et tumorales
des gènes BRCA1 et BRCA2
dans le cancer de l’ovaire
Pr Stéphane Bézieau
Nantes, 06 avril 2017
Liens d’intérêt
• Board d’experts et soutien AstraZeneca
Introduction
• BRCA1 et 2:
– Gènes suppresseurs de
tumeur
– Codent pour des protéines
impliquées dans la voie de
réparation des cassures
double brin de l’ADN par
recombinaison homologue
Indications à la recherche de mutations dans les gènes BRCA1 et BRCA2
1) Oncogénétique
Recherche d’une mutation constitutionnelle = héréditaire
Une mutation constitutionnelle
augmente le risque de cancer
du sein et de l’ovaire
Pas d’urgence en général (6 à 8 mois)
2) Théranostique
Recherche d’une mutation constitutionnelle et/ou tumorale
Et/ou
Une mutation tumorale de BRCA
est un driver de la tumorigénèse
ovarienne
Parfois contexte d’urgence (6 à 8 semaines maximum)
Une mutation germinale se retrouve toujours au niveau somatique,
l’inverse n’est pas vrai !
Indication(s) en oncogénétique
de la recherche de mutations dans les gènes BRCA
Impact pour le patient mais aussi pour ses apparentés -> conseil génétique
Cancer sein 50 ans
Cancer sein 70 ans
ovaire 65 ans
Cancer sein 28 ans
Les gènes BRCA1 (17q21) et BRCA2 (13q12-13) mutés sont responsables de cancers
sein/ovaire selon un mode de transmission autosomique dominant.
Dispositions légales encadrées pour les examens
des caractéristiques génétiques
(symptomatique/asymptomatique/obligation information parentèle)
Quand penser à une prédisposition héréditaire au
cancer de l’ovaire ?
Pas de critère pathognomonique
Arguments en faveur :
•Individuels :
Age au diagnostic < 50 ans
Association à d’autre(s) cancer(s) : sein/ endomètre/ colon
•Familiaux :
Présence de cancer(s) du spectre de la prédisposition suspectée
Même branche parentale
•Tumorales :
Caractéristiques histologiques : séreux, haut grade (stade avancé III ou IV)
La plupart des tumeurs de l’ovaire liées à BRCA1/2 sont
épithéliales, de type séreux de haut grade.
Banerjee S an Kaye SB Clin Cancer Res 2013
Risque de cancer du sein et de l’ovaire lors de la présence
constitutionnelle d’une mutation BRCA1 ou BRCA2
Porteur mutation
Porteur mutation
BRCA1
BRCA2
Risque cumulé à 70 Risque cumulé à 70
ans
ans
Sein
Antoniou, 2003
Chen, 2007
EMBRACE, 2013
65% (CI: 44-78%)
57% (IC: 47-66%)
60% (IC: 44-75%)
45% (CI: 31-56%)
49% (IC: 40-57%)
55% (IC: 41-70%)
Ovaire
Antoniou, 2003
Chen, 2007
EMBRACE, 2013
39% (CI: 18-54%)
40% (IC: 35-46%)
59% (IC: 43-76%)
11% (CI: 2,4-19%)
18% (IC: 13-23%)
17% (IC: 7,5-34%)
Antoniou et al, Am J Hum Genet 2003; 72 : 1117-30; Chen and Parmigiani J Clin Oncol. 2007 Apr 10;25(11):1329-33; Mavaddat et al, J Natl cancer Inst 2013, 105 : 812-822
Les femmes atteintes d’un syndrome de Lynch sont également à risque accru de cancer de
l’endomètre (40 à 60%) et de cancer de l’ovaire (10 à 12%).
