Étude du rôle de la protéine U94 de l`herpèsvirus

FRÉDÉRIC TREMPE
Étude du rôle de la protéine U94 de l'herpèsvirus humain
de type 6 dans le processus de l’intégration
chromosomique.
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en microbiologie-immunologie
pour l’obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.)
DÉPARTEMENT DE MICROBIOLOGIE-IMMUNOLOGIE
FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2013
© Frédéric Trempe, 2013
ii
Résumé
L’herpèsvirus humain de type 6 (HHV-6) infecte les enfants en bas âge et sa prévalence est
estimée à près de 95% dans la population mondiale. Ce virus se distingue des autres
membres de la famille des herperviridae par sa capacité à s’intégrer aux chromosomes
cellulaires. On estime qu’environ 1% de la population mondiale serait porteuse d’une copie
du génome du HHV-6 par cellule (52, 73, 100, 119, 131). Le mécanisme de cette
intégration est toujours inconnu.
Nous pensons que la protéine U94 du HHV-6 joue un rôle important dans l'intégration
chromosomique du génome viral. Elle serait nécessaire à l'éxécution d'une recombinaison
homologue entre les séquences télomériques cellulaires et virales (motif TTAGGG). U94 a
une homologie de séquence de 24% avec la protéine Rep68 responsable de l'intégration du
génome de l’adeno-associated virus 2 (AAV-2) au chromosome 19 (123). Pour ce faire,
quatre activités intrinsèques à la protéine Rep68 lui sont nécessaires : la liaison à l'ADN
simple et double brin, l'ATPase, l'hélicase et l'endonucléase (54, 97).
Le but de ce projet de recherche était de caractériser les activitités biochimiques de la
protéine U94. Tout d’abord, nous avons démontré que la protéine U94A est localisée au
noyau en accord avec les résultats obtenus par le laboratoire du Dr. Mori (87). Pour réaliser
nos études, nous avons exprimé et purifié U94 chez E. coli en fusion avec la protéine
maltose-binding protein (MPB). Nos résultats démontrent que les protéines MBP-U94A et
MBP-U94B sont capables de lier préférentiellement l'ADN simple brin avec un motif
CCCTAA (complément du motif télomérique TTAGGG). L’essai de liaison sur le
Proteon™ XPR36 démontre également que la protéine MBP-U94B lie un ADN double brin
ayant le motif télomérique cellulaire. Nos résultats nous ont amenés à vérifier si l'ARN de
la télomérase, qui contient un motif CCCTAA, pouvait aussi être lié par les protéines MBPU94A et MBP-U94B. Les résultats obtenus indiquent que MBP-U94 ne lie pas l'ARN, ni la
séquence équivalente en ADN ce qui suggère que la liaison de U94 requiert plus d’une
répétition du motif CCCTAA. En se basant sur des études de mutagenèse réalisées sur la
protéine Rep68 (128, 129), nous avons générés des mutants U94A et U94B. Les résultats
iii
démontrent que la mutation K395A affecte négativement la capacité de liaison à l’ADN de
U94.
Les essais d'ATPase indiquent que MBP-U94A et MBP-U94B hydrolysent l'ATP en ADP
et AMP en présence d'un ADN simple brin ou d’un ADN double brin. Divers mutants des
activités d’ATPase/Hélicase et d’endonucléase présumées furent générés et devront être
caractérisés.
Ces résultats suggèrent que U94 possède les activités biochimiques nécessaires à
l'intégration du génome viral aux chromosomes cellulaires.
iv
Abstract
Human herpesvirus 6 infects young children with an estimated prevalence of 95% in the
world population. It differs from the other members of the herperviridae family by its
capacity to integrate cell's chromosomes. It is estimated that approximately 1% of the world
population carries a copy of the HHV-6 genome per cell (52, 73, 100, 119, 131). The
chromosomal integration mechanisms used by HHV-6 are currently unknown.
Our hypothesis is that the HHV-6 U94 protein plays an important role in chromosomal
integration that we suspect occur through homologous recombination between cellular and
viral telomeric sequences (TTAGGG). The U94 gene product shares 24% sequence
homology with Rep68, a responsible for the genomic integration of adeno-associated virus
2 (AAV-2) (123). To promote integration, Rep68 relies on four intrinsic activities: binding
to single and double stranded DNA, ATPase activity, helicase and endonuclease (54, 97).
The goal of this research project is to characterize the biochemical properties of U94 and
determine whether it posseses activities similar to Rep68. First, we confirmed the results of
Dr. Mori's laboratory by showing that U94 is localized in the nucleus (87). Next, to conduct
our studies, we’ve expressed and purified maltose-binding-U94 recombinant proteins
(MBP-U94) in E. coli. Our results suggest that MBP-U94A and MBP-U94B preferentially
bind single-strandred DNA containing the CCCTAA motif (complement to the TTAGGG
telomeric motif). Surface plasmon resonance (SPR) experiments also indicate that MBPU94B binds double-stranded DNA containing telomeric motifs. Since the telomerease RNA
component TERC contains the CCCTAA motif, we investigated whether MBP-U94 could
bind a single-stranded RNA molecule containing the CCCTAA motif. SPR analysis clearly
indicates that MBP-U94 does not bind such RNA nor a single-stranded DNA molecule
having a single CCCTAA motif, suggesting that more than one motif is required for proper
binding. Based on published work on Rep68 (128, 129), we generated specific U94
mutants. Our results indicate that the K395A mutation greatly diminishes U94 binding to
DNA pointing out the importance of this residue.
v
ATPase assays were also performed and indicate that both MBP-U94A and MBP-U94B
possess the ability to hydrolyze ATP into ADP and AMP when incubated in the presence of
DNA. Several other mutants targeting the helicase and endonuclease activities were
generated and will be tested in the near future.
Altogether these results suggest that U94 has biological properties that are consistent with a
role for this protein in the process of chromosomal integration of the HHV-6 genome into
the host chromosomes.
vi
Avant-Propos
Je tiens à remercier toutes les personnes qui m'ont aidé à l'accomplissement de ce
projet. Je remercie d'abord le Dr. Louis Flamand de m'avoir accueilli dans son laboratoire et
offert un projet aussi intéressant. Il a su partager ses connaissances avec moi et m'enseigner
l'art de travailler en laboratoire. À cet effet, les Drs Annie Gravel et Guillaume Morissette
ont aussi été d'une aide plus que précieuse tout au long de mes deux ans de maîtrise. Un
grand merci à ces trois, sans qui ce projet ne serait pas ce qu'il est maintenant. Je veux aussi
remercier Mathieu Iampietro, Isabelle Dubuc et à nouveau Guillaume Morissette pour ces
bons moments passés au bureau, ces échanges sur la politique et les bons coups sur les
marchés boursiers, sans quoi les journées auraient été beaucoup plus longues. Un grand
merci à Tania Lévesque qui fut d'une aide précieuse pour les expériences au HPLC. Enfin,
je veux remercier ma copine, Amélie Veillette pour son support constant tout au long de
ces deux belles années de maîtrise.
À mon grand-père Rafael Niceto Sanchez
vii
Table des matières
RÉSUMÉ.....................................................................................................
ii
ABSTRACT................................................................................................. iv
AVANT-PROPOS....................................................................................... vi
TABLE DES MATIÈRES........................................................................... vii
LISTE DES TABLEAUX...........................................................................
x
LISTE DES FIGURES................................................................................
xi
LISTE DES ABBRÉVIATIONS................................................................ xiii
INTRODUCTION.......................................................................................
1
I. LA FAMILLE DES HERPESVIRIDAE.......................................
1
1.1
1.2
Contexte........................................................................
Les trois sous-familles..................................................
