doctorat de l`université de toulouse doctorat de l

THESE
En vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE
Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier
Discipline ou spécialité : Cancérologie
Présentée et soutenue par DIRAT Béatrice
Le 30 Avril 2010
Titre : Les adipocytes associés au cancer: nouveaux acteurs de la progression tumorale:
un lien entre obésité et cancer.
JURY
Pr Hervé Prats,Professeur des Universités, INSERM, Toulouse
Dr Marie-Christine Rio, Directrice de Recherche, CNRS, Strasbourg
Dr Frédéric Bost, Chargé de Recherche, INSERM, Nice
Pr Catherine Muller Staumont, Professeur des Universités, CNRS, Toulouse
Pr Philippe Valet, Professeur des Universités, INSERM, Toulouse
Président
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Directeur de thèse
Ecole doctorale : Ecole doctorale Biologie-Santé-Biotechnologie de Toulouse
Unité de recherche : Inserm U858, I2MR
Directeur(s) de Thèse : Pr Philippe Valet
Rapporteurs : Rio MC, Bost F
Remerciements
Je tiens tout d’abord à remercier mes deux encadrants de thèse, Philippe Valet et
Catherine Muller de m’avoir confié ce travail. Merci de m’avoir permis de travailler sur ce
sujet tellement « sexy » que sont les adipocytes et leur dialogue avec les cellules tumorales.
Qu’on se le dise, il n’y a pas meilleurs que nous pour créer un site de rencontre entre divers
types cellulaires ! Malgré les hauts et les bas que nous fait traverser ce métier, je vais garder
un bon souvenir de cette collaboration. En effet, je suis très satisfaite de la façon dont le sujet
a évolué, des résultats obtenus, et de l’histoire que nous avons réussi à construire. En un mot,
je me suis régalée. Merci à vous deux pour m’avoir accueilli au sein de vos équipes
respectives, me permettant ainsi d’évoluer dans des domaines très différents.
Un grand merci à mon équipe de l’IPBS. Merci à toi, Fred (Miss Accent) pour avoir
été ma binôme matinale pendant toutes ses années et avoir partagé tant de bons moments en
salle de culture. Merci à toi aussi, Cathy Botanch (Madame Alignement), pour tes fous rires
communicatifs et nos discussions diverses et variées. J’espère que ma paillasse t’apportera de
bonnes ondes ! A toi Marielle (Miss frizouilles), pour m’avoir supporté sans trop rechigné
depuis le DEA et pour avoir été à mes côtés dans ce périple qu’est la thèse ! Merci à toi
Ludivine, Lud, pour les intimes. C’est à ton tour maintenant de devenir la « doyenne » des
adipo girls ! Je te souhaite beaucoup de succès dans cette entreprise ! Merci à toi Marta,
pour ta participation aux manips vivo et à ton accent très polonais, que je trouve super
mignon ! A toi, ma petite Yuan Yuan, pour avoir été une très bonne stagiaire, comme tu dirais
a good assitant ! Merci à toi, Stéphanie pour ta contribution importante à toutes les belles
images d’IF que tu as prises et pour toutes ces heures que tu as passé à faire les diaporamas
pour que je puisse visualiser ce que mes petites cellules étaient capables de faire. Et enfin,
merci à toi, Sandrine (alias Sun Flower) pour ta bonne humeur quotidienne et pour avoir été
mon maître PCR !
Merci également à tous les personnes qui ont été de passage dans l’équipe Mika,
Murielle, Pierre- Yves, Karine, Stéphanie….., pour votre enthousiasme et votre travail à mes
côtés.
1
Un grand merci à mon équipe de l’I2MR. Les copines de la colline ! Même si ma
présence parmi vous n’a été que ponctuelle, j’ai toujours été accueillie avec soin par vous
toutes, les miss ! Un grand merci, à toi, Danièle, pour avoir toujours été là lorsque j’avais
des questions de tout ordre, concernant les adipos. Merci également de m’avoir initié à
l’extraction des préadipocytes à partir de réductions mammaires. Je tenais également à te
remercier pour avoir participé à la collection des échantillons. Je pense m’être rendue
compte du travail que cela a représenté pour toi, et nous te devons une fière chandelle pour
ça ! Merci à toi Sophie pour ta participation aux manips vivo et tes précieuses indications,
lorsque j’avais des questions relatives à ce domaine. Pour finir, un grand merci à toi,
Camille ! Je dois dire que j’ai particulièrement apprécié notre collaboration, nos
brainstormings durant l’incubation de la manip
-ox et le fait que nous ayons fait nos
manips en cachette, c’était terriblement marrant.
Merci à vous deux Ghislaine et Ignacio pour avoir apporté la touche médicale à ce
sujet. Merci à vous Ghislaine pour avoir accepté de vous battre avec ces satanés adipos pour
leur faire révéler leurs secrets, en immunohistochimie ! Merci également d’avoir toujours été
prompte à répondre à mes questions et à me faire partager vos impressions concernant ce que
vous aviez sous votre microscope. Merci à toi Ignacio pour m’avoir permis de voir une
opération, en « live » et pour avoir été le maillon intermédiaire entre nous et l’hôpital, sans
toi, la collecte d’échantillons mammaires aurait été plus que difficile.
Un grand merci à tous ceux de l’institut, Isa, Leyre, Jean-mi, Gladys, les petits
nouveaux et anciens de l’équipe Salles, Elisa, ….. qui ont partagé avec moi, des bons et des
mauvais moments et qui ont toujours été là pour me soutenir et me secouer si besoin.
A toi aussi tigrou, tu te reconnaîtras, pour m’avoir suivi quasi quotidiennement dans
mes aventures de thésarde.
Pour terminer, je tiens à dire un grand merci à mes parents. En effet, vous avez
toujours été là pour m’entendre parler de mes déboires, me soutenir dans les moments
difficiles et m’épauler. Sans votre soutien et votre amour, je ne serai pas là aujourd’hui.
A tous ceux que j’ai cités sur cette page et tous ceux que j’ai oublié, un grand grand
merci……
2
SOMMAIRE
INTRODUCTION…………………………………………………………………….….p5
INTRODUCTION ENERALE……………………………………………………….…p6
I)
Rôle du microenvironnement dans la progression tumorale ………………….p8
A) Naissance du concept du microenvironnement : opposition entre la théorie de la
mutation somatique et la théorie de l’organisation tissulaire……………..……….p8
B) Définition du microenvironnement……………..………………………………...p10
C) Composition du stroma tumoral………………………………………………..….p11
a. Les fibroblastes tumoraux………………………………………..………………..p11
b. La composante inflammatoire…………………………………..…………………p12
- Les macrophages associés aux tumeurs……………………………..…….p13
- Les neutrophiles infiltrant la tumeur………………………………………p15
- Les lymphocytes de la tumeur……………………………………………..p15
c. La matrice extra cellulaire…………………………………………………………p17
d. L’angiogenèse tumorale…………………………………………………………....p18
II)
Adipocytes et cancer…………………………………………………………...p22
A) Le tissu adipeux…………………………………………………………………….p22
a. Généralités sur le tissu adipeux…………………………………………………….p22
b. Naissance d’un adipocyte : la différenciation adipocytaire………………………...p24
B) Rôle physiologique du tissu adipeux………………………………………………..p25
C) Rôle physiopathologique du tissu adipeux dans le cancer………………………......p27
a. Preuves de l’implication des adipocytes associés aux tumeurs dans la progression
tumorale………………………………………………………………………………...p27
b. Les sécrétions adipocytaires impliquées dans la progression tumorale……………..p29
- La leptine………………………………………………………………….p29
- L’adiponectine (ApN)……………………………………………………..p32
- Le Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-α)………………………………...p33
- L’interleukine-6 (IL-6)………………………………………………….....p36
- Le plasminogène activator inhibitor-1 (PAI-1)……………………………p38
- Sphingosine-1-phosphate (S1P) et l’acide lysophosphatidique (LPA)…....p39
- Les acides gras non estérifiés……………………………………………...p41
- Les estrogènes……………………………………………………………..p43
- L’insuline growth factor-1 (IGF-1)………………………………………..p47
- Les chémokines……………………………………………………………p48
III)
a.
a.
b.
c.
d.
Obésité et cancer…………………………………………………………….....p51
A) Définition de l’obésité……………………………………………………....p51
Développement pathologique du tissu adipeux……………………………………..p51
B) Obésité et cancer : épidémiologie…………………………………………...p55
Survenue des cancers………………………………………………………………..p55
Caractéristiques des tumeurs au moment du diagnostic……………………….……p59
Pronostic…………………………………………………………………………….p62
Détection du cancer du sein…………………………………………………………p65
3
e. Surpoids et obésité après le diagnostic : impact sur le pronostic et le traitement.p68
C) Obésité et adipokines : lien avec le cancer……..……………………….p72
a. Obésité et PAI-1……………………………………………..………………….p72
b. Obésité et leptine………………………………………………..………………p73
c. Obésité et adiponectine……………………………………………...…………..p74
d. Obésité et statut inflammatoire………………………………………...………..p75
e. Obésité et acides gras……………………………………………………...…….p76
f. Obésité et estrogènes………………………………………………………...…..p77
g. Obésité et IGF-1………………………………………………………………....p79
RESULTATS…………………………………………………………………………...p81
REVUE GENERALE …………………………………………………………………p81
ARTICLE I……………………………………………………………………………..p83
ARTICLE II……………………………………………………………………………p84
DISCUSSION ET PRESPECTIVES………………………………………………….p100
BIBLIOGRAPHIE……………………………………………………………………..p109
4
INTRODUCTION
5
INTRODUCTION GENERALE
La progression tumorale a été récemment reconnue comme étant le produit d’une
interaction dynamique entre les cellules tumorales et leur microenvironnement. Parmi toutes
les cellules qui composent le stroma tumoral, les adipocytes sont probablement celles dont le
rôle a été le moins bien caractérisé malgré le fait qu’ils représentent le composant majoritaire
du microenvironnement de certaines tumeurs, comme par exemple pour le cancer du sein ou
pour le cancer invasif de la prostate. L’identification d’un rôle des adipocytes dans la
progression tumorale se révèle être un point important en médecine humaine car de
nombreuses études attestent que l’obésité est un facteur de mauvais pronostic dans de
nombreux cancers. Concernant le cancer du sein, une vaste étude menée par l’Institut Curie a
montré que les patientes obèses présentaient des tumeurs plus agressives définies par un stade
avancé et une propension plus élevée à donner des métastases.
Bien que l’association entre adipocyte et tumeur soit mal comprise, un rôle paracrine
des adipocytes dans la stimulation de la progression tumorale est une hypothèse envisageable.
En effet, outre sa fonction de réservoir d’énergie, l’adipocyte est maintenant reconnu comme
une cellule endocrine active, qui sécrète un grand nombre de facteurs incluant des hormones,
des facteurs de croissance, des molécules pro inflammatoires et des chimiokines. Tous ces
éléments suggèrent que les adipocytes sont des candidats susceptibles d’agir sur le
comportement des cellules tumorales. L’augmentation constante des cas d’obésité dans la
société occidentale met un point d’honneur à souligner l’intérêt tant fondamental que clinique
d’étudier la relation existant entre les adipocytes et les cellules tumorales. Ce dialogue
délétère entre les adipocytes et les cellules tumorales pourrait être amplifié au cours de
l’obésité où l’équilibre normal des protéines sécrétées par le tissu adipeux est perturbé.
Notre objectif a donc été d’étudier les adipocytes associés au cancer en tant que
nouveaux acteurs de la progression tumorale, pouvant faire le lien, entre l’obésité et les
cancers.
Comme nous le verrons dans la partie I des résultats, en utilisant un système de coculture en 2D, nous avons pu montrer que les adipocytes contribuaient à augmenter les
capacités invasives des cellules tumorales in vitro et in vivo. Ces capacités invasives
augmentées étant associées à des changements de morphologie qui semblent être sous la
dépendance de l’IL-6, cytokine pro-inflammatoire sécrétée par les adipocytes. De plus, ces
6
capacités invasives augmentées sont aussi le résultat d’un transfert de lipides entre les
adipocytes et les cellules tumorales (partie II des résultats). L’utilisation des lipides
fournissant une réserve d’énergie nécessaire aux processus invasifs.
Suite à ce dialogue avec les cellules tumorales, les adipocytes présentent également des
modifications. Ils sont notamment capables de sur exprimer des molécules comme l’Il-6, l’IL1β et des métalloprotéases comme la MMP-11 et PAI-1, qui sont capables d’agir sur le
comportement tumoral. De plus, des signes de délipidation et la perte de marqueurs
d’adipocytes matures, font de ces adipocytes « relookés » des candidats potentiels pour
participer à la réaction desmoplastique que l’on retrouve autour des tumeurs mammaires
notamment.
Avant de présenter notre travail, il nous a paru nécessaire de rappeler les
connaissances actuelles en ce qui concerne d’une part, le rôle du microenvironnement dans la
progression tumorale, d’autre part, de faire un point sur les facteurs qui sont produits par les
adipocytes et qui peuvent moduler le comportement tumoral et pour finir, un état des lieux
entre l’obésité et les cancers.
7
I) Rôle du microenvironnement dans la progression tumorale
A) Naissance du concept du microenvironnement : opposition entre la théorie de la
mutation somatique et la théorie de l’organisation tissulaire.
Au cours des dernières décennies, le cancer a été considéré comme une maladie génétique
à part entière. En effet, le courant de pensée qui a prédominé durant cette période, à savoir, la
TMS, la théorie de la mutation somatique (353), découle de travaux qui ont été réalisés au
début du vingtième siècle par Théodore Boveri. Ce dernier avait montré que le chromosome
était le support de l’information génétique et avait suggéré que la croissance illimitée des
tumeurs pourrait provenir d’une ségrégation anormale des chromosomes. Plus tard, Boveri a
également prédit la présence de points de contrôle du cycle cellulaire, l’existence de gènes
suppresseurs de tumeurs, d’oncogènes, la progression vers un phénotype tumoral par
l’acquisition des mutations génétiques, l’héritage d’une prédisposition au développement de
cancers par transmission de chromosomes anormaux (18). Ces prévisions ont été confirmées
par la suite, grâce à la découverte des translocations chromosomiques dans les leucémies
myéloïdes chroniques, par la découverte de plus de 100 oncogènes et plus de 30 gènes
suppresseurs de tumeurs (356). Puis plus récemment la découverte des mutations des gènes
APC (Adenomatous Polyposis Coli) puis BRCA1 (BReast Cancer n°1) ont permis d’élucider
au plan moléculaire, les mécanismes de la transformation tumorale (356). En un mot, les
fervents défenseurs de la TMS voyaient le cancer comme une maladie liée seulement à la
cellule cancéreuse qui en tant que cellule « renégate », avait accumulé des mutations multiples
au niveau de son ADN et plus particulièrement au niveau des gènes qui contrôlent la
prolifération et le cycle cellulaire, lui conférant ainsi un avantage de prolifération et de survie
(330). La carcinogenèse est donc un processus complexe qui requiert de nombreuses étapes
pour l’accumulation des altérations génétiques et/ou épigénétiques.
Certains arguments expérimentaux ont montré toutefois que cette théorie basée uniquement
sur l’accumulation de mutations au niveau de l’ADN pouvait être considérée comme une
simplification excessive du problème. D’une part, il a été montré que des cellules, qui au
cours du temps, ont accumulé des mutations, potentiellement oncogéniques, se retrouvent
dans des tissus tout à fait sains (82, 140). Les travaux de Deng et de son équipe ont montré
qu’il y avait une perte d’hétérozygotie pour les cellules normales qui se trouvent à proximité
d’un carcinome mammaire (82). D’après les travaux de Jonason et al (140), chez des
8
individus sains, il existe une population stable de kératinocytes
non cancéreux mais
préprogrammés du fait de leurs mutations, à participer à la carcinogenèse. Aubèle (11) quant à
elle a montré par une technique d’hybridation génomique comparative, que des cellules issues
de carcinomes canalaires in situ (ou DCIS pour ductal carcinoma in situ) qui est un cancer du
sein non invasif, partagent de grandes ressemblances, d’un point de vue génomique, avec des
cellules issues de carcinomes canalaires invasifs (ou IDC
pour invasive ductal cancer)
modèle invasif de cancer du sein. De plus, d’autres études en lien avec celle de Aubèle (140,
200, 360) de comparaisons de profils génétiques de cellules épithéliales issues de différents
modèles de carcinomes mammaires (in situ, invasif, métastatique) n’ont pas réussi à identifier
de signature génétique particulière en fonction du stade.
Tous ces éléments réunis laissent penser qu’en plus des propriétés intrinsèques des cellules
épithéliales, acquises au cours de l’accumulation de mutations, d’autres facteurs, comme par
exemple des modifications du stroma ou microenvironnement tumoral, peuvent aider à la
régulation de la progression tumorale d’où l’idée de la notion de switch micro
environnemental pour expliquer la progression tumorale.
Cette TMS, au vu des éléments précédemment évoqués, ne suffit plus à elle seule à expliquer
le processus de carcinogenèse. De là, est né un autre courant de pensée, qui a vu le jour bien
des années plus tard. Cette théorie alternative à la TMS, est la théorie du champ
d’organisation tissulaire (ou TOFT pour tissue organization field theory). Cette TOFT met en
avant le fait que la carcinogénèse est due à un défaut d’organisation des tissus, qui est
comparable à ce que l’on peut trouver au cours de l’organogenèse, au cours du développement
embryonnaire (331, 332). Le point de départ d’un cancer n’est donc plus uniquement une
cellule « renégate » mais plutôt une société de cellules qui composent ce que l’on appelle le
tissu cancéreux qui comprend les cellules cancéreuses et le stroma tumoral (126). Le rôle du
microenvironnement a été pressenti par Paget, qui en 1889 propose l’hypothèse du « seed and
soil » (258). Cette hypothèse avait été émise pour expliquer la sélectivité des métastases du
cancer du sein vis-à-vis de certains organes. Pour ce chirurgien, le lieu de développement
d’une métastase n’était pas une question de « chance » mais plutôt d’une affinité particulière
des cellules tumorales (seed) pour un organe (soil), pouvant fournir un contexte avantageux
de croissance à ces cellules tumorales.
Des arguments expérimentaux concernant l’implication du microenvironnement dans le
développement tumoral viennent appuyer cet état de fait. Il a été montré que le phénotype
9
néoplasique pouvait être reversé lorsque les cellules tumorales étaient placées dans un
environnement « normal » (329, 220, 27). Cela a été exemplifié par les travaux d’Illmensee et
Mintz qui ont consisté en l’injection de cellules de tératocarcinomes murins dans des
embryons de souris au stade de blastocyste. Le résultat obtenu n’est pas la formation d’une
tumeur mais plutôt le développement de souris tout à fait viables et normales, qui ont intégré
les cellules tumorales dans leurs différents tissus, lignées germinales incluses (337, 132). Les
travaux de Dolberg et Bissell ont
montré que le potentiel oncogénique des cellules
transformées par le virus du sarcome de Rous est inhibé lorsqu’on les injecte dans des
embryons de poulet (85). Si le microenvironnement « normal » peut réprimer la
carcinogenèse, on peut se demander si un microenvironnement anormal ne pourrait pas
promouvoir la carcinogenèse. Divers éléments penchent en cette faveur. Les travaux de
Maffini et al (206) démontrent que l’exposition du stroma à un agent carcinogène comme le
N-nitrosomethylurée (NMU) permettait le développement de tumeurs, que les cellules
épithéliales mammaires soient exposées ou non à ce même agent carcinogène. De même,
l’irradiation du stroma de la glande mammaire, qui entraine une modification de ce dernier,
permet la formation de tumeur à partir des cellules épithéliales mammaire pré néoplasiques
(20).
Ces travaux suggèrent donc que le microenvironnement est un puissant régulateur
(tant pour l’induction que pour l’inhibition) du processus de transformation et de progression
tumorale obtenu après l’apparition de mutations oncogéniques.
B) Définition du microenvironnement.
L’acquisition des diverses caractéristiques tumorigènes des cellules cancéreuses ne
représente donc qu’une partie de l’explication qui permet de comprendre le processus de
croissance des cancers. En effet, il est maintenant admis qu’une tumeur ne peut croitre toute
seule. Les cellules tumorales ne sont pas simplement des ilots de cellules isolées résidant dans
un organe particulier mais bel et bien une structure complexe qui se retrouve englobée dans
un environnement comprenant de la matrice extra cellulaire et une composante cellulaire
constituée de divers types cellulaires (245). Dans un tissu donné, ces facteurs du
microenvironnement coopèrent pour fournir à la fois des signaux biochimiques (facteurs de
croissance, cytokines) et des contraintes structurelles (molécules d’adhésion) qui sont requises
pour dicter des comportements cellulaires appropriés pour le tissu en question (310). La
10
progression tumorale est alors considérée comme le résultat d’un dialogue réciproque
dynamique entre cette composante du microenvironnement et les cellules tumorales (235).
C) Composition du stroma tumoral.
a. Les fibroblastes tumoraux.
Les fibroblastes sont la composante cellulaire majoritaire du microenvironnement
tumoral. Ils sont englobés dans la matrice extracellulaire et ils sont largement responsables de
la synthèse de cette dernière. Ce sont des cellules fusiformes qui sécrètent des composants de
la matrice extracellulaire comme le collagène de type I, II et V, la fibronectine (348). Ils
contribuent également à la formation de la membrane basale en sécrétant du collagène de
type IV et des laminines (52). Ils sont également source de protéases pouvant dégrader la
matrice extracellulaire créant ainsi une libération de facteurs de croissance comme le bFGF
(basic fibroblast growth factor), le TGF-β (transforming growth factor), le PDGF (platelet
derived growth factor), l’EGF (epidermal growth factor). Les MMPs (métalloprotéases)
matricielles exprimées par les fibroblastes peuvent également activer des formes latentes de
facteurs de croissance et d’autres protéases par clivage protéolytique, ce qui conduit à un
remodelage de la matrice extracellulaire (321, 143).
Le stroma normal dans la plupart des organes contient un nombre minimal de fibroblastes en
association avec une matrice extracellulaire physiologique (285). Dans un stroma activé,
comme au cours de la progression tumorale, les fibroblastes sont beaucoup plus nombreux
mais présentent aussi une modification de leur phénotype qui se traduit par l’apparition de
l’expression de l’α-smooth muscle actin (α-SMA), de la vimentine, de la desmine et de la
FAP (fibroblast activated protein) (102). Avec ces marqueurs, les fibroblastes prennent le
nom de myofibroblastes. Dans le cancer du sein, il est estimé que 80% des fibroblastes se
transforment en myofibroblastes (302). Le TGF-β ainsi que le PDGF (facteurs sécrétés par les
cellules tumorales) semblent être les principaux inducteurs de cette modification de phénotype
des fibroblastes résidents (191). L’origine de ces myofibroblastes reste encore débattue. Il a
été supposé que ces les fibroblastes péri tumoraux pourraient provenir de la prolifération des
fibroblastes résidents, suite à l’action des facteurs sécrétés par les cellules tumorales. Il a été
également supposé qu’ils pouvaient provenir de cellules musculaire lisses, de péricytes ou de
cellules tumorales ayant réalisées leur transition épithélio mésenchymateuse (78, 286). Les
myofibroblastes sont également connus pour sur-exprimer des facteurs pro migratoires
11
comme la tenascine C (138) et relarguer du VEGF (vascular endothelial growth factor) qui
recrute des cellules endothéliales et stimule l’angiogenèse (143).
Les travaux d’Olumi et de son équipe (251) ont montré que dans des modèles de xénogreffes
chez la souris, les fibroblastes associés à la tumeur conduisent à la transformation de cellules
épithéliales prostatiques immortalisées, non tumorales mais exprimant l’antigène SV40T. Les
myofibroblastes entraînant une stimulation importante de la croissance et une altération de
l’histologie de ces cellules épithéliales. Ce résultat n’étant pas retrouvé lorsque des
fibroblastes normaux sont mis en présence de ces cellules épithéliales initiées. De la même
façon, les travaux de Shekkar et de son équipe (315) ont montré que la co-culture de MCF10,
(lignée de cellules épithéliales mammaires) qui phénotypiquement sont « normales » et la
lignée MCF10AT1-EIII8 qui est pré néoplasique, avec des fibroblastes associés à la tumeur,
induit la croissance et la formation de tumeur, alors que lorsque des fibroblastes normaux sont
en jeu, cet effet n’est pas observé. D’autres travaux (195) ont aussi démontré que ces
myofibroblastes, par la sécrétion de collagène de type I, contribuaient à diminuer la sensibilité
des tumeurs aux agents chimiothérapiques. De ce fait, les tumeurs chez les souris immunisées
avec des vaccins dirigés contre la protéine FAP incorporaient davantage de molécules comme
du 5-fluo-rouracil que les souris à qui le vaccin « contrôle » avait été administré. La mise au
point de vaccins dirigés contre la protéine FAP qui est surexprimée dans ces myofibroblastes,
conduit à une diminution significative de la croissance cellulaire tumorale et à une diminution
des métastases, ayant comme résultat, la prolongation de l’espérance de vie des souris (195).
b. La composante inflammatoire.
L’abondance des cellules inflammatoires et immunes dans les tissus et les tumeurs a été
observée par les pathologistes au milieu du dix-neuvième siècle (16). En effet, en 1850,
Virchow a été le premier à décrire que l’inflammation (en condition chronique) pouvait
promouvoir la carcinogenèse. Depuis, de nombreuses études ont apporté la preuve de ce
concept. Il y a des associations de cause à effet, entre l’infection par Helicobacter pylori et le
cancer de l’estomac, du papillomavirus humain (HPV) pour le cancer du col de l’utérus, la
maladie de Crohn et le cancer colorectal (46). De plus des traitements chroniques par des antiinflammatoires non stéroïdiens réduisent les cancers (335).
-
Les macrophages associés aux tumeurs.
12
Figure 1. Les monocytes/macrophages participent à la progression tumorale.
Parmi les nombreux types cellulaires inflammatoires et les fibroblastes présents dans le stroma tumoral,
les macrophages associés aux tumeurs, sont vus comme ayant un rôle important dans la progression
tumorale. Les monocytes sont recrutés au niveau de la tumeur, se différencient en macrophage et
participent à la création du microenvironnement tumoral, en favorisant, notamment, l’angiogenèse et la
migration et la croissance des cellules tumorales. CSF-1 (colony stimulating growth factor-1), MCP1(monocyte chemoattractant protein-1), MIP-1 (macrophage inhibitor protein-1), VEGF (vascular
endothelial growth factor) (d’après Ono, Cancer Sci, 2008)
13
Ces TAM (Tumor Associated Macrophages) représentent le composant inflammatoire
majoritaire du stroma tumoral. Ils possèdent un phénotype orienté de type M2, ce qui signifie
qu’ils sont capables de sécréter de faibles quantités d’IL-12, de hautes quantités d’IL-10,
produisent des prostaglandines, du TGFβ, suppriment la réponse inflammatoire et Th1 de la
réponse immunitaire adaptative, activent l’angiogenèse et le remodelage tissulaire (212).
Des études cliniques ont montré qu’il y avait une association étroite entre l’abondance des
TAM et le mauvais pronostic des patients, pour les cancers du sein, de la prostate, du colon et
dans les cancers du col de l’utérus (186, 26). De plus, des travaux portant sur le
développement d’un vaccin visant le legumain (une endopeptidase ciblant spécifiquement les
cystéines), qui est surexprimée dans les tissus cancéreux et notamment par les TAM, ont
démontré que ce vaccin entraînait une diminution de l’angiogenèse, de la croissance tumorale
et l’apparition de métastases chez les souris traitées, en comparaison aux souris contrôles
(199). Comme le montre la figure 1 (254), les cellules tumorales expriment des cytokines
inflammatoires qui recrutent les cellules hématopoïétiques comme les lymphocytes, les
monocytes (qui deviendront macrophages lorsqu’ils se retrouveront dans les tissus) et les
neutrophiles au voisinage de la tumeur. L’expression de CCL-2 (chemokine CC-motive
ligand 2) est corrélée avec un mauvais pronostic pour le cancer du sein, du col de l’utérus et
des cancers de la vessie (186). CSF-1 (colony-stimulating factor 1), le principal facteur de
croissance et de différenciation pour les macrophages, est largement surexprimé par les
tumeurs du sein, de la prostate, de l’ovaire et de l’utérus (142). Des expériences menées avec
des souris déficientes en CSF-1 pour étudier la contribution des cellules inflammatoires dans
des tumeurs mammaires ont montré qu’il y avait une diminution de l’accumulation des
macrophages au voisinage de la tumeur et qu’il y avait un ralentissement de la progression
tumorale et une inhibition des capacités métastatiques des cellules tumorales (192).
L’accumulation des TAM a été également associée à une augmentation de l’angiogenèse avec
la production de facteurs pro angiogéniques comme le VEGF (vascular endothelial growth
factor) et le PDGF (platelet derived endothelial cell growth factor) (16). Il a été décrit que les
TAM s’accumulent dans des régions hypoxiques de la tumeur et que cette hypoxie contribue à
déclencher les programmes angiogéniques des TAM. Ceci se traduit par la sécrétion des deux
facteurs que nous venons de citer mais également d’autres molécules comme le TNF-α, le
bFGF et CXCL8 (296). La lymphangiogenèse est également accentuée par la sécrétion de
VEGF-C par les TAM dans les cancers du col de l’utérus, permettant ainsi une dissémination
des cellules tumorales avec formation de métastases lymphatiques (123). Pour conclure sur le
rôle des TAM dans la progression tumorale, ces cellules sont également décrites pour
14
exprimer des MMPs et particulièrement, la MMP-9. Chez des souris qui sont déficientes en
MMP-9, il y a un retard significatif de la formation de la tumeur avec une diminution de
l’angiogenèse (128). Ainsi en clivant les composants de la matrice extra cellulaire, la MMP-9
permet la libération de facteurs de croissances séquestrés comme le VEGF et les autres
facteurs pro angiogéniques.
- Les neutrophiles infiltrant la tumeur
Ils représentent une autre population cellulaire recrutée précocement au cours du processus
inflammatoire. Ils ont une fonction cytotoxique importante et sont considérés comme des
effecteurs de l’immunité innée anti-tumorale. Dans les cancers bronchiques de type
bronchiolo-alvéolaire, il a été décrit une infiltration neutrophilique associée à un mauvais
pronostic (23). L’utilisation d’anticorps monoclonaux dirigés contre le marqueur Gr-1 permet
l’élimination des neutrophiles dans des modèles animaux ce qui contribue à ralentir la
croissance tumorale. Ces travaux suggèrent que ces neutrophiles ont une action pro tumorale
(264). Comme pour les TAM, la cellule tumorale produirait des facteurs de croissance comme
du GM-CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor) et du G-CSF (granulocyte
colony stimulating factor) qui attireraient les neutrophiles et les rendraient résistants à
l’apoptose. Les neutrophiles quant à eux, sont capables de produire de HGF/SF (hepatocyte
growth factor/scatter factor) qui induit une augmentation de la migration des cellules
tumorales. Toujours dans des carcinomes bronchio-alvéolaire, des taux élevés de HGF/SF
ainsi qu’une infiltration de neutrophiles sont associés à une espérance de vie plus courte des
patients (366). Les neutrophiles, comme les TAM, sont également capables de participer à
l’angiogenèse avec la sécrétion de VEGF et d’IL-8 (308) ainsi qu’au remodelage de la matrice
par sécrétion de métalloprotéases (313). D’autres éléments montrent que cette population
cellulaire participe à des effets anti- tumoraux. En effet, les carcinogènes chimiques voient
leur efficacité augmenter lorsque l’on élimine les neutrophiles (224).
-
Les lymphocytes de la tumeur.
Le rôle du système immunitaire adaptatif est la reconnaissance du « non-soi », mais aussi de
permettre la destruction rapide des cellules qui ne répondent pas à cette définition. Ce système
est composé de cellules qui capturent et assurent le « traitement » de l’antigène et ensuite, le
présentent aux cellules effectrices que sont les lymphocytes T et B. L’activation de ces
cellules devrait permettre une réponse efficace aboutissant à l’élimination de la cellule
tumorale. Cependant l’efficacité de cette réponse peut être modulée par différents facteurs.
15
D’une part, il est nécessaire que la tumeur exprime à sa surface, un antigène qui puisse être
reconnu. L’apparition de ce genre d’antigène n’est pas évidente car en général les antigènes
tumoraux sont faiblement immunogènes. D’autre part, il se peut que l’environnement tumoral
ne soit pas propice au développement d’une réponse immune efficace. En effet, il existe au
niveau de la tumeur des mécanismes qui diminuent ou même abolissent la réponse antitumorale. La faible immunogénicité des cellules tumorales entraine un défaut d’induction ou
de maintien de la réponse immunitaire ou même l’apparition d’une tolérance. On observe au
niveau de certaines tumeurs, la présence de lymphocytes immunorégulateurs CD4+ CD25+ qui
représentent jusqu’à 30% de l’infiltrat leucocytaire intra-tumoral (293). De plus, des cytokines
ayant des effets inhibiteurs sur la réponse immune comme le TGF-β (transfoming growth
factor) ou l’IL-10 peuvent également être produites localement par les cellules tumorales et
par le stroma tumoral. Cet environnement peut alors favoriser la différenciation en
lymphocytes T sécréteurs de cytokines anti-inflammatoires ou encore en lymphocytes à
fonction régulatrice (60).
Plusieurs éléments expérimentaux montrent que l’immunité adaptative a un effet positif dans
la réponse anti-tumorale. In vitro, les lymphocytes CD8+ sont capables d’avoir un effet
cytotoxique en reconnaissant les antigènes tumoraux via le CMH de classe I et tuent les
cellules tumorales par lyse cellulaire. Les CD4+ peuvent également avoir une action antiangiogénique, par le biais de l’IL-4 et de l’interféron (IFN)- γ (144). Des modèles animaux
ont montré que la manipulation de la réaction immune (injection de cellules dendritiques
stimulées par l’antigène tumoral, injection de cytokines stimulant la réponse immune IL-2,
IL-12), peut être efficace en tant que thérapie anticancéreuse. Enfin, en clinique on constate
que la présence de leucocytes intra-tumoraux est associée dans certaines localisations, à un
meilleur pronostic tumoral (168, 89). Les travaux du groupe de J. Galon, font le même constat
(257). Les patients atteints d’un cancer du colon qui ont une infiltration de cellules CD8+ et
CD45+ dans la région tumorale, ont, cinq ans après le diagnostic, plus de 80% de probabilité
de survivre à leur cancer. A contrario ceux qui ont une faible densité de cette population
cellulaire n’ont que 27% de probabilité de survivre (P< 0.0001). L’analyse combinée de ces
cellules CD8+ et CD45+ pourrait donc être un outil intéressant pour la prédiction de la
récurrence tumorale ainsi que pour l’estimation de la survie des patients atteints d’un cancer
du colon à des stades précoces.
Malgré cela, les résultats obtenus chez les modèles animaux ne trouvent pas toujours d’écho
chez l’Homme. Des études cliniques montrent un effet modeste de la manipulation de la
réponse immune dans le traitement des cancers (252).
16
c. La matrice extra cellulaire.
Initialement considérée comme une structure passive qui sert de soutien, la matrice
extra cellulaire est loin d’être une structure ne servant uniquement qu’à l’ancrage des cellules.
Elle est capable de jouer un rôle actif en envoyant des signaux aux cellules qui y résident et de
moduler leur comportement par le biais d’activation de cascades de signalisation par
l’intermédiaire de récepteurs d’adhérence ou alors en modulant l’accès à certaines molécules
qui la composent (180). L’influence qu’a la matrice extra cellulaire sur les cellules
épithéliales n’est pas seulement exercée au travers des molécules de signalisation. En effet, les
travaux de Weaver et de ses collègues (261) montrent que plus la matrice est rigide, plus il y a
une augmentation de la croissance cellulaire épithéliale, une altération des protéines
d’adhésion et une perte de polarité. Ceci est dû à une augmentation des tensions sur le
cytosquelette qui induit l’agrégation des intégrines, augmentant ainsi l’activation des ERKs
(Extracellular signal Regulated Kinase-1) et la formation de points focaux d’adhésion.
Il a été aussi démontré que le remodelage de la MEC ainsi que de la membrane basale par des
enzymes comme les MMPs était plus qu’un simple remodelage qui supprime la barrière
physique qui sépare les cellules épithéliales et tout ce qui les entoure. En effet, cette
modification de la MEC permet de générer des signaux par la libération de molécules
séquestrées (235). L’uPA qui est une sérine protéase est capable de remodeler la MEC en
convertissant spécifiquement le plasminogène en plasmine, molécule active. Cette activité
protéase est dépendante du ratio entre uPA et son inhibiteur, PAI-1 (Plasminogen Activator
Inhibitor 1). L’activation de la plasmine entraîne le clivage de plusieurs composants de la
MEC comme par exemple la laminine et la fibronectine. Cette molécule peut également
activer des MMPs latentes, conduisant donc à une stimulation du remodelage (86). uPA and
PAI-1 sont aussi des marqueurs indépendants de mauvais pronostic dans les cancers du sein.
uPA promeut des effets pro métastatiques également par le fait qu’il induit la prolifération
cellulaire et la migration, qu’il altère l’adhésion cellulaire et qu’il stimule l’angiogenèse et
inhibe l’aopoptose des cellules tumorales (86).
Les composants de la MEC peuvent être clivés, dégradés ou séquestrés afin d’affecter le
comportement des cellules épithéliales comme par exemple pour les molécules comme la
fibronectine et la tesnacine-C. La tenascine-C est une glycoprotéine qui est réprimée dans les
tissus normaux mais qui est exprimée dans le stroma et en région périductale comme
marqueur pour les cancers pré invasifs et invasifs. De nombreux autres facteurs sont
17
également présents dans la MEC et sont libérés au cours de son remodelage, comme par
exemple, IGF (insulin like growth factor), TGFβ, Wnts and FGF (180). Cette MEC activée
par le biais de son remodelage est à l’origine d’une augmentation de l’invasion des cellules
tumorales. En effet, lorsque l’on isole de la MEC issue de glande mammaire qui involue et
qu’on la co-injecte avec des cellules tumorales mammaires, les MDA-MB-231, il y a
davantage de métastases qui se forment, avec un taux plus élevé d’angiogenèse tumorale,
alors que lorsque cette même expérience est réalisée avec de la MEC de glande mammaire de
rates nullipares, le phénomène est inhibé (221).
d. L’angiogenèse tumorale.
L’angiogenèse se définie comme étant le processus qui permet le développement de
nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants (280). La vascularisation est
indispensable pour apporter les nutriments et l’oxygène aux tissus. L’angiogenèse est
contrôlée par une balance entre des facteurs pro et anti-angiogéniques régulant la prolifération
et la migration des cellules endothéliales, le remodelage de la MEC. C’est un processus qui a
lieu non seulement au cours du développement embryonnaire mais aussi au cours de l’âge
adulte. En effet, ce processus est important dans les réponses de protection de l’organisme
comme par exemple la cicatrisation et l’inflammation ou durant le cycle menstruel féminin et
la grossesse. Ce processus peut aussi s’avérer néfaste dans certaines pathologies comme par
exemple le psoriasis, la dégénérescence maculaire ou les hémangiomes. Ce processus peut
également être détourné par les cellules tumorales. En effet, il est essentiel pour la croissance
des tumeurs que celles-ci aient une vascularisation efficace. Au tout début du développement
d’une tumeur, cette dernière est avasculaire et peut grandir jusqu’à une taille critique de
l’ordre de 2-3 mm3. Au delà, si la tumeur veut survivre, grandir et faire des métastases, il y a
nécessité d’une mise en place d’un réseau vasculaire. C’est d’après les travaux pionniers de
Judah Folkman que cette règle a été établie (98). L’initiation de ce processus d’angiogenèse,
qui résulte du déséquilibre entre les facteurs pro et anti-angiogéniques, porte le nom de switch
angiogénique et intègre une série d’évènements comme la sécrétion de facteurs pro
angiogéniques, l’activation de cellules endothéliales, la sécrétion d’enzymes protéolytiques
suivie par la dégradation de la membrane basale et de la MEC, la prolifération des cellules
endothéliales, leur migration et la formation de néo vaisseaux. Les facteurs pro angiogéniques
18
(voir tableau ci-dessous) n’ont pas comme seule source, les cellules tumorales. Les diverses
populations cellulaires que l’on retrouve dans le stroma comme les fibroblastes et les
macrophages sont également capables de les sécréter.