Indication théranostique de la recherche de mutations
dans les gènes BRCA
Thérapie ciblée dans les cancers de l’ovaire:
Les inhibiteurs de PARP1 (Olaparib)
La PolyADP ribose
polymerase (PARP) est
une enzyme majeure de
la voie de réparation des
cassures de l’ADN simple
brin
http://www.arcagy.org/arcagy-organisation-et-recherche
Indications de l’Olaparib
– AMM européenne obtenue en décembre 2014
– Cancer de l’ovaire, des trompes de Fallope ou péritonéal primitif
de haut grade séreux
• Extension à d’autres types histologiques de haut grade
– En rechute
– Sensible au platine
– Traitement d’entretien après une nouvelle réponse à une
chimiothérapie comportant un sel de platine
DIAGNOSTIC
RECHUTE
Chirurgie
Cancer de l’ovaire à
risque de rechute
6 cycles de 3 sem
1 mois
Sel de platine - Taxane
OU
Sel de platine – Taxane +/- Bevacizumab
1e LIGNE
●●●
6
7
8
9
10
11
Sel de platine - Taxane
OU
12 mois
Olaparib si BRCA+
ENTRETIEN
Sel de platine – Gemcitabine +/- Bevacizumab
OU
Autre doublet à base de sels de platine
2e LIGNE
Une patiente est dite sensible aux platines si son
cancer de l’ovaire ne progresse pas durant les six mois
qui suivent la fin de la 1e ligne de chimiothérapie
●●●
●●●
Anti-PARP : indication pour déterminer le statut
moléculaire au niveau constitutionnel des gènes BRCA
K ovaire
séreux de haut grade < 70 ans
44 % des femmes avec
mutés BRCA au niveau constitutionnel
sans antécédents familiaux
de cancer du sein ou de l’ovaire !
Alsop K, JCO 2012
KO BRCA mutés ont un meilleur pronostic et une meilleure réponse aux sels de platine
mais aussi au niveau tumoral !
Les mutations de BRCA dans les tumeurs
ovariennes séreuses sont parfois exclusivement
tumorales
Etude
Nombre
d’échantillons
Mutations
exclusivement
tumorales
Total des
mutations
tumorales+
constitutionnelles
The Cancer Genome Atlas
Research Network, 2011
316
3%
20%
Hennessy et al., 2010
235
5% (11)
19% (44)
Pennington et al., 2014
390
6,5% (25)
24,5% (96)
Magdalena et al., 2016
100
4%
27%
 Mutations exclusivement tumorales de BRCA attendues dans 3 à 7% des cas
Recommandations INCa pour la recherche de
mutation dans les gènes BRCA
indication : traitement par anti=PARP
2 indications pour tester les
gènes BRCA dans le cancer de
L’ovaire
1) Au moment du diagnostic
2) A la rechute
février 2017
Stratégie au CHU
de Nantes
Analyse
constitutionnelle
puis tumorale si
pas de mutation
Identifiée
Mais du matériel
tumoral peut être
adressé au diagnostic
Stratégie au CHU
de Nantes
Analyse
constitutionnelle
et tumorale
simultanée
Just to do it ! mais complexité de l’analyse moléculaire
des gènes BRCA1 et BRCA2
BRCA1
17q12
BRCA2
13q12-13
2 grands gènes sans « hot spot » de mutations
Conséquence:
BRCA1 et 2: nécessité de séquencer l’ensemble du gène (mutations privées)
5592 (7,8 kb ARNm) nucléotides pour BRCA1 ! 10254 (12kb ARNm) pour BRCA2 !
Différence avec d’autres marqueurs théranostiques !
KRAS, NRAS, BRAF,… (une vingtaine de bases nucléotidiques à tester ) !
Technique adaptée à l’analyse de grands gènes
Mais surtout recherche plus difficile dans la tumeur !
Mutation constitutionnelle : Toutes les cellules sont mutées
Mutation exclusivement tumorale : seule les cellules tumorales sont mutées
Sur du matériel fixé au formol et inclue en paraffine (FFPE) !
Difficultés techniques liées à l’analyse de tumeurs en FFPE
.ADN dégradé (fragments inférieurs à 100 pb)
.Le formol induit des changements de nucléotides dans l’ADN aléatoires visibles en NGS
Identification des grands réarrangements (délétions, duplications) difficiles
Comment rechercher les mutations dans les gènes
BRCA1 et BRCA2 au niveau somatique ?