1
1
II. GENRE DES ROSEOLOVIRUS..................................................
3
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
Historique......................................................................
Deux espèces du HHV-6...............................................
Épidémiologie...............................................................
Pathologies associées....................................................
Structure du virus..........................................................
2.5.1 Le génome.................................................
2.5.2 Nucléocapside, tégument et enveloppe.....
Cycles viraux.................................................................
2.6.1 Cycle lytique..............................................
2.6.2 Cycle latent................................................
3
3
4
4
6
6
9
10
11
12
viii
III. INTÉGRATION CHROMOSOMIQUE.....................................
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
13
Découverte....................................................................
Intégration de novo et transmission héréditaire............
Virus latent ou mort? ...................................................
Répercussions cliniques................................................
Mécanisme de l'intégration...........................................
3.5.1 La recombinaison homologue...................
3.5.2 Les télomères............................................
3.5.3 Virus de Marek (MDV).............................
3.5.4 Hypothèses pour HHV-6...........................
13
14
15
16
17
17
17
18
18
IV. LA PROTÉINE REP68 DU AAV-2...........................................
19
4.1
4.2
4.3
Contexte........................................................................ 19
Rôle de la protéine Rep du AAV-2............................... 19
Domaine d'interaction avec l'origine et hélicase SF3.... 21
V. PROTÉINE U94 DU HHV-6.......................................................
5.1
5.2
5.3
22
Unique à HHV-6...........................................................
U94 et Rep68/78...........................................................
Latence et transactivation.............................................
22
23
26
VI. HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS DE RECHERCHE..................
26
6.1
6.2
6.3
Hypothèse.....................................................................
Objectif principal..........................................................
Objectifs spécifiques.....................................................
26
27
27
ix
MATÉRIEL ET MÉTHODES.................................................................
29
RÉSULTATS............................................................................................
41
DISCUSSION...........................................................................................
71
CONCLUSION ET PERSPECTIVES......................................................
79
BIBLIOGRAPHIE....................................................................................
82
x
Liste des tableaux
Tableau 1.
Les herpèsvirus humains et leurs caractéristiques.....................
2
xi
Liste des figures
Figure 1.
Schéma simplifié du génome viral du HHV-6.............................
7
Figure 2.
Génome de l’herpèsvirus humain de type 6 (HHV-6).................
8
Figure 3.
Cycle réplicatif du HHV-6...........................................................
11
Figure 4.
Domaines de la protéine Rep78...................................................
21
Figure 5.
Transcrits de l’ORF U94 du HHV-6............................................
22
Figure 6.
Alignement des séquences en acides aminés de Rep68 et U94...
25
Figure 7.
Localisation cellulaire de la protéine de fusion Flag-U94A........
42
Figure 8.
Immunobuvardage et bleu de coomassie des protéines purifiées
44
Figure 9.
Immunobuvardage et bleu de coomassie des protéines mutées...
46
Figure 10.
Retard sur gel en présence d'ADN simple brin riche en G
et riche en C.................................................................................
48
Figure 11.
Retard sur gel de la protéine U94 sur ADN simple brin..............
50
Figure 12.
Retard sur gel de la protéine U94 sur ADN double brin.............
52
Figure 13.
Schéma de la puce du Proteon™ XPR36.....................................
53
Figure 14.
Expérience de mise au point de la liaison de la protéine MBP à
l'ADN simple et double brin au Proteon™ XPR36.....................
55
Expérience de mise au point de la liaison de la protéine MBPU94B à l'ADN simple et double brin au Proteon™ XPR36.......
56
Témoins négatif et positif du test de liaison à l'ADN simple et
double brin au Proteon™ XPR36...............................................
57
Test de liaison de la protéine MBP-U94A à l'ADN simple et
double brin au Proteon™ XPR36...............................................
59
Figure 15.
Figure 16.
Figure 17.
Figure 18.
Test de liaison de la protéine U94B à l'ADN simple et double
brin au Proteon™ XPR36............................................................ 60
xii
Figure 19.
Test de liaison de la protéine MBP-U94A mutée à l'ADN
simple et double brin au Proteon™ XPR36................................
62
Figure 20.
Test de liaison de la protéine MBP-U94B mutée à l'ADN simple
et double brin au Proteon™ XPR36............................................. 63
Figure 21.
Essais d'ATPase (HPLC) avec oligonucléotide simple brin.......... 65
Figure 22.
Essai d'ATPase (HPLC) avec ADN double brin..........................
Figure 23.
Immunoprécipitation de la protéine de fusion Flag-U94A........... 69
67
xiii
Liste des abréviations
A260/280 (Absorbance à 260 nm/280 nm)
AAV-2 (virus associé aux adénovirus de type 2)
ADP (adénosine diphosphate)
ALT (Alternative lengthening of telomeres)
AMP (adénosine monophosphate)
ATP (adénosine triphosphate)
BCA (essai à l’acide bicinchoninique)
CBMC (cellules mononucléées du sang de cordon)
ChIP (Chromatin Immunoprecipitation)
ciHHV-6 (Intégration chromosomique de l'herpèsvirus humain de type 6)
CMV (Cytomégalovirus)
cpm (comptes par minute)
DR (directement répété)
EBV (virus Epstein-Barr)
E. coli (Escherichia coli)
EDTA (Acide éthylène diamine tétraacétique)
EMSA (Electrophoretic mobility shift assay)
HBLV (Human B-lymphotropic lymphocyte virus)
HHV (Herpèsvirus humain)
HSCT (Hematopoietic stem cell transplantation)
HPLC (High-performance liquid chromatography)
HSV1 (Herpès simplex de type 1)
HSV2 (Herpès simplex de type 2)
hTBP (Human TATA-binding protein)
IE (région précoce-immédiate)
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)
kpb (kilo paires de bases)
KSHV (virus associé au sarcome de Kaposi)
MBP (protéine qui lie le maltose)
MDV (Marek disease virus)
NTP (nucléoside triphosphate)
OBP (Origin binding protein)
ORF (cadre de lecture ouvert)
PBMC (cellules mononucléées du sang périphérique)
PBS (Phosphate Buffered Saline)
PBST (Phosphate buffered Saline Tween)
POT1 (Protection of telomeres 1)
qPCR (quantitative polymerase chain reaction)
xiv
RAP1 (Ras-related protein 1)
RBE (site de liaison de Rep)
RH (recombinaison homologue)
Rmax (réponse maximale)
RU (response unit)
SF3 (super famille III)
SIDA (syndrome de l’immunodéficience acquise)
SNC (système nerveux central)
SOT (Solid organ transplant)
SP (Sclérose en plaques)
SSC (solution de citrate de sodium salin)
TAE (Tris-acetate-EDTA buffer)
TBE (Tris-borate-EDTA buffer)
TBST (Tris-buffered saline tween buffer)
TERC (Telomerase RNA component)
TIN2 (TRF1 interacting nuclear factor 2)
Tm (Melting temperature)
TP (Température de la pièce)
TPP1 (Tripeptidyl peptidase 1)
TRS (Séquences télomériques répétées)
TRF1 (Telomeric repeat-binding factor 1)
TRF2 (Telomeric repeat-binding factor 2)
trs (Site de résolution terminale)
UL (section interne unique longue)
US (section courte unique)
VIH (Virus de l’immunodéficience humaine)
VZV (Virus de la varicelle et du zona)
1
Introduction
1. La famille des Herpesviridae
1.1 Contexte
Les herpèsvirus infectent une grande variété d’organismes vivants. Chez l’humain, on
compte neuf virus de la famille des Herpesviridae caractérisés par leurs structures et leur
mode d’infection à deux vitesses. Le génome de ces virus est constitué d'un ADN linéaire
double brin, empaqueté dans une capside de forme icosaédrique, recouverte d’un tégument
et d’une enveloppe composée de glycoprotéines (138). Ces virus sont parmi les parasites
intracellulaires les mieux adaptés à leur hôte. En état de latence, leurs génomes adoptent
une forme épisomale où ils expriment un minimum de gènes nécessaires à leur maintien ce
qui diminue la reconnaissance de la cellule infectée par le système immunitaire. Lorsque les
défenses de l’hôte s’affaiblissent, le virus se réactive et engendre une infection lytique de
type cytocide. Le virus peut ainsi se multiplier et se transmettre tout en conservant une
certaine pérennité de l’hôte.