Facteurs pro angiogéniques
Facteurs anti angiogéniques
Facteurs de croissance :
VEGF, récepteurs du VEGF, FGF2, EGF,
PDGF, HGF/SF, TGF-α et TGF-β, TNF-α
Glycoprotéines de la matrice :
Trombospondine 1et 2
Fragment de dégradation du collagène :
Angiostatine, endostatine,
Protéases :
Cathepsine, métalloprotéases, uPA
Cytokines :
IFN-α et IFN-β, IP-10, IL-12, IL-18
Cytokines :
IL-1, IL-6, IL-8, MCP-1
Inhibiteurs des facteurs de croissance :
Récepteurs solubles du VEGFR,
angiopoiétine
Autres :
Angiopoïétine, intégrines, hypoxie.
Tableau 1 : Facteurs impliqués dans la régulation de l’angiogenèse.
Cette néo-angiogenèse diminue le taux de cellules nécrotiques, augmente la concentration en
facteurs de croissance, ce qui entraîne une augmentation de la taille de la tumeur (120). A côté
de ses effets sur la croissance tumorale, l’angiogénèse offre également un moyen
d’échappement à la tumeur. En effet, les néo vaisseaux tumoraux présentent des
malformations telle qu’une membrane basale fragmentée qui laisse place à une perméabilité
augmentée permettant une entrée facilitée des cellules tumorales dans la circulation sanguine,
ce qui favorise la formation de métastases (115). Les mécanismes moléculaires qui rentrent en
jeu au cours de l’angiogenèse tumorale font intervenir le facteur de transcription HIF-1α
(Hypoxia Inducible Factor-1). En réponse à un stress hypoxique comme c’est le cas dans les
premiers stades de développement des tumeurs, HIF-1α stimule l’expression de gènes cibles
comme le vegf-A, l’érythropoïétine, et les enzymes glycolytiques comme le transporteur du
glucose Glut-1 (283). Dans les TAM, l’adaptation à l’hypoxie se traduit par une augmentation
de l’expression de gènes inductibles de l’hypoxie comme hif-1 et hif-2, ce qui a pour
conséquence, l’activation de gène cibles comme b-EGF, β-FGF et CXCL8, molécules proangiogéniques (237). Les stratégies anti-angiogéniques dans le traitement de divers cancers
dénotent l’importance de l’angiogenèse dans la promotion de la croissance tumorale, la
19
migration et les propriétés métastatiques des cellules cancéreuses. En effet, l’utilisation d’un
anticorps monoclonal humanisé, le bevacizumab, dirigé contre le VEGF se révèle être
efficace pour le traitement de plusieurs cancers, et notamment, les cancers colo-rectaux. Des
améliorations significatives dans les taux de réponse et la survie étant retrouvées, que cet
anticorps soit combiné ou non à l’utilisation du paclitaxel. D’autres agents antiangiogéniques, comme le sunitinib, sont à l’étude car cette molécule inhibe l’activité tyrosine
kinase du récepteur pour le VEGF (pour revue (117)).
Au vu de tous ces éléments, il apparait évident que le microenvironnement joue un rôle
important dans le comportement des cellules épithéliales, que ce soit dans un contexte
physiologique ou au cours de la progression tumorale (363 , 235). Pour le sujet qui nous
concerne, à savoir le rôle des adipocytes dans la progression tumorale mammaire, nous allons
décrire plus précisément dans le chapitre qui suit l’implication du tissu adipeux, et par
extension, l’implication de l’adipocyte dans le processus cancéreux, même si ce type
cellulaire a été longtemps ignoré en oncologie.
20
Figure 2. Représentation classique du stroma tumoral. Composé au départ de divers types cellulaires tels
que des macrophages, des fibroblastes, des vaisseaux sanguins, le stroma va subir d’importantes modifications,
au cours de la progression tumorale. Les fibroblastes vont s’activer, devenant ainsi des myofibroblastes, et le
nombre de macrophages augmente également, ce qui se traduit par une augmentation de la sécrétion de
facteurs de croissance, de composants de la matrice extra cellulaire, et de métalloprotéases. (d’après Vargogogola et al, Nature Reviews cancer, 2007)
a
b
Figure 3. L’adipocyte: type cellulaire majoritaire du stroma mammaire. (panneau de gauche) schéma d’une
coupe sagittale de sein chez la femme, démontrant que le tissu adipeux, et par extension, l’adipocyte, est un
composant majeur du stroma mammaire.(d’après le site medecin.skyrock.com). (panneau de droite) coupe
histologique de glande mammaire dans un contexte normal (a) ou tumoral (b). (A) adipocyte, (C) centre de la
tumeur, (F) front invasif, (G) glande mammaire (d’après Andarawewa et al, Cancer Res, 2005)
21
II) Adipocytes et cancer
Contrairement à tous les facteurs qui ont été cités précédemment et où les interactions
entre les cellules tumorales et ces divers constituants ont été étudiées, parmi les études qui
portent sur le microenvironnement, peu nombreuses sont celles qui font référence au tissu
adipeux et par extension à l’adipocyte((307). Comme le montre la figure 2, ce type cellulaire,
dans les revues générales consacrées au microenvironnement tumoral, n’est pas souvent
représenté et semble être la cellule oubliée des cancérologues. Pourtant l’adipocyte représente
le composant cellulaire majoritaire du stroma mammaire (comme l’indiquent le schéma d’une
coupe sagittale de sein ainsi que la coupe histologique, figure 3). Même si les premiers stades
de carcinogenèse lors de cancers du sein prennent place dans un environnement riche en
adipocytes, les études sur les interactions entre les cellules tumorales et les adipocytes restent
peu connues sans doute à cause du fait que l’adipocyte a été très longtemps considéré comme
une cellule inerte, uniquement capable de stocker des lipides. Depuis la découverte de la
leptine, la vision de l’adipocyte en tant que cellule stockeuse de graisse a radicalement
changé, et des études récentes se sont intéressées aux sécrétions adipocytaires. C’est
notamment le cas d’une étude menée en 2005 par Celis et al (50) qui a eu pour objet l’analyse
protéomique de tissus adipeux à distance ou à proximité de la tumeur a été réalisée sur des
patientes atteintes de cancer du sein. Dans leur approche, 359 protéines du tissu adipeux, ont
été identifiées et impliquées dans les fonctions métaboliques de l’adipocyte. Cette étude ouvre
donc la voie sur la caractérisation moléculaire des interactions qu’il existe entre les adipocytes
et les cellules épithéliales, et ceci dans un contexte péri tumoral où la réorganisation tissulaire
est courante.
A) Le tissu adipeux.
a. Généralités sur le tissu adipeux.
Il existe deux sortes de tissus adipeux : le tissu adipeux brun qui disparaît rapidement
après la naissance chez l’Homme et le tissu adipeux blanc. Ce dernier est largement distribué
dans l’organisme et un individu de poids normal possède de 10 à 25% de masse grasse. En
dehors de sa fonction structurale, le tissu adipeux blanc a un rôle métabolique essentiel :
c’est le site de stockage des réserves énergétiques en période d’apport calorique et de
22
ADIPOBLASTE
S
Prolifératio
n
CONFLUENCE
Expression des marqueurs
précoces
(LPL, CEBP et , PPAR
PREADIPOCYTE
S
Mitoses postconfluentes
Expansion clonale
ARRET DE LA CROISSANCE
DIFFERENCIATION
TERMINALE
Différenciation
précoce
(C/EBP , PPARγ…)
Différenciation tardive
(GAPDH, GLUT-4, FAS, LHS,
ACC…)
Différenciation très
tardive
(adipsine…. )
Figure 4: Processus séquentiel de la différenciation adipocytaire
(d’après Valet et Richard, « les lipides et la cellules adipeuse », Nathan
Edition)
23
mobilisation des lipides de réserves lorsque les apports font défaut (176). L’adipocyte est la
principale cellule qui compose le tissu adipeux. Cellule originale par sa morphologie puisque
c’est une cellule ronde qui peut être volumineuse (d’une vingtaine de micromètres à deux
cents micromètres pour les plus grosses), qui a peu de cytoplasme et qui stocke ses réserves
énergétiques sous forme de triglycérides au sein d’une large vacuole qui occupe la quasitotalité de la cellule. Représentant l’essentiel de la masse du tissu adipeux, l’adipocyte n’en
est pas le seul constituant. En effet, un nombre important d’autres cellules composent ce que
l’on appelle la partie stroma-vasculaire du tissu. On y retrouve des précurseurs adipocytaires
nommés préadipocytes, des cellules endothéliales, des cellules sanguines provenant de la
vascularisation du tissu ainsi qu’un nombre important de fibroblastes, macrophages ainsi que
des terminaisons nerveuses (368). Le tissu adipeux est un organe qui se développe
tardivement au cours de la vie. Chez l’humain, il commence à apparaître seulement pendant la
deuxième partie de la gestation. Il faut distinguer deux types de développement : un
développement normal du tissu qui a lieu principalement après la naissance, pendant l’enfance
et l’adolescence, où le tissu acquiert un nombre défini d’adipocytes matures, et un
développement pathologique du tissu qui caractérise l’état d’obésité. L’acquisition d’un
phénotype d’adipocyte mature provient de la différenciation de précurseurs adipocytaires
appelés préadipocytes.
b. Naissance d’un adipocyte : la différenciation adipocytaire.
Le processus de différenciation adipocytaire conduit à une modification morphologique
importante de la cellule car l’on passe d’une cellule de type fibroblastique (petite cellule de
forme allongée) à un adipocyte (grosse cellule de forme ronde). Ces modifications
s’accompagnent de changements d’expression génique, avec l’apparition progressive de
marqueurs adipocytaires (figure 4). La différence entre adipoblaste et préadipocyte est très
mince car aucun critère morphologique ne permet de les différencier. La mention de pré
adipocyte est convenable lorsque les cellules commencent à exprimer certains marqueurs très
précoces de la différenciation adipocytaire comme la LPL (lipo protéine lipase), les facteurs
de transcription C/EBP β et δ (CCAAT/ enhancer-binding protein), PPARδ (peroxysome
proliferator-activated receptor). Jusqu’à ce stade, les cellules possèdent la capacité de
proliférer. Après être arrivés à confluence, les pré-adipocytes s’engagent dans la
différenciation qui aboutit à la formation de l’adipocyte. Lors de cette différenciation, les pré
adipocytes subissent quelques mitoses post confluentes et acquièrent des marqueurs de la
24
différenciation. Pour les marqueurs précoces : C/EBP α et PPARγ et pour les marqueurs
tardifs FAS (fatty acid synthase), LHS (lipase hormono sensible. Une fois que l’ensemble de
ces propriétés métaboliques est acquis, les adipocytes néoformés commencent à accumuler
des lipides qui sont d’abord stockés dans de petites gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme.
Ces gouttelettes vont fusionner entre elles pour laisser place à une unique vacuole lipidique
qui va occuper la quasi-totalité du contenu de la cellule, repoussant le cytoplasme et le noyau
à la périphérie de la cellule (238). La différenciation adipocytaire s’étudie in vitro grâce aux
lignées préadipocytaires, les 3T3-L1 et les 3T3-F442A établies à partir du sous-clonage de la
lignée fibroblastique 3T3, provenant d’embryon de souris Swiss (108). La différenciation
adipocytaire est sous le contrôle de nombreux facteurs de transcriptions dont les principaux
sont représentés par différents membres de la famille de PPAR et des C/EBP. Les C/EBP
n’ont pas de ligand et s’activent par homo-dimérisation ou hétéro-dimérisation avec les
différents membres de la famille C/EBP. Les PPAR appartiennent à la famille des récepteurs
nucléaires. Ils sont activés par certains acides gras et doivent s’hétéro-dimériser avec le
récepteur de l’acide rétinoïque RXR. Lors de phases précoces, C/EBP β et C/EBP δ sont les
premiers à être induits. Leur induction transitoire permet l’apparition des deux facteurs de
transcription majeurs de l’adipogenèse que sont C/EBP α et PPAR γ. Ces deux facteurs
activés participent à la transcription de nombreux gènes codant pour des protéines impliquées
dans le métabolisme adipocytaire.
B) Rôle physiologique du tissu adipeux.
Au cours du développement complet de la glande mammaire, celle-ci va devoir subir de
nombreux changements. Comme le montre le schéma de la coupe sagittale, le sein se
compose de l’épithélium mammaire qui est entouré par des tissus conjonctifs qui eux même
sont entourés par du tissu adipeux. Après la naissance et avant la puberté, la glande mammaire
est composée du tissu adipeux et d’un réseau quelque peu limité d’épithélium ductal (75). Au
début de la puberté, quand la glande est remplie par de larges adipocytes contenant une
grande vacuole, l’épithélium s’étend et envahi le compartiment graisseux environnant en
formant des ramifications appelée « end bud » (125). Durant la grossesse, l’expansion
épithéliale est concomitante à une apparente réduction (sur critère morphologique) du nombre
d’adipocytes. Durant la lactation, les lipides sont mobilisés et proviennent des adipocytes qui
deviennent des cellules allongées qui présentent de nombreuses petites gouttelettes lipidiques
(241). Après le sevrage, les cellules sécrétrices de l’épithélium mammaire rentrent en
25
apoptose et des adipocytes matures repeuplent la glande (339). Il apparait donc que
l’environnement de la glande conditionne le comportement de l’épithélium mammaire. Il est
tout de même important de reconnaître que ce que l’on appelle le fat pad, n’est pas
uniquement constitué d’adipocytes mais qu’il y a également d’autres types cellules comme
des fibroblastes, des cellules endothéliales, et des cellules du système immunitaire.
Cependant, les effets spécifiques de la composante graisseuse de ce stroma mammaire ont été
décrits par divers travaux qui suggèrent que les réponses morphogénétiques sont directement
ou indirectement dues à cette composante graisseuse.
Par exemple des travaux sur des MEO (mammary epithelial organoid) de rates pubères
montrent que lorsque ces structures sont cultivées avec des adipocytes mammaires, il y a une
accumulation de lipides et de caséine dans ces MEO. De plus, les adipocytes induisent dans
ces MEO l’apparition de structures alvéolaires et augmentent la taille du lumen. Ces éléments
démontrent donc que les changements morphologiques et fonctionnels de l’épithélium
mammaire est accru par l’action des adipocytes et que ces effets sont transmis via des signaux
paracrines, car les travaux ont été réalisés dans des systèmes de coculture en chambre boyden
(75). D’autres travaux menés par Levine et Stockdale (190) montrent que les adipocytes issus
de la différenciation des 3T3-L1 stimulent la croissance cellulaire de l’épithélium mammaire
(expérience d’incorporation de thymidine tritiée) de souris à mi gestation. En effet, les
cellules épithéliales forment de plus grandes colonies lorsqu’elles sont co-cultivées avec ces
adipocytes que lorsqu’elles sont cultivées sur des structures plastiques. De plus, du milieu
conditionné de ces adipocytes issus de la différenciation des 3T3-L1 augmente également la
croissance cellulaire en comparaison à la croissance des cellules épithéliales avec du milieu
non conditionné. Les travaux de Beck et de ses collègues ont donné des résultats comparables,
avec des cellules épithéliales normales, issues de souris balb/c qui sont traitées ou non avec du
milieu conditionné d’adipocytes isolés ou d’explants graisseux mammaires. Ce qui suggère
donc que les effets observés sont induits grâce à des facteurs diffusibles dérivés de ce tissu
graisseux (22).
Le tissu adipeux est aussi reconnu pour être une source de lipides pour les cellules
épithéliales. Avec un régime déficient en acides gras essentiels, il y a un défaut de la
croissance de l’épithélium mammaire et une régression alvéolaire tandis qu’un régime riche
en acides gras insaturés promeut à la fois la croissance de ce même tissu et la tumorigenèse
(362). De plus, les acides gras insaturés ainsi que leurs dérivés augmentent la capacité de
croissance de l’épithélium en réponse à des facteurs de croissance comme l’IGF-1 (insuline
growth factor-1) et l’EGF (epidermal growth factor) (124). Pour terminer, dans des modèles
26
de souris transgéniques, les A-ZIP/F1, qui sont dépourvues de tissu adipeux, il y a un
développement tout à fait rudimentaire de l’épithélium mammaire. Lorsque ces souris sont
gestantes, il y a tout de même un développement de l’épithélium, ce qui suggère que la
composante graisseuse est nécessaire pour le développement mais pas pour la différenciation
(69). De plus, pour les expériences de morphogenèse mammaire, l’utilisation de tissu
graisseux dépourvu de son épithélium mammaire (epithelium-free mammary fat pad) est
devenue un modèle de référence (314).
C) Rôle physiopathologique du tissu adipeux dans le cancer
a. Preuves de l’implication des adipocytes associés aux tumeurs dans la progression
tumorale
A partir des années 90, un certain nombre de travaux ont tenté de démontrer comment le
tissu adipeux mammaire pouvait contribuer au développement du cancer du sein.
Les travaux d’Elliott et al (91) ont montré qu’un environnement riche en adipocytes facilitait
la croissance de cellules tumorales murines, la lignée SP1, après leur injection chez des souris.
Quand les SP1 ont été injectées en sous-cutané ou dans la cavité péritonéale, mais à distance
de dépôts graisseux, il n’y avait pas de croissance ni de formation de métastases. Par contre,
l’addition de tissu graisseux aux cellules tumorales lors de l’injection, dans les mêmes
territoires, a permis la croissance de la tumeur et aussi à la formation de métastases. Ce
phénomène de croissance est dépendant des estrogènes. Des expériences de co-culture avec
des adipocytes matures et des MCF-7 (lignée positive pour le récepteur aux œstrogènes)
montrent que les adipocytes sont capables de stimuler la croissance des cellules tumorales,
contrairement aux pré-adipocytes qui eux, n’ont pas cette capacité (211). D’autres travaux,
ceux d’Amemori et al (5) suggèrent que les pré-adipocytes et les adipocytes sont capables de
stimuler la prolifération des cellules cancéreuses du colon. Toutefois ces effets pro
prolifératifs des adipocytes matures ne sont pas retrouvés pour des adipocytes matures de
souris ob/ob déficiente pour la leptine, ce qui suggère que la leptine serait responsable de cet
effet favorisant la croissance tumorale. Les travaux d’Iyengar et al ont montré, quant à eux,
que le milieu conditionné d’adipocytes (milieu de culture des adipocytes qui contient leurs
sécrétions) pouvait induire la transcription de facteurs impliqués dans les processus antiapoptotiques ainsi que des voies impliquées dans la stabilisation de proto-oncogènes dans des
27
cellules tumorales qui sont traitées par ce milieu conditionné. Le milieu conditionné induisait
la transcription de voies impliquées dans la promotion de la tumorigenèse incluant la
prolifération cellulaire (IGF2, FOS, JUN, et la cycline D1, NFκB, CDK6), le potentiel invasif
(MMP1, ATF3), la survie (A20, NFκB) et l’angiogenèse (135). De plus, la co-injection, in
vivo d’adipocytes matures et de SUM159PT (lignée négative pour le récepteur aux
estrogènes) permet une stimulation de la croissance tumorale alors que ces mêmes cellules
tumorales co-injectées avec des pré adipocytes croissent de manière moins importante.
L’importance que révèlent les facteurs sécrétés par les adipocytes dans la biologie des cancers
est appuyée par le fait qu’ils sont connus comme étant capables de générer une matrice
extracellulaire par la sécrétion et le clivage du collagène VI (136). Cette protéine est
abondamment exprimée et sécrétée par les adipocytes et agit comme un facteur induisant la
croissance par le biais du récepteur AGC1R. La stimulation de ce récepteur par le collagène
VI active la phosphorylation de la GSK3β, ce qui active la β-caténine et stabilise la cycline
D1. Les souris déficientes pour le collagène VI présentent des taux réduits de croissance
tumorale et d’hyperplasie. Le produit de clivage du collagène VI, la chaîne α 3 a des effets
stimulateurs sur la croissance cellulaire des MCF-7 (136). D’autres travaux suggèrent que les
cellules de la fraction stroma vasculaire du tissu adipeux sont capables de promouvoir la
migration et l’invasion, dépendante de l’IL-6, de cellules cancéreuses négatives pour le
récepteur aux estrogènes (358). Les travaux d’Andarawena et al démontrent que
les
adipocytes associés à la tumeur expriment une protéase, la MMP-11, qui participe d’une part
à l’homéostasie adipocytaire ainsi qu’à la progression tumorale. En effet, cette protéine a été
décrite comme étant sur exprimée dans les tumeurs primaires du sein. Le taux d’ARNm ou le
taux de la protéine étant associé à un mauvais pronostic. L’expression de cette protéine est
limitée aux fibroblastes qui entourent la tumeur. Autour des tumeurs mammaires, il se forme
ce que l’on appelle, la réaction desmoplastique qui se caractérise par un ratio fibroblastes
/adipocytes qui est élevé. Au cours de ses travaux (7) il a été montré qu’une population de
fibroblastes péri tumoraux n’exprimait pas l’α-SMA mais la MMP-11. Cette protéine régulant
négativement l’homéostasie du tissu adipeux, il est tout à fait envisageable de conclure que
des adipocytes sur exprimant cette protéine sont à l’origine des fibroblastes participant à la
réaction desmoplastique. La coinjection de MCF-7 et de fibroblastes MMP-11+/+ en sous
cutané chez les souris nude, entraîne un développement tumoral plus rapide ainsi que des
tumeurs de taille plus importante, en comparaison à la co-injection de MCF-7 et de
fibroblastes MMP-11-/- (215). Les travaux de Noël et al (246) ont montré que cette protéine
surexprimée dans les MCF-7 permettait une prise tumorale plus rapide menant à une
28
augmentation de l’incidence tumorale. De plus il avait été suggéré que cette métalloprotéase
favorisait la survie des cellules cancéreuses dans un environnement qui n’était pas permissif
initialement pour la croissance tumorale. En effet, la MMP-11 est impliquée dans le
remodelage de la matrice extra cellulaire car des expériences avec des MCF-7 exprimant cette
protéine, injectées avec du matrigel pourvu des facteurs de croissances habituels, avaient une
croissance tumorale conséquente, en comparaison à la co-injection de ces mêmes cellules
avec un matrigel dépourvu de facteurs de croissances. Ceci suggère donc que cette protéine
permet une croissance tumorale adéquate grâce à ses activités protéolytiques (244).
b. Les sécrétions adipocytaires impliquées dans la progression tumorale.
Ce n’est que depuis la découverte de la leptine en 1994 par le groupe de Friedman que
le tissu adipeux a réellement changé de statut. En effet, il n’est plus simplement considéré
comme étant un tissu capable de stocker et de mobiliser les réserves énergétiques sous forme
de triglycérides et d’acides gras, mais comme un tissu également capable de synthétiser et de
sécréter de véritables hormones agissant localement et par la circulation sur des fonctions
aussi variées que la prise alimentaire, la métabolisme glucidique et lipidique. Par la suite, de
nombreuses autres molécules ont été identifiées dans les sécrétions des adipocytes. Beaucoup
de ces sécrétions sont d’origine protéique (leptine, adiponectine….) mais on trouve également
des médiateurs lipidiques comme les acides gras non estérifiés. La plupart des facteurs
protéiques appartiennent à la famille des cytokines (protéines solubles biologiquement actives
provenant ou non de cellules immunitaires) et l’utilisation du terme adipokines est
fréquemment employé pour désigner ces facteurs sécrétés par le tissu adipeux.
Un nombre important d’études épidémiologiques suggèrent que le tissu adipeux aurait un rôle
important mais encore controversé dans l’apparition et le pronostic de nombreux cancers
(307), et que ce rôle dépendrait de ces sécrétions, dont nous allons décrire les principales
-
La leptine
La leptine est une protéine de 16 kDa et qui a été isolée pour la toute première fois en
1994 par Zhang et al (380). C’est une adipokine produite de manière prédominante par les
tissus adipeux. Des études ont montré qu’il y avait une corrélation positive entre les taux
circulants de leptine et la quantité totale de tissu graisseux dans l’organisme. En effet, la
29
C- Augmentation
de la synthèse d’estradiol
leptin
ee
E- Réduction de la
LEP
dégradation
par le protéasome du REαR
E
E
P
leptin
e
A- Activation du
LEPR
P
JAK2
JAK2
E
Shc
Grb2
P
P
SOS
Ras
ER
Dégradation
par le
protéasome
PI3K
Akt
E
Raf
MAP3K
B- Inhibition
de
ERK1 et 2
GSK3
ER
leptin
e
STAT3
ER
ERK1/2
STAT3
Adiponectine
STAT3
Prolifération
Adiponectine
Survie
Adiponectine
Migration
D- Activation de la voie passant par
REα
Figure 5. Les différentes voies de signalisation qu’utilise la leptine pour activer la prolifération
et la survie cellulaire.
30
leptinémie est plus élevée chez des individus obèses que chez les individus minces (66). La
leptine induit ses effets en se liant à son récepteur, qui présente plusieurs isoformes, qui sont
le résultat d’un épissage alternatif du gène Ob-R. Les deux principales isoformes, Ob-Ra et
Ob-Rb, sont exprimées ubiquitairement chez l’homme et la souris (201, 118). De nombreuses
études épidémiologiques ont fait état d’une corrélation positive entre la quantité de leptine et
la progression de divers cancers, comme par exemple le cancer du côlon (334), de la prostate
(54) mais aussi, le cancer du sein (228). En effet, comme le montre le schéma de la figure 5,
la leptine est capable d’intervenir à de nombreux niveaux. D’une part, elle est reconnue
comme étant capable de stimuler la croissance de nombreuses lignées cellulaires et aussi la
prolifération de cellules épithéliales du sein qu’elles soient normales ou cancéreuses, via
l’activation de la voie ERK1 et ERK2 et de la voie JAK2-STAT3 (Janus Kinase 2 -signal
transducer and activator of transcription 3) (103) (figure 5A). La voie de survie PI3K-AktGSK3 (phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B-glycogen synthase kinase 3) est aussi
activée par la leptine dans les cancers du sein (103). De plus, la leptine augmente la
croissance de lignées cancéreuses du sein comme les T47D et les HBL100 (127). Enfin, la
leptine est capable de réguler positivement l’activité aromatase dans les MCF-7 ce qui conduit
à l’augmentation de la production d’œstradiol (à partir des androgènes circulants), ce qui
promeut également la prolifération (figure 5C). Le récepteur α aux estrogènes (REα) peut être
transcriptionellement activé en l’absence de son ligand et la leptine peut directement stimuler
le REα au travers de la voie dépendante des MAP Kinases (47). Par ce biais, la leptine
pourrait donc interférer avec les thérapies anti oestrogéniques utilisées pour traiter les tumeurs
positives pour le récepteur aux œstrogènes (figure 5D). Les anti-oestrogéniques sont utilisés
car ils entraînent la dégradation par le protéasome de ce récepteur aux estrogènes. La leptine
en diminuant l’ubiquitinilation de ce récepteur, diminue l’efficacité de cette stratégie (figure
5E). Les travaux de Chen et al (56) utilisant des cellules positives pour le récepteur aux
œstrogènes comme les ZR-75-1, ont montré que la leptine induit l’expression de protéines
impliquées dans la régulation du cycle comme c-myc et la cyclin D1. La leptine pourrait
également réprimer l’expression du répresseur de tumeur, p53, ce qui aurait pour conséquence
d’augmenter la croissance de ces cellules. D’autres travaux ont également montré que la
leptine induisait la migration et l’invasion de cellules C6 de gliomes en augmentant la
production de MMP-13 (375). De plus, il semblerait que la leptine soit également liée à des
processus angiogéniques. En effet, les travaux de Gonzales et al (106) ont montré que la
leptine induisait une augmentation de l’expression du VEGF, principal médiateur de
l’angiogenèse, et de son récepteur, VEGFR-2 dans des tumeurs mammaires de souris.
31
D’autres travaux ont montré que la leptine induisait la formation de tubes de la part des
cellules endothéliales traitées par la leptine, formant ainsi un réseau réticulé évocateur d’un
réseau vasculaire (319). Les travaux de Somasundar et al (328) ont aussi démontré que la
leptine induisait la sécrétion de facteurs de croissances qui étaient associés à la migration de
cellules cancéreuses prostatiques et à une angiogenèse accrue.
Pour terminer, bien que les adipocytes soient de grands producteurs de leptine, cette dernière
peut également être sécrétée par des pré-adipocytes qui sous l’influence des cytokines proinflammatoires comme le TNF-α et l’IL-1β provenant des macrophages infiltrés du tissu
adipeux lors de l’obésité, induisent la sécrétion de cette protéine (322). Les cellules
épithéliales sont également capables d’exprimer cette protéine. Ishikawa et al (134) ont
montré que la leptine était présente à la fois dans des cellules épithéliales normales et dans les
carcinomes et que dans 92% des cas de cancers qui ont été analysés, il y a une surexpression
de la leptine dans les tumeurs. Toutefois, les travaux de Chen et al (57) ont montré que
l’excision de tumeur (productrice de leptine) n’avait pas d’incidence sur le taux circulant de
cette protéine chez des patientes atteintes d’un cancer du sein, ce qui suggère que le tissu
adipeux est le producteur majeur de cette protéine. Une autre étude menée par Miyoshi et al
(227) a montré que l’association entre une forte expression du récepteur à la leptine dans les
tumeurs et une importante quantité de leptine dans le sérum ou une importante expression de
l’ARNm de la leptine dans la tumeur, étaient associées à un mauvais pronostic puisque la voie
impliquant la leptine est associée à la stimulation de la croissance des cellules du cancer du
sein.
-
L’adiponectine (ApN)
L’adiponectine est un polypeptide de 30 kDa spécifiquement sécrété par les
adipocytes, qui dans la circulation, peut se retrouver sous différentes isoformes. La liaison de
l’ApN sur son récepteur (qui sont au nombre de deux, AdiopR1 et AdipoR2 qui lient des
formes bien spécifique de l’ApN et qui ont des localisations particulières) active la voie de
l’Adénosine monophosphate (AMP)- activated protein kinase ainsi que la voie impliquant
PPAR-γ (201). Cette protéine est connue pour avoir des effets insulino-mimétiques mais
également des effets anti-inflammatoires et anti-prolifératifs
Le rôle de l’ApN dans l’étiologie des cancers n’est pas totalement élucidé. Il a été pourtant
montré qu’une relation inverse entre les taux de cette protéine dans les sérums de patients et le
risque de développer un cancer du sein, de l’endomètre, de la prostate, un cancer colorectal ou
32
du rein, existe (213, 327, 104, 333). Parmi ces études, une a montré qu’une association
inverse entre l’ApN était indépendante de l’indice de masse corporel (213) Les travaux de
Kang et al (147)) ont montré que le traitement par l’ApN sur des MDA-MB-231 (lignée de
cancer du sein REα négative) supprimait la prolifération de ces cellules et causait un arrêt de
la croissance avec à terme une entrée en apoptose, tandis que pour des lignées RE+, il n’y
avait pas d’effet. La présence ou l’absence d’effet antiprolifératif de l’ApN sur les cellules de
cancer du sein dépendant très certainement de l’expression spécifique des récepteurs de cette
protéine. En effet, il existe des résultats contradictoires obtenus par Dieudonne et al (83))avec
des MCF-7 (lignée cancer du sein RE+) qui expriment AdipoR1 et AdipoR2. Le traitement
par l’ApN induit une activation de la voie AMP-activated kinase et l’inactivation de la voie
MAP Kinase1 et 3 et ERK2 et 1 (extracellular signal-regulated kinases 2 et 1), qui sont
potentiellement des signaux de transduction pour réguler des effets antiprolifératifs
mentionnées précédemment. Il a été également décrit que le taux d’ApN était négativement
corrélé à l’IMC et au niveau d’hypoxie (55). Les travaux d’Otani et al (255) prouvent que le
traitement avec l’ApN réduit significativement le nombre de polypes adénomateux, surtout
ceux qui font plus de 2 mm de diamètre, dans l’intestin grêle de souris C57BL/6J-ApcMin/+ qui
possèdent une mutation sur le gène Apc (adenomatous polyposis coli) reconnue comme
provoquant le syndrome familial des polypes adenomateux.
Les travaux de Brakenhielm (33) montrent que l’ApN supprime la croissance des cellules
endothéliales des micro-vaisseaux et ceci par une activation de la cascade des caspases. Dans
la même étude, l’infusion d’ApN dans des fibrosarcomes de souris, hautement vascularisés,
entraîne la suppression de la croissance tumorale, ceci étant lié à la perte des cellules
endothéliales. Les travaux de Scherer et de son équipe (179) viennent appuyer ces
conclusions. Pour eux également, l’ApN est un facteur important pour la progression et
l’angiogenèse tumorale. Des souris qui sont déficientes en ApN, présentent un ralentissement
de la croissance tumorale aux stades précoces du développement tumoral. Cependant, le stress
angiogénique qu’impose l’absence de cette protéine, conduit à une réponse adaptative qui
alimente la tumeur grâce à la mobilisation des progéniteurs endothéliaux circulants.
-
Le Tumor necrosis factor alpha (TNF-α)
Le TNF-α circulant se compose de plusieurs sous-unités de 17kDa chacune. Ces sousunités sont tout d’abord sécrétées sous forme de précurseur transmembranaire de 26 kDa
(pour revue (67)) qui va subir un clivage protéolytique grâce à une métalloprotéase, connue
33
sous le nom de TNF-α converting enzyme. Une fois générée, la forme soluble du TNF-α est
capable de se lier avec ses récepteurs, les TNF-R 1 et 2. Le TNFR1 est exprimé dans de très
nombreux types cellulaires alors que le TNFR2 est exprimé en grande partie dans les cellules
hématopoïétiques. Le TNFR1 est activé par le ligand soluble alors que le TNFR2 est
principalement activé par la forme de TNF-α qui est transmembranaire (15). Le TNF-α est la
cytokine qui a été la plus étudiée dans le tissu adipeux. Ce facteur a été initialement décrit
comme étant sécrété par l’adipocyte (122) et impliqué dans le développement de l’insulino
resistance. D’autres auteurs ont montré que chez l’homme, la sécrétion de ce facteur était
davantage due aux cellules composant la fraction du stroma vasculaire et de la fraction
matricielle comprenant les macrophages, et ceci malgré le fait que la plupart des ARNm du
TNF-α soient retrouvés dans les adipocytes (95, 361). Ainsi, les macrophages activés qui
s’infiltrent dans le tissu adipeux au cours de l’obésité seraient de grands producteurs de cette
cytokine.
Le TNF-α est une cytokine qui est impliquée dans un grand nombre de processus. Elle a été
décrite comme étant impliquée dans la réponse inflammatoire immune innée. Des souris qui
sont invalidées pour le TNFα ou pour le TNFR1, présentent une hypersensibilité aux agents
irritants et sont sensibles à tout un panel de pathogènes. Les travaux menés sur ces souris
montrent que l’axe TNFα/TNFR1 est essentiel à la survie des infections par les pathogènes
comme le toxoplasme, la listeria (pour revue (15)). La dérégulation locale de la production de
cette cytokine est une caractéristique des maladies comme l’arthrite rhumatoïde, le syndrome
du colon irritable. En plus de ces effets, il a été décrit un rôle de cette cytokine dans le
processus de carcinogenèse. Au départ, cette cytokine a été décrite comme étant capable
d’induire la nécrose des cellules tumorales et cela a nourrit l’idée que cette cytokine avait des
propriétés anticancéreuses (45). Malheureusement au cours de ces dernières années, le rôle du
TNF-α dans les processus malins a été reconsidéré, et les travaux suggèrent maintenant que
cette cytokine est impliquée dans la progression tumorale. En effet, le groupe de Balkwill
(175) a montré que les cellules tumorales qui étaient capables d’avoir une production
constitutive de cette cytokine, présentaient une capacité plus importante à former des
métastases ainsi qu’à stimuler un réseau de facteurs impliqués dans la progression tumorale
comme par exemple, l’IL-6, MIF (macrophage migration-inhibitory factor), le VEGF, ainsi
que l’axe CXCR-4/CXCL-12. Les travaux de Suganuma et al (343) viennent appuyer le fait
que cette cytokine est importante dans le processus de carcinogenèse car des souris
transgéniques qui sont déficientes pour cette cytokine présentent des défauts de
développement de tumeurs suite à des traitements induisant une carcinogenèse dans cent pour
34
Figure 6. Voie de transduction induite par le TNFα.
(d’après Chen et al, Science, 2002)
35
cent des cas, chez des souris témoins. De plus, il a été décrit que lorsque TNF-α se lie à son
récepteur, TNF-R1, une cascade de signalisation se met en place (voir figure 6) faisant
intervenir le facteur NF
B (58). L’intervention de ce facteur entrainant la régulation positive
de plusieurs régulateurs négatifs de l’apoptose comme c-FLIP et cIAP1 (cellular inhibitor of
apoptosis protein-1), la superoxyde dismutase, BcL2, qui participent à la promotion de la
survie cellulaire (352, 15). De plus, ce facteur est également impliqué dans les dommages à
l’ADN. En effet, un traitement par du TNF-α sur des hépatocytes, conduit à une augmentation
de la formation de 8-oxo-deoxyguanosine, un marqueur des dommages oxydatifs de l’ADN,
ce qui contribue à augmenter les mutations génétiques (15). Enfin, le TNF-α est aussi reconnu
comme étant capable de réguler l’expression de nombreuses autres cytokines comme par
exemple, l’IL-6 (101).
-
L’interleukine-6 (IL-6)
L’IL-6 est une cytokine multifonctionnelle de 21 à 28 kDa en fonction de sa
glycosilation. Bien qu’elle ne soit pas exclusivement produites par les adipocytes (elle est
aussi sécrétée par les fibroblastes, les cellules endothéliales, les macrophages (2). L’IL-6 est
une cytokine qui circule dans l’organisme à de hauts niveaux et la concentration plasmatique
de cette dernière est directement proportionnelle à l’obésité (viscérale) et à la résistance à
l’insuline (159). Un peu plus d’un tiers de la sécrétion de l’IL-6 circulante est originaire du
tissu adipeux, et sa sécrétion est deux à trois fois plus importante dans le tissu adipeux
viscéral que dans le tissu adipeux sous cutané (94). Elle est impliquée dans de nombreuses
fonctions telles que la prolifération, l’apoptose, l’angiogenèse et la différenciation (71). Le
récepteur à l’IL-6 est une protéine de 80 kDa qui lie la cytokine avec une faible affinité. La
présence d’une autre glycoprotéine de 130 kDa (gp130) qui elle ne lie pas l’IL-6 libre est
nécessaire pour que le
récepteur de l’IL-6 lie la cytokine avec une haute affinité. La
dimérisation des domaines intracellulaires de deux gp130 active la voie JAK qui ensuite
active la protéine STAT spécifique de la voie (101).
Concernant son implication dans les cancers, l’IL-6 a été de nombreuses fois décrite comme
participant à de nombreux processus. En effet, des travaux sur des lignées cellulaires de
cancer du sein, positives pour le récepteur aux œstrogènes comme les ZR-75-1 et les T47D
ont montré que l’IL-6 induisait une modification de leur phénotype épithélial en faveur d’un
phénotype plus fibroblastique. D’une forme cuboïdale, on passe à une forme plus fusiforme
après traitement à l’IL-6, ce qui conduit les cellules à se détacher de leurs voisines et à être
36
plus migrantes car elles perdent l’expression de la E-cadherine, protéine impliquée dans la
jonction cellule-cellule (346, 345, 347). Elle a été également décrite comme étant un facteur
de croissance pour des cellules positives pour le récepteur alpha aux estrogènes (RE-α) (304).