Chirurgien
Prescripteur : oncologue, gynécologue,
oncogénéticien
Génétique moléculaire
Pathologiste en charge du diagnostic
Pathologiste de plateforme
Anatomie pathologique du CHU de Nantes
Un travail d’équipe pluridisciplinaire
Importance de partir de matériel tumoral satisfaisant
quantitativement et qualitativement !
 Bon de demande de test BRCA rempli par le clinicien et adressé
au pathologiste responsable du diagnostic initial
 Privilégier un prélèvement pré-chimiothérapie néo-adjuvante
(risque de diminution de cellules tumorales)
 Tout type de prélèvement (biopsie à l’aiguille, biopsie
chirurgicale, pièce opératoire, cyto-bloc)
o
o
o

Type de fixateur: Formol
Temps de fixation: suffisante ( > 6 H et < 48 H)
Temps à fixation < 1 H (idéal)
Transmission du bloc le plus riche en cellules tumorales au
pathologiste de PF (>30%)
 Date prévisionnelle de traitement par Olaparib à préciser
Rôle du pathologiste de Plateforme

Etablissement du % de cellules tumorales sur la lame HES
réalisée à partir du bloc transmis
= estimation de la proportion de cellules tumorales sur l’ensemble des
cellules (hors nécrose) présentes sur la coupe ou sur la zone du prélèvement
qui a été sélectionnée / INCA2010
 Cerclage de la zone tumorale à extraire sur les lames
 Transmission des coupes à 10 µ en Génétique Moléculaire
avec la fiche de traçabilité
D’après D Loussouarn
Notre expérience et notre avis
• 10 % des prélèvements sont non interprétables
– 2/3 sont liés à une insuffisance de matériel (adressé ou
disponible):
o Problème des biopsies chirurgicales et des prélèvements postchimiothérapie
o Ne pas hésiter à multiplier le nombre de coupes sans épuiser le
bloc
Quantité minimale de matériel tissulaire à adresser = 3 coupes
10µ d’une zone de 0,5x0,5cm avec 55% de cellules tumorales
– 1/3 dépendent d’autres facteurs: type de fixateur ?, temps à
fixation ?…Autres ?
Technique pour rechercher les mutations dans les
gènes BRCA1 et BRCA2 au niveau somatique ?
•
Seul le NGS (séquençage haut débit) permet d’étudier les mutations somatiques des gènes
BRCA1/2
– Il est possible d’étudier de faible quantité d’ADN (10-100 ng) contre 1 µg en génétique
constitutionnelle.
– Il permet d’assurer aussi la couverture de l’ensemble des régions codantes avec peu de
PCR (4 PCR multiplex contre plus de 200 PCR s’il fallait le faire en technique
conventionnelle).
– Il permet d’assurer un niveau de détection en dessous de 10% de fréquence allèlique.
•
Le délai pour le rendu de résultat peut être en dessous de 3 semaines ce qui est compatible
avec la décision thérapeutique (contexte actuel de l’AMM).
Petites notions indispensables pour comprendre le NGS
Couverture
(taille de la séquence cible)
Profondeur
(moyenne du nombre de lectures
pour chaque base ;
exprimée en X)
1 read
= 1 fragment lu
= ~200pb
Séquence de référence
Séquence consensus lue
La profondeur de lecture garantie la sensibilité et
la discrimination des artéfacts
Pour respecter les paramètres de validation en accord avec
un seuil de détection de VAF (Variant Allele Frequency) à 10%
- Profondeur de couverture minimale à 500 reads pour que le variant puisse
être vu au minimum sur 50 reads.
- il faut un pourcentage de cellules tumorales au minimum de 30% pour
être sur de voir un variant allèlique à 10% en fréquence.
 si cellularité inférieure à 30% :
. Si un variant retrouvé, il est rendu au prescripteur.