1.2 Les trois sous-familles
Basé sur des critères biologiques et plus récemment sur l’analyse de la glycoprotéine
conservée gH, on distingue 3 sous-familles d’herpèsvirus humain (HHV). Le tableau 1.1 en
fait le résumé et présente les caractéristiques propres à chaque virus (68). La sous-famille
des alphaherpesvirinae regroupe l’herpès simplex 1 et 2 (HSV-1 et -2) et le virus de la
varicelle et du zona (VZV). Ce sont des virus neurotropiques à cycle réplicatif court. Les
sites de latence de ces virus sont les ganglions neurosensitifs (1). Les événements de
réactivation sont fréquents pour ces virus. Pour HSV-1 et 2 les épisodes de réactivation
provoquent des symptômes cutanés sur les muqueuses près des ganglions touchés. Quant au
VZV, la réactivation qu’on appelle le zona se traduit par une dermatose localisée près des
nerfs liés aux ganglions infectés. La deuxième sous-famille, les gammaherpesvirinae, est
constituée du virus Epstein-Barr (EBV) et de l’herpèsvirus de type 8. Ces virus sont
lymphotropiques et ciblent les lymphocytes B et les cellules épithéliales. Ce sont les seuls
herpèsvirus humains oncogènes, donc capables d’induire une transformation cellulaire.
2
Finalement, on trouve chez les betaherpesvirinae le cytomégalovirus (CMV), les
herpèsvirus humains 6A et 6B ainsi que le HHV-7. En bref, ce sont des virus
lymphotropiques à cycle réplicatif long. Leurs sites de latence sont : les glandes sécrétoires,
le système lymphoréticulaire et les cellules épithéliales (1). Le CMV est associé tout
comme l’EBV à la mononucléose infectieuse, mais aussi à des infections congénitales
graves, surtout retrouvées dans les pays industrialisés. Le HHV-6B et le HHV-7 sont les
agents étiologiques de la roséole, une maladie qui touche les jeunes enfants. Quant au
HHV-6A, on ne connaît pas encore les conséquences de son infection, mais cette espèce a
un tropisme marqué pour les cellules neuronales (88).
Tableau 1 : Les herpèsvirus humains et leurs caractéristiques
Nom
Nom usuel
Sous-famille
Pathologies
associées
HHV-1
Herpès simplex 1
Alphaherpesvirinae
Herpès buccal
HHV-2
Herpès simplex 2
Alphaherpesvirinae
Herpès génital
HHV-3
Virus de la varicelle et du zona
Alphaherpesvirinae
Varicelle
Zona
HHV-5
Cytomégalovirus
Betaherpesvirinae
Mononucléose et
infections
congénitales
HHV-6A
Espèce A de l'herpèsvirus humain
Betaherpesvirinae
Aucune associée
Betaherpesvirinae
Roséole
de type 6
HHV-6B
Espèce B de l'herpèsvirus humain
de type 6
HHV-7
Herpèsvirus humain de type 7
Betaherpesvirinae
Roséole
HHV-4
Virus Epstein-Barr
Gammaherpesvirinae
Mononucléose
HHV-8
Herpèsvirus associé au sarcome de
Gammaherpesvirinae
Sarcome de
Kaposi
Kaposi
3
2. Genre des roseolovirus
2.1 Historique
Avant la découverte du HHV-6, le dernier herpèsvirus à avoir fait l’objet d’une découverte
remontait aux années soixante, il s’agit du EBV. Près de 20 ans plus tard, grâce au
développement des méthodes de culture cellulaire et l’engouement de la recherche pour le
virus de l'immunodéficience humaine (VIH), une nouvelle espèce d’herpèsvirus humain fut
identifiée. Le virus fut isolé à partir de cellules mononucléées du sang périphérique
(PBMC) de patients atteints du VIH et de syndromes lymphoprolifératifs (110). Il fut
d’abord nommé Human B Lymphotropic Virus (HBLV) à cause de son tropisme pour les
lymphocytes B (59). Puis, les expériences subséquentes menées sur différents types
cellulaires ont démontré que le virus infecte un large spectre de cellules et
préférentiellement les lymphocytes T. Depuis, le HBLV a été renommé HHV-6, selon la
nomenclature moderne.
2.2 Deux espèces du HHV-6
La souche GS provenant des États-Unis fut le premier isolat du HHV-6 à être découvert.
Rapidement, d'autres souches, d’origines africaines, furent isolées de patients atteints du
VIH. Les souches Z29 et U1102 proviennent respectivement de la république démocratique
du Congo, anciennement appelée le Zaïre (77) et de l’Ouganda (36). En culture cellulaire,
ces deux souches infectent les PBMC et les cellules mononucléées du sang de cordon
(CBMC), mais n’infectent pas les mêmes lignées cellulaires (14, 36, 134). On découvre
dans les années 1990 que les souches Z29 et U1102 représentent des virus proches, mais
différents. En effet, une première équipe a démontré que la souche Z29 n’infecte pas les
lignées cellulaires HSB2 et JJHAN pourtant infectées par le virus U1102 (3, 11, 74, 114,
134). De plus, des expériences menées avec des anticorps monoclonaux et des enzymes de
restriction ont révélé que les deux souches étaient de types différents (134,10). Par la suite,
d'autres expériences vinrent appuyer l'existance de deux sous-types de HHV-6, les types A
et B (10). De fait, les souches U1102 et GS sont de type A, tandis que la souche Z29 est du
type B. En général, ces deux variants partagent une homologie de séquence nucléotidique
4
de 90%. Certaines régions du génome, plus variables, semblent être responsables des
divergences entre les deux variants. Ces divergences sont d’ordre : biologiques,
immunologiques, épidémiologiques et moléculaires. Elles seront davantage décrites dans
les prochaines sections. Dernièrement, la nomenclature a changée, il n’est plus question de
variants, mais bien de deux espèces à part entière puisque les différences entre les deux
virus son assez significatives (4).
2.3 Épidémiologie
HHV-6 est ubiquitaire et sa prévalence est de plus de 95%. On estime qu’avant l’âge de 6
ans, plus de 90% des jeunes enfants auront déjà des anticorps dirigés contre ce virus,
indiquant qu’ils ont contracté le HHV-6 (50, 94, 113).La propagation du virus est associée
au fait que les glandes salivaires sont un site de latence important pour le HHV-6B (38). Le
relâchement du virus dans la salive, lors d’évènements de réactivation lui permettrait de se
transmettre efficacement des parents à l’enfant (34). De façon beaucoup moins importante,
la transmission pourrait se faire par infection congénitale chez 1% des naissances et elle
serait asymptomatique (42). On connaît moins bien l’épidémiologie et la pathogénèse du
HHV-6A. On sait toutefois que cette espèce serait davantage associée à l’infection du
système nerveux central (SNC) (44). Par ailleurs, un mode de transmission vertical, c’est-àdire de la mère à l’enfant, unique au HHV-6, serait en cause dans la majorité des
transmissions congénitales. La section sur le HHV-6 intégré (ciHHV-6) en fera la
description de façon détaillée.