De plus d’autres travaux ont montré que la surexpression et l’activation permanente de
STAT3 conduisaient à une altération des complexes d’adhésion cellule-cellule qui avait pour
conséquence une augmentation des capacités d’invasion des cellules de cancers colorectaux et
de carcinomes cutanés (281, 344). D’autres études ont démontré que des cellules issues de
lymphomes malins non hodgkiniens avaient une augmentation de l’expression de
métalloprotéases comme la MMP-2 et de la MMP-9 qui était corrélée à expression augmentée
d’IL-6 dans ces cellules (169). Cette cytokine est également capable de diminuer la sécrétion
de l’adiponectine (357) et d’augmenter l’expression de l’aromatase dans le tissu adipeux et
dans les cellules de cancer du sein ce qui conduit à une augmentation de la synthèse
d’oestrogènes et à la progression des cancers du sein (273). Il a été également montré que
l’IL-6 induisait la migration de cellules tumorales du sein, au travers de la voie MAP Kinase
(107).
A côté de ces études in vitro et in vivo, un nombre croissant d’études épidémiologiques
accentuent le fait que l’IL-6 est un marqueur de mauvais pronostic pour les patients atteints
de cancers (167). D’une part, elle a été impliquée dans l’agressivité des cancers de la prostate.
En effet, il a été montré par Finley et al (97) que des scores élevés de Gleason étaient corrélés
à de hauts niveaux d’IL-6 dans des milieux conditionnés de tissus adipeux péri prostatiques.
Un score de Gleason élevé est également corrélé avec une détection importante de STAT3.
L’IL-6 régulant STAT3, cette cytokine semble jouer un rôle dans la progression des cancers
prostatiques. De plus, la sécrétion d’IL-6 serait dépendante des adipocytes car peu de cellules
inflammatoires ont été retrouvées dans le tissu adipeux péri prostatique (97). En plus du
cancer de la prostate, l’IL-6 joue un rôle dans le cancer du sein. De nombreuses études ont fait
le lien entre un taux élevé de cette cytokine et un mauvais pronostic dans les carcinomes
mammaires (167). Kozlowsky et al (170) ont montré qu’il y avait statistiquement une plus
grande concentration d’IL-6 dans le sérum de patientes atteintes de cancer du sein, en
comparaison à des femmes en bonne santé. Nishimura et al (243) ont montré que les taux
d’IL-6 étaient significativement augmentés pour des cas de récurrences, spécialement avec
des métastases viscérales, comparé à des cas de non récurrence. Bozcuk et al (32) ont montré
que de forts taux d’IL-6 étaient corrélés avec une faible survie. Les travaux de Saldago et al
(297) ont démontré que les patients qui avait deux ou plus de deux sites métastatiques avaient
des valeurs d’IL-6 circulante beaucoup plus importantes que les patientes qui avaient
37
simplement aucun ou un site de métastase. Jablonska et al (137) ont montré que plus le grade
était important, plus le taux d’IL-6 était important et que l’IL-6 pouvait donc avoir un rôle
dans le diagnostic et le pronostic des patientes atteintes par les cancers du sein.
-
Le plasminogène activator inhibitor 1(PAI-1)
Un des systèmes enzymatiques impliqués dans la dégradation de la matrice
extracellulaire durant la croissance des tumeurs, l’invasion et le processus métastatique est le
complexe uPA pour urokinase-type plasminogen activator. uPA catalyse la conversion du
plasminogène en plasmine qui est capable de dégrader de nombreuses protéines de la matrice
extracellulaire comme la fibrine, et les laminines, ce qui contribue au remodelage des tissus
(210). L’activité de cet uPA est modulée par son inhibiteur, PAI-1 qui est une glycoprotéine
de 379 acides aminés. PAI-1 est sécrété par le tissu adipeux. Des expériences de perte de
poids chez des personnes obèses réduit considérablement le taux de PAI-1 dans le plasma de
ces personnes (218) et ceci, indépendamment des changements de certains paramètres
métaboliques tels que l’insuline ou les triglycérides, suggérant que le tissu adipeux contribue
grandement à la production de PAI-1 circulant, bien que d’autres études aient montré que
PAI-1 était sécrété par d’autres types cellulaires comme le myofibroblaste (249). Ces résultats
viennent corréler ceux qui montrent que des taux de PAI-1 sont détectables, ex vivo sur des
explants issus de plasties abdominales (230). L’uPA est considéré comme un facteur de
mauvais pronostic dans la progression tumorale car grâce à ses activités de remodelage de la
matrice extra cellulaire, qui activent notamment des MMPs (88). PAI-1 quant à lui,
contrairement à ce que l’on pourrait penser du fait sa capacité à inhiber uPA, est également un
facteur de mauvais pronostic dans divers cancers, et notamment dans le cancer du sein. En
effet, l’analyse de dix-huit études montre que de forts taux d’uPA et de PAI-1 sont associés à
une diminution de la survie avec une augmentation de la rechute et l’apparition de métastases.
Nous sommes donc face à ce qu’il est courant d’appeler, le paradoxe PAI-1. Le rôle de PAI-1
dans le développement de cancer est assez controversé. Selon son niveau d’expression ou le
cancer concerné, les résultats divergent. En effet, chez des souris immunodéficiences dans
lesquelles des expériences de transplantation de tumeurs humaines ont été effectuées, suivant
la quantité de PAI-1 qui est injecté, les résultats s’opposent. A faible dose, PAI-1 induit une
stimulation de la croissance tumorale alors qu’à forte dose, un effet inhibiteur est observé
(90). Chez des souris déficientes en PAI-1, la transplantation de kératinocytes murins
transformés conduit à une invasion tumorale et à une vascularisation de la tumeur qui est
38
limitée, alors que pour des cellules de carcinomes mammaires, il n’y a pas d’effet (3). A
l’inverse, les études de McMahon et al (222), de Bajou et al (14, 13), qui ont utilisé des souris
déficientes en PAI-1, suggèrent dans des expériences d’angiogenèse in vitro et in vivo, que
PAI-1 a des propriétés pro-angiogéniques. D’autres études ont également montré que PAI-1
était impliqué dans la migration des cellules tumorales. Les travaux de Palmieri et al (259) ont
montré que des MDA-MB-435 transfectées de manière stable avec le gène de PAI-1
présentaient un chimiotactisme accru envers la vitronectine et la fibronectine, comparé aux
cellules contrôles. D’autres travaux viennent corroborer ces résultats. En effet, PAI-1 serait
également impliqué dans ce que l’on appelle la transition mésenchymateuse-amiboïde (MAT).
Des cellules qui auraient déjà subi une transition épithélio-mésenchymateuse, pourraient, en
fonction de la richesse de leur environnement en PAI-1, réorganiser leur cytosquelette
d’actine avec l’abandon des fibres de stress au profit d’une relocalisation corticale de l’actine.
Ceci conduisant les cellules à se faufiler au travers des mailles de la matrice, sans avoir
recours à des activités protéasiques, ni aux intégrines (210). D’autres travaux ont également
montré que PAI-1 contribuait à la sélection de tumeurs agressives car il diminue la sensibilité
des cellules tumorales aux agents chimiothérapeutiques (131). Les études cliniques montrent
que fortes quantités de PAI-1 prédisposent à des cancers plus agressifs. En effet, une étude
menée par Sakakibara et son équipe a montré que de plus grandes quantités de PAI-1 étaient
retrouvées dans des cancers gastriques qui présentent un envahissement ganglionnaire. Plus
la quantité de PAI-1 est importante, plus la survie est diminuée (294).
-
Sphingosine-1-phosphate (S1P) et l’acide lysophosphatidique (LPA)
Le LPA et la S1P sont des lipides bioactifs qui ont des activités proches de celles des facteurs
de croissance. Bien que la S1P soit considérée comme le produit final de dégradation des
sphingolipides, il est maintenant reconnu que cette molécule est impliquée dans un grand
nombre de processus utiles dans le développement des cancers. La quantité de S1P est
finement régulée grâce à un contrôle entre sa synthèse et sa dégradation via trois enzymes.
Cela implique la sphingosine kinase (SphK), qui génère la S1P en phosphorylant son
précurseur, la sphingosine. Les S1P phosphatases (SPP1 et SPP2), qui convertissent de
manière réversible la S1P en shingosine. Pour finir, la S1P lyase qui de manière irréversible,
dégrade la S1P pour générer entre autre, du phosphate ethanolamine (pour revue (189)). Cette
molécule a été décrite comme étant produite in vitro, par un grand nombre de type cellulaires
par les fibroblastes, les cellules tumorales mais également, les adipocytes (28). La S1P est le
39
ligand de récepteurs couplés aux protéines G, désignés S1P1-5 (226). Plusieurs arguments
mettent en lien cette molécule avec la promotion de divers cancers. Il a été démontré que
l’augmentation de la SphK1 associée à une augmentation de la génération de S1P, était
corrélée à une survie réduite des patients atteints de glioblastomes. De plus, la S1P a été
retrouvée à taux élevés dans des ascites, chez des patientes atteintes de cancer des ovaires
(pour revue (189)). Cette molécule a été décrite comme ayant des effets sur la prolifération
tumorale. En effet, la croissance de cellules de prostate sur exprimant la SphK1 était
augmentée au cours de xénogreffes, tandis que la régulation négative de cette même enzyme
entraînait une diminution de la croissance tumorales par apoptose des cellules cancéreuses
(262). De plus, la S1P a été impliquée dans les processus de migration, d’invasion et dans les
processus métastatiques. En effet, l’activation de S1P1 par S1P entraîne des effets promigratoires. De plus, l’expression basale du système uPAR et uPA est supprimée lors de
l’inhibition de la SphK. S1P est également décrite comme activant PAI-1, qui comme uPAR
et uPA, contribue à l’invasion des glioblastomes (pour revue (262)). Des effets sur
l’angiogenèse ont été également décrits. Les signaux induits par S1P joueraient un rôle dans la
formation des vaisseaux sanguins, en stimulant la prolifération et la migration des cellules
endothéliales. De plus, cette molécule prévient de l’apotose, les cellules endothéliales privées
en sérum. Pour finir, l’utilisation d’anticorps neutralisants dirigés contre la S1P, inhibe la
formation de vaisseaux sanguins dépendante du VEGF et du bFGF dans des modèles de
xénogreffes (262).
Le phospholipide LPA est un intermédiaire métabolique de synthèse des glycérolipides. Il a
été décrit comme étant sécrété par l’adipocyte (305). Il est constitué d’un squelette glycérolphosphate sur lequel est greffé un acide gras en position 1 ou 2. Le LPA peut être produit à
partir de l’acide phosphatidique qui est dégradé par les phospholipases A1 ou A2. Il peu
également
provenir
de
la
dégradation
du
lysophosphatidylcholine,
par
l’activité
lysophospholipase D d’une ectoenzyme, l’autotaxine (ATX) (260). Au moins trois sous-types
de récepteurs du LPA ont été identifiés. Il s’agit de récepteurs à sept domaines
transmembranaires couplés aux protéines G et appartenant à la famille EDG (endothelial
differentiation gene) (225). Les voies de transduction du signal mises en jeu par l’activation
des récepteurs du LPA sont étroitement liées à la nature des protéines G auxquelles ils sont
couplés. Grâce à leur couplage à la protéine Gi (inhibitrice), les trois sous-types de récepteur
conduisent à l’activation des MAPK (mitogen activated protein kinases) et des PI3K
(phosphatidyl inositol 3-kinase), jouant ainsi sur les processus de survie et de prolifération. Le
LPA est également capable d’activer la protéine Gq qui par la suite, active la phospholipas C
40
(PLC) conduisant à l’hydrolyse des phosphatidylinositol-bisphosphate (PIP2) qui génèrent de
multiples seconds messagers menant à l’activation de la protéine kinase C (PKC) et à des
changements de concentration cytosolique du calcium. L’activation de la protéine G12/13
active quant à elle, la voie des RhoA, impliquée dans la migration cellulaire et l’invasion
(225). Des travaux expérimentaux ont permis de montrer que LPA augmentait le potentiel
métastatique de cellules cancéreuses de colon, les DLD1 qui exprimaient à de hauts niveaux
le récepteur LPA1. Dans ces cellules, le LPA permettait également de stimuler la sécrétion du
VEGF et de l’IL-8 (316). Dans un modèle de cancer de la prostate, les PC3 qui étaient
traitées, migraient davantage, et cette migration faisait appel à l’activation de la voie ERK1/2
et de p38 (112). La stimulation de la production de VEGF par des cellules cancéreuses
mésothéliales, induite par le LPA suggère un rôle important de ce facteur dans la
dissémination de ces cellules cancéreuses (295). Les travaux de Boucharaba et al (29) ont
montré que des cellules de cancer du sein, les MDA-BO2 qui sur exprimaient le LPA1 étaient
plus sensibles à l’action du LPA, et cela se traduisait par une croissance tumorale augmentée
chez les souris xénogreffées ainsi qu’à la formation de métastases osseuses qui engendraient
la destruction du tissu osseux. De plus, les travaux de Liu et al (194) ont aussi montré que
l’expression de l’ATX et des récepteurs au LPA dans les lignées de cancers du sein,
augmentait les propriétés invasives et métastatiques de ces cellules.
-
Les acides gras non estérifiés
Lors de la lipolyse, les triglycérides sont hydrolysés en glycérol et en acides gras libres
ou non estérifiés, puis libérés dans la circulation. Ils sont alors utilisés comme substrat
énergétique par les autres organes. De nombreux travaux mettent en avant l’implication des
ces acides gras dans la progression tumorale. Des études épidémiologiques ont montré que la
concentration des lipides dans le plasma, et notamment la concentration plasmatique d’acides
gras libres était augmentée significativement chez les patientes atteintes de cancer du sein, et
sans que ceci soit corrélé à leur indice de masse corporelle (19). La découverte de la protéine
FAS (fatty acid synthase), enzyme essentielle dans le métabolisme des acides gras, est un
marqueur pronostic dans la progression des cancers du sein (268), ce qui renforce l’idée que
les acides gras sont impliqués dans
la régulation de
la croissance tumorale. De plus,
l’utilisation de troglitazone, un ligand du PPARγ, ce facteur nucléaire qui lie PG2δ, influence
significativement la croissance et l’apoptose de diverses cellules cancéreuses (292, 187). Une
grande diversité d’acides gras existe, et tous ne sont pas équivalents dans leurs actions sur les
41
différents paramètres que sont, la prolifération cellulaire, l’apoptose. Il a été montré une
action opposée de l’oléate et du palmitate sur la prolifération de diverses lignées de cancer du
sein. L’oléate, acide gras insaturé (C:18:1) a des effets anti-apoptotiques sur des lignées
négatives pour le récepteur aux œstrogènes comme les MDA-MB-231 et sur des lignées
positives pour le récepteur aux œstrogènes comme les ZR-75-1 et les MCF-7. Ces effets antiapoptotiques étant dépendants de l’activation de la PI3K. A contrario, le palmitate, un acide
gras saturé (C:16), a des effets pro-apototiques sur les lignées cellulaires précédemment
citées (113). D’autres acides gras sont impliqués dans la progression tumorale. En effet, la
stimulation des MDA-MB-231 par de l’acide oléique entraîne une augmentation de la
phosphorylation de FAK (Focal Adhesion Kinase) ce qui à terme induit une augmentation de
la migration de ces cellules (239). Toujours sur ce modèle cellulaire, les travaux de Byon et al
(36) ont montré que les acides gras libres, et notamment l’acide linoléique et l’acide oléique
activaient le facteur de transcription SMAD-4 qui pouvait aller se lier sur la région promotrice
de PAI-1, entrainant une augmentation de l’expression de cette protéine dans les MDA-MB231, ce qui à terme induisait une augmentation de leurscapacités à migrer et à envahir. Les
travaux de Vinciguerra et al (355) ont montré que les cellules HepG2 (cellule d’hépatome)
traitées avec des acides gras insaturés, augmentent la prolifération, la migration et l’invasion
de ces cellules tumorales. De plus, l’expression des gènes impliqués dans l’inflammation et
l’angiogenèse (TNF-α, HIF-1α), les gènes impliqués dans la promotion de la transition
épithélio-mésenchymateuse (snail, TGF-β), l’invasion (MMP-2 et 9) sont régulés
positivement. Ces effets dans ce modèle sont dépendants de l’expression du gène suppresseur
de tumeur PTEN qui voit son expression diminuer significativement après traitement par les
acides gras. De plus, les animaux soumis à un régime riche en acide oléique qui ont été
xénogreffés avec les HepG2 en sous cutané, présentent une croissance tumorale accrue.
D’autres travaux (272) ont également montré que les acides gras et en particulier l’oléate était
utile à la survie des cellules cancéreuses. En effet, un traitement à court terme (de 3 à 24
heures) de cellules de cancer du sein, les MDA-MB-231 avec de l’oléate permet la survie à
long terme, en l’absence de sérum (10 jours). Prenant ces cellules comme modèle, Kaur et al
(151) ont montré que ces cellules étaient capables d’incorporer différents acides gras (l’acide
arachidonique étant le plus capté en comparaison à l’acide oléique ou l’acide
eicosapentaneoïque) et que cette capture était nettement augmentée sous l’effet du TNF-α,
alors que l’insuline ou l’adiponectine, utilisées dans ces travaux ne modifient pas la capture
par les cellules tumorales, des acides gras. Le TNF-α étant décrit comme capable d’induire
l’expression de la caveoline-1, qui renferme des transporteurs comme FAT/CD36 impliqués
42
dans le transport de lipides. De plus, d’autres travaux expérimentaux ont montré que les
acides gras poly insaturés exerçaient des effets immunosuppresseurs sur les CTL (cytotoxic T
lymphocyte). En effet, Kleineld et al (166), pour leur part, a montré que les cellules tumorales
étaient capables d’inhiber l’action des CTL, puisque ces derniers, sous l’effet de la libération
d’acides gras, étaient incapables d’entraîner la lyse de ces dernières. Ceci pourrait être
expliqué par le fait que l’incorporation des acides gras insaturés dans la membrane des CTL
entraîne une altération des voies de signalisation due à une modification de la bicouche
lipidique. Ceci est suggéré dans les travaux de Stulnig et al (342). Les signaux de transduction
faisant intervenir des domaines membranaires qui sont décrits comme étant insolubles aux
détergents (DRMs detergent-resistant membrane domains), passent par des protéines comme
les tyrosines kinase de la famille Src, qui sont contenues dans ces domaines. Ces DRMs sont
majoritairement constitués d’acides gras saturés. Ainsi, il a été démontré qu’il y avait un
déplacement des protéines de la famille Src, comme Lck, Fyn, de ces DRM, lorsque les
DRMs étaient enrichi en acides gras poly insaturés. Il apparaît donc que la capture des acides
gras modifie la comportement et la croissance cellulaire par une variété de mécanismes,
incluant la modification de la membrane cellulaire, qui en retour, affecte les systèmes de
transduction de signaux, le métabolisme des acide gras et la régulation de l’expression de
certains gènes clés (311). Altenburg et al (4), ont montré que l’incorporation d’acide gras poly
insaturé comme l’acide docosahexaenoic réduit l’expression à la surface du récepteur
CXCR4, ce qui entraîne une diminution de la migration des MDA-MB-231, dépendante de
cette voie.
-
Les estrogènes
Il a été décrit que le tissu adipeux pouvait sécréter des quantités non négligeables
d’estrogènes (242). La biosynthèse des estrogènes diffère entre les femmes pré et post
ménopausées. Pour les premières, les estrogènes sont synthétisés par les ovaires. Pour les
secondes, la biosynthèse ovarienne est remplacée par une synthèse plus périphérique, et chez
les femmes post ménopausées obèses, le tissu adipeux est alors, la principale source de
biosynthèse. Le médiateur de cette biosynthèse d’estrogène est un complexe enzymatique,
nommé aromatase cytochrome p450. Cette enzyme est le produit du gène CYP19.
L’aromatase convertit les androgènes circulants tels que la testostérone ou l’androstènedione
pour synthétiser des estrogènes. L’expression de ce complexe enzymatique dans le corps, se
retrouve à plusieurs niveaux et notamment dans le tissu adipeux (du sein, des cuisses, et des
43
Figure 7. Liens moléculaires entre l’obésité et le cancer du sein hormonodépendant
(d’après Lorincz et al, Endoc Relat Cancer, 2006)
44
fessiers) et le muscle (pour revue (275)). Le tissu adipeux est le site majeur d’expression de ce
complexe enzymatique (324). Il a été de plus démontré que le niveau d’aromatase augmente
avec l’IMC (198). Ce complexe enzymatique est également exprimé dans les cellules
tumorales (324, 303) mais son activité est bien plus négligeable que celle retrouvée dans les
cellules stromales entourant les adipocytes. Il a été également décrit pour des cancers du sein,
que l’activité de l’aromatase se trouvait augmentée dans le tissu adipeux à proximité de la
tumeur, et que l’augmentation moyenne de cette activité, sur douze cas était de 1.89 (IC à
95% compris entre 1.56-2.31) (253). De plus, la quantité d’estrogènes dans les tissu adipeux
entourant les tumeurs est presque dix fois plus élevée que la quantité d’estrogènes que l’on
peut retrouver dans la circulation sanguines de femmes qui sont post ménopausées (pour
revue (198) . Ces éléments laissent donc supposer que l’interaction entre la tumeur et les
adipocytes stimule l’augmentation de l’activité de cette enzyme. De plus, des cytokines
comme l’IL-6 ou le TNF-α sont capables de stimuler l’activité de cette enzyme (274). L’IGF1 est également lié à l’augmentation de l’activité aromatase dans les cellules adipocytaires
(323) et de ce fait, une augmentation de l’expression et de l’activité de cet enzyme conduit à
une augmentation de la conversion des androgènes périphériques en estrogènes.
Il existe deux formes de récepteurs aux estrogènes (RE), le RE-α et le RE-β. Le RE-α est le
récepteur qui est communément décrit lorsque l’on qualifie des cellules tumorales RE- ou
RE+, car l’activation de RE-α conduit à une augmentation de la prolifération. Quant à RE-β,
ce dernier lie également les estrogènes mais sa présence dans les cellules cancéreuses est liée
à un pronostic favorable (pour revue (62)). Les mécanismes mis en jeu lorsque les estrogènes
stimulent la prolifération cellulaire sont l’induction de l’activité transcriptionelle du RE, et
l’activation directe des signaux intracellulaires comme la voie MAP Kinase (figure 7). Les
estrogènes stimulent les cellules qui sont en G0/G1 en les faisant entrer dans le cycle
cellulaire pour faire une transition G1-S et un cycle complet de division. L’action des
estrogènes en
phase G1 est médiée par le facteur de transcription c-Myc. Il y a une
diminution de l’expression de c-Myc lors des traitements avec des anti-estrogènes et
l’utilisation d’oligonucléotides inhibant ce dernier, inhibent l’effet mitogène des estrogènes
(pour revue (198)). Les travaux de Shymala et al (318) ont confirmé l’implication des
estrogènes dans l’effet prolifératif des cellules de la glande mammaire. Des expériences
d’incorporation de thymidine radio-marquée ont montré une augmentation d’un facteur trois
de la synthèse d’ADN dans la glande mammaire après traitement aux estrogènes chez des
souris stérilisées. De plus, même après arrêt du traitement par les estrogènes, il y a toujours
une augmentation de la synthèse d’ADN dans la glande mammaire, surtout pour l’épithélium
45
Adhesion
Migration
Figure 8. Voies de signalisation impliquant
l’IGF.
(d’après Schadev et al, Endocr Relat Cancer, 2001)
46
qui se trouve à proximité du tissu adipeux, ce qui suggère que le tissu adipeux mammaire
serait capable de contribuer à la sécrétion d’estrogènes.
-
L’insuline growth factor-1 (IGF-1)
Il a été démontré que les composants du système IGF sont impliqués dans la progression
du cancer du sein. Le complexe IGF exerce de nombreuses fonctions, et il est constitué par de
nombreuses protéines, notamment IGF-I et IGF-II, ainsi que leurs récepteurs respectifs (IGFIR et IGF-IIR), les IGF-binding protein (IGFBPs) et les IGFBP protéases. Bien que de
nombreux récepteurs pour les IGFs aient été découverts, il apparait que la plupart des effets
de l’IGF-I passent par l’IGF-IR (pour revue (291)). L’IGF-I est un polypeptide de 7kDa et
partage un fort degré d’homologie avec l’insuline. Chez des souris transgéniques, sur
exprimant ce facteur de croissance, il a été montré que ce facteur jouait un rôle important la
transformation maligne des cellules épithéliales dans le cancer du sein (291). Dans le cancer
du sein, IGF-I est exprimé par les cellules stromales et relativement peu dans les cellules
épithéliales mammaires (374), ce qui suggère que ces carcinomes ont toutes les chances de
répondre davantage aux effets mitogènes et anti-apoptotique de ce facteur (198, 291). Les
adipocytes sont capables de synthétiser ce facteur et dans le contexte du tissu adipeux
mammaire, il est aisé d’imaginer que les cellules épithéliales mammaires soient baignées dans
un environnement riche en IGF-I. La liaison d’IGF-I à son récepteur IGF-IR entraîne une
dimérisation de ce dernier. Cela a pour conséquence d’activer son activité tyrosine kinase et la
phosphorylation de nombreux substrats protéiques clés, comme les IRS (insulin recpetor
substrate), IRS -1 et IRS-2, les SHC (Src homology collagen). Par la suite, la phosphorylation
de ces substrats entraîne le recrutement de protéines à domaine SH2 qui activent de
nombreuses voies de signalisation, incluant la voie des mitogen-activated protein kinase
(MAPK) ainsi que la voie phosphoinositide 3-kinase (PI3Kinase), qui comme c’est indiqué
sur la figure 8, sont impliquées dans les processus mitogéniques et anti-apoptotiques (291).
Des expériences impliquant IGFBP-3 pour inhiber le signal de IGF-I, on montré que cette
inhibition entraînait l’apoptose via l’induction des caspases 7 et 8 (164). La protection d’IGFI contre l’apoptose est médiée par l’activation de PI3K et de la voie Akt/protein kinase B
(PKB). Akt/PKB phosphoryle BAD, un membre de la famille de Bcl-2 aux propriétés
proapoptotiques. Une fois phosphorylé, BAD ne peut plus s’hétérodimériser avec Bcl-2 ou
47
Bcl-XL, ce qui n’induit plus la mort cellulaire (378). Le système IGF a été également impliqué
dans les processus d’invasion et de migration. L’expression dans la lignée MDA-MB-435
d’un mutant,dominant négatif pour l’IGF-IR, entraine une diminution de ses capacités
d’adhésion, de migration et d’invasion in vitro and in vivo (87). Comme cela est également
représenté (figure 7), il semblerait que l’IGF puisse travailler de concert avec les estrogènes
en stimulant l’activité transcriptionnelle du RE (pour revue (198)). Ainsi, pour des lignées qui
sont RE+ comme les MCF-7, ZR-75-1 et T47D, la stimulation par de l’IGF-I à des doses de
l’ordre du pico et du nanogramme entraîne une augmentation de leur prolifération,
contrairement aux lignées qui sont RE- comme les MDA-MB-231, MDA-435 et MDA-468,
où une réponse minimale voire absente est observée après le traitement (336, 149).
L’inhibition de l’action du RE par l’utilisation d’IGFBP-1 (qui régule la biodisponibilité
d’IGF-I) suggère que la signalisation passant par IGF-I est nécessaire pour une activation
maximale du RE (184). Cette synergie d’action se retrouve aussi dans l’autre sens, puisque les
estrogènes sont capables de stimuler l’expression d’IGF-I, d’IGF-IR ainsi que d’IRS, résultant
en une augmentation de la phosphorylation des tyrosines de IGF-IR suite à un traitement par
IGF-I (pour revue (198)). De plus, il a été également montré que l’IGF-I est capable
d’augmenter, dans les adipocytes, l’activité aromatase qui elle-même est impliquée dans la
génération des estrogènes (323).
-
Appartenant
Les chemokines
à la famille des cytokines, les chémokines exercent des fonctions
importantes de communication entre cellules. Leurs propriétés chémoattractantes constituent
le point commun majeur des différentes chémokines et c’est d’ailleurs ce point commun qui
est à l’origine de leur dénomination (chemoattractant cytokines). Le système des chemokines
humain comprend plus de 40 chemokines et 18 récepteurs associés. Lorsque ces chémokines
qui sont de petites protéines très basiques dont la taille varie entre 6 et 14 kDa, se lient sur
leurs récepteurs, toute une cascade de signalisation se met en place. Les récepteurs aux
chémokines sont des récepteurs de la superfamille des récepteurs couplés aux protéines G
ainsi que les récepteurs aux tyrosines kinases. La dissociation de la sous-unité alpha des sousunités beta-gamma entraîne la régulation de plusieurs voies de signalisation qui font intervenir
le cAMP/proteine kinase A (PKA), la PKC, la phospolipase C (PLC), les phosphoinositides 3kinase (PI3 Kinases)/ Akt/mTOR, Ras/Raf/MEK/JNK/p38/ERK1/ERK2 et active la voie
48
NFκB. Ces intermédiaires activés, sont également impliqués dans la transduction du signal
produite par les récepteurs aux tyrosines kinases (pour revue (340)). Ainsi les chémokines se
retrouvent impliquées dans de nombreux processus biologiques que tels que l’apoptose, la
prolifération, l’angiogenèse et la migration de cellules. Les chémokines sont des protéines qui
sont sécrétées et qui peuvent être divisées en deux familles, selon l’ordre des cystéines (acide
aminé conservé dans la structure de ces protéines). Il existe donc la famille des CXC
chémokines et la famille des CC chémokines (34).
Par exemple, CCL2 est reconnu comme étant impliqué dans le recrutement des macrophages
dans le tissu adipeux au cours de l’obésité, ceci dans des modèles murins et humains (373),
(361). CCL2 ou encore MCP-1 (pour monocyte chemoattractant protein-1) voit sa sécrétion
augmenter dans le tissu adipeux de souris génétiquement obèses et diabétique, les db/db ainsi
que dans le tissu adipeux de souris qui sont obèses suite à un régime riche en graisse (145).
De plus, il a été décrit une augmentation de l’expression des gènes des CC chemokines
(CCL2, 3, 5, 7, 8, 11) dans le tissu adipeux sous-cutané et viscéral d’individus obèses en
comparaison aux tissus adipeux de même localisation chez des individus ayant un IMC
normal (129). CCL2, sécrété par les adipocytes, a été également décrit comme étant capable
d’induire une accumulation de lipides dans des hépatocytes (64). De plus, les travaux de
Dalhman et al (72) ont montré que cette protéine sécrétée par le tissu adipeux ainsi que par
l’adipocyte isolé d’individus obèses avait un effet local. En effet, malgré l’augmentation de la
quantité de cette protéine, au niveau tissulaire, aucune modification de la quantité de cette
chémokine dans la circulation n’a été décelée chez les individus obèses. Des résultats
contraires ont été trouvés dans les travaux de Fasshauer et al (96). En effet, ils ont montré
qu’au cours de la différenciation adipocytaires des 3T3-L1, il y avait une diminution de
l’expression de CCL2 et que sa sécrétion était stimulée par l’IL-6. Concernant CCL5 (ou
encore RANTES), il a été décrit comme étant sécrété par des adipocytes matures du tissu
adipeux viscéral ou sous-cutané, sa sécrétion étant dépendante de la taille des adipocytes car il
est apparu que sa sécrétion était augmentée chez les individus obèses. De plus, l’hypoxie
(phénomène qui se produit au cours de l’obésité) est également un facteur inducteur de
l’expression de cette chémokine, qui est impliquées dans le recrutement de différents types de
leucocytes (326). Il a été également démontré que la sécrétion de CCL5 par des cellules
souches du tissu adipeux était capable de stimuler les capacités d’invasion de cellules
tumorales au travers de l’induction de la MMP-9 (267). Une autre étude confirmant le fait que
ces chémokines puissent être sécrétées par l’adipocyte, a été réalisée par Lee et al (185). En
effet, une analyse de microarray sur des adipocytes issus de tissu sous cutané abdominal
49
d’individus obèses, montre une augmentation de l’expression des gènes pro-inflammatoires,
notamment CCL2 et 3 sans qu’il y ait une « contamination » par des macrophages de ce tissu,
étant donné l’absence de gènes discriminant les macrophages.
Concernant l’autre famille de chémokines, la famille des CXC chémokines, on peut à
nouveau séparer cette famille en deux. En effet, ces cytokines, suivant qu’elles contiennent ou
non le motif acide glutamique-leucine-arginine (motif ELR) à l’extrémité N-terminale, qui est
immédiatement précédé par la première cystéine, vont posséder des propriétés angiogéniques
ou non (pour revue (340)). Il a été également décrit que ces cytokines étaient sécrétées par le
tissu adipeux, et cela est notamment le cas pour GRO-α (ou CXCL-1). Les travaux de Maury
et al (217) ont démontré que cette cytokine était surexprimée dans le tissu adipeux viscéral
d’individus obèses. Les taux circulants de cette cytokine chez les personnes obèses et
sévèrement obèses étaient augmentés de 30%, en comparaison aux personnes ayant un IMC
normal. L’étude suggère que l’hypertrophie des adipocytes d’individus obèses serait à
l’origine de cette sécrétion augmentée. Cette cytokine a été impliquée dans de nombreux
processus biologiques, et notamment dans la migration de diverses lignées de cellules
tumorales mammaires (376). De plus, cette cytokine étant ELR+, elle a des capacités à
promouvoir l’angiogenèse. Les travaux de Wang et al (359) ont montré que CXCL-1 induisait
la migration de cellules endothéliales et la formation de tubes in vitro et que cette cytokine
sous l’action des prostanglaindines de type E2, voyait son expression augmenter, ce qui
permettait de promouvoir la croissance tumorale, in vivo. L’action de cette cytokine passe par
le récepteur CXCR2. Le processus d’angiogenèse, dans des micropoches cornéennes de
souris, est inhibé lorsque des souris déficientes pour CXCR2 ont été utilisées ou lors de
traitements avec un anticorps dirigé contre CXCR2 chez des souris exprimant ce récepteur
(340). Une autre chémokine qui a été décrite comme étant impliquée dans le processus
cancéreux, est la chémokine, CXCL12 (ou SDF-1). CXCL-12 est capable d’augmenter les
capacités invasives et la migration des cellules cancéreuses mammaires (146). Les effets de
cette chémokine passent par le récepteur CXCR4. In vivo, la neutralisation des interactions
entre cette cytokine et son récepteur inhibe significativement le processus métastatique, avec
pour conséquence, une diminution de l’envahissement ganglionnaire et une diminution des
métastases dans le poumon. L’expression de ce récepteur, qui n’a que cette cytokine pour seul
ligand, est un facteur de mauvais pronostic (236, (34). Les travaux de Muehlberg et al
confirment cela. En effet, les cellules souches dérivant du tissu adipeux sont capables de
sécréter des chémokines de la famille des CXC. L’utilisation d’une lignée murine mammaire,
50
Figure 9. Schéma récapitulatif des voies de signalisation activées par les sécrétions
adipocytaires
au cours de l’obésité et pouvant être associées à la progression tumorale
(d’après Van Kruijsdijk, Cancer Epidemiol Biomarker Prev, 2009)
51
4T1, qui a été invalidée pour CXCR4, montre que l’effet des cellules souches du tissu
adipeux sur la croissance tumorale est aboli (234).
Au vu de tout ce qui vient d’être décrit, il semblerait donc que les adipocytes, en plus de leur
capacité à stocker des lipides, sont également des cellules qui sont capables de sécréter un
large éventail de molécules pouvant influencer grandement le comportement des cellules
tumorales. L’ensemble des actions des diverses sécrétions des adipocytes est résumé dans la
figure 9.
52
II)
Obésité et cancer
A) Définition de l’obésité
L’obésité ou le surpoids se caractérisent par un développement excessif du tissu
adipeux. L’obésité peut être mesurée comme étant le poids corporel, le poids du corps en
fonction de la taille de l’individu ou alors, l’obésité peut être définie en fonction de la
répartition du tissu graisseux dans l’organisme. L’IMC (indice de masse corporelle) qui
représente le ratio de la masse (en kilogrammes) sur la taille au carré (en mètres) ainsi que le
type d’obésité, à savoir une obésité centrale ou périphérique (en fonction du type de
distribution du tissu adipeux) sont les deux le types de méthodes qui sont classiquement
utilisées pour juger du degré d’obésité. L’obésité centrale se définit comme étant le rapport
entre le tour de taille et le tour de hanche et ce rapport doit être égal ou supérieur à 0.95 pour
les hommes et 0.80 pour les femmes pour que l’on commence à parler d’obésité. Concernant
l’IMC, il y a également différents degrés. Ceci est repris dans le tableau qui suit.
Grade
Non gradé
Grade 0
Grade1
Grade2
Grade3
IMC
IMC< 18.5
IMC : 18.5-24.9
IMC : 25-29.9
IMC : 30-39.9
IMC> 40
Description
Poids insuffisant
Poids normal
Surpoids
Obésité
Obésité morbide
a. Développement pathologique du tissu adipeux.
L’obésité se caractérise par une augmentation de la masse adipeuse dans différentes
régions de l’organisme. Dans la partie haute pour les obésités androïdes, dans la partie basse
au cours des obésités gynoïdes ou plus globale dans le cas d’obésités sévères. L’augmentation
de la masse adipeuse est la résultante de l’augmentation de taille des adipocytes
(hypertrophie) et/ou du nombre d’adipocytes (hyperplasie). Il semblerait que l’augmentation
du tissu adipeux proviendrait dans un premier temps d’une hypertrophie qui serait suivie par
la suite d’une hyperplasie (77).
L’excédent des apports énergétiques est stocké au sein de l’adipocyte sous forme de
triglycérides. Au cours de l’hypertrophie, les lipides s’accumulent dans la vacuole lipidique
53
des adipocytes déjà présents dans le tissu adipeux, ce qui provoque une augmentation
importante de leur taille. Concernant l’hyperplasie, ceci correspondant donc à une
augmentation du nombre de cellules du tissu adipeux. Les adipocytes proviennent d’une
réserve de « précurseurs » adipocytaires contenus dans la fraction du stroma vasculaire. Lors
de l’hyperplasie, on observe la différenciation de ces précurseurs en nouveaux adipocytes. Il
en résulte ainsi, une augmentation du nombre total d’adipocytes. Un autre paramètre à prendre
en compte dans l’augmentation de la masse adipeuse, est l’hypothèse de la taille critique. En
effet, c’est dans les années 70 que Lemmonier a suggéré que les adipocytes ne pourraient pas
dépasser une taille maximale. Le besoin de « lieu » de stockage supplémentaire ne pourrait
donc se faire que par le recrutement de nouveaux adipocytes (188). Des expériences de
lipectomie ont démontré que la régénération du tissu adipeux dépendait plus de la taille
initiale des adipocytes que du nombre ce cellules enlevées. Pour des quantités de tissu adipeux
équivalentes enlevées mais dont le nombre de cellule est différent (ceci du à modification de
la taille des adipocytes par une restriction calorique importante), seuls les hamsters n’ayant
pas subi de restriction calorique augmentent le nombre de cellules pour régénérer la partie
manquante du tissu. Ceux qui ont subi la restriction calorique, qui ont donc des adipocytes de
taille plus petite, répondent par une augmentation de la taille des adipocytes présents (216).