. Par contre si pas de variant retrouvé: test non contributif, demande de nouveau
prélèvement
ANALYSE
TUMORALE
Choix technologique au CHU de Nantes : BRCA Tumor MASTR Plus Dx
(MultiplicomR)
4 PCR multiplex
EXTRACTION
de l’ADN
Analyse bioinformatique (SeqNext, JSIR)
Exemple de résultat : mutation exclusivement somatique
Confirmation des variants retrouvés
• Important pour limiter les erreurs
• Variant retrouvé en constitutionnel
 Variant validé : résultat rendu
• Variant non retrouvé en constitutionnel
– Validation sur le prélèvement tumoral
• Si pourcentage de reads > 15%: confirmation en Sanger
• Si pourcentage de reads < 15%: on relance la technique
– Confirmation de l’absence du variant sur un second
prélèvement constitutionnel indépendant
La difficulté n’est pas seulement technique mais
surtout dans l’interprétation des variants !
• Absence de mutations récurrentes au niveau constitutionnel
et somatique dans les gènes BRCA
• Classification des variants en 5 classes
• Difficultés de classification des variants “faux sens”
– Effet sur l’épissage – délétion totale ou partiel d’un exon ?
– Effet sur la fonction de la protéine ?
De nombreux variants de signification inconnue
Proportion de VSI non négligeable dans les gènes BRCA
VSI
CLINICIENS
MALHEUREUX !
Données INCa 2013
9,9 % de mutations
7 % d’UV !
Aide à l’interprétation des variants dans la
tumeur
• Pas de bases de données spécifiques aux mutations tumorales
• Sur la cohorte du TCGA : 88% des mutations constitutionnelles de BRCA1
étaient identifiées dans les bases de données contre 40% des mutations
somatiques / 58% des mutations constitutionnelles pour BRCA2 contre 30%
pour les mutations somatiques.
• Bases de données utilisables
– BRCA share/UMD database – http://www.umd.be/BRCA1/ http://www.umd.be/BRCA2/
– ClinVar – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
– LOVD – http://databases.lovd.nl/shared/genes/BRCA1
http://databases.lovd.nl/shared/genes/BRCA2
– BIC – http://research.nhgri.nih.gov/bic/
• Il existe un consortium international pour l’évaluation des variants sur le plan
constitutionnel : ENIGMA consortium
Avantage pour analyse BRCA1 et BRCA2 :
Connaissances acquises sur 12 000 cas analysés depuis 2002 au
niveau constitutionnel
Evans et al.
The Angelina Jolie effect: how high celebrity profile can
have a major impact on provision of cancer related services.
Breast Cancer Res. 2014 Sep 19;16(5):442.
L’expérience est
un avantage même si…..
Une mutation connue dans la prédisposition au cancer du
sein et de l’ovaire peut poser question en théranostique !
• L’étude de la sensibilité aux inhibiteurs de PARP n’a pas été réalisée
pour chaque mutation (impossible !)
• Il existe déjà une différence de sensibilité aux sels de platine entre les
deux gènes BRCA1/2
• La mutation (BRCA1:p.Cys61Gly) n’a pas la même réponse qu’une
mutation stop
BRCA1 p.Cys61Gly
RING
NN
L L
S S
Exon 11
C61G
BRCA2
OB
1
Transactivation
BRC repeat
BRCT
BRCT
OB
2-3
Helical
domain
Bolton KL et al. JAMA 2012;307:382–390;
Drost R et al. Cancer Cell 2011;20:797–809;
Zheng L et al. Oncogene 2000;19:6159–6175
N
L
S
p.Lys3326*
STOP
WT
Bilan au CHU de Nantes des gènes de l’analyse des gènes BRCA1 et BRCA2 au
niveau tumoral:
Mars 2016 - Mars 2017
175 KO analysés sur matériel tumoral : 12 ininterprétables (7%)
car cellularité tumorale <10% ou séquence ininterprétable
N=163 (93%)
Interprétables (17 ont nécessité de redemander du matériel tumoral) !