2.4 Pathologies associées
Le HHV-6 est un pathogène opportuniste. L’infection primaire à HHV-6B touche
habituellement les enfants avant l’âge de 2 ans. Le pic de l’infection est observé entre le
6ième et 9ième mois de vie, suite à la chute des anticorps maternels acquis à la naissance (45).
La majorité des enfants qui sont touchés par le virus développent une maladie fébrile aigüe
de courte durée. Le tier d’entre-eux développeront l’exanthème subit, mieux connue sous le
nom de roséole ou sixième maladie. Cette maladie est caractérisée par une forte fièvre de 3
à 5 jours, suivi par une éruption cutanée localisée au niveau du tronc et du visage. Dans
5
moins de 10% des cas, la maladie peut entrainer des convulsions fébriles qui se résorbent
rapidement (9). C’est en 1988 que la roséole a été associée pour la première fois au HHV-6
(135). Rappelons que la très grande majorité des cas de roséole sont dus à une infection par
le HHV-6B bien que quelques cas semblent attribuables à une infection par le HHV-7.
Dans un second temps, il est rare d’observer une infection primaire à HHV-6 chez l’adulte
puisque dans plus de 90% des cas, l’infection a lieu en bas âge (50, 94, 113). De plus,
comme tout les herpèsvirus le HHV-6 entre en latence après la primo-infection et persiste
au sain de l’hôte tout au long de sa vie. Advenant une infection durant l’enfance, l’adulte
pourrait être sujet à un évènement de réactivation du virus. Dans la majorité des cas, celuici se réactive généralement en période d’immunosuppression de l’hôte. Plus rarement, le
virus peut se réactiver chez un hôte relativement immunocompétent, tel que chez les
femmes enceintes où les défenses immunitaires sont moins efficaces (25). Les individus
immunodéprimés les plus souvent touchés par la réactivation du virus sont ceux atteints par
le VIH, ceux sous traitements de chimiothérapie pour combattre un cancer ou ceux ayant
subit une transplantation d’organe. Principalement chez les transplantés de moelle osseuse,
la réactivation du HHV-6 est fréquente et peut être très problématique. En effet, près de
50% des individus qui subissent une transplantation de möelle osseuse et de 20 à 30% des
transplantations d’organes solides seront touchés par l’infection ou la réactivation du HHV6, et ce, dans les 2 à 4 semaines après l’opération (137). L’infection d’un receveur à partir
des tissus d’un donneur infecté est également possible. Autrement dit, un receveur de greffe
séropositif pour HHV-6 peut être superinfecté par une souche distincte provenant du
donneur (71). Les symptômes pouvant être associés sont : fièvre, éruptions cutanées,
pneumonies, encéphalites et même le rejet de la greffe (28). Dans un autre ordre d’idée, on
a associé plus rarement le HHV-6 à des maladies telles que le syndrome de
l’immunodéficience acquise (SIDA) et la sclérose en plaques (SP). En 1988, des
expériences ont démontré que le HHV-6 infecte les lymphocytes T CD4+, tout comme le
VIH (63, 81). Depuis, le HHV-6 est mis en cause dans certaines infections opportunistes
chez les patients atteints du VIH. Selon certains, il pourrait même contribuer à la
progression du virus, mais plusieurs expériences semblent démontrer le contraire (2). Quant
à l’association entre le HHV-6 et la sclérose en plaques (SP), elle est encore très
controversée. La présence d’ADN viral dans le noyau d’oligodendrocytes près des plaques
6
de démyélinisation responsable du SP a créé un réel engouement pour cette piste de
recherche (21). De plus, on associe surtout l’espèce A du HHV-6 à la sclérose en plaques
(SP) (5), mais la controverse est encore vive et davantage de preuves expérimentales seront
nécessaires. En bref, il n’est pas facile de déterminer les pathologies associées à HHV-6A
et HHV-6B. Puisque ces virus sont ubiquitaires et qu’ils se réactivent, il devient très
difficile de déterminer si les virus sont responsables des symptômes reliés à la maladie ou
s’ils ne sont pas plutôt une conséquence d’une maladie déjà en place.
2.5 Structure du virus
2.5.1 Le génome
Le génome viral est un ADN double brin linéaire de 160 kilo paires de bases (kpb) à 162
kpb selon la souche en question. Il est composé d’une section interne unique longue (UL) de
143 à 145 kpb, entrecoupée de 3 répétitions intermédiaires (R1-R3) contenant, entre autres,
la région précoce-immédiate A (IE-A). La région unique est flanquée à chaque extrémité
par les séquences directement répétées (DR) d’une longueur approximative de 9 kpb (10,
12, 136). Les séquences DR sont à leur tour flanquées de séquences télomériques répétées
(TRS), l’une dite homologue (GGGTTA)n et l’autre dite hétérologue het(GGGTTA)n qui
consistent en un patron de séquences télomériques irrégulières (93). Ces dernières auraient
un rôle lors de la réplication virale et dans le maintien du génome sous la forme épisomale
durant la latence (126). Dans le contexte de l’intégration chromosomique du HHV-6, ces
séquences seraient nécessaires à l’insertion du génome viral dans les chromosomes
cellulaires via la recombinaison homologue; mais ce sujet sera développé de façon plus
approfondie dans la section sur l’intégration (138). Pour compléter la séquence génomique
virale, on retrouve aux extrémités des séquences télomériques les séquences Pac1 et Pac2
nécessaires à l’empaquetage du génome viral dans la capside (41). La figure 1 ci-bas
représente un schéma de la structure simplifiée du génome viral.
7
Figure 1: Schéma simplifié du génome viral du HHV-6.
Tirée de la revue Trempe et coll., 2011 (39)
D’un point de vue transcriptionnel, le HHV-6B compte 119 cadres de lecture ouverts
(ORF), c’est neuf de plus que le HHV6-A; ils sont identifiés B1-B9 (10). Les séquences
codantes peuvent être sur l’un des deux brins et sont situées dans la section UL (U1-U100)
et dans les séquences DR (DR1-DR7). Certains gènes peuvent être épissés, mais en général
la séquence génomique et l’ARNm sont identiques. Un schéma des différents ORF est
représenté en figure 2.
8
Figure 2 : Génome de l’herpèsvirus humain de type 6 (HHV-6).
Tirée de Gompels et coll., 2006 (40)
Les membres de la famille des Herpesviridae ont sept blocs de gènes conservés codants
principalement pour des protéines de structures, des enzymes du métabolisme des acides
nucléiques et des protéines impliquées dans la réplication de l’ADN viral. La figure 2
représente en noir les gènes qui sont conservés chez les Herpesviridae. La configuration et
l’ordre de ces blocs sont très variables d’une espèce à l’autre. Par exemple, HHV-6 et
HHV-7, tous deux du genre roseolovirus, ont conservé la même organisation de leurs blocs
géniques (106). Par ailleurs, un huitième bloc contenant les gènes de la famille US22 est
9
présent seulement chez les quatre membres des β-herpèsvirus humains et leurs fonctions
seraient diverses. Ces gènes sont marqués en gris sur la figure 2. Enfin, il existe sept gènes
spécifiques à HHV-6: U1, U9, U22, U61, U78, U83 et U94. Tandis que certains d’entres
eux sont de petits gènes dont nous n’avons aucune évidence de leur expression, les
transcrits U22, U83 et U94 sont impliqués dans les processus biologiques importants du
virus. U22 code pour une glycoprotéine de l’enveloppe virale et U83 pour une chimiokine
utile dans le recrutement des monocytes (3). Quant au gène U94, il est d’un grand intérêt
pour ce projet, il sera décrit plus en details dans les prochaines sections.