L’obésité est aussi associée à une augmentation modérée mais chronique d’un ensemble de
facteurs inflammatoires et c’est d’ailleurs pour cela que l’on décrit l’obésité comme une
maladie de « bas grade » inflammatoire. Des études ont montré que le tissu adipeux des
patients ou des animaux obèses était le siège d’une accumulation macrophagique,
proportionnelle à l’IMC (pour revue (63, 361)). Ces macrophages pouvant être une source de
production d’adipokines. Les macrophages expriment des marqueurs d’activation et
différentes populations dans un état pro- ou anti-inflammatoire existent dans le tissu adipeux
humain. Les phénotypes des macrophages pourraient ainsi être pro- ou anti-inflammatoires
selon le degré d’obésité et de son évolution, comme le suggère une étude chez la souris,
montrant que la prise de poids s’accompagne d’une transition dans les populations cellulaires
passant d’un phénotype macrophagique M2 (anti-inflammatoire) vers un profil M1 (pro
inflammatoire) (pour revue (63)). Chez l’humain, le même genre de résultat est obtenu. En
effet, au cours d’obésité morbides, il a été montré que le tissu adipeux blanc sous cutané de
ces personnes ne présentait pas de marquage positif pour l’IL-10, marqueur de type M2. Une
perte de poids drastique chez ces personnes, suite à une chirurgie baryatrique a conduit à
détecter ce marqueur (41). Il a été également décrit que l’accumulation macrophagique est
plus importante dans le tissu viscéral que dans le tissu sous-cutané, ce qui pourrait expliquer
54
certains des risques associés à l’accumulation de graisse intra-abdominale (41). En ce qui
concerne les lymphocytes, il a été également décrit qu’une accumulation de ces derniers était
observable au cours de l’obésité. Ils seraient aussi impliqués dans la sécrétion de molécules
pro inflammatoires comme CCL5 qui contribuerait à inhiber la différenciation adipocytaire
(371).
B) Obésité et cancer : épidémiologie.
a. survenue des cancers.
La prévalence du surpoids et de l’obésité dans la plupart des pays développés, n’a pas
cessé d’augmenter durant les deux dernières décennies. L’obésité est devenue un véritable
problème de santé publique et cette tendance ne semble pas montrer de signes de faiblesse.
Aux Etats-Unis, le surpoids et l’obésité sont à l’origine de nombreux cas de décès (entre
280000 et 325000 décès par an), toutes causes confondues. En ce qui concerne l’Union
Européenne, il est estimé qu’il y a entre 279000 et 304000 décès (39). Bien que l’obésité ait
été longtemps reconnue comme étant une cause importante dans le développement du diabète
et des maladies cardiovasculaires, la relation entre obésité et différents types de cancers a été
moins étudiée.
Depuis les années 1970, les études épidémiologiques ont montré que l’obésité contribuait à
augmenter l’incidence de nombreux cancers. Il a été montré par exemple que l’obésité était
associée à un plus grand risque de cancers colorectaux chez les hommes et chez les femmes
dans des études de cohorte et dans des études de cas témoins (350). Une différence qui est
dépendante du sexe, puisque le risque relatif est plus élevé chez l’homme que chez la femme.
Une hypothèse pouvant expliquer cette différence, est que l’obésité viscérale est plus
fréquente chez les hommes que chez les femmes, ce qui serait un facteur de risque plus
important que l’obésité « périphérique » ou le surpoids général. En effet, des études
rapportant que le ratio du tour de taille sur le tour de hanche, ou simplement le tour de taille
étaient associés à un risque de cancer du colon, avec des tumeurs de plus grande taille chez les
patients. Les cancers de l’endomètre sont également liés à l’obésité (350), (141). Une
augmentation linéaire entre le risque de cancers de l’endomètre et l’augmentation de l’IMC a
55
été observée. Cette augmentation du risque était doublée et même triplée pour les patientes en
surpoids et/ou obèses. Concernant les cancers rénaux, le surpoids et l’obésité jouent
également un rôle important dans l’augmentation de ce type de cancer. Les cancers de
l’œsophage et plus particulièrement les adénocarcinomes de l’œsophage, connaissent eux
aussi, une augmentation de leur apparition chez les personnes obèses (370). Certaines études
ont également montré que le reflux gastro-œsophagien était également associé à des
adénocarcinomes de l’œsophage ainsi qu’à un syndrome de Barrett (177). Bien que des études
épidémiologiques se contredisent, des éléments suggèrent que l’obésité pourrait être à
l’origine d’une augmentation d’apparition du cancer du pancréas (24). Un nombre limité
d’études sur le cancer de la vésicule biliaire et obésité ont été menées. Cependant, ces études
ont aussi montré que l’obésité augmentait d’un facteur deux, l’apparition de ce type de cancer,
car l’obésité augmente la formation de cristaux biliaire, ce qui a pour conséquence de causer
une inflammation chronique de la vésicule et ainsi, augmente le risque d’apparition de cancer
dans le tractus biliaire (341). Concernant les cancers du col de l’utérus (39), les cancers de
ovaire (39), les conclusions sont les mêmes que celles pour le cancer du pancréas. Les études
se contredisent mais pour celles qui suggèrent que l’obésité contribue à la survenue de
cancers, il y a une augmentation du taux d’apparition d’un facteur 2 à 3 pour les IMC les plus
élevés dans le cancer du col de l’utérus et jusqu’à un facteur 2 pour le cancer des ovaires.
L’hypothèse majeure qui explique les différences observées est que les femmes obèses ont
tendance à avoir une surveillance moins régulière que les femmes qui ont un poids normal.
Pour le cancer de la prostate, des études montrent qu’il y a une augmentation modeste mais
tout à fait significative de du risque de développer un cancer avec l’obésité (300, 93). De plus,
il a été montré que l’obésité était associée à des stades plus avancés de ce cancer mais aussi à
un risque accru de mourir de ce cancer (9). Aussi, il a été montré que les hommes obèses
ayant un cancer de la prostate étaient plus susceptibles de souffrir de récurrence de cette
maladie après une prostatectomie radicale, en comparaison avec des hommes qui ont un poids
normal (6, 100).
Un tableau récapitulant les divers cancers cités et les risques relatifs qui leur sont associés, va
suivre (39).
56
Type de cancer
Colorectaux
Risque relatif
Risque relatif
25< IMC < 25-30kg/m2
IMC > 30kg/m2
1.5
2.0
1.2
1.5
1.3
1.5
endomètre
2.0
3.5
rénaux
1.5
2.5
Adénocarcinome
2.0
3.0
pancréas
1.3
1.7
foie
indéterminé
1.5-4.0
Vésicule biliaire
1.5
2.0
(hommes)
Colorectaux
(femmes)
Cancer du sein
(postménopause)
de l’œsophage
Le cancer du sein, quant à lui, a fait également l’objet de nombreuses études, et l’on
peut dire que malgré, là aussi, des études qui se contredisent, l’existence d’une association
entre obésité et cancer du sein est tout à fait envisageable. Il est maintenant assez bien établi
que l’obésité représente un facteur de risque pour le cancer du sein (279). De nombreux
paramètres peuvent être à l’origine des différences que l’on observe dans ces nombreuses
études. En effet, l’IMC est le paramètre fréquemment utilisé pour identifier les patientes en
surpoids et/ou obèses. Cependant les seuils utilisés ne sont pas toujours ceux qui sont
recommandés par l’organisation mondiale de la santé. Certaines études, jugeant qu’une
personne est obèse à partir d’un IMC supérieur à 27.3 kg/m2 (70) alors qu’il est
communément admis qu’une personne est obèse lorsqu’elle a un IMC qui est supérieur à 30
kg/m2. De plus, les méthodes statistiques employées diffèrent d’une étude à une autre, ainsi
que la taille de l’échantillon. Dans la plupart des études de cas-témoins et des études de
cohorte, il semblerait qu’il existe une relation inverse entre des IMC élevés et le risque de
développer un cancer du sein chez les femmes en pré ménopause. Par exemple London et al
(197), au cours de leurs travaux, ont analysé la relation qui pouvait exister entre le risque de
cancer du sein parmi près de 116000 patientes âgées de 30 à 55 ans. Ils ont montré qu’il y
57
avait une diminution significative du risque de cancer du sein chez les femmes pré
ménopausées, lorsqu’il y avait une augmentation relative du poids. Le risque relatif qu’un
cancer survienne pour celles qui se trouvent dans des stades avancés d’obésité étant de 0.6.
Les travaux de Vatten et al (354) et de Willett et al (365) ainsi que Peacock et al (263)
arrivent à la même conclusion (354). Une autre étude de cohorte menée sur plus de 300000
patientes, a montré qu’il y avait une relation inverse entre l’IMC et le cancer du sein chez les
femmes pré ménopausées. Ici, le risque relatif étant de 1.02 (351). Les travaux de Lahmann et
al ont montré que sur 74000 femmes pré ménopausées, il n’y avait pas d’association inverse
significative entre le poids, l’IMC et le cancer du sein (178). Pour tenter d’expliquer le lien
entre obésité et protection contre le cancer du sein pour les femmes en pré ménopause,
plusieurs hypothèses ont été avancées. Notamment, il a été décrit que les femmes obèses
présentent davantage de cycles anovulatoires, ce qui se traduit par une diminution des taux
d’œstradiol et de progestérone au cours du cycle menstruel. Ces deux hormones étant connues
pour être impliquées dans la stimulation de la division des cellules épithéliales mammaires
(161), leur diminution résultant en la réduction de la division cellulaire, ce qui pourrait
contribuer au faible risque de cancer du sein. De plus, il a été également démontré que même
si l’obésité se caractérise par une diminution des taux de SHBG (sex hormone-binding
globulin) qui par voie de conséquence laisse un pool d’estrogène plus important,
bio
disponible, et que le tissu adipeux est capable de synthétiser ses propres estrogènes, les
femmes pré ménopausées et obèses, avaient des taux d’œstradiol plus faibles en comparaison
à celles qui avaient un poids normal. Les études ont proposé qu’il y ait une clairance
hépatique de cette hormone qui soit plus importante du fait de la diminution de SHBG (25).
Les études faisant le lien entre surpoids/ obésité et le développement de cancer du sein en post
ménopause sont plus nombreuses et plus homogènes (43), (178). En effet, en compilant
plusieurs études de cohorte qui incluent au final 337819 femmes et 4385 cas de cancers
invasifs, Van der Brandt et al ont montré que le risque relatif de développer un cancer du sein
était égal à 1.26 (95% IC : 1.09-1.46), chez les femmes post ménopausées avec un IMC
supérieur ou égal à 28kg/m2. Ceci étant valable pour les femmes qui n’utilisent pas un
traitement hormonal substitutif (351). Une étude prospective sur plus de 75000 femmes dont
la moyenne d’âge est de 73.5 ans a démontré que les femmes qui se trouvaient dans les
quartiles les plus élevés concentrant le poids (facteur de risque égal à 1.49), le gain de poids
depuis l’âge de 18 ans (facteur de risque égal à 1.64), l’IMC (facteur de risque égal à 1.58)
ainsi que le tour de taille, avaient davantage de risque de développer un cancer du sein que
celles qui se situent dans les plus bas quartiles pour chacun des paramètres cités. Selon cette
58
étude, une grande quantité de tissu adipeux est un facteur de risque indépendant pour le
développement de cancer du sein pour les femmes post ménopausées (172). L’étude de
Morimoto et al, vient confirmer cet état de fait, puisque sur 1030 patientes ayant développé un
cancer invasif du sein, les femmes ayant un IMC> 31.1 avait un risque élevé (risque relatif de
2.52, IC 95% entre 1.62-3.93) d’avoir un cancer du sein, surtout pour celles qui n’utilisaient
pas de traitement hormonal substitutif (231). Quant à celles qui prenaient un traitement
hormonal substitutif, on ne dénote pas d’effet de l’IMC sur le développement du cancer, sans
doute dû au fait que l’apport exogène d’hormones entraîne une augmentation des taux
circulant d’estrogènes, de façon similaire, que ce soit chez des femmes minces ou obèses,
rendant ainsi la conversion des androgènes en estrogènes, par le tissu adipeux, négligeable. Le
mécanisme exact qui régie ces constations sur un risque accru de développer un cancer du
sein avec l’obésité, chez les femmes en périodes post ménopausique, n’est pas totalement
compris. De nombreuses hypothèses ont été proposées pour expliquer ce phénomène (338). Il
est décrit que l’obésité s’accompagne d’une augmentation des taux d’œstradiol qui résulte de
la conversion des androgènes circulants en œstrogènes grâce aux capacités d’aromatisation du
tissu adipeux, pourvu d’une enzyme clé dans ce processus, l’aromatase. Il y a également une
augmentation des niveaux d’œstradiol libre résultant de la diminution des taux de SHBG (sex
hormone binding globulin) associée avec l’obésité. De plus, une synergie entre les hormones
sexuelles stéroïdienes et l’IGF-1 (insulin-like growth factor), qui stimule l’activité
proliférative du tissu épithélial mammaire (338) est envisageable.
b. Caractéristiques des tumeurs au moment du diagnostic.
Comme nous venons de le voir, autant l’obésité est considérée comme un facteur de
risque indépendant, pour le développement d’un cancer chez les femmes post-ménopausées,
autant le lien entre obésité et le stade de la maladie au moment du diagnostic est encore sujet à
discussion. Le stade de la maladie se détermine grâce à la classification TNM qui est une
classification internationale. La lettre T (pour Tumour) symbolise la tumeur primaire. Cette
lettre est cotée de T0 lorsque la lésion primaire n’est pas retrouvée à T4 pour les tumeurs les
plus étendues. Cette cotation dépend du volume tumoral qui est représenté par le diamètre
maximum de la lésion et de la fixation aux organes voisins. La lettre N (pour Node) détermine
s’il y a une atteinte ganglionnaire par la tumeur. Le N va de N0 à N3 et est fonction du siège
des adénopathies (plus ou moins proches de la tumeur), des dimensions des adénopathies, de
leur nombre et de leur éventuelle fixation aux tissus voisins. La lettre M (pour Métastase) est
59
cotée M0 en l’absence de métastases ou M1 en leur présence, quelque soit leur siège, unique
ou multiple. Selon les localisations tumorales, la combinaison de ces trois paramètres permet
de décrire divers stades de gravité de la maladie (stade I à IV).
Dans une étude menée par Cui et al (70) sur un échantillon de 966 patientes, il a été démontré
que les femmes qui avaient les plus hauts IMC présentaient un cancer du sein à des stades
plus avancés que celles qui se situaient dans des IMC bas. Les tumeurs étant détectées à des
stades II voire à des stades encore plus avancés. Par exemple, les femmes en surpoids ou
obèses présentaient dans 50% et 51% des cas, respectivement des stades plus avancés que
leurs homologues ayant un poids normal. Pour un IMC supérieur à 27.3, qui dans cette étude
est la valeur associée à l’obésité, les femmes qui ont un IMC supérieur ont des tumeurs plus
grandes (supérieures à 2 cm) que celles des femmes dont l’IMC est inférieur à 27.3. Par
contre, les deux autres paramètres qui permettent de déterminer la gravité de la maladie, à
savoir l’atteinte ganglionnaire ainsi que l’existence de métastase, ne sont pas associés à la
valeur de l’IMC. Sur un même modèle, les travaux de Maehle et al (204) sur 1241 patientes,
confirment que l’augmentation de l’IMC et l’augmentation du
poids du corps sont
significativement corrélées à l’augmentation du diamètre moyen de la tumeur. Par exemple,
une augmentation de 10kg du poids du corps est associée à une augmentation du diamètre de
la tumeur de 0.20 cm. Cette association est retrouvée chez des patientes qui présentent ou non
une atteinte ganglionnaire. De plus, le diamètre de la tumeur est aussi à mettre en lien avec les
récepteurs aux hormones. En effet, pour les patientes ayant un poids du corps important, ou
un IMC élevé, ces dernières présentent davantage de tumeurs qui sont positives pour le
récepteur à la progestérone, que leurs homologues ayant un poids normal. L’IMC étant
positivement corrélé à la présence du récepteur aux estrogènes. Cela dit, une fois l’âge et le
statut en récepteur hormonal pris en compte simultanément, à la fois, le poids du corps et
l’IMC sont significativement associé au diamètre de la tumeur chez des patientes présentant
des tumeurs négative pour les récepteurs hormonaux. Bien que la contribution des
mécanismes hormonaux sur la progression tumorale ne sont pas à exclure, le fait que les
tumeurs négatives pour les récepteurs hormonaux croissent davantage avec l’augmentation de
l’IMC, laisse penser que d’autres mécanismes rentrent jeu, et notamment les cytokines
sécrétées par le tissu adipeux. L’étude de Phipps et al (266) tend à suggérer qu’il y a un risque
d’avoir des tumeurs du sein qui sont « triple négatives », à savoir négatives pour le récepteur
aux estrogènes et progestérone ainsi que négative pour HER2 (protéine codée par le protooncogène HER/neu) avec une augmentation de l’IMC et du poids. A contrario, Loi et al
(196), ont montré que l’obésité était associée à une plus grande taille des tumeurs (P=0.002), à
60
une augmentation du nombre de ganglions atteints (P = 0.003) mais qu’il n’y avait pas
d’association entre le fait que les patientes soient obèses et leur statut en récepteurs aux
hormones. Dans l’étude de cas/ témoin de Carmichael et al (43), comprenant 1579 patientes,
les femmes obèses présentent des tumeurs du sein qui sont significativement plus importantes
que celles de femmes non obèses (2.6 cm vs 2.2 cm). De plus, le Nottingham pronostic index
(NPI), qui utilise les mêmes critères que notre classification TNM révèle que les patientes
obèses ont un NPI plus mauvais au moment du diagnostic que les femmes minces. Autant la
plupart des études trouvent une corrélation positive entre la taille de la tumeur et l’obésité,
autant les résultats sur l’envahissement ganglionnaire et l’obésité sont plus discutés. Dans
une étude (74) comprenant 176 femmes présentant une atteinte ganglionnaire lors de leur
cancer du sein, à la fois le ratio de la taille du ganglion sur la taille de la tumeur primaire
(M/P) ainsi que la présence de ganglions atteints étaient plus souvent retrouvé chez les
femmes obèses. De plus, il existe une corrélation positive entre ce ratio M/P et l’obésité (P=
0.0002). Schapira et al (309) ont montré quant à eux dans une étude enrôlant 248 femmes, que
celles qui sont en période post ménopausique et obèses avaient davantage d’envahissement
ganglionnaire que les patientes normo pondérales. Hall et al (111) ont décrit un lien entre
l’IMC et la taille des seins et le stade du cancer du sein. Les femmes qui se situent dans le
plus haut tertile de l’IMC sont celles qui ont le plus souvent de grands bonnets (taille D) pour
leur sous vêtements et ces dernières présentent des risques d’envahissement local, voire à
distance, qui est majoré de cinquante pour cent, en comparaison aux femmes qui se situent
dans le plus bas tertile de l’IMC et de ce fait qui ont de petits bonnets (taille A). L’étude de
Majed et de son équipe sur près de 15000 patientes atteintes d’un cancer du sein, a montré que
pour celles qui étaient en surpoids ou obèses (soit 8% de l’effectif) il y avait un plus mauvais
pronostic. En effet, chez ces patientes, des cancers au stade II et III et des tumeurs de grade
histopronostique III étaient plus souvent observés. De plus, les extensions tumorales locales et
ganglionnaires étaient plus importantes parmi ces patientes (209). Il a été aussi prouvé que des
patientes qui sont obèses avaient une plus grande incidence de présenter des carcinomes
inflammatoires du sein, qui est une forme très agressive et hautement létale du cancer du sein.
Cela a été d’ailleurs montré dans l’étude de Dawood et al (76) menée sur 602 patientes. Ces
patientes là, ainsi que celles qui étaient en surpoids, avaient des tumeurs caractérisées par un
stade TNM avancé, un envahissement ganglionnaire important en comparaison avec des
femmes qui n’étaient pas en surpoids. Ce même constat a été retrouvé par l’étude menée par
Porter et al (269) ainsi que Chang et al (53). Une autre raison suggérant l’association entre de
plus larges tumeurs chez des patientes qui présentent un IMC élevé, est que le tissu adipeux
61
pourrait augmenter la croissance tumorale par des facteurs endogènes. En effet, Daling et al
(73) a montré que sur une population de 1177 patientes ayant un cancer du sein et âgées de
moins de 45 ans, celles qui étaient dans le plus quartile de l’IMC avaient davantage de
tumeurs négatives pour le récepteur aux estrogènes, avaient un index mitotique (test du Ki67)
plus élevé et une fraction de cellules en phase S bien plus importante que ce qui était retrouvé
chez les patientes atteintes de cancer du sein mais étant minces.
c. Pronostic
Un nombre important d’études suggèrent que l’obésité est associée à un mauvais pronostic
dans le cancer du sein. Dans sa revue générale, Carmichael (42) faisait état que de
nombreuses études épidémiologiques (incluant près de trois cent milles femmes) soulignaient
le lien entre un mauvais pronostic pour le cancer du sein chez les patientes obèses. A
contrario, un petit nombre d’études épidémiologiques (enrôlant près de quatre milles femmes)
ne trouvaient pas une telle association (42, 150). Des travaux qui ont objectivé un rôle
pronostique protecteur de la corpulence définie grâce à l’IMC. Il s’agit notamment des
travaux menés par Marret et al (214) effectués à partir d’une cohorte française de six cent
femmes, qui a retrouvé un risque de récidive locale inversement corrélé à l’IMC.
Quant aux travaux de Schapira et al (309) qui ont étudié le lien entre l’obésité et distribution
du tissu graisseux sur le développement du cancer du sein ont montré que les femmes pré
ménopausées (ainsi que les post ménopausées) qui présentaient une distribution haute de la
masse graisseuse (ration entre le tour de taille et le tour de cuisse élevé), avaient un meilleur
pronostic pour le cancer du sein, du fait qu’elles avaient une diminution de l’atteinte
ganglionnaire et présentaient de plus petites tumeurs. Bien que ces arguments laissent penser
que l’obésité serait un facteur de « protection » contre le cancer du sein, d’autres études
viennent contredire ces résultats (43, 42). Une étude plus récente datant de 2005 et menée par
Loi et son équipe (196) a démontré sur plus de mille patientes en pré ménopause, que
l’obésité était un facteur indépendant de mauvais pronostic puisqu’elle était associée à une
récurrence du cancer du sein avec un rapport de risque de 1.50. Ces patientes obèses
présentaient également de plus larges tumeurs et davantage de ganglions atteints. Une autre
étude conduite sur près de 1300 femmes non ménopausées atteintes d’un cancer du sein
invasif, ont une survie nettement diminuée lorsque qu’elles présentent une obésité, soit
abdominale, soit générale (1). Les travaux de Cui et al (70) ont montré, quant à eux, que les
femmes jeunes, ayant moins de cinquante ans et qui étaient obèses, avaient plus de
62
probabilités d’avoir un cancer du sein à un stade avancé au moment du diagnostic (l’odd ratio
étant de 2.34) que les femmes qui avaient un IMC inférieur à 27.3 kg/m2. Les conclusions du
travail de Cleveland et al (65) ont établi que les femmes obèses avaient près de trois fois plus
de risque de mourir
d’un cancer du sein en comparaison à leurs homologues pré-
ménopausées qui ont un poids idéal. Une étude de cas témoins menée par Petrelli et al (265) a
constaté que 30 à 50% des décès consécutifs à un cancer du sein parmi les femmes post
ménopausées dans la population américaine étaient attribuables à l’obésité. Les taux de
mortalité suite à un cancer du sein étaient augmentés en fonction de l’augmentation de l’IMC
et le risque relatif était de 3.08 pour des personnes obèses dont l’IMC était supérieur à 40.
Dans une étude de cas/témoins incluant 3345 femmes (ont 84% sont éligibles) âgées de 50 à
74 ans, avec des cancers invasifs déclarés, les femmes ayant gagné 30kg ou plus depuis l’âge
de 18 ans ont un odd ratio qui s’élève à 2.04 (95% IC : 1.20-3.48) pour les cancers du sein en
comparaison à des femmes présentant les même conditions mais qui ont maintenu un poids
stable (207). L’étude de Majed et al (209, 208) confirme l’implication de l’obésité sur le
mauvais pronostic du cancer du sein. Sur près de 15000 patientes prises en charge pour un
premier cancer du sein unilatéral non métastatique d’emblée et dont le suivi médian était de
huit ans, l’étude a montré qu’il y avait une augmentation significative du risque de décès et de
récidive métastatique chez les patientes ayant un IMC au-delà de 25kg/m2 par rapport aux
patientes ayant un IMC normal. L’augmentation du risque de décès et de récidive
métastatique était d’environ 10% pour les patientes en surpoids et de 20% pour les patientes
obèses. L’étude du risque de récidive controlatérale n’a pas retrouvé d’éventuelles
associations significatives. Toutefois, l’estimation des taux de survie retrouvait des
différences modestes à long terme (à 15 ans de suivi) aux dépens des patientes en surpoids et
obèses. Les risques relatifs objectivaient une augmentation du risque de récidive
controlatérale de l’ordre de 10% pour les patientes en surpoids et de 30% pour les patientes
obèses, en comparaison à celles ayant un IMC normal. Aussi, le risque de survenue d’un
second autre cancer est significativement augmenté de 50% parmi les femmes ayant un IMC
supérieur à 30 kg/m2. Les deux tiers des cas de seconds autres cancers dans cette population
de patientes étant représentés par les cancers du côlon et de l’endomètre. Une autre étude, sur
un nombre plus réduit de patientes (n=1360), vient appuyer le fait que les femmes obèses ont
un risque accru de récurrence à distance de cancer du sein (hasard ratio de 1.5 avec un IC à
95% compris entre 1.02-2.09, P= 0.02). Concernant l’impact de l’obésité, sur la mortalité, et
ceci toutes causes confondues, il y a également une augmentation avec un hasard ration de
1.48 (avec un IC à 95% compris entre 1.00-2.26, P= 0.06) (196). Les patientes qui
63
présentaient un carcinome inflammatoire du sein et qui de surcroits étaient en surpoids ou
obèses présentaient une survie globale et une survie sans rechute qui étaient nettement
diminuées (hasard ratio égal à 1.86 avec un IC à 95% compris entre 1.02-3.4) en comparaison
à des patientes minces ayant elles aussi un carcinome inflammatoire mammaire (76, 53). Les
femmes pré-ménopausées obèses atteintes d’un cancer du sein, dans l’étude de Daling et al
(73) avaient 2.5 fois plus de risque de mourir de leur maladie dans les cinq ans qui suivirent le
diagnostic que les femmes à la corpulence normale. Les travaux de Dignam et al (84) ont
analysé les données d’une étude prospective sur 3385 femmes atteintes par un cancer du sein,
mais sans envahissement ganglionnaire et présentant des récepteurs tumoraux aux estrogènes.
Ils ont retrouvé une augmentation du risque de récidive controlatéral et de survenue d’un
second autre cancer d’environ 60% parmi les patientes ayant un IMC supérieur ou égal à 30
kg/m2, comparativement à celles ayant un IMC inférieur à 25 kg/m2. une étude menée par
Caan et al (38), comprenant 1692 femmes qui ont survécu à un cancer du sein, a montré que
le fait d’être obèse un an avant le diagnostic du cancer du sein était associé à une
augmentation du risque de décès toute causes confondues (hasard ratio de 1.6 avec un IC à
95% compris entre 1.1-2.3) ainsi qu’une augmentation suggérée de décès suite au cancer du
sein (hasard ratio de 1.6 avec un IC à 95% compris entre 0.9-2.7). Dans le même courant de
pensée, les travaux de Cleveland et al (65) ont démontré que chez les patientes qui ont été
diagnostiquées comme ayant un cancer du sein, celles qui sont pré ménopausée et qui ont pris
du poids (plus de 16 kg) entre l’âge de vingt ans et un an avant le diagnostic, ont deux fois
plus de risque de décéder des suites de leur cancer du sein. Pour les patientes qui étaient
ménopausées au moment du diagnostic, celles qui ont gagné plus de 12.7 kg depuis leurs 50
ans jusqu’à un an avant le diagnostic ont vu leur risque de décès, suite à leur cancer, se
multiplier par trois. De plus, une étude portant sur 5204 infirmières qui ont développé un
cancer invasif mais non métastatique, a montré aussi que le poids, avant le diagnostic était
positivement associé à une probabilité de récurrence du cancer du sein et de décès, mais ceci,
seulement chez les patientes qui ne fumaient pas (173). D’autres études, viennent confirmer le
fait que l’obésité est associée à un plus mauvais pronostic et à une survie amoindrie en
comparaison aux femmes qui ont un IMC normal (364, 276). Une étude assez ancienne vient
également confirmer cette hypothèse. En effet, les travaux de Zumoff et al (384) montrent que
le fait de ne pas être obèse au moment de subir une mastectomie, est un facteur prédictif de
survie sans récurrence pour les dix années consécutives à cette opération. En effet, dix ans
après cette mastectomie radicale, les patientes ont été classées en deux groupes. Le groupe des
« survivantes », c'est-à-dire celles qui n’ont pas présenté de récurrence, et le groupe des « non
64
survivantes », à savoir celles qui sont décédées ou qui présentent une récurrence du cancer.
Pour le premier groupe, seulement
25% des patientes étaient obèses au moment de
l’opération (elles présentaient un écart de poids de 20% en comparaison du poids idéal), alors
que dans le groupe des non survivantes, toutes les patientes étaient obèses (avec un écart de
poids de 50% en comparaison du poids idéal) au moment de l’opération.
d. Détection du cancer du sein
Comme nous venons de le voir, une majorité des études épidémiologiques s’accordent
à dire que l’obésité est un facteur de risque dans le développement du cancer du sein chez les
femmes post ménopausées. De plus, l’obésité est également associée à des tumeurs de plus
grandes tailles, et d’un envahissement ganglionnaire plus important au moment du diagnostic.
Elle a été également associée à un mauvais pronostic puisque les patientes obèses présentent
plus de risque de récurrence et ont un taux de mortalité suite au cancer du sein qui est plus
important, en comparaison aux femmes ayant un poids normal.
Plusieurs hypothèses ont été avancées pour tenter d’expliquer ces constatations. Tout d’abord,
l’idée d’un retard dans la détection des tumeurs a été avancée. En effet, il est souvent dit que
les personnes obèses ont une mauvaise image de leur personne et moins d’estime de soi que
des personnes ayant un poids normal, ce qui pourrait conduire au fait que les personnes
obèses soient moins « assidues » pour renter dans les programmes de dépistage. En effet, des
études se sont arrêtées sur la fréquence des examens de dépistage chez un grand nombre
femmes, et ceci en fonction de leur IMC. Il a donc été décrit qu’en comparaison avec des
femmes qui ont un IMC normal, les femmes obèses ont eu moins tendance à faire des
mammographies, voire aucune, dans les deux ans qui ont précédé le diagnostic d’un cancer du
sein (odds ratio égal à 1.8 avec un IC à 95% compris entre 1.2-2.6). Cette différence étant
retrouvée chez les femmes blanches, et non pas chez les femmes noires (383). L’autre facteur
qui a été suggéré comme participant au retard de la détection des tumeurs, est le fait que chez
les femmes obèses, la palpation des tumeurs est plus délicate que chez des femmes minces. En
effet, le sein est constitué de la glande mammaire (là où se développent généralement les
tumeurs) et d’une couche de tissu graisseux qui sont recouvertes par la peau. Normalement,
cette couche de tissu graisseux est fine, et cela ne gêne pas la palpation d’une présente
tumeur. Pour les patientes souffrant d’obésité, cette couche de tissu graisseux peut devenir
assez épaisse et gêner la palpation. Les travaux de Reeves et al (277) ont montré que sur 2863
patientes présentant un cancer invasif du sein, celles qui avaient un haut IMC présentaient un
65
état avancé de la maladie, surtout pour celles dont les cancers avaient été diagnostiqués suite à
une autopalpation et non pas suite à une mammographie ou un examen clinique du sein. Ariel
et al (10) a également recensé le cas d’une patiente qui après avoir perdu beaucoup de poids, a
présenté un renflement mammaire qui s’est révélé être un carcinome. Cette situation, où le
tissu graisseux « cachait » les tumeurs, a été retrouvée chez plusieurs patientes. Chapgar et al,
quant à eux, ont démontré que les patientes qui avaient des tumeurs palpables, présentaient
des IMC plus bas que les patientes qui à contrario, avaient des tumeurs non palpables (51).
Pour les femmes obèses, qui pourraient présenter des tumeurs difficilement palpables, il est
donc recommandé de procéder à d’autres examens, et notamment à des mammographies. Ce
dernier point a été également discuté afin de déterminer si la mammographie était aussi
sensible pour détecter les tumeurs chez les femmes obèses, qui présentent des seins plus
volumineux que chez les femmes ayant un poids normal. Plusieurs études ont mis en avant, le
fait que les femmes obèses, étaient plus fréquemment la cible de « fausses » détections, au
moment de la mammographie et que ces dernières faisaient l’objet de tests complémentaires
(92, 130) que leurs homologues ayant un poids normal. Une étude portant sur un grand
nombre de patientes (près de 290000 patientes post-ménopausées et ne prenant pas de
traitement hormonal de substitution) a montré que la sensibilité de la mammographie n’était
pas la raison principale qui pouvait expliquer le fait qu’un nombre augmenté de cancers de
sein à des stades avancés, étaient détectés chez des patientes post-ménopausées, en surpoids
ou obèses, en comparaison à des femmes post-ménopausées normo-pondérées (157). En effet,
malgré le fait qu’il existe une petite différence sur l’observance de la mammographie (il a été
trouvé que 80.7% des femmes obèses de catégorie II/III ont subi cet examen dans les deux ans
qui ont précédé la découverte de leur cancer, contre 85.8% pour des femmes ayant un poids
normal), cela ne contribue pas à expliquer le taux augmenté de détection de cancers à des
stades avancés. De plus, la détection « ratée », de cancers, qui se mesure par l’apparition d’un
cancer dans les douze mois qui suivent la mammographie, est similaire entre les femmes qui
sont en surpoids ou obèses à celle qui ont un poids normal.
La densité mammaire est un important facteur de risque dans le développement d’un cancer
du sein (155), et Wolfe dans les années 70 a été le premier à le reconnaître. Depuis ces
premières observations, des études sont venues accentuer le fait qu’il existait une association
entre l’augmentation de la densité mammaire et le risque de cancer du sein (155). En effet, la
densité mammaire qui est fonction de l’abondance du tissu épithélial et des tissus connectifs,
pourrait agir comme un écran et ainsi, masquer la présence de cancers lors des
mammographies. Selon l’étude menée par BI-RADS (American College of Radiology Breast
66
Imaging Reporting and Data System), le taux de cancers non détecté par mammographie (taux
défini comme étant le nombre de cancers détectés dans les douze mois qui suivirent une
première détection négative) est aussi élevée chez les femmes qui ont une densité mammaire
importante que chez les femmes qui ont des seins qui sont classés dans la catégorie « presque
entièrement graisseux (155). Ces travaux sont en accord avec ceux trouvés par Boyd et al
(31) qui ont montré que L’IMC et la densité mammaire étaient des facteurs indépendants de
risque dans la survenue des cancers du sein. Il faut tout de même préciser que les IMC
importants sont négativement corrélés à la densité mammaire (31). En effet, il a été démontré
que les seins qui présentent un contenu graisseux assez élevé (ce qui était retrouvé chez des
femmes de plus de cinquante ans) permettaient une augmentation de la détection de tumeurs
(156, 130).
Pour expliquer le mauvais pronostic du cancer du sein chez les femmes obèses, il a été
également souligné tant pour la radiothérapie que pour la chimiothérapie, des réductions de
doses délivrées chez les femmes en surpoids ou obèses étaient courantes pour éviter la
toxicité du traitement (43, 203). En effet, les doses des médicaments utilisés en
chimiothérapie, sont calculées en fonction de la surface du corps qui prend en compte la taille
et le poids du patient. Par souci de limiter les effets toxiques, une limitation des doses
couvrant une aire du corps de 2m2 maximale était préconisée. Cela dit, des études où les doses
étaient calculées en fonction de l’aire du corps, réelle, pour les femmes en surpoids ou obèses,
sans se limiter à 2m2 n’ont pas montré de toxicité particulières chez ces femmes là, puisque
des hospitalisations suite à un état fébrile dû à une neutropénie n’était pas retrouvé plus
fréquemment
en comparaison aux femmes ayant un poids normal et recevant la doses
calculée en fonction de son poids réel (109, 289). Une augmentation des globules blancs serait
même retrouvée chez ces patientes. De plus, l’utilisation de doses calculées suivant le poids
réel des patientes, améliore la survie globale et la survie sans rechute de ces femmes en
surpoids ou obèses, en comparaison à des femmes qui auraient reçu une réduction de dose
(109). Selon les travaux de Bastarrachea et al (21), dans une étude comprenant 735 patientes
ayant des cancers du sein à des stades II ou III, l’obésité serait un facteur qui diminuerait
l’efficacité de la chimiothérapie. En effet, les patientes obèses qui ont eu des doses calculé sur
leur poids réel, ont un risque de récurrence étant 1.33 trois plus important (IC compris entre
1.05 et 1.68) que les femmes non obèses. Ce bilan négatif, pourrait s’expliquer par le fait que
l’obésité pourrait jouer un rôle important dans la clairance des agents anticancéreux, avec une
augmentation significative de l’élimination du cyclophosphamide (21). Cependant, on peut
trouver des études contradictoires qui montrent que l’obésité ne modifie pas l’efficacité du
67
tamoxifène (84). Pour terminer, le fait que l’obésité est considérée comme un facteur de
mauvais pronostic dans le cancer du sein, pourrait aussi provenir du fait que la chirurgie
locorégionale est un challenge chez les personnes obèses. La chirurgie dans le creux axillaire
pour enlever des ganglions lymphatiques potentiellement colonisés par les cellules
cancéreuses, chez les personnes obèses, est associée à une augmentation de l’incidence de
lymphoedème, d’autant plus si la chirurgie est suivie, malheureusement, par une infection. De
plus, cette chirurgie axillaire chez les patientes obèses, est également associée avec une
augmentation de l’incidence des complications à long terme de la radiothérapie, comme par
exemple, le lymphoedème, la réduction de la mobilité de l’épaule (43).
Au vu de tout ce qui vient d’être cité, on ne peut que conclure, qu’en dehors des problèmes
« techniques » que peut susciter l’obésité, il y a bien une composante biologique, dévolu au
tissu adipeux qui rentre en ligne de compte dans le développement du cancer du sein et dans
son devenir.
e. Surpoids et obésité après le diagnostic : impact sur le pronostic et le traitement.
D’après ce qui a été cité précédemment, le fait d’être obèse au moment du diagnostic
laisse présager un mauvais pronostic ainsi qu’une survie diminuée pour les femmes atteintes
d’un cancer du sein. Des études se sont également penchées sur l’impact de la prise de poids
et par extension de l’obésité sur le devenir de ces cancers du sein, après le diagnostic. En
effet, la prise de poids après le diagnostic est un fait fréquemment rapporté pour les patientes
atteintes d’un cancer du sein, et tout spécialement parmi les femmes qui reçoivent une
chimiothérapie adjuvante par voie systémique ( pour revue (81)). C’est ce qui a été rapporté
dans l’étude de Lankester et al (181). Sur 100 patientes traitées par chimiothérapie, soit avec
la combinaison FEC (fluorouracil, epirubicin, cyclophospahmide), soit avec le CMF
(cyclophosphamide, methotrexate, fluorouracil 5FU), approximativement, 64% des patientes
ont pris plus de 2kg, 31% ont maintenu leur poids et 5 patientes on même perdu plus de 2 kg
indépendamment du statut ménopausique. Des études épidémiologiques ont montré un lien
entre la récurrence du cancer du sein et la prise de poids après le diagnostic. C’est le cas
notamment de l’étude de Kroenke et al (173) qui sur 5024 infirmières retenues pour l’étude, a
montré que les patientes ayant gagné entre 0.5 et 2.0 kg/m2 ou plus de 2.0 kg/m2 après le
diagnostic, ont un risque plus élevé de présenter une rechute de leur cancer du sein, en
comparaison aux femmes qui ont maintenu leur poids. Ici par contre, ce phénomène semble
plus important chez les femmes pré ménopausées que chez les femmes post ménopausées.
68
Une autre étude venant confirmer cette hypothèse a été menée par Camoriano et al (40) dans
laquelle il a été observé que sur 545 patientes qui ont reçu une chimiothérapie adjuvante suite
à une mastectomie pour des cancers avec envahissement ganglionnaire, les femmes qui ont
été traitées ont eu tendance à gagner du poids. Le poids médian gagné étant de 3.6 kg pour les
femmes post ménopausées et 5.9 kg pour les femmes pré ménopausées. Après un suivi moyen
de 6.6 ans, les femmes pré ménopausées ayant gagné plus que le poids médian précédemment
cité, avaient 1.6 fois de risque de mourir et 1.5 fois plus de risque d’avoir un épisode de
rechute que les femmes pré ménopausées qui ont pris moins de poids que le poids médian.
