Étude du rôle de la protéine U94 de l`herpèsvirus

FRÉDÉRIC TREMPE
Étude du rôle de la protéine U94 de l'herpèsvirus humain
de type 6 dans le processus de l’intégration
chromosomique.
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en microbiologie-immunologie
pour l’obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.)
DÉPARTEMENT DE MICROBIOLOGIE-IMMUNOLOGIE
FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2013
© Frédéric Trempe, 2013

ii
Résumé
L’herpèsvirus humain de type 6 (HHV-6) infecte les enfants en bas âge et sa prévalence est
estimée à près de 95% dans la population mondiale. Ce virus se distingue des autres
membres de la famille des herperviridae par sa capacité à s’intégrer aux chromosomes
cellulaires. On estime qu’environ 1% de la population mondiale serait porteuse d’une copie
du génome du HHV-6 par cellule (52, 73, 100, 119, 131). Le mécanisme de cette
intégration est toujours inconnu.
Nous pensons que la protéine U94 du HHV-6 joue un rôle important dans l'intégration
chromosomique du génome viral. Elle serait nécessaire à l'éxécution d'une recombinaison
homologue entre les séquences télomériques cellulaires et virales (motif TTAGGG). U94 a
une homologie de séquence de 24% avec la protéine Rep68 responsable de l'intégration du
génome de l’adeno-associated virus 2 (AAV-2) au chromosome 19 (123). Pour ce faire,
quatre activités intrinsèques à la protéine Rep68 lui sont nécessaires : la liaison à l'ADN
simple et double brin, l'ATPase, l'hélicase et l'endonucléase (54, 97).
Le but de ce projet de recherche était de caractériser les activitités biochimiques de la
protéine U94. Tout d’abord, nous avons démontré que la protéine U94A est localisée au
noyau en accord avec les résultats obtenus par le laboratoire du Dr. Mori (87). Pour réaliser
nos études, nous avons exprimé et purifié U94 chez E. coli en fusion avec la protéine
maltose-binding protein (MPB). Nos résultats démontrent que les protéines MBP-U94A et
MBP-U94B sont capables de lier préférentiellement l'ADN simple brin avec un motif
CCCTAA (complément du motif télomérique TTAGGG). L’essai de liaison sur le
Proteon™ XPR36 démontre également que la protéine MBP-U94B lie un ADN double brin
ayant le motif télomérique cellulaire. Nos résultats nous ont amenés à vérifier si l'ARN de
la télomérase, qui contient un motif CCCTAA, pouvait aussi être lié par les protéines MBP-
U94A et MBP-U94B. Les résultats obtenus indiquent que MBP-U94 ne lie pas l'ARN, ni la
séquence équivalente en ADN ce qui suggère que la liaison de U94 requiert plus d’une
répétition du motif CCCTAA. En se basant sur des études de mutagenèse réalisées sur la
protéine Rep68 (128, 129), nous avons générés des mutants U94A et U94B. Les résultats

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démontrent que la mutation K395A affecte négativement la capacité de liaison à l’ADN de
U94.
Les essais d'ATPase indiquent que MBP-U94A et MBP-U94B hydrolysent l'ATP en ADP
et AMP en présence d'un ADN simple brin ou d’un ADN double brin. Divers mutants des
activités d’ATPase/Hélicase et d’endonucléase présumées furent générés et devront être
caractérisés.
Ces résultats suggèrent que U94 possède les activités biochimiques nécessaires à
l'intégration du génome viral aux chromosomes cellulaires.

iv
Abstract
Human herpesvirus 6 infects young children with an estimated prevalence of 95% in the
world population. It differs from the other members of the herperviridae family by its
capacity to integrate cell's chromosomes. It is estimated that approximately 1% of the world
population carries a copy of the HHV-6 genome per cell (52, 73, 100, 119, 131). The
chromosomal integration mechanisms used by HHV-6 are currently unknown.
Our hypothesis is that the HHV-6 U94 protein plays an important role in chromosomal
integration that we suspect occur through homologous recombination between cellular and
viral telomeric sequences (TTAGGG). The U94 gene product shares 24% sequence
homology with Rep68, a responsible for the genomic integration of adeno-associated virus
2 (AAV-2) (123). To promote integration, Rep68 relies on four intrinsic activities: binding
to single and double stranded DNA, ATPase activity, helicase and endonuclease (54, 97).
The goal of this research project is to characterize the biochemical properties of U94 and
determine whether it posseses activities similar to Rep68. First, we confirmed the results of
Dr. Mori's laboratory by showing that U94 is localized in the nucleus (87). Next, to conduct
our studies, we’ve expressed and purified maltose-binding-U94 recombinant proteins
(MBP-U94) in E. coli. Our results suggest that MBP-U94A and MBP-U94B preferentially
bind single-strandred DNA containing the CCCTAA motif (complement to the TTAGGG
telomeric motif). Surface plasmon resonance (SPR) experiments also indicate that MBP-
U94B binds double-stranded DNA containing telomeric motifs. Since the telomerease RNA
component TERC contains the CCCTAA motif, we investigated whether MBP-U94 could
bind a single-stranded RNA molecule containing the CCCTAA motif. SPR analysis clearly
indicates that MBP-U94 does not bind such RNA nor a single-stranded DNA molecule
having a single CCCTAA motif, suggesting that more than one motif is required for proper
binding. Based on published work on Rep68 (128, 129), we generated specific U94
mutants. Our results indicate that the K395A mutation greatly diminishes U94 binding to
DNA pointing out the importance of this residue.

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ATPase assays were also performed and indicate that both MBP-U94A and MBP-U94B
possess the ability to hydrolyze ATP into ADP and AMP when incubated in the presence of
DNA. Several other mutants targeting the helicase and endonuclease activities were
generated and will be tested in the near future.
Altogether these results suggest that U94 has biological properties that are consistent with a
role for this protein in the process of chromosomal integration of the HHV-6 genome into
the host chromosomes.