Si la majorité des loci génomiques sont conservée à 95%, d’autres le sont beaucoup moins
et permettent de différencier les espèces A et B (10). La région IE-1 a été décrite comme
étant la plus variable entre les deux espèces, avec une homologie de séquence nucléique de
31% (37, 88). D’ailleurs, les sites d’épissage et de transcription des gènes dans le temps
seraient différents et auraient un effet marqué sur la biologie du virus (10). Une autre partie
du génome diffère entre les deux espèces, il s’agit de la section génique U97 à U100 qui
code pour le complexe glycoprotéique à la surface de l’enveloppe virale et qui affecte donc
le tropisme cellulaire. Dans leur ensemble, ces facteurs contribuent aux divergences
biologiques entre les deux virus.
2.5.2 Nucléocapside, tégument et enveloppe
La structure des Herpesviridae est caractéristique de cette famille. En effet, malgré les
différences biologiques, génomiques et pathologiques de ces virus, la structure du virion est
très conservée d’une espèce à l’autre. On distingue 4 structures essentielles: le génome, la
capside, le tégument et l’enveloppe. La capside consiste en une structure protéique de 162
capsomères de forme icosahédrique mesurant près de 90 à 110 nm de diamètre (12). Elle
renferme le génome viral et le protège de l’environnement extérieur jusqu’au moment où le
génome viral est relâché dans le cytoplasme de la cellule.
Autour de la capside se trouve le tégument, une structure diffuse de protéines cellulaires et
virales acquises par la nucléocapside dès la sortie du noyau cellulaire. Lors de l’infection, le
tégument contient les premières protéines effectrices. Par conséquent, ces protéines ne
10
dépendent pas de la transcription/traduction. Cette structure renferme plus de 40% de la
masse protéique totale du virus, ce qui témoigne de l’importance structurelle du tégument
(41).
Enfin, l’enveloppe représente la structure extérieure du virion. Elle est formée à partir de la
membrane nucléaire de la cellule et d’autres structures membranaires intracellulaires. Elle
inclut les protéines du complexe glycoprotéique souvent impliquées dans le tropisme
cellulaire et l’infection virale.
2.6 Cycles viraux
Le HHV-6 infecte préférentiellement les lymphocytes T CD4+ activés, mais peut
également infecter les cellules épithéliales et endothéliales, les astrocytes et les
lymphocytes B (37). In vitro, la propagation virale se fait surtout grâce à des lignées de
cellules T immortalisées choisies selon une infection à HHV-6A ou HHV-6B. Les cellules
subissent un changement morphologique caractéristique qui consiste en leur gonflement et
à l’apparition de cellules géantes multinucléées. Le mécanisme exact par lequel le virus
pénètre dans la cellule reste incompris, mais certaines pistes sont suggérées. L’infection des
cellules par le HHV-6 se fait via le CD46; un récepteur présent sur toutes les cellules
nucléées (112). Ce récepteur est un modulateur de l’activité cellulaire lors de l’infection et
est impliqué dans la voie du complément. Il est donc important dans la réponse de l’hôte
face à l’infection (108). À la surface du virion, quatre glycoprotéines ont un rôle
prédominant dans l’attachement du virion à la cellule: gH (U48), gL (U82), gQ1 et gQ2
(U100). L’ensemble de ces quatre glycoprotéines constitue le complexe viral nécessaire à
l’interaction avec le CD46 (89). Il semble que la présence de ce récepteur à la surface des
cellules soit insuffisante pour permettre l’infection. En ce sens, des expériences menées
avec des anticorps bloquants pour les glycoprotéines gH et gB (U39) ont démontré leur
importance dans le processus de fusion membranaire (37). Plusieurs données récentes
révèlent que certains virus peuvent interagir avec les radeaux lipidiques lors de l’infection.
Ce pourrait être le cas de l’infection à HHV-6, puisque l’attachement du virus au CD46
entraîne un déplacement du récepteur vers ces microdomaines, ce qui pourrait faciliter
l’infection (120). Après l’attachement du virus à la surface cellulaire, un changement de
11
conformation s’opère et le virion entre dans la cellule par endocytose. Par comparaison
avec le cytomégalovirus (CMV), on suppose que le virus pourrait traverser le cytoplasme
via le réseau de microtubules et rejoindre les complexes du nucléopores afin que le génome
soit libéré dans le noyau (28). À ce niveau, on distingue deux modes d’infections.
2.6.1 Cycle lytique
Après l’entrée au noyau, le génome viral prend la forme d’un épisome. Dès lors, il exprime
ses gènes de façon séquentielle (α, β, γ) pour répliquer son génome et former de nouveaux
virions. La figure 3 illustre le cycle réplicatif du HHV-6.
Figure 3: Cycle réplicatif du HHV-6
Tirée de la revue Trempe et coll., 2011 (39)
12
Pour ce faire, le virus utilise la machinerie cellulaire de transcription et de traduction, mais
possède sa propre ADN polymérase. Les protéines très précoces (α) sont des facteurs de
transcription ou des protéines régulatrices. Elles ont donc une influence importante sur la
transcription séquentielle des protéines, mais aussi au niveau de la régulation de la
réactivation et sur l’évasion du système immunitaire (121). Les protéines précoces (β) sont
quant à elles nécessaires au métabolisme de l’ADN et à la réplication. Enfin, les protéines
tardives (γ) sont des protéines structurales nécessaires à l’assemblage de la capside. Elles
sont dépendantes de la polymérase virale (95).
La réplication du génome viral se fait selon la méthode du cercle roulant et fait appel à sept
facteurs viraux différents. Une première protéine, Origin Binding Protein (OBP) lie
l’origine de réplication et provoque l’ouverture de l’épisome (32, 55, 56). Un complexe
protéique hélicase/primase tient cette ouverture stable et produit des séquences d’ARN
guides pour la synthèse du brin lent (92). Pendant que l’ADN polymérase virale (pU38)
synthétise l’ADN, la protéine majeure de liaison à l’ADN (U41) stabilise le simple brin
(122). Du même coup, un facteur de processivité (U27) s’associe à l’ADN polymérase (75).
Au fur et à mesure de la réplication, des concatémères se forment. Ceux-ci sont ensuite
clivés via les sites Pac1 et Pac2 situés aux extrémités du génome et empaquetés (31). La
nucléocapside maintenant mature migre vers le cytoplasme en empruntant une enveloppe
temporaire à la membrane interne du noyau (126). Puis, elle perd cette première enveloppe
et acquiert à l’appareil de golgi ou aux lamelles annelées le tégument et l’enveloppe
parsemée de glycoprotéines virales. Par la suite, le virus rejoint la membrane plasmique via
des vésicules de transport et sort par exocytose; de nouveaux virions sont formés et peuvent
infecter à leur tour d’autres cellules. Le cycle réplicatif prend en moyenne 72 heures (13).
2.6.2 Cycle latent
L’une des caractéristiques des herpèsvirus humains est leur capacité à entrer en état de
latence. Le HHV-6 diminue son expression génique au minimum, afin de réduire sa
détection par le système immunitaire de l’hôte. On différencie deux types d’infection
latente: la réplication chronique de faible niveau et l’infection latente vrai. La première se
ferait surtout au niveau des glandes salivaires et du cerveau; elle serait impliquée dans la
13
transmission du virus via la salive (22, 38). La seconde, dite «vrai», n’implique pas de
réplication à faible niveau. Elle consiste plutôt en un foyer viral qui peut se réactiver et
produire une infection lytique dans un moment de vie où l’hôte subit un stress important ou
se
trouve
dans
un
état
d’immunosupression.