Pour les femmes post ménopausées, la tendance d’une survie globale et d’une absence de
rechute, amoindrie, par cette prise de poids n’est pas significative. A contrario, les études
menées par Caan et al (38, 37) qui comprenaient respectivement, 1692 et 3215 patientes
atteintes d’un cancer dans les phases précoces, ont montré que ni la prise de poids modérée
(entre et 5 et 10% du poids au diagnostic) ni une prise de poids plus conséquente (plus de
10% du poids au diagnostic) n’avaient d’incidence sur la l’augmentation du risque de rechute
et de décès toutes causes confondues suite au cancer du sein.
Bien que la prise de poids apparaisse comme un sérieux problème pour les patientes ayant un
cancer du sein, les mécanismes qui sont à l’origine de cette prise de poids ne sont pas
totalement élucidés. La consommation de régimes riches en graisses, pourrait être un des
mécanismes qui explique le lien entre obésité et cancer du sein. En effet, des études
épidémiologiques ont pointé du doigt cette hypothèse. Les travaux de Zhang et al (379) ont
démontré que des régimes riches en graisses étaient associés à une réduction de la survie de
femmes post ménopausées qui avaient un cancer du sein. De plus, les travaux de Saxe et al
(306) conclu que des régimes contenant des acides gras saturés, ou insaturés augmentaient les
risques de récurrence et de décès, chez des patientes atteintes d’un cancer du sein et suivie sur
une période de 5 ans ou plus. De plus dans la revue de Rock et al (282) on peut trouver que
sur cinq des huit études de cohorte menées depuis 1985 sur l’impact de l’alimentation sur le
cancer du sein, les femmes qui ont des régimes riches en fruits, légumes et autres nutriments
comme la vitamine C, le β-carotène…présentent une probabilité de survie augmentée. Aussi,
la réduction de la consommation de régimes riches en graisse contribuerait à diminuer les
taux endogènes des estrogènes chez les femmes pré et post ménopausées. C’est d’ailleurs ce
qu’ont démontré les travaux de Wu et al (369). Pour des femmes qui se sont astreintes à des
régimes alimentaires qui présentaient une diminution de 10 à 12% du contenu en graisses, une
diminution significative de l’œstradiol plasmatique de 7.4% pour les femmes pré
ménopausées et de 23% pour les femmes post ménopausées, étaient observable. Des travaux
69
semblables menés par Prentice et al (270) ont montré que chez des patientes post
ménopausées, en bonne santé, une diminution de 17% de leur concentration moyenne
d’œstradiol était associée à une perte de poids moyenne de 3.4 kg en suivant un régime
alimentaire quotidien qui contenait un faible taux de lipides (29.5g au lieu de 68.5g). De plus,
une perte de poids chez les femmes obèses, s’accompagne d’une diminution des quantités
d’insuline et d’une augmentation des concentrations de SHBG. Chez la femme obèse pré
ménopausée, ces observations sont également retrouvées mais des effets sur le niveau des
estrogènes ne sont pas retrouvés (59). Pour terminer sur la prise alimentaire comme
mécanisme expliquant l’obésité, d’autres études qui ont mené leurs travaux sur une vingtaine
de patientes, suggèrent également que l’hyperphagie est retrouvée chez les patientes qui
souffrent d’un cancer du sein et qui sont traitées. Cependant le petit nombre de patientes
incluses dans ce genre d’étude, et de plus, les données étant répertoriées sur les témoignages
des patientes, des études complémentaires sont à envisager pour confirmer cette hypothèse
(81).
La diminution de l’activité physique est aussi un facteur qui pourrait conduire à la prise de
poids chez les patientes souffrant d’un cancer du sein. En effet, un état de fatigue a été
rapporté dans 96% des cas, ce qui ne contribue pas à l’activité physique (81). Pourtant une
étude prospective sur 2987 patientes atteintes de cancer du sein non métastatique, basée sur le
témoignage des patientes, a montré que l’activité physique après le diagnostic du cancer du
sein pouvait diminuer le risque de décès suite à ce cancer. Le plus grand bénéfice était
retrouvé chez les femmes qui avaient une activité physique équivalente à celle d’une marche
de 3 à 5h par semaine à allure modérée. Le bénéfice de l’activité physique était surtout
observé pour les femmes ayant des tumeurs hormones dépendantes (119). Une autre étude qui
appuie ce qui vient d’être cité, montre que les femmes post ménopausées qui font
régulièrement de l’exercice physique présentent des niveaux circulant d’estrone et
d’androgènes qui sont 15 à 25% plus bas que ceux des femmes post ménopausées plus
sédentaires (240, 48).
Au vu de tout ce qui vient d’être décrit, on peut donc dire qu’il existe une association entre
l’obésité et le cancer du sein, pour les femmes post ménopausées. Dans la majorité des
études, on dénote également que l’obésité est un facteur de mauvais pronostic à la fois pour
les femmes pré et post ménopausées. Le risque de développer un cancer, attribuable à
l’obésité est comparable au risque de développer un cancer, lors d’une histoire de cancers
familiaux (17). Il est suggéré que la réduction de l’obésité pourrait diminuer les cas de cancers
du sein de un dixième en Europe avec pour conséquence, une réduction de la mortalité(153).
70
Il est craint que dans les prochaines années, l’augmentation de l’obésité ne rende difficile la
diminution de la mortalité face au cancer du sein, étant donné que cette dernière participe
activement au développement de cette maladie.
71
III) Obésité et adipokines : lien avec le cancer.
Les déséquilibres énergétiques chroniques qui sont à l’origine du développement de
l’obésité contribuent aux dysfonctions du tissu adipeux. Les phénomènes d’hypertrophie et
d’hyperplasie de l’adipocyte, de stress sur le réticulum endoplasmique lorsque les capacités
de stockage des lipides sont dépassées, ainsi que les dysfonctions des mitochondries
entraînent un changement dans le relarguage des adipokines, une augmentation de la
libération des acides gras libres et des médiateurs inflammatoires, causant ainsi, les effets
néfastes
sur le foie, le pancréas et le muscle squelettique, ainsi que sur le cœur et le
compartiment vasculaire. Ce bouleversement du métabolisme de l’adipocyte donne lieu à une
modification de toutes ses sécrétions, au cours de l’obésité.
A) Obésité et PAI-1
La possibilité que le tissu adipeux, en lui-même contribue à sécréter de grandes quantités
de PAI-1 au cours de l’obésité, est née du fait que des taux anormaux de PAI-1 étaient
associés à des désordres vasculaires (thromboses, infarctus du myocarde) et que ces désordres
vasculaires se retrouvaient fréquemment chez des personnes obèses. Les premiers indices en
faveur du tissu adipeux sécréteur de PAI-1 sont le résultat de la détection de grandes quantités
d’ARN messager de PAI-1 dans le tissu adipeux de souris. De plus, des études cliniques ont
montré que la perte de poids dues soit à une résection de la masse grasse (271), soit par
l’exercice physique (99) chez des personnes obèses, entraine une diminution de la quantité
PAI-1. Le taux de PAI-1 s’élève de nouveau si les personnes reprennent du poids (219). Ces
constations initiales ont pu être étudiées en utilisant des modèles de souris obèses, les souris
ob/ob. Dans ces souris, les analyses comparatives de l’expression de PAI-1 ont montré qu’il y
avait une expression cinq fois plus importante de PAI-1 dans les souris obèse ob/ob que dans
des souris minces, et que cette augmentation était le reflet de l’expression du tissu adipeux car
de faibles augmentations de l’ARNm de PAI-1 ont été retrouvées dans les cellules
endothéliales, suggérant donc que le tissu adipeux est celui qui contribue le plus à sécréter de
grandes quantités de PAI-1, surtout au cours de l’obésité (298). Le tissu adipeux est avant tout
composé d’adipocytes qui proviennent de la différenciation de pré-adipocytes. Des travaux de
Seki et al (312) ont montré qu’en présence de sérum ou d’insuline, les adipocytes et non pas
les préadipocytes (3T3-L1) exprimaient PAI-1 au niveau transcriptionnel. Le rôle clé de
72
l’adipocyte dans la sécrétion de PAI-1 a été confirmé par le fait que des adipocytes obtenus
après la différenciation des 3T3-L1, étaient capables d’exprimer à des taux conséquents PAI-1
tant au niveau transcriptionnel que protéique (317). De plus l’expression des ARNm de PAI-1
était plus forte dans le tissu adipeux viscéral que dans le tissu adipeux sous-cutané de rats
obèses, ce qui pourrait donc suggérer le lien entre obésité et cancer du colon.
Pour terminer, l’expression de PAI-1 est soumise à de nombreuses régulations, et notamment
une régulation de la part de cytokines. En effet, il a été montré que le TNF-α était capable
d’induire PAI-1 dans des adipocytes « matures » issus de la différenciation des 3T3-L1 (299)
et que l’administration de TNF-α (qui est surexprimé au cours de l’obésité) chez des souris
minces, augmentait significativement le taux d’ARNm de PAI-1 dans les adipocytes ainsi que
dans les cellules musculaire lisses du tissu adipeux. De plus, des explants humains de tissus
adipeux répondent également par une augmentation de l’ARNm de PAI-1 en réponse à la
stimulation exogène du TNF-α (61). L’insuline et le TGF-β sont décrits également comme
étant des inducteurs de la synthèse de PAI-1 (298). De même l’IL-6 induit la sécrétion de
PAI-1 dans des 3T3-L1 (171).
B) Obésité et Leptine
La leptine est principalement exprimée par le tissu adipeux et au niveau du tissu
adipeux, son expression est restreinte aux adipocytes matures alors qu’elle est très faiblement
exprimée dans les lignées pré-adipocytaires en culture, même différenciées (202). La leptine a
été identifiée comme étant un facteur de satiété faisant le lien entre le statut nutritionnel de
l’organisme, le contrôle de la prise alimentaire et la dépense énergétique. La leptine est
fortement augmentée dans le tissu adipeux d’hommes ou d’animaux obèses de même que les
taux plasmatiques qui peuvent être corrélés avec la masse adipeuse totale chez la souris ou
chez l’homme (205). L’expression de l’ARNm de la leptine est plus importante dans le les
adipocytes du tissu adipeux sous-cutané que dans ceux du tissu adipeux viscéral (229). Il
semble que ces différences soient dues à la taille des adipocytes des différents dépôts. Il a été
démontré que la taille des adipocytes est un facteur déterminant dans la quantité de leptine
sécrétée. Les adipocytes les plus gros ayant une plus forte expression de leptine, et ceci, pour
un même individu (68). Cependant il n’est pas déterminé si l’augmentation du contenu en
triglycérides, les facteurs mécaniques associés à l’augmentation de la taille des adipocytes
influence l’expression de la leptine. Avec toutes les cibles de la leptine qui ont été citées dans
73
le chapitre précédent, on peut donc conclure que si cette protéine est surexprimée au cours de
l’obésité, ses actions sur la promotion de la carcinogenèse le sont également. Dans les études
cliniques, il y a cependant des résultats contradictoires. Il est cependant reconnu que les
patientes en période post ménopausique ont davantage de cancers du sein lorsqu’elles ont des
taux de leptine élevés. Il est donc important de considérer que la leptine a des actions
spécifiques sur les cellules néoplasiques. Le développement de cancers agressifs pourrait
provenir également d’une sur stimulation de l’épithélium mammaire par des œstrogènes et
que ceci soit lié à une production anarchique de leptine par le tissu adipeux en condition
d’obésité. La leptine est impliquée dans la progression des carcinomes mammaires qui sont
dépendant des estrogènes. Elle est capable de stimuler l’activité aromatase, ce qui a pour
conséquence la production d’estrogènes à partir d’androstènedione, dans le tissu adipeux,
entraînant ainsi une stimulation des cancers dépendants de ces hormones.
C) Obésité et adiponectine
Contrairement à toutes les autres adipokines qui au cours de l’obésité, se retrouvent
être corrélée positivement, l’adiponectine connait une régulation inverse. Les taux circulants
d’ApN in vivo sont inversement corrélés à un risque élevé de cancers, associés à un contexte
d’obésité et de résistance à l’insuline (152). Il a été montré que l’obésité augmente les taux de
cancers du sein chez les femmes ménopausées de 30 à 50 % (367). Les cas d’insulino
résistance et d’obésité sont associés au développement de cancers du sein, et la diminution
observée des niveaux d’ApN souligne l’association entre cancer du sein et obésité (213). Dans
les cas d’obésité, la réduction de l’ApN conduit à un développement de la résistance à
l’insuline et pour compenser, l’organisme se retrouve en situation d’hyper insulinémie.
L’augmentation des taux d’insuline provoque une diminution de la part du foie, de la synthèse
d’IGFBP-1 et 2 (insulin-like growth factor), ce qui résulte en l’augmentation de l’IGF-1
biodisponible. L’insuline et l’IGF-1 lorsqu’ils se lient sur leurs récepteurs, permettent la
prolifération cellulaire et l’inhibition de l’apoptose dans de nombreux tissus, en augmentant la
sécrétion du VEGF, contribuant ainsi à la carcinogenèse (152).
L’ApN a été aussi reconnue pour diminuer la production de TNF-α dans les macrophages et
inhiber son action sur les cellules endothéliales (256). Le TNF-α comme nous l’avons vu
étant impliqué, à la fois dans la synthèse des estrogènes par sa stimulation de l’activité
aromatase mais aussi comme facteur pro-angiogénique. Il est évident que si ses actions, sont
74
accrues du fait d’un défaut de production d’ApN au cours de l’obésité, tout cela contribue à
amplifier la carcinogenèse.
D) Obésité et statut inflammatoire
Il est maintenant admis que l’inflammation joue un rôle important dans la promotion
et le développement tumoral. Les inflammations chroniques locales observées au cours de la
maladie de Crohn contribuent à augmenter les risques d’apparition de cancers du colon (139).
De plus, l’utilisation chronique de traitements anti-inflammatoires, réduit les risques de
mortalité liés à certains cancers (pour revue (16)). En effet, des patients ayant reçu ce genre de
traitements présentent moins de
cancers du colon. Des expériences chez l’animal ont
également montré que l’utilisation concomitante de ce genre de traitement lorsque l’animal
était soumis à des carcinogènes, était accompagnée d’une diminution des cancers de la vessie,
du colon. Ces anti-inflammatoires non stéroïdiens inhibent la cyclooxygénase. Cette enzyme
est induite par des cytokines et elle est exprimée lors des cancers et lors de conditions
inflammatoires. Dans une étude en double aveugle de six mois regroupant des patients atteints
de cancer familiaux comme les adénomes polyposis qui quotidiennement prenaient du
celecoxib, un inhibiteur de la cyclooxygenase, les auteurs ont constaté, chez ces patients, une
diminution significative du nombre de polype colorectaux (335). Le rôle précis de ces
composants inflammatoires dans la carcinogenèse n’est pas totalement élucidé. Il est reconnu
qu’au cours de l’obésité, il existe un état inflammatoire dit de « bas grade », qui est caractérisé
par une élévation systémique modérée mais chronique d’un ensemble de molécules. Cette
situation inflammatoire de « bas grade » est une caractéristique majeure du mauvais
fonctionnement du tissu adipeux, et cette dysfonction pourrait être un lien clé entre l’obésité
et le cancer. Il a été rapporté une augmentation de l’expression du TNF-α dans le tissu
adipeux de plusieurs modèles de rongeurs obèses (122) et dans le tissu adipeux sous-cutané
humain d’individus obèses (121), suggérant que plus les adipocytes augmentent de taille (ce
qui se passe au cours de l’obésité), plus ils sont sécréteurs pour cette cytokine. Cette
corrélation n’a pas été retrouvée dans les travaux de Hauner et al (116). Chez le rat,
l’expression du TNF-α augmente également avec la taille des adipocytes (233). Il a été
également décrit que la perte de poids s’accompagnait d’une diminution des concentrations
plasmatiques de TNF-α et d’IL-6 (158). De plus, des animaux nourris avec des régimes riches
en graisses, augmentent le contenu en TNF-α dans leur tissu adipeux (232). Concernant les
75
études cliniques faisant un lien entre obésité, inflammation et cancer, les résultats obtenus par
le groupe de Kim (165) ont montré que le tissu adipeux pouvait produire des médiateurs
inflammatoires comme l’IL-6 et le TNF-α, qui pouvaient induire des cancers colorectaux car
une corrélation positive entre ces deux facteurs était retrouvée chez les individus obèses. De
même, dans une étude menée par Il’yasova et al (133) sur des patients qui ne présentaient pas
au moment de l’étude de cancer, a montré que le risque de développer un cancer et de mourir
des suites de ce dernier était augmenté lors de situation d’inflammation chroniques. Par
exemple, le risque de mourir d’un cancer était 1.28 plus élevé lorsque les patients avaient une
augmentation de la production d’IL-6 et 1.13 plus de risque lorsqu’il s’agissait d’une
augmentation du TNF-α. Le groupe de Bozcuk et al (32) a montré que le TNF-α était un
marqueur prédictif dans la survie globale et dans la survie sans rechute dans les cancers du
sein. A contrario, l’étude de Gonullu et al (105) constate que les patients en surpoids ou
obèses ayant un cancer du sein à un stade précoce présentaient des concentrations élevées
d’IL-6 et non pas de TNF-α, en comparaison avec des individus sains.
E) Obésité et acides gras
Le cancer du sein est le cancer majoritaire chez les femmes et il est la seconde cause
de mortalité par cancer, chez les femmes américaines. Selon les statistiques américaines, pour
l’année 2009, il avait été estimé que 200 000 nouvelles femmes seraient diagnostiquées pour
un cancer du sein, et 40 000 mourront de ce cancer. Etant donné que la grande incidence des
cancers du sein chez les femmes d’Amérique du Nord est corrélée à un environnement décrit
comme celui du « western lifestyle », qui est la combinaison de régimes alimentaires ayant un
excès d’apport calorique avec une diminution des dépenses énergétiques, ceci se manifeste
par le développement de l’obésité. A partir de ce constat, l’idée que le régime alimentaire
pouvait être associé au risque du cancer du sein a germé. Un bon nombre conséquent d’études
épidémiologiques ont suggéré que de fortes consommations d’aliments riches en graisses
avaient des effets délétères sur l’issue de patientes ayant subi une tumorectomie après un
premier cancer du sein (247, 284, 379). Pour confirmer le rôle du régime alimentaire dans le
développement du cancer du sein, des études sur les rongeurs ont été réalisées et c’est
Tannenbaum qui, il y a plus de cinquante ans a montré que les régimes riches en graisse
augmentaient la survenue de tumeurs mammaires chez les rongeurs. Des résultats
contradictoires ont été retrouvés. Par exemple, dans l’étude menée par Carrington et al (44),
76
un régime pauvre en graisse sur des Balb/c chez qui, des cellules tumorales avaient été
injectées (lignée WAZ-2T (± SA) ou des cellules pré néoplasique (CL-S1), entraînait une
augmentation du potentiel invasif et métastatique des deux lignées tumorales. A contrario, le
régime riche en graisse inhibait la croissance des cellules épithéliales normales ou pré
néoplasiques. Les travaux de Kalid et al (162) ont montré que des régimes riches en graisses
(bien que les souris ne présentent pas de résistance à l’insuline, mais sont tout de même
obèses), augmentaient l’incidence de la survenue d’un second cancer avec un plus grand
nombre de tumeurs, sans que l’incidence sur la survenue du premier cancer soit modifiée avec
des animaux sous un régime pauvre en graisses. Les travaux de Rose et al viennent renforcer
cette idée. En effet, chez la souris nude, qui a été injectée avec des MDA-MB-435, l’intervalle
de latence pour l’apparition des tumeurs chez les animaux qui ont été nourris avec une régime
riche en graisse est plus court que pour les souris nourries avec un régime pauvre en graisse.
De plus, concernant la croissance tumorale, bien que la différence soit peu importante, elle
tout de même significative entre les deux régimes alimentaires, celui riche en graisse
augmentant la croissance tumorale. Aussi, les animaux soumis au régime riche en graisses
présentent une augmentation des métastases du cancer mammaire (288). Toujours selon le
même auteur, dans sa revue (287), il a fait référence au type d’acides gras qui pouvaient
induire les effets observés. Notamment, les acides gras n-3 (que l’on retrouve dans l’huile
issue de poissons) sont capables d’inhiber l’invasion in vitro des MDA-MB435 ainsi que la
croissance tumorale et le processus métastatique in vivo. Au contraire, les acides gras n-6
contenus dans l’huile de maïs comme l’acide linoléique, sont quant à eux capable de stimuler
les capacités invasives des MDA-MB-735 in vitro par des mécanismes visant à augmenter la
MMP-9 (287). D’autres travaux viennent confirmer l’implication des acides gras. En effet sur
une étude portant sur 121 patientes atteintes de cancer du sein, le contenu en acide gras du
tissu adipeux mammaire entourant la tumeur a été analysé. Lorsque le tissu adipeux contenait
de faibles taux d’acide α -linoleique (18 :3
n-3),
ceci était associé à une infiltration
ganglionnaire et à une invasion du compartiment vasculaire par les cellules tumorales, ce qui
suggère que cet acide gras joue un rôle dans les processus métastasiques (30).
F) Obésité et estrogènes
Plusieurs hypothèses ont été proposées pour expliquer l’association qu’il existe entre
l’obésité et le risque du cancer du sein chez la femme en période post-ménopausique. Il a été
77
décrit que le tissu adipeux pouvait influencer la synthèse et la biodisponibilité des hormones
stéroïdes endogènes et particulièrement, les estrogènes et ceci par plusieurs mécanismes.
Comme cela a été décrit dans le chapitre précédent, le tissu adipeux est capable de sécréter
des quantités non négligeables d’estrogènes, grâce à sa capacité à aromatiser les androgènes
endogènes circulants qui sont sécrété par les surrénales notamment, pour les transformer en
estrogènes. Il a été décrit que le tissu adipeux était la principale source de production
d’estrogènes chez l’homme et la femme post ménopausée et que l’IMC et les taux circulants
d’estrone et d’œstradiol étaient liés (pour revue (39, 198). Chez les sujets ayant un IMC
supérieur à 30 kg/m2 les concentrations des différents estrogènes étaient statistiquement plus
importantes (ceci allant de 60% à 219%) en comparaison aux femmes minces, à savoir celles
qui avaient un IMC inférieur à 22.5 kg/m2 (160). De plus, le ratio REα/REβ est plus important
dans les tumeurs du sein, en comparaison au ratio dans un tissu normal. Aussi, les femmes
post ménopausées qui sont obèses et qui ont des cancers du sein, présentent des cancers qui
sont plus souvent REα positifs, ce qui appuie l’hypothèse que l’obésité contribue au
développement tumoral par une synthèse accrue des estrogènes (62). De plus, il a été aussi
montré que les femmes obèses post ménopausées avaient une augmentation de l’activité
aromatase (198), ce qui va dans le sens d’une augmentation des taux d’estrogènes. Il a été
aussi décrit, toujours pour ces patientes là, qu’une diminution de l’efficacité de réponse à un
inhibiteur de l’aromatase, le letrozole, en comparaison à des femmes minces post
ménopausées, ce qui suggère que de plus fortes doses de cet inhibiteur sont nécessaires pour
contrecarrer l’augmentation des estrogènes (59). Une méta-analyse de six études prospectives
a indiqué que les femmes qui développaient des cancers du sein, en période postménopausique avaient une augmentation significative des taux d’estrogènes de 15% en
comparaison à celles qui ne développent pas la maladie. De plus, une autre méta-analyse
regroupant neuf études prospectives a montré que le risque de cancer du sein était doublé
lorsque de forts taux d’estrogènes étaient retrouvés (pour revue (62)).
L’autre mécanisme qui fait que le tissu adipeux influence la biodisponibilité des estrogènes,
est la modification de la SHBG (sex hormone bonding globulin). Au cours de l’obésité, une
augmentation des taux d’insuline sont observables, et cela a pour conséquence, de réduire la
synthèse hépatique de SHBG, qui est une protéine plasmatique qui lie avec une haute affinité
la testostérone et avec une affinité moindre, l’œstradiol (320). Il a été montré dans de
nombreuses études que cette protéine était diminuée au cours de l’obésité (pour revue (39)),
ce qui contribue donc à augmenter la fraction libre de cette hormone. Des régimes
alimentaires qui conduisent à une restriction énergétique chez des personnes en surpoids ou
78
obèses, entraînent de rapides et significatives augmentations de la concentration de SHBG
(pour revue (114)). Il a été dit que les femmes post ménopausées qui avaient un surpoids
(23kg au dessus de leur poids idéal) avaient des capacités de liaison de la SHBG qui étaient
égales à seulement 20 à 30% de ce qui était retrouvé chez leur homologues ayant un poids
normal. Cela se traduisait par une augmentation d’un facteur 2 à 3 de la fraction biodisponible
des estrogènes (320). De plus, la pré-incubation de la lignée de cancer du sein, MCF-7 avec
SHBG, avant le traitement par l’œstradiol, inhibe les effets anti-apoptotiques de l’œstradiol.
Ainsi SHBG apparait comme étant un régulateur de l’action des estrogènes dans les cancers
du sein, agissant comme un facteur anti-prolifératif, la perte de ce dernier chez les personnes
obèses contribuant à la tumorigenèse (198).
G) Obésité et IGF-1
Le dernier mécanisme qui contribuerait à augmenter la production d’estrogène dans le
tissu adipeux, est qu’au cours de l’obésité et chez les femmes post ménopausées, il a été décrit
qu’il y avait aussi une augmentation de taux circulants d’insuline et d’insuline-like growth
factor-1 (IGF-1). L’hyperinsulinémie observée au cours de l’obésité peut affecter la
tumorigenèse en contribuant à la synthèse et à l’activité de l’IGF-1, un facteur de croissance
de plus en plus reconnu dans la le cancer du sein. Au cours de la dernière décennie, de
nombreuses preuves se sont accumulées en faveur de l’implication d’IGF-I dans la
progression du cancer du sein. Il a été décrit dans des études de cas/témoins que de grands
taux d’IGF-I dans le sérum des patientes étaient un marqueur de l’augmentation du risque de
cancer du sein. Comme ce facteur de croissance est globalement sécrété par les cellules
stromales et non pas par les cellules tumorales elle-même, il y a tout lieu de penser qu’une
modification des concentrations d’IGF-I peuvent être retrouvés au cours de l’obésité. Il a été
décrit qu’il n’y a pas de relation linéaire entre l’IMC et le taux circulant d’IGF-I. En effet,
certaines études soulignent le fait que le taux maximum d’IGF-I a été retrouvé chez des
personnes ayant un IMC compris entre 24 et 27 kg/m2 (pour revue (39)). L’hypothèse qui a
été avancée pour expliquer ce phénomène est que les personnes obèses, malgré le fait qu’elles
aient une sensibilité à l’hormone de croissance plus importante, présentent une réduction des
protéines IGFBPs qui sont impliquées dans le rétrocontrôle négatif de l’IGF libre sur la
glande pituitaire, sécrétrice d’hormone de croissance. A côté de cela, au cours de l’obésité,
suite à l’excès d’acide gras libre, l’organisme répond par une hyperinsulinémie (39).
79
L’insuline, quant à elle, est capable de stimuler la synthèse et l’activité biologique de l’IGF-I.
Autant la relation entre IGF-I et IMC, reste floue, autant il est bien décrit qu’au cours de
l’obésité, il y a une augmentation des taux circulants d’insuline, une diminution des IGFBP 1
et 3, et que tout cela peut conduire à augmenter la proportion d’IGF-I libre comme cela est
retrouvé dans certaines études chez les personnes obèses (pour revue (198)). L’augmentation
de la biodisponibilité de l’IGF-I combinée à l’augmentation des estrogènes au cours de
l’obésité pourrait être une des explications faisant que la progression tumorale mammaire soit
plus importante chez les personnes obèses que chez les personnes avec un IMC normal.
Au vu de tout ce qui vient d’être décrit, il convient donc dire qu’il existe une association entre
l’obésité et le cancer du sein, pour les femmes post ménopausées. Dans la majorité des
études, on dénote également que l’obésité est un facteur de mauvais pronostic à la fois pour
les femmes pré et post ménopausées. Le risque de développer un cancer, attribuable à
l’obésité est comparable au risque de développer un cancer, lors d’une histoire de cancers
familiaux (17). Il est suggéré que la réduction de l’obésité pourrait diminuer les cas de cancers
du sein de un dixième en Europe avec pour conséquence, une réduction de la mortalité (153).
Il est craint que dans les prochaines années, l’augmentation de l’obésité ne rende difficile la
diminution de la mortalité face au cancer du sein, étant donné que cette dernière participe
activement au développement de cette maladie.
80
RESULTATS
81
Revue Générale :
Unraveling the obesity and breast cancer links : a role for cancer
associated adipocytes
(Dirat et al, 2010, Endocr Development)
82
Levy-Marchal C, Pénicaud L (eds): Adipose Tissue Development: From Animal Models to Clinical Conditions.
Endocr Dev. Basel, Karger, 2010, vol 19, pp 45–52
Unraveling the Obesity and Breast Cancer
Links: A Role for Cancer-Associated
Adipocytes?
Béatrice Dirata–c ⭈ Ludivine Bocheta–c ⭈ Ghislaine Escourroud ⭈
Philippe Valeta,c ⭈ Catherine Mullera,b
a
University of Toulouse, bInstitute of Pharmacology and Structural Biology CNRS UMR 5089, cInstitut
National de la Santé et de la Recherche médicale, INSERM U858 Equipe 3, IFR31, and dDepartment of
Anatompathology and Cytology, CHU Rangueil, Toulouse, France
Abstract
In addition to diabetes and cardiovascular diseases, epidemiological evidence demonstrates
that people who are obese or overweight are at increased risk of developing cancer – colon,
breast (in postmenopausal women), endometrial or kidney cancer being among the most frequent. In addition to the increase in tumor occurrence, obesity also affects tumor prognosis,
especially in breast and prostate cancers. In breast cancer, obesity is associated with reduced
survival and increased recurrence independent of menopausal status. Host factors seem to contribute to the occurrence of tumors exhibiting an aggressive biology defined by advanced stages
and high grade. Mature adipocytes are part of the breast cancer tissue and as highly endocrine
cells susceptible to profoundly modify breast cancer cell behavior. Tumor progression has
recently been recognized as the product of an evolving crosstalk between tumor cells and the
surrounding ‘normal’ cells. We propose that such a bidirectional crosstalk exists between breast
cancer cells and tumor-surrounding adipocytes, and that the tumor-modified adipocytes (or
cancer-associated adipocytes) are key actors in tumor progression. The positive contribution of
cancer-associated adipocytes into tumor progression might be amplified in obese women and
explains at least in part the poor prognosis observed in this subset of patients.
Copyright © 2010 S. Karger AG, Basel
The prevalence of overweight and obesity has been increasing worldwide over the
past decades and reached alarming dimensions [1]. According to 2005 projections
by the World Health Organization (WHO), there are 1.6 billion overweight and
400 million obese adults worldwide. WHO predicts that by 2015 these numbers
will increase to 2.3 billion overweight and 700 million obese adults Studies from
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different countries with different lifestyles have shown consistently that obesity, as
measured using body mass index (BMI), is associated with an increased risk of allcause mortality [1, 2]. In studies able to stratify the cause of death, the increased
all-cause mortality has been related to cardiovascular and cancer mortality [see
e.g. 2]. Although obesity has long been recognized as an important cause of diabetes and cardiovascular disease, the relationship between obesity and cancer
has retained less attention than its cardiovascular effects. In a recent interview,
Prof. D. Hill, President of the UICC, said ‘Lack of public understanding of the link
between body weight and cancer probably parallels our attitudes to smoking and
cancer in the late 1950s’. However, the link between obesity and cancer is complex
since cancer is a heterogeneous group of diseases. The International Agency on
Cancer has determined that people who are overweight or obese are at increased
risk of developing adenocarcinoma of the esophagus, colon cancer, breast cancer
(in postmenopausal women), endometrial cancer and kidney cancer. Some epidemiological evidence has also indicated that cancers of the liver, gallbladder and
pancreas are also obesity-related whereas no associations are seen for example for
lung cancer [reviewed in 2]. In addition, obesity might influence different steps of
the disease and a careful examination should be given when considering the diagnosis (increase in cancer occurrence) or prognosis and mortality. For example, in
breast cancer, early studies have established that obese women have an increased
risk of developing postmenopausal, but not premenopausal, breast cancer. It has
been even demonstrated that a modest reduction in risk is present in women with
high BMI [reviewed in 2]. By contrast, studies of mortality and survival demonstrated that obesity is associated with reduced survival and an increased likelihood of recurrence. This poor prognosis seems to be independent of menopausal
status, smoking habits, tumor stage, and tumor hormone-binding characteristics
[for reviews, see 3, 4]. Multiple factors might contribute to the survival rates in
obese patients with cancer including a higher likelihood of comorbid conditions
and other ‘non-biological’ effects (e.g. delayed diagnosis or underdosing of chemotherapy). However, emerging evidence suggests that host factors might contribute to the occurrence in obese women of tumors exhibiting an aggressive
biology defined by advanced stage and high grade [5–8]. The molecular mechanisms underlying these effects remain poorly understood but increasing interest
has emerged towards adipokines, a term that defined the multiple secretory products of adipocytes. In fact, adipocytes, initially considered as energy storage cells,
have clearly emerged as endocrine cells in the last 10 years [9]. Through their ability to secrete hormones, growth factors, chemokines or pro-inflammatory molecules, adipocytes are therefore excellent candidates to play a crucial role in tumor
behavior through heterotypic signaling processes. The crosstalk between adipose
and epithelial tumor components might be positively affected in obesity where the
normal balance of these adipose tissue secretory proteins is perturbed [10, 11].
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Therefore, the purpose of this review is to emphasize the role that mammary adipose tissue might play in locally affecting breast cancer cell behavior. Adipose tissue constitutes an active endocrine organ that can have far-reaching effects on the
physiology of other tissues. To understand how obesity influences breast cancer
prognosis by increasing circulating plasma levels of estrogen, insulin, insulin-like
growth factors or other hormonal factors, the reader is referred to recent reviews
on that topic [see 2, 12].
Adipose Tissue Is an Active Component of the Tumor Stroma
Emerging evidence in the literature recognizes tumor progression as the product
of an evolving crosstalk between tumor cells and its surrounding supportive tissue, the tumor stroma [13]. This framework includes a specific type of extracellular matrix – the tumor matrix – as well as cellular components such as fibroblasts,
immune and inflammatory cells, and blood vessels. Based on the pioneering work
of Jude Folkman [14], it is now widely recognized that tumors must induce angiogenesis to grow as well as to metastasize to distant organ sites and accordingly
targeting the tumor vasculature has become an attractive possibility as a form of
anticancer therapy. Recent cumulative evidence demonstrates that in addition to
endothelial cells, other components of the stroma also act as key players in tumor
progression and invasion. Cancer-associated fibroblasts and tumor-associated
macrophages promote tumor progression by secreting growth factors, chemokines
and pro-migratory extracellular matrix components [13, 15]. Is there a role for adipocytes in this ‘tissue-integrated’ view of tumor progression? Compared to other
components of the stroma, adipocytes received relatively little attention despite the
fact that they correspond to one of the most prominent cell types in breast tumors
(fig. 1). In addition, an effect of tumor-surrounding adipocytes would not have
been entirely surprising when one considers the intimate relationship that exists
between adipose and mammary tissues. The mammary gland develops in a bed
of white adipose tissue, and there are extensive mesenchymal-epithelial interactions in which the adipose mesenchyme ‘instructs’ aspects of mammary epithelial
development [16]. Finally, it is obvious that in numerous organs including breast,
early local tumor invasion results in immediate proximity of cancer cells to adipocytes (fig. 1). There is some evidence in the literature that adipocytes can affect
through paracrine mechanisms the behavior of breast tumor cells [for review, see
12]. For example in a three-dimensional collagen gel matrix co-culture technique,
it has been shown that mature adipocytes secrete a factor(s) which can promote
the growth of human breast cancer cell lines, as reflected in an enhanced uptake
of bromodeoxyuridine [17]. In an elegant in vivo study, the group of Scherer [18]
has shown that co-injection of the breast cancer cell line SUM59PT with murine
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Tumor center
Invasive front
Adipose tissue
Fig. 1. Mature adipocytes are present in breast tumor stroma. Histologic examination of a breast
tumor (HE, orig. magnif. ×200). Note that mature adipocytes are located adjacent to invading
cancer cells.
adipocytes (but not pre-adipocytes) in immunodeficient mice not only increase
the levels and rate of tumor progression but also promote development of metastases as well. They further demonstrate that this effect is partially controlled by
type VI collagen secreted by adipocytes that promotes GSK3β phosphorylation,
β-catenin stabilization and increased β-catenin activity in breast cancer cells [19].
Collagen VI is not the only candidate that has been demonstrated to be involved
in this process of adipokine’s driven tumor progression. Leptin has been shown
to promote in some, but not all, cell lines in an autocrine and paracrine manner
the proliferation and/or migration of breast cancer cells. Another adipose tissuederived protein, adiponectin, whose expression is reported to be inversely related
to body fat, has been shown to inhibit cell proliferation and enhance breast cancer
cell apoptosis, although again these effects appear to be restricted to specific models (for a detailed review of these two adipokines in breast cancer progression, see
Vona-Davis and Rose [12]). Elevated serum estrogen levels as well as enhanced
local production of estrogen have been considered primary mediators of how
increased body weight promotes breast cancer development in postmenopausal
women [2]. Related to tumor progression, the local estrogen production (through
aromatization of the C19 steroid androstenedione in adipocytes) might also favor
tumor growth through the interaction with the estrogen receptor of nearby tumor
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cells, a point that has been extensively reviewed in the literature [for review, see 20].
In obesity, the normal balance of these adipose tissue secretory proteins is affected
both positively (leptin) and negatively (adiponectin). According to the preclinical evidence demonstrating their ability to modulate breast cancer cell behavior,
they represent a good candidate to explain the poorer prognosis of breast cancer
in obese patients, although their local secretion in breast tumors remains poorly
characterized [21]. However, all these studies through their use of ‘naive’ adipocyte-conditioned medium or the use of recombinant proteins (e.g. leptin or adiponectin) precludes that the mature adipocytes remain relatively inert in response
to the nearby tumor cells. It has been demonstrated that cancer cells usually go
about generating a supportive microenvironment by modifying the phenotype
of surrounding normal cells. For example, it has been demonstrated that cancer
cells modify the phenotype of fibroblasts that acquire traits of wounded fibroblasts
(including the expression of a smooth cell actin) [22], that are therefore named
carcinoma-associated fibroblasts, supporting the idea that cancer is a ‘wound
that never heals’ [13]. In accordance with this concept of a constant bidirectional
crosstalk between cancer and stroma cells, we therefore propose that tumor-surrounding adipocytes also exhibit profound phenotypic changes. A first argument
in favor of this hypothesis came from the laboratory of Marie-Christine Rio [23]
showing that in vivo invasive cancer cells induce in adjacent adipocytes the expression of stromelysin-3 (also named metalloprotease 11, MMP-11), a potent inhibitor of adipocyte differentiation. We recently set up in the laboratory an original
co-culture model between breast tumor cells and adipocytes. Our results show
that tumor cells promote extensive phenotypic changes in adipocytes leading to
an ‘activated’ phenotype, that in turns promote the occurrence of metastatic traits
in cancer cells [Dirat et al., in preparation]. Therefore, these preliminary results
demonstrate that cancer cells might force adipocytes to express a new subset of
molecules that are not expressed by adipocytes in normal conditions, and that
like cancer-associated fibroblasts, cancer-associated adipocytes (CAA) are present
within a tumor with specific features that remain to be extensively characterized.