20,2 % mutés ou VSI BRCA1 ou BRCA2
Mutation tumorale
19/163 (11,6%)
Mutation
constitutionnelle
4/19 (21%)
Mutation
tumorale exclusive
10/19 (53%)
10/163 (6 % de mutation
tumorale)
Recherche non réalisée : 5/19 (26%)
VSI tumoral
14/163 (8,6%)
VSI
constitutionnel
5/14 (36%)
VSI tumoral exclusif
7/14 (50%)
Recherche non réalisée : 2/14 (14%)
80 % des KO sans mutation ou VSI identifiés dans BRCA1 ou BRCA2
Mutations ou modifications non visibles en NGS !
– Mutations introniques (non explorées !)
– Perte de l’allèle sauvage (LOH) : possible sous réserve
– Methylation du promoteur de BRCA1 : autre technique nécessaire
Inactivation bi-allèlique selon la théorie de Knudson !
Etude de la méthylation de BRCA1:
Robbert et al Hum Mut, 2016, 38:226-235
-
Dans 17% (9/53) des KO sans mutation ponctuelle BRCA
constitutionnelle ou tumorale
-
Mutuellement exclusif avec mutation BRCA
-
Systématiquement associé avec LOH
Extension possible des patientes éligibles aux anti-PARP
22/130 (17%) patientes attendues dans notre série ? Étude en cours….
+ étude ancillaire PAOLA
D’autres gène impliqués dans la RH sont altérés
dans les cancers de l’ovaire
2014
2015
Concept de BRCAness ou HRness
Extension de la population
potentiellement éligible aux anti-PARP.
Vers une signature génomique….
Toss et al, Hindawi
Publishing Corporation
BioMed Research
International
Volume 2015
BRCAness
HRness
Nik-Sainal S et al, nature , 2 mai 2016
La recherche constitutionnelle de mutation dans les gènes BRCA1 et
BRCA2
-
Pour la prescription d’Olaparib, recherche de mutations dans les gènes
BRCA1 et BRCA2 en attendant HRness….
Pour la prédisposition héréditaire, vers un panel de gènes de prédisposition
au cancer du sein et de l’ovaire (panel HBOC)
PALB2 : 7/708 = 1 %
BRCA1 et BRCA2 : 69/708 = 9,75 %
Panel HBOC en discussion (GGC)
BRCA1, BRCA2
PALB2
TP53
CDH1
RAD51C
RAD51D
MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, EPCAM
PTEN
Castera et al, EJHG, fev 2016
Technique NGS différente pour le constitutionnel
Recherche simultanée des mutations ponctuelles et des grands réarrangements
(délétions et duplications)
séries de 48 patients (KSO et K Colon)
POINTS IMPORTANTS POUR LES TESTS BRCA
• Caractéristiques du prélèvement
• Prélèvement de préférence réalisé avant chimiothérapie
• Matériel suffisant nécessaire à prélever
• Informer les chirurgiens +++
• Avec au moins 30% de cellules tumorales sans nécrose
• Si moins de 30% de cellules tumorales : résultat sans mutation
sous réserve
• Transmission de tous les blocs au service d’anatomopathologie du CHU
de Nantes (Dr Delphine LOUSSOUARN) :
– Nature de la tumeur
– Type histologique
– Date prévue de début de traitement par Olaparib si éligible
• Prélèvement sanguin associé si statut constitutionnel inconnu
(consultation d’oncogénétique) pour une analyse simultanée avec la
tumeur.
•
•
Remerciements
Equipe oncogénétique du laboratoire de génétique moléculaire du CHU de Nantes
– Céline Garrec (PH)
– Capucine Delnatte (PH)
– Virginie Guibert (Ingénieur)
– Fabrice Airaud (Ingénieur)
– Delphine Leroux
– Nadège Marti
– Karine Pennarun
– Ingrid Ricordeau
– Eva Trochu
– Flora Bréheret
– Jessica le Gall (Interne)
– Carine Vallet (secrétaire)
– Nathalie You (secrétaire)
Anatomie pathologique CHU de Nantes
– Dr Christine Sagan
– Dr Delphine Dansette
– Et techniciens de la plateforme
– Secrétariat