Les
cellules
cibles
sont
les
monocytes/macrophages (64) et les cellules progénitrices de la moëlle (78). Par ailleurs,
certains rapportent avoir détecté de l’ADN viral à faible niveau dans les PBMC d’adultes
sains (107) et dans plusieurs tissus (23); mais aucune preuve n’a permis de démontrer qu’il
s’agissait de réactivation.
De la même façon que le CMV, HHV-6 exprime des transcrits de latence qui proviennent
de la région IE-A du génome (66). Ceux-ci fortement exprimés avant la réactivation in vivo
et in vitro seraient un élément déclencheur de la réactivation et de la transcription des gènes
très précoces (65).
3. Intégration chromosomique
3.1 Découverte
L’intégration chromosomique de certains virus est un phénomène connu depuis bien
longtemps. En effet, elle a d’abord été décrite chez les familles des rétrovirus et des virus
associés aux adénovirus. Chez les herpèsvirus, le phénomène est beaucoup moins commun
et sa découverte chez quelques espèces est assez récente. L’herpèsvirus de poulet
responsable de la maladie de Marek (MDV) est en mesure de s’intégrer aux chromosomes
des cellules de volailles et provoquer des lymphomes. Chez les herpèsvirus humain, le
phénomène est plutôt rare. L’observation de l’intégration du virus Epstein-Barr (EBV) a
déjà été réalisée dans des lignées de cellules transformées d’un lymphome de Burkitt, mais
semble être pour l'instant que marginal (103). De façon beaucoup plus importante, il a été
démontré dans les dernières années que le HHV-6 pouvait s’intégrer au génome cellulaire.
La première observation provient du laboratoire du Dr. Luppi, qui démontra, dans les
années 90, la présence d’ADN du HHV-6 intégré dans le génome cellulaire de trois patients
atteints de trois maladies différentes : la maladie de Burkitt, le lymphome non-Hodgkinien
et la sclérose en plaques (80). Depuis, de nombreux cas d’intégration chromosomique par
14
HHV-6 (ciHHV-6) ont été reportés. Les travaux de plusieurs laboratoires permettent
maintenant d’estimer sa prévalence à 1% dans la population mondiale (52, 73, 100, 119,
131). Les espèces A et B du virus peuvent tous deux s’intégrer, mais les cas rapportés
permettent d'estimer que la prévalence du ciHHV-6B est trois fois plus importante que celle
du ciHHV-6A (42). Par conséquent, on attribue maintenant à HHV-6 la capacité indéniable
de s’intégrer dans le génome cellulaire, et ce, avec la plus haute prévalence de tout les
herpèsvirus humain. Enfin, la particularité de l’intégration à HHV-6 réside dans le fait que
toutes les cellules d’un individu contiennent une copie du génome viral (130). Il advient
alors, que la transmission du ciHHV-6 se fait par l’hérédité, selon les lois de Mendel.
3.2 Intégration de novo et transmission héréditaire
Tous les cas d’intégration observés jusqu’à maintenant sont la conséquence d’une
transmission verticale (héréditaire). L’intégration de novo est très difficile à démontrer in
vivo car le nombre de cellules contenant le génome viral intégré est faible et donc trop
restreint pour être détectable par les méthodes diagnostiques. Ce qui laisse croire que ce
type d’intégration est possible, provient d’une expérience menée par Arbuckle et son
équipe, où ils ont démontré que le virus HHV-6 était sous forme intégrée après avoir
infecté des cellules JJhan et HEK-293 (7). Ces auteurs ont d’ailleurs vérifié qu’il ne
s’agissait pas de latence en s’assurant de l’absence de forme épisomale (7). Par contre, de
plus amples recherches devront être faites à ce sujet pour démontrer véritablement la
capacité du HHV-6 à intégrer le génome humain de novo. Malgré tout, la vraisemblance de
l’intégration de novo va de soi puisque malgré le fait qu’on observe toujours la présence de
la forme intégrée de par sa transmission verticale, il a bien fallu au départ qu’une cellule
germinale soit permissive à l’intégration.
Aujourd’hui, même si la transmission germinale est bien acceptée par la communauté
scientifique, ce concept n’a pas toujours fait l’unanimité. En premier, Daibata et coll.,1988
(27) ont démontré que le site d'intégration du HHV-6 était identique chez trois individus de
la même famille. Contesté par certains, une intégration préférentielle sur certains loci
spécifiques fut proposée comme explication aux observations (79). En 1999, une
observation du laboratoire du Dr. Daibata vint appuyer fortement le concept de la
15
transmission héréditaire. Il observa chez un enfant dont les deux parents étaient intégrés par
le HHV-6, que les sites d’intégrations (22q13 et 1q44) étaient d’une part celui de sa mère et
d’autre part celui de son père (26). Quelques-uns ont réfuté cette observation en affirmant
qu’il était possible qu’une infection active provenant des parents est eu lieu durant
l’embryogenèse ou à la naissance de l’enfant (46). Pourtant, peu de doute persiste
aujourd’hui quant au fait que le HHV-6 puisse se transmettre de manière héréditaire
puisque plusieurs expériences ont appuyé ce concept (53, 130). Enfin, basé sur les
expériences et observations faites jusqu’à maintenant, on suppose que la transmission peut
s’effectuer sur au moins 3 générations (27).
3.3 Virus latent ou mort?
La fonction de l’intégration chromosomique est très controversée. Certains parlent d’une
autre forme de latence, tandis que d’autres sont plus prudents et n’écartent pas la possibilité
de la «mort» virale. La latence se veut un état de dormance où le virus minimise son
expression génique et passe inaperçue face au système immunitaire. Après la latence, le
virus doit aussi pouvoir en sortir et être en mesure de se répliquer. Or, très peu d'éléments
nous permettent de conclure que l'intégration du génome est complète et que le virus peut
se réactiver. L’équipe du Dr. Arbuckle a séquencée les jonctions virus-cellule d’un des sites
d’intégration pour se rendre compte qu’une partie du DR droit était délétée de façon
variable d’un individu à l’autre (7). Quant à l’autre extrémité, aucun résultat n’a été
dévoilé. Par conséquent, le virus peut-il se réactiver même si lors de l’intégration il perd
des bouts de séquence? Peut-être que les séquences perdues ne sont pas nécessaires au bon
fonctionnement du virus? Par ailleurs, aucune preuve de réactivation in vivo n’a été publiée
jusqu’à maintenant. En effet, démontrer que la réactivation provient bien de cellules
intégrées et que le virus infectieux est le même que celui qui était intégré n’est pas une
tâche facile. La réactivation a été observée en condition in vitro une seule fois. Pour ce
faire, ils ont utilisé un agent chimique, la trichostatine A (inhibiteur de l’histone
déacétylase) qui a permis d’augmenter le nombre de copies d’ADN du HHV-6A dans les
lymphocytes T de porteurs du ciHHV-6. Ensuite, le virus aurait été transmis à des cellules
MOLT-3 (7). Néanmoins, ce papier s’est attiré plusieurs critiques quant au choix des
cellules à infecter et au gène utilisé pour associer le virus infectieux à celui intégré (90). En
16
effet, l'espèce virale utilisée pour cette étude n'est pas connue pour infecter les cellules
MOLT-3. Puis, le gène U94 utilisé pour associer le virus intégré au virus infectieux est
beaucoup trop conservé chez le HHV-6, le choix d'un gène plus variable aurait appuyé
davantage les résultats.
3.4 Répercussions cliniques
Puisque la réactivation à partir de l’état latent n’a pas encore été démontrée, il est très
difficile d’associer l’intégration chromosomique à une quelconque maladie. Par contre, il
est facile d’imaginer qu’une telle insertion dans notre code génétique pourrait causer des
tords. En ce sens, on trouve un taux plus élevé de ciHHV-6 chez des individus atteints de
maladies diverses (~2%) que chez des donneurs de sang sains (0,85%) (98). Un des groupes
de patients majoritairement touchés par le ciHHV-6 est celui des greffés de cellules
hématopoïétiques (HSCT) et d’organes solides (SOT) (58, 60, 100). Une récente étude
réalisée chez des transplantés de foie démontre qu’un taux plus élevé d’infections
bactériennes et de rejet de greffe est associé aux patients intégrés par le ciHHV-6 (72).