A detailed proteomic analysis of the proteins secreted in breast adipose tissue collected from tumorectomy of estrogen receptor-negative, high-grade tumors present in premenopausal women showed that numerous hormones, cytokines and
growth factors are present within this tissue [24]. Comparison with adipose tissue
of normal breast will clearly offer the opportunity to characterize the molecular
circuitry between adipocytes and epithelial cells. In addition, this crosstalk might
also affect less differentiated cells as well as mature adipocytes. For example, it
has been demonstrated that conditioned media from breast cancer cells inhibited the differentiation of pre-adipocytes into mature adipocytes in favor of the
accumulation of pre-adipocyte cells into the cancer tissue [25]. Characterization
of the molecular circuitry between CAA and the epithelial component might help
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CXCL1 mRNA expression
(arbitrary units)
150
100
50
0
VAT
SAT
MAT
Fig. 2. Chemokine CXCL-1 is not expressed in mammary adipose tissue. Expression of CXCL-1
was measured by qPCR on subcutaneous adipose tissue (SAT). Visceral adipose tissue (VAT) was
obtained from healthy donors (5 and 9 respectively) with BMI ≤25. Mammary adipose tissue
(MAT) was obtained from reduction mammoplasty performed in 12 healthy women exhibiting
normal (≤25) BMI. Results are expressed as mean ± SD (in arbitrary units).
to identify attractive targets in cancer therapy since drugs aimed at stromal adipocyte signals and effector functions may prove complementary to conventional
treatments targeting the overt cancer cells in breast tumors.
Consequences for the Poor Prognosis Observed for Breast Cancer in Obese
Patients: Some Answers, Many Questions
Although not demonstrated experimentally, one might reasonably speculate that
the positive contribution of these CAA into tumor progression might be amplified
in obese women, therefore explaining in part the poor prognosis observed in this
subset of patients. Accumulating evidence in recent years has demonstrated that
obesity is associated with a low-grade inflammation of white adipose tissue which
can subsequently lead to insulin resistance, impaired glucose tolerance and even
diabetes [9]. The increased production and secretion of a wide range of inflammatory molecules, including TNF-α and interleukin-6, by adipocytes (but also by
infiltrating macrophages which may be a major source of locally produced proinflammatory cytokines) seen in white adipose tissue from obese patients might
have a profound effect on tumor progression, especially if this inflammatory
response is amplified in the cancer tissue [2]. Concerning adipose breast tissue,
characterization of its pattern of secretion is clearly needed in both lean and obese
patients since it is poorly defined as compared to other fat cell depots. Preliminary
experiments performed in our laboratory in fact suggest that striking differences
might be observed. For example, as seen in figure 2, whereas the proangiogenic
chemokine CXCL-1 is expressed in deep and subcutaneous adipose tissue, its
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expression is absent from mammary adipose tissue, clearly demonstrating that
specific studies should be performed. If, as we believe, the tumor characteristics
are modified during the early steps of tumor progression (e.g. early acquisitions
of metastatic traits) in a context of obesity, weight loss after breast cancer diagnosis might have a limited impact on prognosis, this latter point remaining largely
debated in the literature [26]. Obesity also affects the prognosis of prostate tumors
with the occurrence of more aggressive disease [2]. The expected striking increase
in the incidence of these aggressive cancers in the near future related to obesity
turns the knowledge of this field of great impact as it is needed for the development of strategies to prevent and treat this disease.
Acknowledgements
Studies performed in our laboratories were supported by the French National Cancer Institute
(INCA PL 2006–035 to G.E., P.V. and C.M.), the ‘Ligue Régionale contre le Cancer’ (Comité du
Lot et Haute-Garonne to C.M.) and the University of Toulouse (AO CS 2009 to C.M.).
References
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and economic consequences of the global epidemics of obesity and diabetes. Nat Med 2006;12: 62.
2 Calle EE, Kaaks R: Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed
mechanisms. Nat Rev Cancer 2004;4:579.
3 Carmichael AR: Obesity and prognosis of breast
cancer. Obes Rev 2006;7:333.
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Prof. Catherine Muller
IPBS CNRS UMR 5089, Université de Toulouse
205, route de Narbonne, FR–31077 Toulouse Cedex (France)
Tel. +33 5161 17 59 32, Fax +33 561 17 59 33
E-Mail [email protected]
52
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Dirat · Bochet · Escourrou · Valet · Muller
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Article 1 :
Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to early
breast cancer invasion in vitro and in vivo
(manuscrit soumis à Embo Molecular Medecine)
83
Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to early breast cancer
invasion in vitro and in vivo
Béatrice Dirat
1,2,3
, Ludivine Bochet
Majed4, Aline Meulle
1,2,3,7
1,2,3
, Marta Dabek1,2, Danièle Daviaud
, Bernard Salles1,2, Sophie Le Gonidec
1,3
1,3
, Stéphanie Dauvillier1,2, Bilal
, Ignacio Garrido5, Ghislaine Escourrou 6,
Philippe Valet 1,3 and Catherine Muller 1,2 *
1
University of Toulouse, UPS, IPBS, F-31077 Toulouse, France
2
Cancer Biology Department, Institute of Pharmacology and Structural Biology CNRS UMR 5089, 205 route de
Narbonne, F-31077 Toulouse, France
3
Metabolism and Obesity Department, Institut National de la Santé et de la Recherche médicale, INSERM U858,
F-31432 Toulouse, France
4
Biostatistics Department, Curie Institute Cancer Research and Treatment Institute, 75005, Paris, France and
Unit of Epidemiology & Clinical Research, Arras Hospital, Arras, France.
5
Surgical Oncology Department, Institute Claudius Regaud Cancer Center, rue du Pont-Saint-Pierre, 31052
Toulouse, France
6
Department of Pathology, Hôpital de Rangueil, 1, avenue Jean-Poulhes, TSA 50032, 31403 Toulouse, France.
7
Present address: Unit of Pharmacology and Therapeutics, Université Catholique de Louvain, Brussels, Belgium.
Corresponding author: Pr Catherine Muller, IPBS CNRS UMR 5089, 205 route de Narbonne, 31077 Toulouse
Cedex – Tel: 33-561-17-59-32; Fax: 33-561-17-59-33; e-mail: [email protected]
Characters count (including space): 54996
Running title: Key role of mature adipocytes in breast cancer progression
Key words: Adipocytes, Breast Cancer, Interleukin 6, Metastasis, Obesity
1
Abstract: Early local tumour invasion in breast cancer results in immediate proximity of cancer cells to mature
adipocytes, but the role of these cells in tumour progression has been poorly studied. Using a 2D co-culture
system, we demonstrate that tumour cells co-cultivated with mature adipocytes exhibit an increase in invasive
capacities in vitro and in vivo. In turn, adipocytes cultivated with cancer cells exhibit delipidation and decreased
adipocyte markers associated to the occurrence of an activated phenotype marked by over-expression of
proteases, including MMP11, and pro-inflammatory cytokines (IL-6, IL-1β), IL-6 playing a key role in the
adipocyte-dependent pro-invasive effect. These phenotypic changes of adipocytes are observed in human breast
tumours using immunohistochemistry and qPCR in a series of adipocytes isolated from adipose tissues obtained
either from tumorectomy or mammoplasty. The tumours of larger size and/or with lymph nodes involvement
exhibit the higher levels of IL-6 in cancer-associated adipocytes. This new bidirectional crosstalk between
adipocytes and breast tumour cells might explain the poor prognosis of breast cancer in obese women that
frequently exhibit extended tumours at diagnosis.
2
Introduction
Accumulating evidence show that cells that compose the tumour stroma are associated, if not obligate, partners
in tumour progression (for review, see Mueller & Fusenig, 2004; Joyce & Pollard, 2009; Wiseman & Werb,
2002). In breast cancer, stroma cells include resident adipocytes and fibroblasts, a wide range of recruited
hematopoietic cells, as well as newly formed blood vessels with their associated cells (Wiseman & Werb, 2002).
Dynamic and reciprocal communication between epithelial and stromal compartments occurs during breast
cancer progression (Mueller & Fusenig, 2004; Joyce & Pollard, 2009). Cancer cells usually go about generating
a supportive micro-environment by activating the wound-healing response of the host (Schafer & Werner, 2008)
and conversely the stromal cells, such as Cancer-Associated Fibroblasts (CAF) or Tumour-Associated
Macrophages (TAM) promote tumour progression by secreting growth factors, pro-inflammatory cytokines and
pro-migratory extra-cellular matrix (ECM) components, as well as up-regulating the expression of serine
proteases and metalloproteases that degrade and remodel the ECM (Joyce & Pollard, 2009). To date, most of the
studies focused on cancer cell-mesenchymal cell interactions have emphasized the contribution of fibroblasts,
endothelial and inflammatory cells (Mueller & Fusenig, 2004). Little attention has been given to the mature
adipocytes, although it is obvious that in breast, early local tumour invasion results in immediate proximity of
cancer cells to adipocytes (Wiseman & Werb, 2002). Until recently, adipocytes were mainly considered as an
energy storage depot, but there is now clear evidence pointing to adipocytes as endocrine cells that produces
hormones, growth factors, cytokines and other molecules, an heterogeneous group of molecules included under
the term of adipokines (Rajala & Scherer, 2003). Accordingly, mature adipocytes are therefore excellent
candidates to influence tumour behaviour through heterotypic signalling processes and might prove to be critical
not only for tumour survival, and growth but also to metastasis. There is some evidence in the literature that
adipocytes can affect through paracrine mechanisms, involving molecules such as leptin, adiponectin, hepatocyte
growth factor and collagen VI, the growth and survival of breast tumour cells even in estrogen negative cells (for
review, Vona-Davis & Rose, 2007). In addition, a role for adipocytes in supporting tumour invasion is suggested
by the increase ability of the SUM-159PT breast cancer cells to metastasise to the lung when they are co-injected
subcutaneously in nude mice with mature adipocytes (Iyengar et al, 2003). Mature adipocytes might not be inert
to their surrounding as it has recently been shown that MMP-11/stromyelysin 3 is induced in adipose tissue by
cancer cells as they invade their surrounding environment (Andarawewa et al, 2005). However, the molecular
circuitry that defines tumour cells and adipocytes crosstalk and the phenotype changes in adipocytes supporting
tumour progression remains poorly characterized as compared to other components of the breast cancer stroma.
This issue is clearly important in human medicine since obesity has been recently identified as a negative
prognosis factor for breast cancer (Calle & Kaaks, 2004; Majed et al, 2008). This poor prognosis seems to be
independent of menopausal status, smoking habits, tumour stage, and tumour hormone binding characteristics
(for review, Carmichael, 2006; Stephenson & Rose, 2003). Interestingly, several studies pointed out that obese
women exhibit extended tumour at diagnosis (including increase in lymph nodes involvement) suggesting an
effect of host dependent factors on the early stages of tumour progression (Majed et al, 2008; Feigelson et al,
2006; Maehle et al, 2001; Berclaz et al, 2004; Daniell et al, 1993). According to these epidemiological and
experimental evidences, we investigated the effect of adipocytes on the early steps of tumour invasion. Our study
brought in vitro and in vivo evidences supporting that peri-tumoral adipocytes exhibit modified phenotype and
specific biological features and modify the cancer cell phenotype leading to their more aggressive behaviour.
3
Results
To investigate the influence of tumour-surrounding adipocytes on cancer cell behavior, we set up an original ex
vivo 2D co-culture system. Human cancer cells with low (ZR 75.1) or high (SUM159PT) migratory and invasive
capacities (Sommers et al, 1994) were grown for 3 days on inserts, that allow the diffusion of soluble factors, in
the presence or not of differentiated adipocytes obtained from the in vitro differentiation of the murine preadipocyte cell line, F442A (Green & Kehinde, 1976). After 3 days, tumour cells were trypsinized and Matrigel
assays were performed towards a medium containing either 0 or 10 % serum. As shown in fig. 1A, the invasive
capacity of ZR 75.1 tumour cells toward 10 % FCS containing medium was increased by about 3-fold in cells
previously co-cultivated for 3 days with adipocytes as compared to tumour cells grown alone. No additional
increase in the invasion of ZR 75.1 was observed when the co-culture time with adipocytes was increased up to 5
days (data not shown). This effect was not observed when tumour cells were co-cultivated with pre-adipocytes
(fig. S1A). Similar results were obtained with the SUM159PT cell line although to a lesser extent (1.4 fold
increase in co-cultivated tumour cells versus tumour cells grown alone, p<0.05) (fig. 1A). Experiments were also
performed with the mouse mammary cell line 4T1 and its non-metastatic sibling cell line 67NR (Aslakson &
Miller, 1992). Co-culture with adipocytes increases both 67NR and 4T1 invasive capacities by 2-fold (fig. 1B).
Therefore, mature adipocytes are able to stimulate the invasive capacities of murine and human breast cancer
cell lines that express (ZR 75.1) or not (SUM159PT, 67NR, 4T1) estrogen receptor. In addition, the pro-invasive
effect was dissociated from the tumour-growth promoting effect since co-culture with adipocytes has no effect
on ZR 75.1 proliferation in opposition to SUM159PT cells (fig. S1B). When tumour cells were grown in the
presence of conditioned medium (Ad-CM) obtained from “naïve” adipocytes (that have never been co-cultivated
with tumour cells), the invasive capacities of the cells were not significantly increased as exemplified for ZR
75.1 and 67NR cells (fig. 1C). However, the pro-invasive effect of CM was recapitulated when this medium was
prepared from adipocytes previously co-cultivated with by tumour cells (Cancer-Associated adipocytes
conditioned medium, CAA-CM) highlighting that a cross-talk between the two cell populations are necessary to
observe this effect (fig.1C). In ZR 75.1 cells co-cultivated with adipocytes for 3 to 5 days, morphological
changes were observed in a time-dependent manner including a loss of cell polarity causing a spindle-cell
morphology, increased intercellular separation and increased formation of pseudopodia emanating from the cell
membrane were observed (see fig 2A). Down regulation of membrane E-Cadherin expression to a disorganized
state in the cytoplasm, in association to β-catenin redistribution, was observed in these cells (fig. 2B). In
addition, sub-cortical actin filaments were markedly reduces and re-localized to filopodia-like foci at the plasma
membrane in association to cell polarization (fig. 2A). Decrease in E-cadherin expression was also observed at
mRNA and protein levels without expression of mesenchymal markers suggesting an incomplete epithelialmesenchymal transition (EMT) (fig. S2). For the SUM 159PT cell line, that has already performed complete
EMT, morphological changes were also observed with reorganization and polarization of vimentin (see fig. 2A)
without modification of its level of expression (fig. S2). Similar results were obtained with the murine breast
cancer cells that also exhibit a fibroblast-like morphology prior to co-culture (data not shown). When the ZR
75.1 cells where no longer co-cultivated in the presence of adipocytes, the observed phenotype (partial EMT,
actin reorganization) was not reversible for the observed period (up to 96 h) as shown in fig. 2B (left panel)
using immunofluorescence approaches. Accordingly, the increase in cells invasive capacities was maintained
after removal of adipocytes (see fig. 2B, right panel). The absence of the reversibility of the adipocyte-induced
4
invasiveness was also observed for the other tumour models used in our study (data not shown). Our coculture
system shows that adipocytes stimulate the invasiveness of tumour cells in vitro. To test the hypothesis that
“priming” tumour cells with adipocytes regulates tumour cell distal organ seeding and persistent growth, we
performed metastasis assays using the 4T1 cell line. It has been previously shown that when injected
intravenously in syngenic immunocompetent BalB/c mice, these cells form metastases in lungs and liver, after 12 weeks (Aslakson & Miller, 1992). 4T1 tumour cells were cultured in vitro for 4 days in the presence or not of
adipocytes, harvested, carefully dissociated into single cell suspensions and injected i.v. into syngeneic BALB/c
host mice. As shown in fig. 3A, the number of lung metastases was clearly enhanced in mice injected with 4T1
cells previously co-cultivated with adipocytes as compared to mice injected with 4T1 grown alone. Histological
analysis (fig. 3B) confirmed that when the 4T1 cells have been previously co-cultivated with adipocytes, the
lesions replaced large areas of the lung parenchyma, whereas 4T1 cells previously grew alone exhibited less
parenchymal involvement. Both the numbers and the size of metastasis nodules were significantly increased in
mice injected with adipocytes-cocultivated 4T1 compared to 4T1 cells grew alone (fig. 3C-D). Taken together,
these results demonstrate that adipocytes promote the invasive phenotype of tumour cells both in vitro and in
vivo. Since we have demonstrated that a crosstalk between the two cell populations is necessary to observe this
pro-invasive effect, we then examined adipocyte phenotype. As shown in fig. 4A (upper panel), mature
adipocytes co-cultivated with ZR 75.1 tumour cells exhibit a dramatic reduction in the number and size of lipid
droplets that correlated with a significant decrease in lipid accumulation (fig. 4A, lower panel). Note that the
number of viable adipocytes was not significantly changed by the presence of tumour cells (data not shown).
These adipocytes lose several terminal differentiation markers exemplified by the strong decrease in resistin,
HSL (Hormone-Sensitive Lipase), APN and aP2 mRNA (Rajala & Scherer, 2003) (fig. 4B) that were confirmed
at protein levels (fig. 4C) for APN and resistin. The level of CEBPα was dramatically reduced whereas that of
PPARγ was not significantly affected by the presence of tumour cells (fig. 4B). As stated before, MMP11/stromyelysin 3 is induced in vivo in adipose tissue by cancer cells as they invade their surrounding
environment (Andarawewa et al, 2005). Similar up-regulation was noted in the co-cultivated adipocytes,
highlighting the in vivo relevance of this co-culture model (fig. 4B). By contrast, the levels of MMP-2 (not
shown) and MMP-9 (fig. 4B) remain unchanged whereas a significant increase (10 fold) of PAI-1 expression
was found (fig. 4B). We investigated the expression profiles of inflammatory cytokines in co-cultivated
adipocytes. A 5-fold increase of IL-6, IL-1β, and TNFα was shown at mRNA levels, but only IL-6 and IL-1β
were found to be significantly higher in the supernatant of co-cultivated cells (fig. 4C) whereas the levels of
TNFα remains undetectable in both conditions (data not shown). The levels of other cytokines (HGF, TGFβ,
FGF) that have been previously involved in the occurrence of EMT remain unchanged (not shown). Similar
extensive adipocyte phenotypic changes were obtained with other tumour cells lines (fig. S3). The original coculture model that we set up used murine mature adipocytes derived from the in vitro differentiation of the non
mammary preadipocyte cell line, F442A. Although 3T3F442A cells are valuable experimental model, they do
have distinct attribute compared with human cells in primary culture, beyond the obvious species differences. In
addition, accumulating evidence suggest that different white adipose tissue (WAT) depots contain adipocytes
with distinct intrinsic characteristics, including receptors, adipokines, and transcription factors (Atzmon et al,
2002), mammary adipose tissue (MAT) remaining the less well characterized among other fat depots. The
maintenance in cell culture of a viable and phenotypically stable population of mature adipocytes isolated from
5
MAT poses unresolved technical challenges. We therefore chose to use mammary adipocytes derived from ex
vivo differentiation of progenitors purified from MAT of healthy donors undergoing reduction mammoplasty
(aged 18 to 66 years, BMI 21.2 to 30.8 kg/m2). Using this approach (Daviaud et al, 2006), we were able to
differentiate these primary cells reproducibly and efficiently in 6 independent samples (shown in fig. S4, the
expression profiles of several adipose markers in the cells as compared to isolated mammary adipocytes). Figure
5A (left panel) depicts a representative field of mature adipocytes grown for 3 days in the presence (C) or not
(NC) of tumour cells. Adipocytes co-cultivated with tumour cells exhibit loss of lipid droplets (shown by Red oil
staining) associated with profound morphological changes toward a more flattened shape. A strong decrease in
the late differentiation markers APN, HSL and aP2, as well as CEBPα, was observed (fig. 5A, right panel). The
inflammatory state previously described was observed with a 3-fold increase in IL-6 mRNA associated to an
increase in IL-1β and TNFα mRNA, although to a lesser extent. The levels of MMP-11 mRNA remain
unchanged and were up-regulated only when the co-culture was prolonged up to 5 days, suggesting that this
event is not a prerequisite for the lose of differentiation markers (fig. S5). Mature mammary adipocytes strongly
stimulated the invasive capacities of tumour cells with very little variation within the 6 different samples tested
(fig. 5B, left panel). As shown in figure 5B for two independent samples (right panel), when tumour cells (ZR
75.1) were co-cultivated for three days with adipocytes, profound morphological changes were observed
associated with β-catenin redistribution in all the tested samples. Our co-culture system allow us to define a
phenotype of tumour-modified adipocytes (that we decided to name Cancer-Associated Adipocytes or CAA)
characterized by a decrease in lipid content associated to the loss of terminal differentiation markers and by
over-expression of proteases including MMP11 and pro-inflammatory cytokines (IL-6, IL-1β). A major clinical
issue is whether or not these tumour-reoriented adipocytes are found in primary human tumours. First,
histological examination of breast tumours were performed and as exemplified in fig. 6A (left panel), we
consistently observed at the invasive front of human breast tumours, the presence of shrunken adipocytes of
various sizes, displaying irregular cell outlines with a dilated interstitial space, that might be related to extensive
extra-cellular matrix occurring in tumour-surrounding adipocytes such as collagen VI over-expression (Iyengar
et al, 2005). There was no apparent infiltration of monocytes in adipose tissue present at the invasive front as
assessed by CD68 expression (data not shown). Further characterization of these CAAs was performed using
immunohistochemistry. As shown in fig. 6A (right panel), we observed that the expression of APN in CAAs was
clearly decreased as compared to normal mammary adipose tissue (a-b). MMP-11 (in accordance with
previously published results (Andarawewa et al, 2005) (c-d), and IL-6 (e-f) were expressed by adipocytes
proximally located to the invasive cancer cells whereas normal adipose tissue remains negative in all the tested
samples (n>10). By contrast, IL-1β was not detected either in normal or tumour-associated adipocytes (data not
shown). To further assess the expression of these proteins using a quantitative approach, adipocytes were
isolated from fat samples associated to tumorectomy or reduction mammoplasty (Daviaud et al, 2006). A series
of 28 samples were used that are comparable in age (mean: 51.8 ± 7.3 versus 60 ± 13) and BMI (26.2 ± 2.8
versus 25.2 ± 2.3) (14 samples in each group) (see tables S1 and S2 for the clinical characteristics of the
patients). Adipocytes isolated from tumour samples over-expressed MMP-11 and PAI-1 and IL-6, as compared
to adipocytes purified from normal mammary gland, whereas a slight but not significant increase in IL-1β was
observed. The mRNA levels of TNFα were unchanged between normal and tumour-surrounding adipocytes (see
fig. 6C). The adipose tissue also contains stromal cells that are composed of fibroblasts, endothelial cells,
6
adipocytes precursors at different stages of differentiation (including preadipocytes and adipose derived stem
cells or ADSC). The levels of expression of MMP-11, PAI-1, IL-6, IL-1β and TNFα were not modified between
normal and tumour-surrounding adipose SVF highlighting that the observed increase in pro-inflammatory
molecules and proteases is an adipocyte-dedicated event (fig. 6C). When the levels of expression of IL-6 in
adipocytes were analyzed as a function of tumour characteristics, we found that the higher levels were associated
with the tumours of larger size and with lymph nodes involvement (fig. 6D), whereas this associations were not
found for PAI-1 nor MMP-11 (see fig. S6). Our results demonstrate that IL-6 is over-expressed in tumoursurrounding adipocytes both in vitro (see fig. 4 and 5A) and in vivo (fig. 6). As shown in fig.7A, we further
demonstrate that IL-6 (at 10ng/mL, a dose that corresponded to the levels secreted by CAAs, see fig. 2C)
significantly increases the invasive capacities in ZR 75.1 and 67NR cells (see fig. 7A). Addition of IL-6 to the
epithelial-like ZR 75.1 cells lead to the down regulation of membrane E-Cadherin expression to a disorganized
state in the cytoplasm, in association to β-catenin redistribution and relocalization of sub-cortical actin filaments
to filopodia-like foci at the plasma membrane in association to cell polarization (see fig. 7B, left panel). When
ZR 75.1 cells were cocultivated with adipocytes in the presence of murine IL-6 blocking Ab, the adipocyte proinvasive effect was significantly decreased (fig. 7B, right panel). Finally, mIL-6 blocking Ab specifically inhibits
the pro-invasive effect of CAA-CM in both 67NR and 4T1 models and had no effect on the invasive capacities
of non co-cultivated cells (see fig. 7C).
Discussion
Adipocytes represent the most abundant cells of the normal and tumour-surrounding breast stroma. The
mammary gland develops in a bed of white adipose tissue, and there are extensive mesenchymal-epithelial
interactions in which the adipose mesenchyme "instructs" aspects of mammary epithelial development
(Wiseman & Werb, 2002). In early breast invasive carcinomas, compromise of the basement membrane integrity
results in a immediate proximity to mature adipocytes and we provide in vitro (fig. 1, 2 and 5) and in vivo (fig. 3)
evidences that these cells are able to stimulate tumour cell invasive capacities. Previous published studies have
demonstrated the importance of adipocytes for survival and growth of tumours in vivo (Iyengar et al, 2005);
Elliott et al, 1992), but few studies have addressed the question of tumour cell invasion. It has been previously
demonstrated that the ability of the SUM-159PT breast cancer cells to metastasise to the lung is increased when
they are co-injected subcutaneously in nude mice with mature adipocytes, but the molecular mechanism
involved in this effect has not been characterized (Iyengar et al, 2003).In addition, one might not exclude in this
study that adipocytes increase the tumour cell metastasis ability through indirect mechanisms such as increase
angiogenesis and/or increase recruitment of other accessories cells. We show here that the crosstalk between the
tumour /mature adipocyte populations is a sufficient event to increase cell metastatic abilities (see fig. 3). Such
as intimate crosstalk at the tumour invasive front has been previously described for TAM or Gr-1+CD11b+
myeloid cell that are recruited by expression of tumour-derived chemotactic factors, leading to enhanced tumour
invasion (for review, see 2, (Yang et al, 2008)). Cancer cells go about generating a supportive microenvironment
by also modifying the phenotype of surrounding normal cells. For example, cancer cells modify the phenotype of
fibroblasts that acquire traits of wounded fibroblasts (including the expression of α smooth cell actin) (Haviv et
al, 2009) that are therefore named Carcinoma Associated Fibroblasts. In accordance with this concept of a
constant bidirectional crosstalk between cancer and stroma cells, we show here that tumour-surrounding
7
adipocytes also exhibit profound phenotypic changes and we name these cells Cancer Associated adipocytes
(CAAs). CAAs exhibit an activated phenotype characterized by the loss of lipid content, a decrease in late
adipose markers and the over-expression of inflammatory cytokines and proteases as shown both in coculture
system (using both murine and human mammary adipocytes) and in human tumours (fig. 4-6). The mechanism
responsible for adipocytes reorientation remains unclear. Modification resembling to the CAAs is also observed
in adipose tissue of tumour-bearing mice at distance from the tumour site, that exhibits morphological
modification with shrunken size, decreased in key adipogenic transcription factors like C/EBPα and latedifferentiation markers like leptin (Bing & Trayhurn, 2008). However, some noticeable evidence exists between
adipose atrophy during cancer cachexia and the CAAs such as the decrease in resistin expression (see fig. 4 and
5) and the down-regulation of lipolytic enzymes such as HLS or ATGL (see fig. S7) underlying that the
mechanisms might not been the same, in addition to the endocrine (cancer cachexia) versus paracrine (CAAs)
effects involved (Bing & Trayhurn, 2008). There are several molecules that have been described as strong
suppressors of adipogenesis such as IL-1β, TNFα, or even IL-6 (Harp, 2004). These molecules can be secreted
by tumour cells but one might not exclude that the adipocyte inflammation induce by tumour cells might itself
contribute to the CAAs phenotype. In favour of this hypothesis, we demonstrated that tumour conditioned
medium was not able to reproduce CAAs phenotype suggesting that either adipocyte-factors or inducible factors
in tumour cells are necessary to observed this effect (see fig. S8). Among the CAAs secretion identified, the proinflammatory cytokine IL-6 seems to be a key player. Its over-expression is observed in both co-culture systems
(either with murine and mammary adipocytes, fig. 4 and 5), further validated in human tumour both in
adipocytes at the invasive front and close to the invasive front (fig. 6) and its functional effect demonstrated in
vitro (fig. 7). The increase in tumour cells invasive capacity induced by IL-6 could be the result of the EMT
transition exhibited by tumour cells (shown for ZR 75.1 cells in fig. 7B) (Sullivan et al, 2009; Arihiro et al,
2000; Sansone et al, 2007), but other pathways should not be excluded (Sansone et al, 2007). It has been
demonstrated in breast cancer patients, that the extent of the increase in serum IL-6 correlates with poor disease
outcome and reduced prognosis (Knupfer & Preiss, 2007). Recent evidence supports the concept that IL-6
derived stroma might support breast tumour growth and metastasis, involving for example IL-6 secreted by
mesenchymal fibroblasts at metastatic sites (Studebaker et al, 2008). Our data strongly suggest that adipocytederived IL-6 could also play a role in the early steps of tumour invasion. When we compared the expression
profiles of isolated adipocytes from tumour versus reduction mammoplasty, the most striking difference was
seen for IL-6 expression (see for fig. 7C) and this up-regulation observed in tumour samples was restricted to
mature adipocytes among the other components of adipose tissue (fig. 7C). The absence of IL-6 over-expression
in the SVF fraction of human adipose tissue isolated from breast tumour biopsies apparently contradicts a recent
study performed ex-vivo using human ADSC co-cultivated with tumour cells (Walter et al, 2009). Interestingly,
the tumours of higher size and/or with lymph nodes involvement exhibit the higher levels of IL-6 in tumoursurrounding adipocytes. Our results suggest that the crosstalk between the CAAS and tumoral components might
be amplified in obesity where the normal balance of adipose tissue secretory proteins is perturbed. In fact,
obesity is related to a condition of chronic inflammation characterized by the abnormal production of
inflammatory cytokines that plays a role in insulin resistance (Rajala & Scherer, 2003). Obesity and the defined
profiles of CAAs share inflammation as common traits, including over-expression of IL-6 with the noticeable
absence of over-expression of TNFα in CAAs (see fig. 6). Interestingly, the association of high levels of IL-6 in
8
CAAs with high tumour size and enhanced local invasion, reproduced traits present in obese patients (Majed et
al, 2008; Berclaz et al, 2004; Daniell et al, 1993). Decreased APN level, that is observed in CAAs (fig. 4-6), is
also observed in a context of obesity (Rajala & Scherer, 2003). In vitro assays have suggested and inhibitory role
for APN for tumour growth, and an inverse correlation between APN levels and breast cancer incidence
demonstrated (Barb et al, 2007). Therefore, CAAs within a context of obesity should be more susceptible to
amplify the negative crosstalk that we identified, a hypothesis that remain to be demonstrated in murine and
human models. Identification of key targets in this negative crosstalk will provide unique opportunities to set-up
specific strategies for the treatment of the subsets of patients exhibiting aggressive diseases.
Methods
Cell Culture. All culture media (obtained from Invitrogen Auckland, NZ) were supplemented with antibiotics.
The murine 3T3F442A pre-adipocyte cell line was cultured in DMEM medium supplemented with 10% of fetal
calf serum (FCS). The differentiation was induced by incubating confluent cells in differentiation medium
(DMEM supplemented with 10% FCS plus 50 nM insulin) for up to 14 days as described previously (Meulle et
al, 2008). Unless indicated, the term “adipocytes” represent cells that have been differentiated for 10 to 14 days.
To estimate the adipocyte phenotype, triglyceride content was quantified using a colorimetric kit (Wako
Chemicals), and Oil red staining was performed as previously described (Masson et al, 2009). The breast cancer
cell line ZR 75.1 (provided by Pr K. Bystricky, LBME, Toulouse, France) and the murine 67NR and 4T1 cell
lines (provided by Dr S. Vagner, INSERM U563, Toulouse, France) were cultured in DMEM medium
supplemented with 10% (ZR 75.1 and 67NR) and 5% (4T1) FCS. The SUM159PT (provided by Dr J Piette,
IGMM, Montpellier, France) was grown in Ham F12 (50:50) medium complemented with 5% FCS, 1µg/ml
hydrocortisone (Sigma, Saint-Quentin les Ulysses, France) and 0.2 UI /mL insulin.
Human samples. Breast adipose tissue samples were collected from reduction mammoplasty or tumorectomy
according to the guidelines of the Ethical Committee of Toulouse-Rangueil. All subjects gave their informed
consent to participate to the study, and investigations were performed in accordance with the declaration of
Helsinki as revised in 2000. In cases of tumorectomy, the fat tissues samples obtained were immediately close to
the tumour mass and were devoid of fibrosis, as assessed macroscopically (data not shown). Adipose tissue
pieces were immediately used for collagenase digestion as previously described (Daviaud et al, 2006) and
centrifuged to separate adipocytes from the stroma-vascular fraction (pellet, SVF). mRNAs were extracted from
the mature adipocytes and the SVF fraction. The SVF fraction issued from mammoplasty reduction adipose
tissue samples was also used for ex vivo differentiation as previously described (Bour et al, 2007). Briefly, the
stromal vascular pellets were incubated overnight with DMEM/Ham's F12 medium supplemented with 10%
FCS. After overnight culture, the medium was replaced by an adipogenic induction medium (DMEM/Ham's F12
(1:1) medium supplemented with 1µg/ml ciglitazone, 10 mg/ml transferrin, 33 mM biotin, 66 mM insulin, 1 nM
triiodothyronine, and 17 mM pantothenate). Cells were cultivated in this medium during 3 days before the
ciglitazone was removed and maintained 10 days in culture for differentiation. .
Co-culture and invasion assays. Co-culture between tumour cells and adipocytes were performed using a
Transwell culture system (0.4 µM pore size, Millipore). 5 x 104 (67NR), 1.5 x 105 (SUM159PT and 4T1) or 3 x
9
105 (ZR 75-1) cells were seeded in the upper chamber of the Transwell system in the culture medium of
adipocytes and co-cultivated or not with mature adipocytes for the indicated times. Medium was daily changed.
Adipocytes or tumour cells cultivated alone in similar conditions served as controls. To evaluate the effect of
adipocyte-conditioned medium (Ad-CM) on tumour cells invasion, mature adipocytes were cultivated overnight
with serum-free medium containing 1% of delipidated BSA (Sigma, France). Culture media are then collected
and centrifuged at 1000 rpm for 10 min and supernatants stored at -80°C until use. As indicated, CM was
collected also from adipocytes previously co-cultivated during 3 days with tumour cells (CAA-CM). After 3
days of co-culture in the presence of either mature adipocytes, Ad-CM or CAA-CM (complemented with 10%
serum), tumour cells were trypsinized and used to perform Matrigel invasion assays as previously described
(Monferran et al, 2004). A total of 35-40 fields per filter were counted using an optical microscope. Three
independent experiments were performed. As indicated, invasion assays were performed with tumour cells
previously cultivated 3 days with recombinant human IL-6 (both obtained from PeproTech, France) or with
blocking Ab directed against murine IL-6 (αIL-6)(obtained from R&D, France).
Vein tail metastasis assays. Eight- to twelve-week-old male syngeneic BALB/c host mice (Janvier, Le Genest
St-Isle, France) with an average body weight of 22g were used in this study. The local Institutional Animal Care
and Use Committee approved the experimental protocols described in the study. A catheter was indwelled into
the femoral vein under anesthesia (sodium pentobarbital, 1:10; 0.2 ml per mice; Ceva, Libourne, France), sealed
under the back skin, and glued on the top of the skull. The mice were housed individually and allowed to recover
for 4 days. Then, mice (6 animals/conditions) were injected into femoral artery with 4T1 cells (1x106 cells)
either previously co-cultivated or not for 4 days with mature adipocytes. Fourteen days after injection, mice were
sacrificed by cervical dislocation and lungs were taken for analyses. Tumours were scored from 1 to 5.0
according to their likelihood to represent metastasis to lungs, with: "0": denoting normal lung tissue, without
nodules; “1”: tissue with 0±5 nodules; “2”: 5±10 nodules; “3”: 10±20 nodules; “4”: 20±30 nodules; “5”: higher
than 30 nodules. Then, lungs were fixed in 4% paraformaldehyde (PAF) and embedded in paraffin. Sections
were stained with haematoxylin and eosin (H & E) and metastasis and tumour growth were observed (mean
number of nodules per lung area and mean nodule area as a function of lung area measured by Image J software
program).
Immunofluorescence, immunohistochemistry and determination of adipokines secretion. ZR 75.1 and
SUM159PT grown on coverslips and cultivated or not with adipocytes were fixed in 3.7% paraformaldehyde for
20 min at room temperature (RT). After blocking with 10% FCS and 2% BSA in PBS for 1 hour, cells were
incubated 2 hours at RT with the following antibodies: rabbit polyclonal anti-vimentin (Neomarkers), mouse
monoclonal anti-β-catenin (clone 14, BD Biosciences), anti E-cadherin (clone HECD-1, Calbiochem), and
rhodamine-phalloidin used to detect polymerized actin (Invitrogen). After washing, antibody binding was
detected with Alexa fluor 488-conjugated anti-rabbit or anti-mouse Abs for 30 min at RT. Confocal images were
obtained by means of a confocal laser microscopy system (Leica, St-Gallen, Switzerland). Images were collected
by scanning stained cells sequentially under 100X objective lens (zoom 2). For each sample, over 100 cells were
examined in at least three independent experiments. Immunohistochemistry was performed as previously
described (Andarawewa et al, 2005). The anti-MMP-11 antibody (MAb 5ST-4A9) is a king gift of Dr MC Rio
10
(IGBMC, Strasbourg, France). The mAb directed against human adiponectin (HADI 773) was from Alexis
biochemicals, and the goat antibody directed against human IL-6 used in immunohistochemistry was from R&D.
Concentration of secreted factors in supernatants was determined using the Xmap Technology (Luminex, Austin,
TX), with a Milliplex Kit (Millipore, Billerica, MA).
RNA extraction and quantitative RT-PCR (qPCR). Total RNAs were extracted using the RNeasy mini kit
(Qiagen GmbH, Hilden, Germany). Gene expression was analyzed using real time PCR as described previously
(Daviaud et al, 2006). Total RNAs (1 µg) were reverse-transcribed for 60 min at 37°C using Superscript II
reverse transcriptase (Invitrogen, Auckland, NZ) in the presence of a random hexamer. A minus reverse
transcriptase reaction was performed in parallel to ensure the absence of genomic DNA contamination. Real time
PCR was performed starting with 25 ng of cDNA and the indicated concentrations of both sense and antisense
primers (presented in the supplemental Methods Section, Table S3 and S4) in a final volume of 25 μl using the
SYBR Green TaqMan Universal PCR master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). Fluorescence was
monitored and analyzed in a GeneAmp 7300 detection system instrument (Applied Biosystems, Foster City,
CA). Analysis of 18S ribosomal RNA was performed in parallel using the ribosomal RNA control TaqMan
assay kit (Applied Biosystem), or HPRT RNA (100 nM) or GAPDH RNA (300 nM) to normalize for gene
expression. Analysis of hMMP-11, hE-cadherin and hN-Cadherin gene expression was performed using a
TaqMan assay kit (Applied biosystem). Oligonucleotide primers were designed using the Primer Express
software (PerkinElmer Life Sciences) as previously described (Daviaud et al, 2006).
Statistical methods. For all the experiments performed in vitro, significant differences were evaluated using the
unpaired two-tailed Student's t test. Quantitative expression of biological markers measured by Q-PCR in
isolated adipocytes was assessed using estimations of means and standard deviations (SD). Hence, a normal
distribution of these measures was assumed. However, sub-populations’ size was limited in most cases. Thus, we
tested differences, regarding the expression of biological markers between sub-populations of interest, using non
parametric tests (i.e. Wilcoxon’s non parametric rank test). Quartiles were also computed; box plots permitted to
appreciate the presence of outliers and to illustrate differences in biological markers’ expression. The threshold
of statistical significance was fixed at alpha risk = 5%. Splus statistical software was used for the data analysis
(Venables & Ripley, 2002).
Acknowledgements. The authors would like to thank Dr Jean-Sebastien Saulnier-Blache for critical reading of
the manuscript, Sandrine Imbert for her excellent technical assistance, Sandra Grès for qPCR primer design and
the Anexplo- Phenotypage platform, IFR150 in Toulouse, for Luminex analysis. The “Canceropole Grand SudOuest”, INCA (PL-2006-035 to PV, CM and GE), The “Ligue Nationale Contre le Cancer- (Comité “MidiPyrénées” and Comité du Lot to CM) and the radioprotection Committee of EDF (to CM) supported this work.
11
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Legends of the figures
Figure 1. Coculture of breast tumour cells with mature adipocytes stimulates their invasive capacities. (A)
ZR 75.1 or SUM159PT cells were co-cultivated (C) or not (NC) for 3 days in the presence of mature adipocytes.
After this period, tumour cells were trypsinised and used for Matrigel invasion assay towards a medium
containing either 0 (white bars) or 10 % serum (black bars), mean of at least 3 independent experiments ± SD, *
statistically significant by Student's t-test, p<0.05, ** p<0.01; (B) similar experiments were performed with the
67NR and 4T1 murine cancer cells, representative images of Matrigel invasion assay performed towards a
medium containing 10% serum are shown below each graph; (C) 67NR and ZR 75.1 cells were cultivated 3 days
in normal medium (NC), in conditioned medium obtained from adipocytes (Ad-cm) or in conditioned medium
obtained from adipocytes previously grown in the presence of tumour cells (CAA-cm). After this period, tumour
cells were trypsinised and used for Matrigel invasion assay towards a medium containing either 0 (white bars) or
10 % serum (black bars). Mean of at least 3 independent experiments ± SD, * statistically significant by
Student's t-test, p<0.05, ** p<0.01, NS = not significant.
Figure 2. Cancer cells exhibit morphological changes upon co-culture with adipocytes. (A) ZR 75.1 or
SUM159PT were grown on coverslips in inserts, the lower wells containing (C) or not (NC) mature adipocytes.
After 3 or 5 days, cells were fixed and stained with the indicated Abs; (B) Left panel: ZR 75.1 cells were grown
for 3 days on an insert in the presence or not of mature adipocytes. After 3 days, inserts of cells previously cocultivated (C) or not (NC) were taken and cells further incubated in complete medium for 72 (a-b) or 96h (c-d)
and stained with anti β-catenin Ab. Right panel: cells were taken at the indicated time points to perform Matrigel
invasion assay towards a medium containing either 0 (white bars) or 10% serum (black bars). Mean of at least 3
independent experiments ± SD, ** statistically significant by Student's t-test, p<0.01, NS = not significant.
Figure 3. Coculture with adipocytes stimulates the metastatic potential of 4T1 cells in vivo. (A) Left panel:
representative lungs harvested at necropsy after tail-vein injection of 4T1 co-cultivated (C) or not (NC) during 4
days with adipocytes prior to injection, right panel: score of lung nodules observed in similar conditions as
14
determined by macroscopic examination. * statistically significant by Student's t-test, p<0.05; (B) Left panels:
H&E stained transverse section of host lungs from mice injected with 4T1 cells previously cocultivated (C) or
not (NC) during 4 days with adipocytes (original magnification x 40). Examples of invading lesions are shown
by asterisks. Right panels: magnified views of invading lesions; (C-D) Metastasis number in mice injected with
4T1 cells previously co-cultivated (C) or not (NC) during 4 days with adipocytes expressed as the average
number of metastasis sites per lung area (C) or Metastasis index (D) expressed as the average metastasis area
normalized by total lung area. * stastistically significant by Student's t-test, p<0.05.
Figure 4. Adipocytes co-cultivated with breast tumour cells undergo extensive phenotypic changes. (A)
Upper panel: mature murine adipocytes co-cultivated (c) or not (nc) in the presence of ZR 75.1 tumour cells
were stained with Red Oil; Lower panel: the TG content was dosed in adipocytes. Mean of at least 3 independent
experiments ± SD, * statistically significant by Student's t-test, p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001; (B) Adipocytes
were cocultivated (black bars) or not (white bars) in the presence of ZR 75.1 tumour cells. After 3 days, mRNAs
were extracted and expression of the indicated genes analyzed by q-PCR. (C) Dosage of the indicated murine
secreted factors in the supernatants of adipocytes grown alone (nc, white bars) or in the presence of breast
tumour cells (c, black bars). Mean of at least 3 independent experiments ± SD, * statistically significant by
Student's t-test, p<0.05.
Figure 5. Similar crosstalk between tumour cells and adipocytes is observed with human mammary
adipocytes. (A) Left panel: mammary human adipocytes issued from the ex vivo differentiation of the SVF
fraction of adipose tissue obtained from reduction mammoplasty were co-cultivated (C) or not (NC) for 3 days in
the presence of ZR 75.1 tumour cells. Shown a representative experiment with Red oil staining and phase
contrast. Right panel: after 3 days, mRNAs were extracted from adipocytes grown alone (white bars) or in the
presence ZR 75.1 tumour cells (black bars) and the levels of expression of the indicated genes evaluated by qPCR. Data are represented as fold changes of adipocytes grown alone towards cocultivated adipocytes for
samples obtained from 6 independent donors ± SD; * statistically significant by Student's t-test, p<0.05, ***,
p<0.001. (B) Left panel: ZR 75.1 tumour cells were grown (black bars) or not (white bars) with mature human
adipocytes obtained from 6 independent donors. After 3 days, cells were taken to perform Matrigel invasion
assays toward a medium containing either 0 or 10% serum, * statistically significant by Student's t-test, p<0.05,
*** p<0.001; Right panel: tumour cells co-cultivated (C) or not (NC) with adipocytes were fixed and stained for
β-catenin expression. Shown the results of representative experiments obtained with adipocytes issued from 2
independent donors.
Figure 6. Cancer-Associated adipocytes from human breast tumour exhibit extensive phenotypic changes
in accordance with the in vitro co-culture assays. (A) Histologic examination of an invasive breast tumour
after H&E staining (original magnification x200). Note that the number and the size of adipocytes are greatly
reduced at the invasive front of the tumour; (B) APN (a-b), MMP-11 (c-d), IL-6 (e-f) expressions were
visualized in adipocytes (lipids in white, nucleus in blue) located adjacent to invading cancer cells (right
columns) as compared to normal adipose tissue (left columns). (C) Upper panels: expression of the indicated
genes was analyzed by q-PCR in mature adipocytes obtained from reduction mammoplasty (RM) or
15
tumourectomy (TU) (14 independent samples in each group); Lower panels: similar experiments were performed
with the SVF fraction of the samples; (D) Expression of IL-6 as a function of tumour characteristics. ER
(estrogen receptor), G (grade), IDC (invasive ductal carcinoma), ILC (invasive lobular carcinoma), N (lymph
nodes involvement).
Figure 7. IL-6 is involved in the adipocyte-driven pro-invasive effect. (A) ZR 75. 1 and 67NR cells were
cultivated for 3 days alone or in the presence of IL-6 (10ng/mL) and taken to perform a Matrigel assays toward
medium containing either 0 (white bars) or 10 % (black bars) serum. Mean of at least 3 independent experiments
± SD, ** statistically significant by Student's t-test, p<0.01. (B) Left panel: similarly treated ZR 75.1 cells were
fixed and stained for the indicated antibodies; Right panel: ZR 75.1 were co-cultivated for 3 days in a insert, the
lower wells containing (black bars) or not (white bars) murine adipocytes. As indicated, blocking Ab directed
against murine IL-6 (αIL-6) or control Ab (IgG) was added in the culture medium. Tumour cells were then taken
and Matrigel invasion assays were performed towards a medium containing 10% serum. Mean of at least 3
independent experiments ± SD, ** statistically significant by Student's t-test, p<0.01. (C) 67NR and 4T1 cells
were cultivated 3 days in normal medium (NC), in normal medium containing either control Ab (NC + IgG) or
blocking Ab directed against murine IL-6 (NC + αIL-6), in conditioned medium obtained from adipocytes
previously grown in the presence of tumour cells (CAA-CM), or in CAA-CM containing either control (CAACM + IgG) or IL-6 blocking Ab (CAA-CM + αIL-6). After this period, tumour cells were trypsinised and used
for Matrigel invasion assay towards a medium containing either 0 (white bars) or 10 % serum (black bars). Mean
of at least 3 independent experiments ± SD, * statistically significant by Student's t-test, p<0.05, ** p<0.01.
16
A
ZR 75.1
SUM159PT
**
B
67NR
4T1
*
C
*
**
*
NS
**
NS
67NR
6
ZR 75.1
Dirat et al, figure 1
A
5 Days
3 Days
C
NC
C
-catenin
vimentin
SUM159PT
actin
ZR 75-1
E-cadherin
NC
NS
NS
B
**
a
b
c
d
- 72h
**
- 96h
Dirat et al, figure 2
A
NC
C
B
C
D
NC
** *
C
*
** *
**
**
Dirat et al, figure 3
B
A
nc
*
c
*
***
*
*
***
**
***
*
***
***
C
*
*
*
*
Dirat et al, figure 4
A
NC
NC
***
***
***
***
***
*
*
C
C
*
B
***
NC
C
NC
C
Dirat et al, figure 5
D
mRNA relative expression
mRNA relative expression
SVF fraction
Isolated mature
adipocytes
C
mRNA relative expression
A
2.0
B
MMP-11
PAI-1
a
b
c
d
e
f
TNF-
IL-6
IL-1
P=0.01
P=0.001
P<0.001
1.5
1.0
0.5
0.0
RM
RM
TU
RM
TU
RM
RE-
RE+
GII
TU
RM
TU
RM
TU
RM
TU
RM
TU
RM
TU
RM
TU
<3cm
>3cm
N-
N+
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
TU
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
GIII
IDC
ILC
Dirat et al, figure 6
A
ZR 75-1
67NR
**
**
IL-6
E-cadherin
NT
**
actin
-catenin
B
C
67NR
*
4T1
**
*
*
Dirat et al, figure 7
A
B
Figure S1. (A) Adipocytes but not preadipocytes promotes ZR 75.1 invasive capacities. ZR 75.1 were cocultivated (C) or not
(NC) with murine pre adipocytes in an insert for 3 days. Tumour cells were then trypsined and used to perform a Matrigel invasion
assay toward medium containing either 0% (white bars) or 10% serum (black bars), (B) Effect of adipocytes on tumor cell
proliferation. indicated cells were grown for three days on inserts in the presence (black bars) or not (white bars) of mature
adipocytes obtained from the in vitro differentiation of the murine pre-adipocyte cell line, F442A. After three days, cells were counted.
Mean of five independent experiments ± SD, ***, statistically significant by Student’s t-test, p<0.001.
B
A
ZR- 75.1
NC
C
SUM-159PT
NC
C
N-Cadherin
Vimentin
E-Cadherin
*
Tubulin
Figure S2. Coculture with murine mature adipocytes induces an incomplete epithelial mesenchymal transition in ZR
75.1 tumor cells. (A) Relative mRNA expression of N-cadherin (upper panel) and E-cadherin (bottom panel) expression in indicated
tumor cell lines cocultivated (black bars) or not (white bars) with murine adipocytes evaluated by Q-PCR, mean of three independent
experiments ± SD, *, statistically significant by Student’s t-test, p<0.05. (B) Analysis of protein expression of the indicated markers
performed by Western blots with extracts obtained from non cocultivated cells (NC) or cocultivated cells (C).
Dirat et al, SuppS2
Figure S3.The occurrence of the CAAs phenotype is reproductively observed with other cell lines than ZR 75.1. Mature
adipocytes were cocultivated (black bars) or not (white bars) in the presence of SUM-159PT breast cancer cells for three days. mRNAs
were extracted from adipocytes and the expression of the indicated genes analysed by Q-PCR (means of three independent
experiments ± SD), statistically significant by Student's t-test, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001.
Figure S4. Expression of key adipogenic markers in the human mammary adipocytes obtained from ex vivo
differentiation. The human adipose tissues were obtained from reduction mammoplasty. After collagenase digestion, mature
adipocytes (white bars) were isolated by flotation. The Stroma-Vascular fractions (SVF) containing adipocyte progenitors were
cultivated in a lipogenic medium to obtain, after 10 to 14 days, cells exhibiting morphological feature (assessed by lipid content) of
mature adipocytes (black bars). The expression of the indicated markers of adipocyte differentiation was analysed by Q-PCR (mean of
six independent donors).
Figure S5. Upregulation of MMP-11 occurs only at 5 days of coculture when mammary human adipocytes are
cocultivated with breast tumor cells . After 3 or 5 days of coculture of mature mammary adipocytes with ZR 75.1 tumor cells,
mRNAs were extracted from adipocytes grown alone (white bars) or in the presence of tumor cells (black bars) and the levels of
expression of MMP-11 evaluated by Q-PCR. Datas are represented of fold changes of adipocytes grown alone towards cocultivated
adipocytes for samples obtained from 6 independent donors ± SD ; * statistically significant by Student's t-test, p<0.05
Dirat et al, SuppS5
A
1.4
PAI-1
0.8
mRNA relative expression
1.0 1.1 1.2 1.3
P=0.05
RE-
RE+
IDC
ILC
GII
GIII
N-
N+
<3cm
>3cm
2.0 2.5
1.0 1.5
0.5
0.0
mRNA relative expression
3.0
MMP-11
RE-
RE+
IDC
ILC
GII
GIII
N-
N+
<3cm
>3cm
Figure S6. Expression of PAI-1 and MMP-11 in tumor-associated adipocytes as a function of tumor characteristics.
Expression of PAI-1 or MMP-11 genes was measured from tumor-associated adipocytes in 14 independent samples. Expression was
analyzed as a function of tumor characteristics ; ER (estrogen receptor), IDC (invasive ductal carcinoma), ILC (invasive lobular
carcinoma), N (lymph nodes involvement).
SuppS6
HSL
Tubulin
Figure S7. The occurrence of the CAAs phenotype is associated with a profound down regulation of lypolytic enzymes
in mature adipocytes. (A) Mature adipocytes were cocultivated (black bars) or not (white bars) in the presence of SUM-159PT breast
cancer cells. At the indicated times, mRNAs were extracted from adipocytes and the expression of Adipocyte TriGlyceride Lipase (ATGL)
or Hormono-Sensitive Lipase (HSL) analysed by Q-PCR (means of three independent experiments ± SD), statistically significant by
Student's t-test, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, (B) Proteins were extracted from adipocytes cocultivated (C) or not (NC) in the
presence of tumor cells and the expression of HSL was measured by Western blot experiments, tubulin being used as a loading
control ; (C) these results were confirmed using immunofluorescence approach (five days of coculture)
Dirat et al, SuppS7
**
***
**
Figure S8. The occurrence of the CAAs phenotype is not reproduced by conditioned medium obtained from tumor cells.
Adipocytes were cocultivated (c, black bars) or not (nc, white bars) in the presence of SUM-159PT cells. In parallel, adipocytes were
cultivated in the presence of tumor cells conditioned medium complemented with 10% serum (SUM159PT-cm, grey bars). After three
days, mRNAs were extracted from adipocytes and the expression of indicated genes analysed by Q-PCR (means of three independent
experiments ± SD).
Variables
Age in years
[35-50[
50
Body Mass Index in kg/m
[18-25[
[25-30[
30
Controls (n=14)
n (%)
Cases (n=14)
n (%)
6 (42,8)
8 (57,2)
3 (21,4)
11 (78,6)
5 (35,7)
7 (50)
4 (28,6)
9 (64,3)
2 (14,3)
1 (7,1)
2
Supplementary Table 1. Age and anthropometric characteristics of control
and cases series.
Variables
Sub-groups
Tumor histology
Lobular
Canalar
I
II
3 (21,4)
11 (78,6)
0 (0)
9 (64,3)
III
Pre-menopausal
Post-menopausal
5 (35,7)
3 (21,4)
11 (78,6)
Breast cancer stage
Menopausal status
Cases (n=14)
n (%)
]0-2]
]2-5]
>5
nc
Clinical node involvement
N0
N1
N2
Tumor estrogen receptors status ER (-)
ER (+)
Tumor HER2 status
HER2 (-)
3 (21,4)
7 (50)
2 (14,3)
2 (14,3)
3 (21,4)
5 (35,7)
6 (42,9)
4 (28,6)
10 (71,4)
11 (78,6)
HER2 (+)
3 (21,4)
Tumor diameter in cm
Supplementary Table 2. Clinical characteristics of the breast cancer patients.
Name
adiponectin
Forward
TGGAATGACAGGAGCTGAAGG
Reverse
TATAAGCGGCTTCTCCAGGCT
Concentrations (nM)
900
aP2
TTCGATGAAATCACCGCAGA
GGTCGACTTTCCATCCCACTT
900
ATGL
CAGCACATTTATCCCGGTGTAC
AAATGCCGCCATCCACATAG
100
C/EBP-
CAAGAACAGCAACGAGTACCG
GTCACTGGTCAACTCCAGCAC
100
FGF-
GCGACCCACACGTCAAACTA
TGGCACACACTCCCTTGATAGA
100
HGF
TCGTGGCAATGGGAAAAATT
GGAACATGTAAGTCCAGACCTTGTT
100
HSL
GGCTTACTGGGCACAGATACCT
CTGAAGGCTCTGAGTTGCTCAA
900
IL-1
ACCATGGCACATTCTGTTCAAA
GCCCATCAGAGGCAAGGA
300
IL-6
GCCCACCAAGAACGATAGTCA
CAAGAAGGCAACTGGATGGAA
300
leptin
GGGCTTCACCCCATTCTGA
TGGCTATCTGCAGCACATTTTG
900
MMP-9
TGAGTCCGGCAGACAATCCT
CGCCCTGGATCTCAGCAATA
300
MMP-11
GCCCTCATGTCCCCTTTCTAC
CCTTCGGTCATCTGGGCTAA
900
PAI-1
TCTCCAATTACTGGGTGAGTCAGA
GCAGCCGGAAATGACACAT
900
PPAR-2
CTGTCAGAAACGGCTGTGTCA
TCCGGGCGAAACATTCA
300
TNF-
TGGGACAGTGACCTGGACTGT
TTCGGAAAGCCCATTTGAGT
100
Resistin
TCGTGGGACATTCGTGAAGA
GGGCTGCTGTCCAGTCTATCC
300
Supplementary Table 3. Sequences and concentrations of the primers used to detect murine genes expression using Q-PCR
Name
Forward
Reverse
Concentrations (nM)
adiponectin
GCAGAGATGGCACCCCTG
GGTTTCACCGATGTCTCCCTTA
300
aP2
GCATGGCCAAACCTAACATGA
CCTGGCCCAGTATGAAGGAAA
300
C/EBP-
ACCCTCAGCCTTGTTTGTACTGTAT
GGACTGATCGTGCTTCGTGTT
300
C/EBP-
AACATCGCCGTGCGCAAGAG
GCTTGAACAAGTTCCGCAGG
300
HSL
GTGCAAAGACGGAGGACCACTCCA
GACGTCTCGGAGTTTCCCCTCAG
900
IL-1
TCAGCCAATCTTCATTGCTCAA
TGGCGAGCTCAGGTACTTCTG
300
IL-6
AGGGCTCTTCGGCAAATGTA
GAAGGAATGCCCATTAACAACAA
100
leptin
CCTTCCAGAAACGTGATCCAA
GGCCAGCACGTGAAGAAGAT
900
MMP-9
CCCTGGAGACCTGAGAACCA
CCACCCGAGTGTAACCATAGC
900
PAI-1
ACCGATTCGACCAGTTATTTGAC
TCTTGTTCTCTGCTGCCTTCAG
300
PPAR2
GAACCACCGCACGATGTTG
AAGTCGAACACGCTGCTGAA
900
TNF-
CCGAGTCTGGGCAGGTCTAC
TGGGAAGGTTGGATGTTCGT
300
Supplementary Table 4. Sequences and concentrations of the primers used to detect human genes expression using Q-PCR
Supplementary methods
Antibodies. The mouse monoclonal anti- tubulin Ab (clone DM1A) was obtained from
Neomarkers. The rabbit polyclonal Ab directed against Hormone-Sensitive Lipase (HSL) is a
kind gift of Dr D. Langin (INSERM U858). The mouse monoclonal Ab directed against NCadherin (3B9) was from Invitrogen.
Western blot analysis. Whole cell extract were prepared as previously described (Muller et
al., 2001). Briefly, tumour cells previously cocultivated or not with adipocytes were pelleted
and resuspended in extraction buffer containing 50 mM NaF, 20 mM HEPES (pH 7.8), 450
mM NaCl, 25 % glycerol, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM dithiothreitol in the presence of proteinase
inhibitors: 20 g/ml phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 g/ml aprotinin, 1g/ml leupeptin,
1g/ml pepstatin, then frozen on dry ice and thawed at 30°C three times. After
centrifugation for 30 min at 4°C, supernatants were stored at -80°C. Proteins were subjected
to electrophoresis on a 8% SDS-polyacrylamide gel under reducing conditions. The proteins
were then electroblotted onto a nitrocellulose filter using a semi-dry apparatus (Bio-rad
Trans- Blot, Bio Rad). Immunoblots were performed as previously described (Muller et al.,
2001).
Cell proliferation assay. Tumour cells (5 X 104 SUM159-PT or 2 x 105 ZR 75-1 cells) were
seeded on inserts in the upper chamber of the Transwell system in the culture medium of
adipocytes and were cocultivated with adipocytes for 3 days. Tumour cells grown alone
served as a control. After 3 days, tumour cells were trypsinized and counted using a
Malassez counting chamber.
Preparation of tumour cells conditioned-medium and coculture. To evaluate the
effect
of
tumour-conditioned
medium
on
adipocyte
phenotype
(SUM-159PT-cm),
exponentially growing SUM-159PT cells were incubated overnight in serum-free media in the
presence of 0.5% delipidated BSA. The culture medium was collected and centrifuged at
1000 rpm for 10 minutes. After 3 days in culture alone, in the presence of SUM159PT cells or
SUM-159PT-cm (complemented with 10 % serum), mRNA were extracted from adipocytes to
perform Q-PCR experiments.
RNA extraction and quantitative RT-PCR (qPCR). Analysis of hE-cadherin and hNCadherin gene expression was performed using a TaqMan assay kit (Applied biosystem).
1
References
Muller, C., Monferran, S., Gamp, A. C., Calsou, P., and Salles, B. (2001). Inhibition of Ku
heterodimer DNA end binding activity during granulocytic differentiation of human
promyelocytic cell lines. Oncogene 20, 4373-4382.
2
Article 2 :
Le rôle des acides gras dans les capacités invasives des cellules tumorales
(manuscrit en préparation)
84
MATERIEL ET METHODES
Cellules et culture cellulaire :
Les cellules C2C12 ont été cultivées dans du DMEM complémenté avec 10% de sérum de
veau fœtal durant les trois premiers jours, puis pour l’induction de la différenciation, les
cellules sont cultivées dans du DMEM complémenté avec 2% de sérum de cheval. Les HMEC
(obtenues auprès de J. Piette, Montpellier) sont cultivées dans du milieu MEBM (cambrex
CC-3151), additionné de 5µg/ml de transferrine, 10-5 M d’isoproterenol et 125 µ g/ml de
streptomycine et 125 UI/ml de pénicilline. Concernant les lignées S1, T4-2 (obtenues auprès
de E Liaudé, Montpellier), ces cellules sont cultivées dans du milieu H14 auquel on rajoute
250 ng/ml d’insuline bovine, 10µg/ml d’apotransferrine, 2.6 ng/ml de sodium sélénite, 1.4µM
d’hydrocortisone et des estrogènes E2 10-10M pour les T4-2 et le même milieu au<uel on
rajoute en plus, 10 ng/ml d’EGF pour les S1. Tous les réactifs viennent de chez sigma et les
milieux de chez Bibco.
Coloration des gouttelettes lipidiques :
Le marquage fluorescent se fait à l’aide du Nile Red (Sigma). Pour cela, il faut laver les
cellules tumorales au PBS 1X, une fois, puis les incuber dans une solution de Nile Red à
0.1µg/ml, 15 min à température ambiante, à l’abri de la lumière. Après un second lavage au
PBS 1X, il faut fixer les cellules avec du PAF (paraformaldéhyde) à 3.7% pendant 30 min à
température ambiante. Laver de nouveau au PBS 1X une fois et monter les lamelles sur lame
avec du Vectashield comme milieu de montage. Observation au laser argon 488nm.
Concernant le marquage des gouttelettes lipidiques à l’huile rouge (Sigma), il faut au
préalable rincer les tumorales ou les adipocytes suivant le cas, avec du PBS 1X. Les cellules
doivent être ensuite fixées avec du PAF à 3.7% pendant 30 min à température ambiante.
Laver 2 fois au PBS 1X. Colorer les cellules avec une solution d’huile rouge prête à l’emploi
(600µl de solution stock (500mg de poudre pour 100ml d’isopropanol)) pendant 10 min pour
les adipocytes et 30 min pour les cellules tumorales. Deux rinçages à l’eau et montage des
lamelles sur lame comme précédemment décrit. Observation sous microscope à fort
grossissement pour les cellules tumorales.
85
Dosage des acides gras libres (AGL) et des triglycérides (TG) :
Les adipocytes ont été co-cultivés ou non avec les cellules tumorales (ZR-75-1) durant 3 à 5
jours dans du DMEM contenant 50 nM d’insuline (sigma). Pour le dosage des acides gras
libres, dans le surnageant, 2% de BSA délipidée (Sigma) ont été rajoutés durant la durée de la
co-culture. Le milieu a été changé tous les jours. Au bout des 3 ou 5 jours de co-culture, un
échantillon du milieu est collecté pour être dosé, selon les instructions du kit (Wako NEFA).
5 µl de l’échantillon sont incubés avec 100µl du réactif 1 pendant 10 min à 37°C. On rajoute à
ce mélange 200µL de réactif 2 et on incube 10min à 37°C. Lecture au spectromètre à 550nm.
Concernant les TG dans le surnageant même procédure que celle décrite précédemment,
excepté que la BSA n’a pas été rajoutée. 10µl d’échantillon sont mélangés avec 1000µl du
réactif du kit (TG PAP 150 Biomérieux) et incubation pendant 10 min à température
ambiante. Lecture à 505 nm.
Concernant le dosage des TG dans les cellules, après être lavés, les adipocytes sont mis en
contact avec un tampon de lyse (600µl) (EDTA 1mM et Tris HCl pH 7.5 10mM). 10µl de
cette solution est analysée comme précédemment. Concernant les cellules tumorales, avant
d’être reprises dans ce tampon de lyse (15µl), elles sont lavées puis trypsinées et centrifugées
pendant 10min à 1000rpm.
Western Blot :
Le western blot est réalisé comme précédemment décrit dans l’article I. L’incubation avec
l’anticorps anti-CD36 est effectuée dans du TBS (Tris-HCl 100mM pH 7.6, NaCl 145 mM)lait 5% contenant 0.02% de Tween et les lavages dans du TBS-Tween 0.1%. L’anticorps est
utilisé au 1 :500ième (Abcam ab 17044). L’anticorps secondaire couplé à la HRP est utilisé au
1 : 5000ième. L’immunodétection est effectuée à l’aide d’un système de révélation ECL
(Enhanced ChemiLuminescence, Pierce).
Récupération des cellules tumorales « flottantes » :
Les ZR-75-1 ont été co-cultivées ou non avec des adipocytes pendant 5 jours. Le milieu de
culture étant changé tous les jours. Après ce lapse de temps, les cellules tumorales NC et C
ont été récupérée après avoir été lavées et trypsinées. Elles ont été centrifugées 5 min à
1000rpm et mise à l’étuve pendant 1h30. Sur le principe que les cellules qui contiennent un
contenu lipidique important, flottent, nous avons pu isoler au bout de ce temps après l’étuve,
86
des cellules qui flottaient, dans la condition des cellules ayant été au préalable co-cultivées.
Nous ne retrouvons pas cela pour celles qui n’ont pas été co-cultivées. Après avoir récupéré
chacun de ces différents types de cellules, nous les avons utilisés dans des essais d’invasion et
pour le dosage du contenu en TG.
β-oxydation :
Les cellules tumorales, quelles aient au préalables co-cultivées ou non, ont été mis en contact
pendant deux heures avec un tampon qui contient les éléments suivants : 124 mM NaCl, 4.95
mM KCl, 2.62 mM CaCl2, 2H2O, 1.24 mM KH2PO4, 1.24 mM MgSO4, 7H2O et 24 mM
NaHCO3. Ce tampon a été au préalable mis sous carbogène et additionné de 1.5% de BSA
délipidée ainsi que de 1 mM de palmitate froid. Le pH est ajuste à 7.2-7.4 et le tput est
complété avec du palmitate chaud à 0.5 µCi/ml.
Au bout des deux heures d’incubation, 1 ml de milieu est récupéré pour être mis dans un
eppendorf contenant une base forte, la benzéthonium et de l’acide sulfurique (qui va changer
le pH pour permettre de libérer le CO2 libéré). Laisser 2 heures à température ambiante pour
que la base forte ait capté le CO2, pour la mesure de l’oxydation complète du palmitate.
Concernant l’oxydation incomplète du palmitate, les cellules qui ont été incubées avec le
tampon contenant le palmitate radio marqué, sont lavées puis récupérée dans du tampon de
lyse. Ajouter ce lysat, à un mélange de méthanol chloroforme ainsi qu’une solution de
KCl/HCl qui va permettre de précipiter les acides gras à longue chaine. Centrifuger 10 min à
température ambiante à 2500 rpm et récupérer la phase organique inférieure et en mesurer la
radioactivité pour obtenir la mesure de l’oxydation incomplète.
Transfert de lipide :
Lorsque les 3T3-F442A sont à confluence, les cellules sont mises dans un milieu de
différenciation contenant (du DMEM 4.5 g/l de glucose, 10% de SVF, 50 nM d’insuline, 125
µg/ml de streptomycine et 125 U/ml de pénicilline) contenant du palmitate radio marqué au
carbone 14, (0.12µCi/ml). Le milieu est changé tous les deux jours. Au onzième jour de
différenciation, les adipocytes sont rincés 3 fois avec du PBS 1X. Les ZR-75-1 sont
ensemencées (300 000 cellules par insert) dans des inserts de co-culture (Millipore) et sont
mises ou non en présence des adipocytes. Pour chaque puit, on met
3ml de milieu à
l’intérieur et 3ml de milieu à l’extérieur, milieu qui cette fois-ci, diffère du précédent, car il ne
87
contient plus de palmitate radio marqué. Les cellules sont gardées 3 à 5 jours sans que le
milieu de culture soit changé. A la fin de la co-culture, les cellules sont rincées 2 fois avec du
PBS 1X, puis lysées dans 500µl de tampon de lyse. 200µl du lysat est mis à compter dans du
scintillant.
88
RESULTATS
Les adipocytes co-cultivés avec les cellules tumorales présentent une délipidation.
Comme nous l’avons montré précédemment, en réponse au dialogue avec les cellules
tumorales, les adipocytes présentent un phénotype activé, qui se caractérise par une
expression accrue de certains marqueurs pro-inflammatoires comme l’IL-6, l’IL1-β, par une
augmentation de l’expression de la MMP-11 et de protéases associées comme PAI-I. De plus,
comme indiqué sur la figure 1A, le marquage à l’huile rouge montre une diminution du
nombre et de la taille des gouttelettes lipidiques dans les adipocytes (soit issus de la
différenciation de fibroblastes murins, les 3T3-F442A, soit issus de la différenciation de
précurseurs adipocytaires obtenus à partir de réductions mammaires) lorsqu’ils sont cocultivés avec des cellules tumorales mammaires durant 3 jours, en comparaison avec les
adipocytes non co-cultivés (NC) (fig. 1A, résultats d’une expérience représentative avec la
lignée ZR-75-1). Le contenu en triglycérides (TG), qui est la forme de stockage des acides
gras (AG), a été déterminé dans les adipocytes murins après 3 ou 5 jours de co-culture avec
les cellules tumorales ZR-75-1. Comme le montre la figure 1B, le contenu en TG est
significativement diminué dès 3 jours de co-culture (environ 2 fois de diminution par rapport
au contrôle), cet effet étant majoré après 5 jours de co-culture (diminution d’environ 4 fois du
contenu en TG) (fig. 1B). Des résultats comparables ont été obtenus avec d’autres lignées
tumorales mammaires et prostatiques (résultats non montrés)
Les cellules tumorales co-cultivées présentent une augmentation de leur contenu en TG.
Des résultats préliminaires que nous avons obtenus suggèrent que les adipocytes co-cultivés
présentent une augmentation de la lipolyse basale (résultats non montrés). Nous nous sommes
ensuite posé la question de savoir si les acides gras libres (AGL) sécrétés par les adipocytes
co-cultivés pouvaient être capturés et stockés par les cellules tumorales elles-mêmes. En effet,
il a été décrit que comme les adipocytes, d’autres types cellulaires sont capables de stocker
(avec des capacités de stockage toutefois limitées) des acides gras sous forme de TG, par
exemple les cardiomyocytes ou les cellules pancréatiques (193). Il pourrait en être ainsi pour
des cellules tumorales lorsqu’elles se retrouvent dans un environnement riche en acides gras.
De plus, il a été également montré que l’accumulation des acides gras sous forme de TG était
un facteur de protection des cellules, vis-à-vis de la toxicité éventuelle de cet environnement
riche en acides gras (193). Pour vérifier l’hypothèse que les cellules tumorales sont capables
de stocker des acides gras sous forme de TG, nous avons procédé au dosage des TG dans les
89
ZR-75-1, au bout de 3 ou 5 jours de co-culture avec les adipocytes. Comme le montre la
figure 2A, les ZR-75-1 co-cultivées (C) avec des adipocytes présentent une augmentation de
leur contenu en TG en comparaison avec les ZR-75-1 cultivées seules, ce contenu en TG
augmentant de façon significative dans le temps (entre 3 et 5 jours de co-culture). La
coloration à l’huile rouge (révélée au microscope au contraste de phase) et au Nile Red
(révélée au microscope à fluorescence) montre nettement l’accumulation des lipides neutres
sous la forme de gouttelettes dans des cellules ZR 75.1 co-cultivées avec des adipocytes par
rapport aux cellules non co-cultivées (fig. 2B). Ces résultats suggèrent donc que ces cellules
sont capables de capter les AGLs, et de fait comme le montre la fig. 2C, elles sont capables
d’exprimer la protéine CD36 qui est un des transporteurs principaux des AGLs. Afin de savoir
si cette observation était restreinte au modèle cellulaire des ZR-75-1, les mêmes expériences
ont été réalisées dans d’autres lignées cellulaires. Ainsi nous avons montré dans la lignée
SUM-159PT qu’il existe une augmentation importante au cours du temps du contenu en TG
comme montré par le dosage (plus de 7 fois d’augmentation par rapport aux contrôles non cocultivés) (fig. 3A, panneau de gauche) et par les marquages aux Nile Red et à l’huile rouge
(figure 3A, panneau de droite). Nous avons utilisés deux autres lignées, la lignée S1 et la
lignée T4-2, qui sont des lignées de cancer du sein provenant toutes les deux d’un même clone
parental mais qui pourtant présentent des caractéristiques très différentes d’un point de vue de
leur potentiel tumorigène (8). Concernant la lignée S1, cette dernière est peu tumorigène et
comme l’indique la figure 3B, elle ne présente pas de d’augmentation d’accumulation des TG,
au bout de 3 ou 5 jours de co-culture. Au niveau du marquage des gouttelettes lipidiques, là
non plus, il n’y a pas de différence entre les deux conditions. Concernant les T4-2, ces
dernières sont tumorigènes et métastatiques et dans ce modèle de tumeur agressive,
l’accumulation de TG lors de la co-culture est significativement augmentée, en comparaison
avec les cellules non co-cultivées (environ 2 fois d’augmentation après 5 jours de co-culture).
De même, le marquage à l’huile rouge au bout de 5 jours montre une accumulation de
goutellettes lipidiques pour les T4-2 co-cultivées (figure 3C).
Transfert d’AG entre les adipocytes et les cellules tumorales au cours de la co-culture. Il
est décrit dans la littérature que les cellules tumorales sont capables de synthétiser ellesmêmes des acides gras, grâce à une enzyme que l’on nomme fatty-acid synthase (FAS). Cette
enzyme est capable de produire de novo, des acides gras à longue chaine à partir d’acétyl
CoA, de malonyl CoA et de nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) (pour
revue (174). Son expression est augmentée dans la plupart des carcinomes humains (prostate
90
et sein) et cette surexpression est corrélée à un plus mauvais pronostic. De plus, il a été décrit
pour les adipocytes, que lorsque les acides gras étaient inclus dans le régime alimentaire, il y
avait une inhibition de la synthèse de novo d’acides gras, et que les acides gras stockés dans
les gouttelettes lipidiques des adipocytes provenait d’un « switch » d’origine endogène à une
origine exogène (12). Afin de savoir si dans notre système de co-culture, les acides gras qui
sont stockés sous forme de TG, proviennent d’une synthèse de novo des cellules tumorales,
ou s’ils sont le reflet de la capture et du stockage des AGLs sécrétés lors de la lipolyse des
adipocytes co-cultivés, des expériences de transfert d’AGLs radiomarqués ont été réalisés. La
lignée pré-adipocytaire F442A a été différenciée en adipocytes, en présence de palmitate
radiomarqué. Dès l’induction de la différenciation, le milieu de culture de ces adipocytes en
cours de différenciation est changé tous les deux jours avec l’ajout d’acides gras radio
marqués pour que ces derniers puissent être captés et s’accumuler dans les gouttelettes
lipidiques. Durant cette différenciation, nous avons vérifié que l’excès d’acide gras n’avait
pas d’incidence particulière sur la différenciation (résultats non montrés). Une fois le stade de
différenciation en adipocytes (10 jours de différenciation) atteint, la co-culture en présence
des cellules tumorales est initiée dans un milieu qui ne contient alors plus d’acide gras radiomarqués (voir fig. 4A). Au bout de 3 à 5 jours de co-culture, tant les adipocytes que les
cellules tumorales (ZR-75-1) sont récupérés et la radioactivité dans ces cellules est mesurée.
Comme le montre la figure 4B, les adipocytes co-cultivés présentent une diminution
significative du contenu radioactif qui est plus marquée au bout de 5 jours de co-culture
suggérant qu’une lipolyse est induite lorsque les adipocytes sont cultivées en présence des
cellules tumorales. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus précédemment. Concernant
les ZR-75-1, le contenu en radioactivité est significativement augmenté dès les 3 jours de coculture avec les adipocytes, augmentation qui est plus importante au bout de 5 jours de coculture. Le fait que l’on retrouve de la radioactivité dans nos cellules tumorales montre qu’il
y a bien un transfert de substrat lipidique entre nos deux populations cellulaires.
L’utilisation des acides gras confère des capacités invasives accrues aux cellules
tumorales. Comme il est décrit dans la littérature, l’accumulation et le stockage sous forme
de TG des acides gras, par les cellules autres que les adipocytes, est un mécanisme de défense
contre la toxicité que peut induite l’excès d’acides gras. En effet, il a été reconnu que
l’accumulation d’un excès de lipide pour des cellules non adipeuses, conduisait à des
disfonctionnements cellulaire, voire à la mort cellulaire, les lipides étant à l’origine de la
génération d’espèces réactives de l’oxygène, de la synthèse de novo de céramide….. (193).