Dans un autre ordre d’idée, il est difficile de différencier l’infection active à l’intégration
chromosomique, ce qui dans certains cas peut engendrer un mauvais diagnostique. Un
individu intégré dans toutes les cellules de son corps obtient des valeurs très élevées
d’ADN viral lorsque ses prélèvements sont soumis à des tests quantitatifs de
polymérisation en chaine (qPCR). Les résultats peuvent laisser croire que l’individu souffre
d’une infection active par le HHV-6. Or, l’administration d’antiviraux doit être fait
seulement par nécessité, puisque leur administration peut être dangereuse chez des patients
déjà durement atteints. En fait, chez des patients atteints du ciHHV-6, les antiviraux
n’auront aucun effet, sauf celui de détériorer l'état du patient (51). Enfin, on en connait peu
sur les réels enjeux du ciHHV-6 et de ses répercussions cliniques, d'autres études seront
nécessaires afin de cerner le problème.
17
3.5 Mécanisme de l’intégration
Le mécanisme de l’intégration du HHV-6 est inconnu à ce jour. Évidemment on peut en
apprendre beaucoup en étudiant d’autres virus qui peuvent s’intégrer. Avant de faire des
analogies entre le virus responsable de la maladie de Marek (MDV) et le HHV-6, quelques
concepts se doivent d’être détaillés. Il sera donc question de la recombinaison homologue
et des séquences télomériques.
3.5.1 La recombinaison homologue
La recombinaison homologue (RH) consiste en un échange entre deux ADN de séquences
en partie équivalentes. Cette permutation peut être réciproque ou non et dépend absolument
d’une recombinase. En contexte cellulaire, la RH sert à maintenir l’intégrité du génome,
mais peut être impliquée dans le remaniement des chromosomes en période de stress
cellulaire. Par conséquent, elle est régulée par plusieurs facteurs cellulaires puisqu’elle peut
entrainer des conséquences graves pour la cellule. En génie génétique elle est utilisée pour
remplacer ou déléter un gène. D’un point de vue moléculaire, la RH se fait à partir d’une
ouverture simple brin dans un des ADN. Cette ouverture est causée par un bris ou par une
protéine à activité endonucléase. La recombinase, une protéine habilité à faire la
recombinaison homologue, peut ainsi lier l’extrémité simple brin et s’apparier sur la
séquence homologue de l’autre séquence d'ADN. S’ensuit un échange de séquences entre
les deux ADN (118).
3.5.2 Les télomères
Les télomères sont les séquences aux extrémités des chromosomes. Ils consistent en une
série de répétitions (TTAGGG)n d’une longueur variant de 5 à 15 kb dans les cellules
somatiques (91). Ces différences sont observables entre les chromosomes et même entre les
allèles. Au bout, le télomère est simple brin, riche en guanosines et est associé à plusieurs
complexes de six protéines (TRF1, TRF2, POT1, TIN2, TPP1, RAP1). Les fonctions de ces
protéines sont de contrôler la structure adoptée par l’extrémité des télomères, participer à la
formation d’une boucle en T et de contrôler l’élongation par la télomérase (29). La
télomérase est une ribonucléoprotéine qui allonge les télomères grâce à son activité de
18
transcription inverse et sa composante ribonucléique qui lui sert d'amorce (15). Dans une
cellule différenciée l’activité télomérase est nulle et la longueur des télomères diminue à
chaque division cellulaire (104). Lorsque la grandeur atteint un seuil critique, la cellule
entre en sénescence ou meurt par apoptose. À l’inverse, dans 85% des cas de cancers, les
cellules se protègent du raccourcissement des télomères en favorisant l'activité de la
télomérase (115). L'autre 15% des cancers contourneraient le raccourcissement via le
système alternatif d'élongation des télomères (ALT) qui dépend de la recombinaison
homologue (20).
3.5.3 Virus de la maladie de Marek (MDV)
Le virus de la maladie de Marek est un alphaherpesvirus oncogène qui infecte les poulets.
Sa forme intégrée aux chromosomes cellulaires est à l’origine de lymphome des cellules T.
Par conséquent, il cause de gros problèmes en production avicole et nécessite que les
élevages soient vaccinés. La structure de son génome est analogue aux herpèsvirus humains
1 et 2. Elle consiste en une section longue unique (UL) et une section courte unique (US),
séparées par deux séquences internes répétées (IRL et IRS) et flanquées à leurs extrémités
par des séquences répétées terminales (TRL et TRS) (19). De plus, chaque TR contient en
son extrémité une séquence télomérique parfaite (CCCTAA)n, tandis qu’une séquence
imparfaite de même nature cloisonne les deux séquences IR (62). Les séquences
télomériques répétées du MDV sont homologues à celles des télomères cellulaires et
pourraient être impliquées dans l’intégration virale. En fait, l’intégration se fait
indépendamment du chromosome et le génome viral est inséré en entier (30). Par contre, il
est préférentiellement localisé dans les régions télomériques des chromosomes (105). Une
récente étude confirme qu’un délétant de séquences télomériques du MDV s’intègre moins
fréquemment et ne cible plus de région en particulier (61).
Hypothèses pour HHV-6
Le MDV et le HHV-6 ont en commun quelques caractéristiques. D’abord, ils se distinguent
des autres herpèsvirus par leur capacité à s’intégrer aux chromosomes cellulaires. Puis, tous
deux ont des séquences télomériques dans leur génome. Certains ont émis l’hypothèse que
le MDV pourrait s’intégrer grâce à la recombinaison homologue via les séquences
19
télomériques. Étant donné ces ressemblances, il est probable que le HHV-6 s’intègre via les
séquences télomériques de son génome. Cette hypothèse est en partie soutenue par
l’observation des cas reportés dans la littérature, où on observe que les sites d’intégration
du HHV-6 se trouvent dans les régions télomériques (39).
4. La protéine Rep68 du AAV-2
4.1 Contexte
Selon notre hypothèse, le HHV-6 pourrait s’intégrer aux chromosomes cellulaires par
recombinaison homologue via les séquences télomériques. Pour que la recombinaison se
fasse, il est nécessaire d’avoir une recombinase. Quant aux virus HHV-6 et MDV, on a des
preuves que l’intégration est possible. Il y a donc deux possibilités: soit que le virus code
pour sa propre recombinase, soit il utilise la machinerie cellulaire. Mais la nature fait bien
les choses et par conséquent l’existence du HHV-7 nous permet d’aller un peu plus loin
dans cette réflexion. En effet, le HHV-7 est un très proche voisin du HHV-6, avec une
homologie de séquence nucléique de 85% (28). Comme le HHV-6, il contient dans ses DR,
des séquences télomériques. Pourtant, le HHV-7 est incapable, jusqu’à preuve du contraire,
de s’intégrer aux chromosomes des cellules (43). Alors, pour que le HHV-6 puisse
s’intégrer, il doit nécessairement coder pour une ou des protéines qui ont certaines activités
biochimiques des recombinases. Le HHV-6 a la particularité d’avoir dans son génome
l’origine de réplication fonctionnelle (ORF) U94, qu’il ne partage pas avec le HHV-7 (85).