91
Dans notre modèle d’étude, l’accumulation de lipides par les cellules tumorales pourrait
favoriser l’invasion tumorale. En effet, nous avons montré précédemment que la co-culture
stimule l’invasion tumorale (Article 1). Les cellules tumorales qui ont accumulé des lipides,
présentent une morphologie plus modifiée, que cela soit pour les ZR-75-1 (figure 2B) ou pour
les SUM159PT (figure 3A). En ce qui concerne les ZR-75-1, celles qui ont été co-cultivées
avec les adipocytes et qui ont accumulées des lipides présentent davantage de pseudopodes
que les ZR-75-1 non co-cultivées. Les cellules ont tendances à se séparer les unes des autres,
au lieu de former un amas cellulaire comme le montre le marquage à l’huile rouge et au Nile
Red (figure 2B). Concernant les SUM159PT, qui ont déjà réalisé leur transition épithéliomésenchymateuse, elles ont, à l’état basal, un aspect fibroblastique. Lors de l’accumulation de
goutellettes lipidiques, leur morphologie change également puisqu’elles s’étalent davantage
(figure 3A). Pour confirmer l’idée que ces changements de morphologie en lien avec
l’accumulation des lipides, s’accompagnent également d’une modification des capacités
invasives, nous avons procédé à une séparation des cellules tumorales en fonction de leur
contenu en lipides, après qu’elles aient été co-cultivées ou non avec des adipocytes pendant 5
jours, selon le protocole présenté en fig. 5A. Au bout de 5 jours de co-culture, les cellules
tumorales ayant accumulé le plus de lipides sont isolées par flottaison, le dosage en TG
permettant de valider la qualité de cette séparation (voir fig. 5B, panneau de gauche).
Concernant leurs capacités à envahir une matrice de matrigel, la figure 5B (panneau de droite)
montre que ces ZR-75-1 « flottantes » et riches en lipides envahissent davantage que les
cellules co-cultivées avec un contenu lipidique moindre (P< 0.01), ce qui suggère un lien
entre invasion et accumulation d’acides gras
Implication de la β -oxydation pour l’utilisation des acides gras au cours des processus
d’invasion. Le métabolisme énergétique d’une cellule repose en partie sur les glucides mais
également sur les lipides qui à masse équivalente, contiennent deux fois plus de calories. Les
lipides constituent donc une réserve importante d’énergie au niveau des organismes car ils
sont plus facilement stockés que les glucides, grâce à leurs propriétés hydrophobes. La βoxydation est l’ensemble des réactions qui permettent d’oxyder les acides gras en unités
acétyl-CoA, dans le but de libérer des coenzymes réduits afin de synthétiser de l’ATP, qui est
la forme énergétique de la cellule. Nous avons émis l’hypothèse que les AG transférés dans
les cellules tumorales pouvaient être utilisés pour réaliser cette β-oxydation. Dans un premier
temps, nous avons voulu savoir si, à l’état basal, les cellules tumorales étaient capables de
réaliser les étapes de β-oxydation. Comme le montre la figure 6A (panneau de gauche),
92
différentes lignées ont été testées pour leur capacité à oxyder les lipides. Pour cela, les cellules
ont été traitées au préalable avec du palmitate radio marqué pendant deux heures, et le
dégagement de CO2 a été ensuite détecté. La lignée C2C12, lignée de cellule musculaire, a été
utilisée comme contrôle positif pour la β-oxydation (fig. 6A). Comme on peut le voir sur cette
figure, certaines des cellules tumorales sont tout à fait capables d’oxyder les acides gras, en
particulier les SUM159PT et les ZR 75.1 et ce à un niveau élevé. Par contre, ni les HMEC, ni
les S1, ni les T4-2 ne possèdent cette activité, suggérant que la capacité à oxyder les acides
gras est indépendant des caractéristiques d’agressivité des cellules, ce qui demande toutefois à
être confirmée dans d’autres modèles. Des résultats préliminaires, obtenus sur deux
expériences indépendantes nous montrent (figure 6A, panneau de droite) que les ZR-75-1, cocultivées pendant 3 jours avec des adipocytes, augmentent significativement leurs capacités à
oxyder les acides gras (P<0.05). La co-culture des cellules tumorales avec les adipocytes
permet donc de stimuler les capacités d’oxydation des acides gras. Comme la β-oxydation, à
terme, permet de générer de l’ATP, et donc donne de l’énergie aux cellules tumorales, nous
avons voulu savoir si cette voie pouvait être impliquée dans l’invasion des cellules tumorales.
Pour cela, nous avons utilisé l’étomoxir, qui permet d’inhiber l’activité d’une enzyme capitale
dans la β-oxydation, la CPT1 (carnitine palmitoyl transferase), qui est en charge du transport
des acides gras à longue chaine dans la mitochondrie. L’utilisation de cet inhibiteur permet de
bloquer la β-oxydation. Nous avons donc traité les ZR-75-1 durant les 3 jours de co-culture
avec cet inhibiteur à la concentration finale de 1µmol/L. Les cellules tumorales, ont été
récupérées par la suite pour des essais d’invasion. Comme le montre la figure 6B, il y a un
stockage plus important des lipides dans la ZR-75-1 qui ont été co-cultivées avec les
adipocytes durant 5 jours et qui ont été traitées durant le temps de la co-culture avec
l’étomoxir, puisque de plus grosses gouttelettes sont visibles après traitement. Le traitement à
l’étomoxir sur des cellules co-cultivées ou non, n’induit pas de mort cellulaire (résultats non
montrés). Comme le montre la figure 6C, l’invasion des ZR-75-1 co-cultivées pendant 3
jours, traitées par l’étomoxir, est significativement diminuée, alors que ce même traitement
n’a aucune incidence sur les cellules non cocultivées, ce qui suggère que les cellules
tumorales co-cultivées deviennent dépendantes de la β-oxydation des acides gras, pour leur
fourniture énergétique nécessaire au processus invasif.
93
A
3T3F442A
N
C
Adipocytes
humains
C
N
C
C
B
*
*
**
*
3
jours
5
jours
Figure 1. Délipidation des adipocytes co-cultivés avec les cellules tumorales. (A)
Coloration d’adipocytes murins (3T3-F442A) ou humains, non co-cultivés (NC) ou co-cultivés
(C) durant 3 jours en présence de cellules tumorales, les ZR-75-1. (B) Le contenu en TG a
été mesuré dans des adipocytes murins (3T3-F442A) non co-cultivés (NC) ou co-cultivés (C)
durant 3 ou 5 jours avec des cellules tumorales (ZR-75-1). Moyenne obtenue sur six
expériences indépendantes. Test de significativité selon le test de Student. ** P<0.01, **
P<0.001
94
*
*
A
**
*
**
*
3
jours
5
jours
B
N
C
C
C
CD3
6
ZR-75- SUM159P Contrôl
e
1
T
positif
Figure 2. Les cellules tumorales co-cultivées présentent une augmentation de leur
contenu en TG. (A) Le contenu en TG a été mesuré dans les cellules tumorales ZR-75-1
non co-cultivées (NC) ou co-cultivées (C) avec des adipocytes pendant 3 ou 5 jours. (B)
Coloration des gouttelettes lipidiques à l’huile rouge (images du haut) ou au Nile Red
(images du bas) dans des ZR-75-1 co-cultivées (C) ou non (NC) pendant 5 jours avec des
adipocytes (grossissement x40 et x100 respectivement). (C) Western blot de la protéine
CD36 dans différentes lignées tumorales. Moyenne obtenue sur six expériences
indépendantes. Test de significativité selon le test de Student. ** P<0.01, ** P<0.001
95
*
A
*
*
3 jours
5
jours
3
jours
5
jours
N
C
C
NC
C
N
C
C
B
C
*
*
**
*
3 jours
5
jours
Figure 3. Accumulation de gouttelettes lipidiques en présence des adipocytes pour
diverses lignées tumorales. (A) Le contenu en TG a été dosé pour les SUM159PT non cocultivées (NC) ou co-cultivées (C) pendant 3 ou 5 jours avec des adipocytes (panneau de
droite). Coloration des gouttelettes lipidiques (panneau de droite) au Nile Red (x100) et à
l’huile rouge (x40) pour ces cellules tumorales après 5 jours de co-culture. (B) Expérience
similaire avec les S1. (C) Expérience similaire avec les T4-2. Moyenne obtenue sur six
expériences indépendantes. Test de significativité selon le test de Student. ** P<0.01, **
P<0.001
96
A
Preadipocyte
s
Cellules
tumorales
[C14]
palmitate
B
adipocyte
s
*
*
*
C
3 jour
jjjouyj
joujo
urs
sjujo
urs
jours
jours
joursj
ours
*
*
5
jour
jjjour
s
jours
**
*
*
*
3
5
jour
jour
jours
jourjo
urs
Figure 4. Transfert des acides gras entre les adipocytes
et les cellules tumorales au
cours de la co-culture. (A) Procédure expérimentale. (B) La radioactivité (dpm) a été
mesurée dans les adipocytes non co-cultivés (NC) et co-cultivés © avec les ZR-75-1 après 3
ou 5 jours de co-culture. (C) La radioactivité a été mesurée dans les ZR-75-1 qu’elles aient
été co-cultivées (C) ou non (NC) avec les adipocytes pendant 3 ou 5 jours. Moyenne obtenue
sur 4 expériences indépendantes. Test de significativité selon le test de Student.* P<0.05, **
P<0.01, ** P<0.001
97
A
Centrifugation
5 min à 1000
rpm
1H30 à
37°C
Centrifugation
5 min à 1000
rpm
Cellules tumorales cocultivées
ayant un contenu
en lipide important
cellules tumorales cocultivées
ayant un faible contenu
en lipide
Cellules tumorales cocultivées
avec les adipocytes
5 jours
1H30 à
37°C
cellules
tumorales
non co-cultivées
Cellules
tumorales
non co-cultivées
5 jours
B
**
* **
*
**
*
*
*
*
*
C (5
C (5
jours)
jours)
Figure 5. L’accumulation de lipides dans les cellules tumorales accentue les capacités
invasives. (A) Procédure expérimentale. (B) (panneau de gauche) Le contenu en TG a été
mesurée dans les ZR-75-1 non co-cultivées (NC), dans les ZR-75-1 co-cultivées (C) 5 jours
avec les adipocytes. Parmi les ZR-75-1co-cultivées (C), le contenu en TG a été dosé dans
celles qui flottaient et celles qui ne flottaient pas. (panneau de droite) Invasion des ZR-75-1
non co-cultivées (NC) ou co-cultivées (C) suivant leur contenu lipidique, envers un milieu
contenant 0% de sérum (colonne blanche) ou 10% de sérum (colonne noire). Moyenne
obtenue sur 4 expériences indépendantes. Test de significativité selon le test de Student. **
P<0.01, ** P<0.001
98
A
*
B
ZR-75-1
N
C
C
C+etomoxi
r
C
*
Figure 6. Implication de la β-oxydation dans l’utilisation des acides gras au cours des
processus d’invasion. (A) Libération de CO2 radioactif après oxydation du palmitate
radiomarqué dans différentes lignées cellulaires (panneau de gauche). Libération du CO2
radioactif après oxydation du palmitate radiomarqué suivant que les ZR-75-1 ait été cocultivées (C) ou non (NC) pendant 3 jours avec des adipocytes (panneau de droite). (B)
Coloration des gouttelettes lipidiques au Nile Red de ZR-75-1 non co-cultivées (NC) ou cocultivées (C), traitées au non avec de l’étomoxir (1µmol/L) après 5 jours de co-culture. (C)
Invasion des ZR-75-1 non co-cultivées (NC) ou co-cultivées (C) 3 jours avec des adipocytes,
traitées ou non avec de l’étomoxir (1µmol/L), contre un milieu contenant soit 0% ou 10% de
sérum. Moyenne obtenue sur 4 expériences indépendantes. Test de significativité selon le
test de Student. * P<0.05.
99
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
100
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
Au cours de ce travail, nous avons pu mettre en évidence le rôle des adipocytes dans la
progression tumorale. A l’aide d’un modèle de co-culture en 2D, nous avons montré que les
cellules tumorales co-cultivées avec des adipocytes matures, augmentaient leurs capacités
d’invasion in vitro et in vivo. En retour, les adiocytes co-cultivés avec les cellules tumorales
présentent des signes de délipidation et une perte des marqueurs adipocytaires, associés à un
phénotype activé, caractérisé par la surexpression de protéases comme la MMP-11 et de
cytokines pro-inflammatoires comme l’IL-6 et l’IL-1β. L’IL-6 jouant un rôle dans l’effet pro
invasif des adipocytes. Ces résultats ont été confirmés sur des échantillons de patients qui
montraient que plus l’expression de l’IL-6 est importante dans les adipocytes associés au
cancer, plus les patientes présentaient des tumeurs de taille importante et/ou une atteinte
ganglionnaire. Le transfert de lipides mis en évidence au cours du dialogue entre les cellules
tumorales et les adipocytes contribue également à augmenter les capacités invasives des
cellules tumorales, ces dernières étant pourvues de la machinerie enzymatique nécessaire à
l’oxydation des acides gras.
Rôle des adipocytes associés au cancer dans la réaction desmoplastique. Au cours de la
co-culture, nous avons démontré que les adipocytes, en réponse à leur dialogue avec les
cellules tumorales, présentaient des modifications de leur phénotype. Les adipocytes cocultivés ont un phénotype activé, puisqu’ils sont capables de sécréter de nombreux facteurs
tels que l’IL-6, l’IL-1β ainsi que des métalloprotéases et apparentées comme la MMP-11 et
PAI-1, respectivement. De plus, ces modifications de sécrétions s’accompagnent d’une
diminution des marqueurs d’adipocytes matures, comme par exemple, la lipase hormosensible (LHS), l’adiponectine et des facteurs de transcription jouant un rôle majeur dans
l’adipogenèse comme CEBPα. Ces pertes de marqueurs adipocytaires s’accompagnent d’une
modification de la morphologie de l’adipocyte qui au cours de la co-culture prend des aspects
de fibroblastes puisqu’il devient une cellule allongée et non plus ronde, et qui de surcroit, a
perdu une grande quantité de son contenu lipidique. Au cours du développement d’un cancer
du sein, une couche dense de fibroblastes indifférenciés se forme autour de la tumeur, et ceci
est à l’origine de ce que l’on nomme, la réaction desmoplastique. Cette couche dense est un
support matriciel et nourricier pour la tumeur. Il a été décrit que les fibroblastes indifférenciés
entourant la tumeur sont responsables de la sécrétion de grandes quantités d’estrogènes, grâce
à la surexpression de l’aromatase (381). L’expression élevée de l’aromatase dans ces cellules
101
constitue une « source » d’estrogènes pour les cellules tumorales et permet aussi la
prolifération des fibroblastes. L’origine des cellules qui composent cette couche dense
fibreuse est largement débattue et il est généralement décrit qu’une marge part d’entre eux
expriment l’α-SMA (α-smooth musle actin), marqueur des myofibroblastes. Plusieurs
hypothèses concernant l’origine de ces fibroblastes activés (encore appelés Fibroblastes
associés aux cancers ou « Cancer-associated Fibroblasts ) ont été émises. Outre l’activation
de fibroblastes résidents, ils pourraient provenir du recrutement de cellules mésenchymateuses
circulantes ou de cellules déjà présentes comme des cellules épithéliales cancéreuses ayant
subi la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), des cellules endothéliales ou des
cellules myoépithéliales (78). La modification de morphologie des adipocytes en réponse à
leur dialogue avec les cellules tumorales nous a permis d’émettre l’hypothèse que les
adipocytes pourraient participer à la réaction desmoplastique. D’après des résultats
préliminaires obtenus dans l’équipe, la prolongation de la co-culture jusqu’à 8 jours permet la
transformation des adipocytes matures en cellules à l’allure fibroblastique. De plus, ces
adipocyτεσ co-cultivés sont capables d’exprimer en plus grandes quantités, des protéines de
la matrice extra cellulaire, comme par exemple le collagène I et la fibronectine, qui
contribuent à l’aspect fibreux de ce que l’on peut retrouver autour de la tumeur (Ludivine
Bochet, résultats non publiés). Les travaux d’Andarawewa et al (7) suggèrent que les
adipocytes au front invasif joueraient un rôle dans la réaction desmoplastique car une sous
population de fibroblastes n’expriment pas l’α-SMA mais sur expriment la MMP-11 est
retrouvée dans les tumeurs. Dans notre système de coculture en 2D nous sommes donc en
train d’évaluer si les fibroblastes issus de la réorientation des adipocytes expriment ou non
l’α-SMA. De façon intéressante, le groupe de K. Clément a montré que les préadipocytes
traités avec du milieu conditionné de macrophages activés (qui sécrètent des molécules proinflammatoires), produisaient de grandes quantités de protéines de la matrice extra cellulaire
(telles que le collagène I, la fibronectine et la teascine) sans que cette activation ne conduise à
l’expression de l’α SMA dans les pré-adipocytes activés (154). Il est intéressant de noter que
les cellules cancéreuses sont capables d’inhiber la différenciation des pré-adipocytes en
adipocytes (223), résultat que nous avons retrouvé au laboratoire (Ludivine Bochet, résultats
non publiés). Ainsi, les fibroblastes dérivés des adipocytes pourraient provenir à la fois de la
réorientation des adipocytes et de l’inhibition de la différenciation des pré-adipocytes.
Comme c’est le cas pour la réorientation des adipocytes, les molécules impliquées dans
l’inhibition de la différentiation adipocytaire reste à identifier. Des molécules comme le TNFα
102
(79, 49), l’IL-6, les Wnt 3b et 10a (250) sont dans ce contexte des candidates intéressantes que
nous sommes en train de tester.
De plus, des travaux préliminaires obtenus dans l’équipe suggèrent que les adipocytes
réorientés ont des capacités de migration et d’invasion augmentées, en comparaison à des
adipocytes (Ludivine Bochet, résultats non montrés). Cette augmentation des capacités de
migration et d’invasion pourrait laisser supposer que ces adipocytes co-cultivés pourraient
participer à l’établissement d’une niche pré-métastatique. Les travaux de Kaplan et al (148)
suggèrent que les progéniteurs hématopoïétiques dérivés de la moelle osseuse, qui expriment
VEGFR1, sont capables de former des clusters de cellules dans les sites de métastase, et ceci
avant l’arrivée des cellules tumorales. Les adipocytes co-cultivés, capables de migrer et
d’envahir davantage que des adipocytes pourraient exprimer des marqueurs, comme par
exemple le CXCR4, migrer vers les organes qui sécrètent l’unique ligand de ce récepteur, à
savoir, CXCL-12 ou SDF-1, s’établir dans les sites métastatiques et produire les composants
de la matrice extracellulaire et sécréter des molécules qui attireraient les cellules tumorales
dans les sites métastatiques. Cette hypothèse pourrait être vérifiée avec l’utilisation
d’adipocytes GFP qui seraient injectés chez les souris en combinaison avec des cellules
tumorales, différemment marquées. Le suivi de l’arrivée de cellules GFP dans les sites
métastasiques, précédant l’arrivée de cellules tumorales, pourrait être également une
perspective mettant en lien le rôle des adipocytes dans la progression tumorale.
Le transfert de lipides entre les adipocytes et les cellules tumorales joue un rôle dans le
métabolisme tumoral. Comme nous l’avons montré précédemment, les adipocytes au contact
de la tumeur présentent des signes de délipidation, ce qui est le résultat d’une
dédifférenciation adipocytaire associée à une lipolyse induite par les cellules tumorales qui
permettent une augmentation de la libération d’acide gras libres. De plus, l’hypothèse que
nous avons émise concernant le devenir des ces acides gras libres et notamment leur capture
et stockage par les cellules tumorales, est confirmée par les résultats que nous avons obtenus
lors d’expériences de transfert d’acides gras libres radiomarqués. La capacité des cellules
tumorales à stocker des acides gras puis à les utiliser suggère que les cellules tumorales
pourraient avoir une activité lipolytique favorisant leur métabolisme.
Depuis 1920, il est admis que les cellules tumorales présentent un métabolisme altéré,
d’après les observations d’Otto Warburg qui montraient que les cellules tumorales étaient
capables d’induire la glycolyse anaérobie, avec comme produit final, la production de lactate.
D’après ces observations, le concept de « transformation métabolique » est requis pour la
103
progression tumorale. Depuis ces observations, des études sur le métabolisme tumoral ont
montré que les cellules tumorales étaient capables de synthétiser des acides gras à partir du
glucose (pour revue (80)). Il a par ailleurs été montré que les cellules tumorales exprimaient
fortement des enzymes nécessaires à la lipogenèse comme l’ATP-citrate lyase (ACL), l’acétyl
CoA carboxylase (ACC) ainsi que la fatty acid synthase (FAS) (80), l’expression de cette
dernière étant un indicateur de mauvais pronostic dans le cancer de la prostate et du sein.
L’expression de cette enzyme confère un avantage de survie et de croissance à ces cancers
humains et de hauts niveaux d’expression de FAS entraînent une augmentation d’un facteur 4
du risque de décès pour le cancer du sein (pour revue (174)). Concernant le cancer de la
prostate, de hauts niveaux d’expression de FAS sont associés à une augmentation de quatre
fois du risque de récurrence et à un niveau élevé du score de Gleason au diagnostic (pour
revue (174)). L’inhibition de l’expression de FAS conduit à l’induction de la mort des cellules
du cancer du sein (268). La cellule tumorale peut utiliser ces acides gras, soit issus de la
synthèse de novo soit issus de l’accumulation d’acide gras exogènes, pour diverses activités
biologiques. Il est par exemple reconnu que ce métabolisme lipidique pourrait être à l’origine
de la génération de lipides pour le renouvellement des membranes cellulaires pour les cellules
tumorales qui prolifèrent beaucoup (80). Toutefois, les travaux récents de Nomura et al (248)
montrent qu’outre la lipogénèse, la lipolyse pourrait être une des activités clé de la
progression tumorale. En effet, ces auteurs montrent que les cellules tumorales expriment
fortement une enzyme lipolytique, la MAGL (mono acylglycerol lipase) qui comme son nom
l’indique, dégrade les monoacylglycerol, ce qui conduit à augmenter le niveau d’acide gras
libres intracellulaires. L’expression de cette protéine est corrélée à l’agressivité des cellules
tumorales car celles qui l’expriment le plus sont celles qui migrent, envahissent, survivent et
croissent le mieux in vitro et in vivo. De plus, la surexpression de cette enzyme dans des
cellules cancéreuses non agressives reproduit les effets précédemment énoncés. Les défauts
d’activité de cette enzyme sont contrecarrés lorsque les animaux sont mis sous régime riche
en graisse, ce qui suggère que les sources exogènes d’acides gras contribuent à la malignité
des cellules tumorales. Comme nous l’avons montré, les cellules tumorales co-cultivées sont
capables d’accumuler des acides gras sous forme de TG et si nécessaire, de les dégrader les
TG. Bien que la façon dont les cellules tumorales stockent et libèrent les acides gras contenus
dans les gouttelettes lipidiques reste encore inconnu, les récents travaux de Nomura et al
(248) montrent que les cellules tumorales expriment fortement au moins une enzyme
lipolytique, la MAGL. Dans notre modèle, nous formulons l’hypothèse que d’autres enzymes
connues pour leur implication dans la dégradation des DG et des TG, et c’est notamment le
104
cas pour la lipase hormo-sensible (LHS) et pour l’ATGL (adipose triglyceride lipase), sont
aussi exprimés par les cellules tumorales. Des résultats préliminaires au sein du laboratoire
nous indiquent que les cellules tumorales de la lignée ZR-75-1 et SUM159PT expriment la
LHS. L’activité et la régulation de l’expression de ces protéines en fonction du profil
d’agressivité des cellules tumorales ainsi qu’au cours de la co-culture esten cours d’étude au
laboratoire.
Une fois les acides gras libérés, quel est le mécanisme impliqué pour expliquer leur
rôle dans la progression tumorale? Dans le travail de Nomura, les acides gras générés par la
MAGL sont convertis en lysophospholipdes comme le lysophosphatidyl choline (LPC) et le
lysophosphatidyl ethanolamine (LPE) qui pourraient également intervenir comme des seconds
messagers générant des signaux de transduction et de motilité (182). Ils sont également à
l’origine de la biosynthèse de molécules induisant des signaux pro tumorigènes comme par
exemple le PI(3,4,5)P3 (phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate) qui permet d’activer le
complexe Proteine kinase B/Akt, qui favorise la prolifération et la survie (377), mais
également, à l’origine du LPA (acide lysophosphatidique) qui stimule l’agressivité des
cellules cancéreuses (278). Les prostaglandines sont également d’autres dérivés lipidiques,
qui formés par les cyclooxygénases contribuent à l’interaction tumeur-hôte ainsi qu’à la
migration tumorale (110). Pour finir, les acides gras pourraient également être dirigés vers la
voie de β-oxydation mitochondriale pour générer de l’ATP.
Bien que les besoins énergétiques des cancers soient majoritairement satisfaits par la
glycolyse, l’oxydation des acides gras libres offre une alternative intéressante en situation de
déprivation en glucose. En effet, il a été démontré par les travaux de Buzzai et al (35) que les
cellules tumorales qui présentaient une activation d’Akt (ce qui les rend dépendantes du
glucose pour leur survie) survivaient grâce à l’activation de l’oxydation des acides gras,
lorsque le glucose était retiré du milieu de culture. De plus, l’inhibition pharmacologique de
l’oxydation des acides gras par l’étomoxir (qui inhibe l’entrée des acides gras dans la
mitochondrie en bloquant l’activité de la carnityl palmitoyl trasnferase 1 (CPT1) entraîne une
inhibition de la prolifération et sensibilise les cellules leucémiques à l’apotose (301). Il est
communément admis que les tumeurs présentent une « préférence » dans l’utilisation des
lipides issus de la voie endogène (268, 80). Dans notre étude, nous avons montré que les
acides gras provenaient de la lipolyse des adipocytes et que les cellules tumorales étaient
capables de stocker les acides gras sous forme de TG dans des gouttelettes lipidiques. Si l’on
fait le parallèle avec les adipocytes, il est décrit que lorsque le régime alimentaire est
pourvoyeur d’acides gras, l’adipocyte réduit sa synthèse de novo en acide gras, et on assiste
105
donc à un switch dans la formation des dépôts adipeux qui passe d’une origine endogène, à
une origine exogène (12). Les cellules tumorales co-cultivées avec les adipocytes se
retrouvent dans un environnement riche en acides gras libres, suite à la lipolyse des
adipocytes, ce qui pourrait favoriser la capture des acides gras libre dans le milieu au lieu de
la synthèse de novo de ces derniers. De plus, il faut rappeler que la synthèse d’acides gras par
la FAS, est un processus qui demande beaucoup d’énergie à la cellule. En effet, pour produire
un acide gras (par exemple l’acide palmitique), il y a une consommation de 7 ATP et de 14
NADPH. Ainsi la synthèse d’acides gras contribue à utiliser l’ATP et à diminuer la
biodisponibilité des espèces réduites comme le NADPH pour la synthèse des macromolécules
de la cellule tumorale (382). Dans un contexte de restriction énergétique comme cela peut être
le cas lors de la progression tumorale (en hypoxie notamment), l’utilisation des acides gras
stockés dans les gouttelettes lipidiques, lors de la β-oxydation apparait comme une voie
intéressante pour fournir de l’énergie aux cellules. Comme nos résultats l’indiquent, cette
fourniture énergétique lors de l’utilisation des acides gras pourrait servir à des processus
métastatiques. En effet, les cellules tumorales co-cultivées avec les adipocytes ont des
capacités d’invasion qui sont augmentées en comparaison avec les cellules tumorales non cocultivées. Au niveau basal, les cellules tumorales sont capables de réaliser le processus de βoxydation et il semblerait que la co-culture induise cette capacité à oxyder les acides gras dans
la lignée ZR-75-1. L’inhibition de la CPT1, enzyme limitante de la β-oxydation,
par l’étomoxir, conduit à une diminution significative des capacités invasives des ZR-75-1 cocultivées, ce qui montre que la β-oxydation est impliquée dans les processus invasif. Ceci est
en accord avec les résultats obtenus par Le et al (182). Ces auteurs ont montré que les
animaux xénogreffées avec des cellules tumorales de poumons les M109, présentaient
davantage de métastases lorsque les cellules tumorales étaient riches en lipides. De plus,
d’autres travaux tels que ceux de Khasawneh et al (163), font le lien entre la β-oxydation et la
progression tumorale puisque des souris transgéniques qui présentent une activation de
l’oncogène K-ras, mises sous régime alimentaire riche en graisse, font davantage de βoxydation des acides gras que les souris contrôles.
Pour la suite des travaux, il serait donc intéressant d’étudier le transfert et le stockage
des acides gras dans le modèle de co-culture en 2D avec différentes lignées cellulaires
épithéliales, soit normales, soit tumorales. Cela nous permettra d’évaluer si la capacité à
induire la lipolyse et la capacité à stocker les acides gras sont spécifiques des cellules
tumorales, et si elles sont augmentées dans les cellules les plus agressives. De la même façon,
la nature et la régulation des activités lipolytiques des TG et des DG reste à déterminer. De
106
plus, l’évaluation des capacités de β-oxydation dans des cellules épithéliales normales ou
tumorales, dans des conditions de déprivation en glucose pour valider l’hypothèse que la voie
de la β-oxydation est la voie privilégiée des cellules lors de conditions de restriction de
substrats. Nous envisagerons également d’évaluer l’effet de l’inhibition de la β-oxydation
(grâce à l’étomoxir, un inhibiteur de la CPT1) sur le potentiel invasif de diverses lignées
tumorales. Si les résultats sont positifs, l’approche in vivo pourra être utilisée avec des souris
traitées ou non avec cet inhibiteur et la croissance de la tumeur et le développement
métastatique seront comparées.
Le dialogue entre les adipocytes associés au cancer et les cellules tumorales est-il
amplifié au cours de l’obésité ? Comme nous l’avons indiqué précédemment, nous avons
montré qu’il existe un dialogue bidirectionnel entre les tumeurs et les adipocytes qui leur sont
associés. Ce dialogue bidirectionnel conduit à une augmentation de l’invasion tumorale qui
pourrait être amplifié chez les patients obèses et expliquer la survenue de maladies plus
agressives dans cette catégorie de patients. En effet, il a été montré que l’hypertrophie du tissu
adipeux était associée à des dysfonctions de l’adipopcyte, et notamment à un stress
mitochondrial et un stress du réticulum endoplasmique, qui conduisent à la production
anarchique d’adipokines, à un relargage des acides gras libres et de médiateurs pro
inflammatoires (77). De façon intéressante, il a été montré que l’expression et la sécrétion de
nombreuses adipokines étaient liées à la taille des adipocytes. Il a notamment été décrit que la
leptine, l’IL6, l’IL-8, le TNF-α, MCP-1, étaient d’autant plus sécrétés que l’adipocyte était de
taille importante (325). Il a été également décrit que le taux de lipolyse basale différait entre
des adipocytes de petite et grande taille, les adipocytes de grande taille présentant une lipolyse
accrue du fait d’une augmentation de l’expression de l’ATGL et la LHS (372). Dans notre
modèle d’étude qui est le cancer du sein, l’obésité s’accompagne d’une augmentation de la
taille des gouttelettes lipidiques, ce qui contribue à augmenter la taille de l’adipocyte du
stroma mammaire (183). Ainsi nos travaux qui mettent en relief l’implication de l’Il-6 ainsi
que les acides gras dans le processus métastatique, suggèrent fortement que le dialogue
adipocyte/cellule tumorale sera un facteur aggravant de la progression tumorale dans un
contexte d’obésité Pour confirmer cette hypothèse, l’injection de cellules tumorales comme
les 4T1, que nous avons utilisées dans nos travaux, pourra être effectuée dans des souris
obèses ou soumises à un régime riche en graisses. La progression tumorale et notamment le
développement des métastases au niveau des poumons devra être suivie afin de vérifier si les
107
souris obèses ou soumises à un régime riche en graisse présentent davantage de métastases et
de réaction desmoplastique que les souris contrôles.
À ces effets, s’ajoute également dans l’obésité l’apparition de zones hypoxiques au cours du
développement du tissu adipeux. En effet, cette hypertrophie qui conduit à la formation
d’adipocytes de plus grande taille, amène ces derniers à devenir peu à peu distant des
vaisseaux sanguins qui les entourent. Cette hypoxie, quant à elle conduit à l’initiation de la
réponse inflammatoire qui va permettre de stimuler l’angiogenèse (349). On retrouve donc,
dans le tissu hypoxique une augmentation des adipokines comme l’IL-6, le TNF-α, MCP-1,…
(290). De récents résultats obtenus dans le laboratoire montrent que le milieu conditionné
d’adipocytes hypoxiques possède un pouvoir chemoattractant plus important que le milieu
conditionné des adipocytes normoxiques pour des cellules de cancer de prostate. Le lien entre
hypoxie, tissu adipeux et progression tumorale semble donc aussi un axe de recherche
intéressant pour étudier le lien entre adipocytes, obésité et cancer.
Bien que l’adipocyte ait été ignoré des études sur le microenvironnement tumoral durant de
nombreuses années, il convient de souligner l’importance de ce dernier dans la progression
tumorale. Comme nous l’avons présenté tout au long de ce travail, le dialogue croisé entre les
adipocytes et les cellules tumorales mammaires, confère des modifications importantes pour
chacun des partenaires de ce dialogue. Les adipocytes au contact de la tumeur sécrètent divers
facteurs favorisant les capacités de survie, de prolifération et le potentiel métastatique des
cellules tumorales. Le fait, d’une part, que l’obésité soit en constante augmentation dans les
sociétés occidentales, et d’autre part, que les études épidémiologiques soulignent l’association
entre obésité et cancer, il est d’un intérêt tant fondamental que clinique d’étudier la relation
qui existe entre les adipocytes et les cellules tumorales. Cette relation pouvant être renforcée
au cours de l’obésité, ce qui permettrait d’expliquer le mauvais pronostic des cancers, chez les
personnes obèses.
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Summary
The tumor progression was recently recognized as the product of a dynamic
interaction between tumor cells and their microenvironment. Among the cells type which
compose the microenvironment, adipocytes are the ones whose role was the least well
characterized, in spite of the fact that adipocytes represent the main component of
microenvironment in certain tumor models, as for example breast cancer, or the invasive
prostate cancer. The role of fat cells in tumor progression has a great interest because it was
demonstrated in epidemiological studies that the obesity is a factor of poor prognosis in
numerous cancers. Indeed as shown the results of a vast study led by the Curie institute,
patients affected by breast cancer, and who are obese, exhibit more aggressive tumors defined
by a more advanced stage and/or lymph node involvment. Besides its function of energy
storage, adipocyte is an endocrine cell, able to secrete a variety of molecules including,
chemokines, growth factors, pro-inflammatory molecules, which can regulate the behavior of
cancer cells.
We have shown that the co-culture in 2D for 3 to 5 days, of tumoral cells with
adipocytes (coming from in vitro differentiation of the murine cell line 3T3-F442A, or
coming from the differentiation of precursors of mammary reductions), induce an increase of
the invasive and migratory capacities of tumor cells, this effect being more marked for weakly
invasive cell lines. Mice injected with 4T1 co-cultivated with adipocytes, exhibit more lung
metastases than mice injected with 4T1 not co-cultivated. Adipocytes, in turn, when they are
co-cultivated with the tumor cells, exhibit an activated phenotype. The secretion of proinflammatory markers as IL-6; IL-1 ß is increased, as well as an increase of metalloproteases
as the MMP-11. IL-6, according to our results is involved in the modification of the
phenotype of tumor cells, conferring them, an increase of the invasive capacities.
Furthermore, these adipocytes acquire a fibroblastic phenotype that is characterized by a
delipidation and a loss of markers of mature adipocytes, suggesting a reorientation of these
cancer-associated adipocytes, which could contribute, by means of their secretions to the
desmoplastic reaction observed in breast cancers. Furthermore, we also observed that free
fatty acids released during the lipolysis of adipocytes, can be uptake and stored in lipid
droplets by tumor cells. Our results have shown that, more co-cultivated tumor cells are able
to store fatty acids, more their invasive capacities were increased. Furthermore, the inhibition
of ß-oxidation pathway, enzymatic way involved in the fatty acids use, thanks to etomoxir (an
inhibitor of CPT-1, enzyme involved in ß- oxidation pathway) decreases the invasive
capacities of co-cultivated tumor cells.
All these elements suggest that adipocytes really have a role to play in the tumor
progression since they allow the acquisition of an invasive phenotype thanks to cytokine
secretions and fatty acids release. This vicious circle could be amplified in a context of
obesity, and it could contribute to explain the poor prognosis observed in obese patients,
affected by breast cancer.
135
Résumé
La progression tumorale a été récemment reconnue comme étant le produit d’une
interaction dynamique entre les cellules tumorales et leur microenvironnement. Parmi les
cellules qui constituent le microenvironnement, les adipocytes sont celles dont le rôle a été le
moins bien caractérisé, malgré le fait que les adipocytes représentent le composant cellulaire
majoritaire du microenvironnement de certaines tumeurs, comme par exemple le cancer du
sein, ou le cancer invasif de la prostate. L’identification du rôle des adipocytes dans la
progression tumorale a toute son importance car il a été démontré dans des études
épidémiologiques que l’obésité est un facteur de mauvais pronostic dans de nombreux
cancers. En effet comme le montre les résultats d’une vaste étude menée à l’institut Curie, les
patientes atteintes de cancer du sein, et qui de surcroit sont obèses, présentent des tumeurs
plus agressives définies par un stade plus avancée et avec une propension plus élevée à donner
des métastases. Outre sa fonction de réservoir d’énergie, l’adipocyte est une cellule endocrine
active, capable de sécréter une grande variété de facteurs incluant, des chimiokines, des
facteurs de croissance, des molécules pro-inflammatoires, qui peuvent réguler le
comportement des cellules cancéreuses.
Nous avons montré, que la co-culture en 2D, pendant 3 à 5 jours, de cellules tumorales
avec des adipocytes, soit issus de la différenciation in vitro de la lignée murine 3T3-F442A,
soit issus de la différenciation de précurseurs adipocytaires provenant de réductions
mammaires, entrainait une augmentation des capacités invasives et migratoires des cellules
tumorales, cet effet étant plus marqué pour des lignées faiblement invasives. Des expériences
chez l’animal ont donné des résultats comparables. Les souris qui ont été injectées avec des
4T1 co-cultivées avec des adipocytes, présentent davantage de métastases pulmonaires que les
souris qui ont été injectées avec des 4T1 non co-cultivées. Les adipocytes, quant à eux,
lorsqu’ils sont co-cultivés avec les cellules tumorales, présentent un phénotype activé. La
sécrétion de marqueurs pro-inflammatoires comme l’IL-6 ; l’IL-1β est retrouvée chez ces
adipocytes, ainsi qu’une augmentation de métalloprotéases comme la MMP-11. L’IL-6, selon
nos résultats étant impliqué dans la modification du phénotype des cellules tumorales, leur
conférant une augmentation des capacités invasives. De plus, ces adipocytes acquièrent un
phénotype fibroblastique qui se caractérise par une délipidation et une perte des marqueurs
d’adipocytes matures, suggérant une réorientation des ces adipocytes associés au cancer, qui
pourraient participer, par le biais de leurs sécrétions à la réaction desmoplastique observée
dans les cancers du sein. De plus, nous avons également observé que les acides gras libérés au
cours de la lipolyse des adipocytes, induite par les cellules tumorales, pouvaient être récupérés
et stockés sous forme de triglycérides par les cellules tumorales elles-mêmes. Nos résultats
ont montré que, plus les cellules tumorales co-cultivées étaient capables d’accumuler des
acides gras sous forme de triglycérides, plus leurs capacités d’invasion, étaient augmentées.
De plus, l’inhibition de la β-oxydation, voie enzymatique impliquée dans l’utilisation des
acides gras, grâce à l’utilisation de l’étomoxir (inhibiteur de CPT-1, enzyme de la βoxydation) diminue les capacités invasives des cellules tumorales co-cultivées.
Tous ces éléments suggèrent donc que les adipocytes ont véritablement un rôle à jouer
dans la progression tumorale car ils permettent l’acquisition d’un phénotype invasif grâce à
leur sécrétion de cytokines et d’acides gras. Ce cercle vicieux pourrait être amplifié dans un
contexte d’obésité, et cela pourrait contribuer à expliquer le mauvais pronostic des patientes
obèses, atteintes d’un cancer du sein.
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