Ce pourrait-il que cet ORF soit un élément clé de l’intégration chromosomique? Des
éléments de cette protéine laisse croire que ce serait possible. En effet, la protéine U94 du
HHV-6 partage une homologie de séquence en acide aminés de 24% avec la protéine Rep
du virus associé aux adénovirus de type 2 (AAV-2) (123).
4.2 Rôle de la protéine Rep du AAV-2
Le AAV-2 est un parvovirus qui nécessite la présence d’un adénovirus pour infecter les
cellules. En son absence, le AAV-2 entre en latence en s’intégrant au génome de la cellule
et se réactive lors d’une infection par le virus auxilliaire (49). Il est associé à aucune
maladie chez l’être humain. Son génome est un ADN simple brin de 4700 nucléotides qui
20
contient l’ORF Rep et Cap. Rep est associé à la réplication virale et Cap est une protéine de
structure. Le génome est aussi flanqué par des TR composés de séquences palindromiques
répétées. Ces séquences lui permettent de former à ses extrémités une structure en T
nécessaire à sa réplication et à la transcription de ses gènes. Le fonctionnement de la
réplication et le rôle joué par la protéine Rep sont bien connus. D’abord, le site de liaison
de Rep (RBE) est essentiel dans ce processus, il consiste en 3 répétitions du motif (GAGC)
(83, 109). La liaison de Rep à ce site provoque le réarrangement spatial du génome et libère
le site trs, endroit où Rep clive le génome grâce à son activité endonucléasique intrinsèque
(54). La protéine se lie ensuite à la nouvelle extrémité 5’ ainsi créée et la réplication se fait
grâce à la machinerie cellulaire à partir de l’extrémité 3’ (117). Comprendre le rôle de Rep
dans la réplication du AAV-2 permet de jeter les bases du mécanisme de l’intégration. En
ce sens, l’analyse des sites d’intégration du AAV-2 permet de conclure que le virus
s’intègre préférentiellement à un locus bien précis du chromosome 19 (111). En effet, ce
site est désigné AAVS1 et consiste en quatre répétitions du même motif retrouvé dans le
site RBE des TR du virus (67). Or, la protéine Rep pourrait se lier simultanément au site
situé sur le chromosome cellulaire et au RBE viral pour ainsi les rapprocher et permettre la
réplication au niveau du chromosome (84). Les dernières étapes du procédé sont encore
inconnues, mais on sait que le génome viral s’intègre sous la forme de concatémères et
persiste dans la cellule hôte jusqu’à la réactivation.
D’un point de vue mécanistique, la protéine Rep semble avoir besoin de quatre activités
pour permettre l’intégration du AAV-2 : la liaison à l’ADN simple et double brin et des
activités hélicase et endonuléase ATP dépendantes (54, 97).Voici une brève description des
domaines nécessaires à ces différentes activités.
21
4.3 Domaine d’interaction avec l’origine et hélicase SF3
Figure 4 : Domaines de la protéine Rep78
Adaptée de la revue Hickman et coll., 2005 (47)
L’ORF REP code pour 4 isoformes de la protéine Rep nommés selon leur poids
moléculaire: Rep40, Rep52, Rep68, Rep78 (76). Les protéines Rep68/78 sont nécessaires à
la réplication du génome de AAV-2 (16). La figure 4 illustre l’arrangement des domaines
de la protéine Rep78. Elle se distingue de la protéine Rep68, par son domaine composé de
doigts de zinc qui lui permet d’interagir avec des facteurs cellulaires (82). Dans un premier
temps, le domaine d’interaction avec l’origine (en jaune) est responsable des activités de
liaison à l’ADN simple brin et endonucléase de la protéine. La liaison à l’ADN est
indépendante de l’ATP et se fait préférentiellement aux sites RBE des TR viraux ou sur le
locus AAVS1 situé sur le chromosome 19 de l’humain. Par contre, l’apport en ATP
semblerait stimuler la liaison à l’ADN par la protéine Rep68 (69, 96). Quant à l’activité
endonucléasique, elle est ATP dépendante et coupe obligatoirement sur un ADN simple
brin et à un site très particulier ; le site de résolution terminale (trs). Dans un second temps,
le domaine responsable de l’activité hélicase (en vert pâle) est caractéristique de la super
famille III (SF3). En effet, il existe 3 grandes familles d’hélicases: SF1, SF2 et SF3. La
famille SF3 est unique aux petits virus à ARN ou ADN. Ces hélicases sont caractérisées par
4 motifs : Walker A, Walker B, B’ et C. Les deux premiers sont conservés dans les trois
familles d’hélicases. Ces motifs sont responsables de l’activité ATPase de la protéine
nécessaire à sa translocation sur l’ADN double brin (116). Quant au motif C, il est unique à
cette famille. Il serait essentiel au mouvement de la protéine le long de l’ADN, puisqu’il
contient une arginine qui capte le signal de phosphorylation du domaine A et engendre le
changement de conformation de la protéine (47). Les connaissances actuelles sur la
22
structure quaternaire des hélicases SF3 suggèrent fortement la formation de complexes
protéiques pour leur bon fonctionnement. Pour la Rep68/78, il a été démontré in vitro qu’il
pouvait y avoir formation de complexes dépendant de la structure de l’ADN (82). Enfin,
une autre particularité des hélicases SF3 est leur capacité à accomplir plusieurs tâches telles
que le remodelage de l'origine de réplication et la réplication.
5. Protéine U94 du HHV-6
5.1 Unique à HHV-6
Le gène U94 est unique à HHV-6. Tel que mentionné, l’ORF U94 est même absent du
génome du HHV-7, l’espèce la plus rapprochée du HHV-6 (85). Brièvement, ce gène est
situé à l’extrémité droite de la région UL du génome du HHV-6 et il est codé par 1473 pb
sur le brin complémentaire. Lors de la transcription, on détecte 2 transcrits émanant de cette
région : l’un de 5 kb beaucoup moins fréquent et l’autre de 2,7 kb qui représente la très
grande majorité des transcrits produits (87). Tel que représenté à la figure 5, l’ARNm le
plus fréquent (2,7 kb) contient 3 exons et deux introns épissés (102). Les deux premiers
exons ne codent pour aucune séquence protéique, tandis que l’exon 3 code pour la protéine
U94 de 490 acides aminés; celle décrite dans la littérature et dont il sera question ici (87).
Figure 5 : Transcrits de l’ORF U94 du HHV-6
Figure adaptée de Mori et coll., 2000 (87)
L’ORF U94 est très conservé entre les deux espèces du HHV-6 et entre les différents
23
isolats. En effet, la séquence génomique et protéique de U94 seraient identique à près de
97% entre le HHV-6A et HHV-6B (35, 57). De plus, la divergence entre les souches de
même espèce serait de moins de 0,2 à 0,6 % ce qui suggère que cette protéine joue un rôle
biologique prédominent (102). L’équipe du Dr. Mori, qui a identifiée les transcrits, a aussi
vérifié la localisation cellulaire de la protéine U94. 24 heures après l’infection de cellules
MT-4 par le HHV-6B, la protéine U94 est localisée au niveau du noyau. Avec le temps, soit
48 heures après l’infection, la protéine est cytoplasmique (87). Quant à son type temporel,
les résultats diffèrent selon la technique utilisée. Certains affirme qu’elle est une protéine
très précoce (86, 95), tandis que d’autres concluent qu’elle est précoce (127).
5.2 U94 et Rep68/78
Les herpèsvirus peuvent jouer le rôle de virus auxilliaires pour permettre l’infection par le
AAV-2 (48). En ce sens, le Dr. Thomson affirmait en 1991 que la protéine U94 serait le
résultat d’un transfert direct entre le AAV-2 et le HHV-6 (123). Selon lui, l’homologie de
séquence en acides aminés de 24% avec la protéine Rep68/78 suggère que ce gain de gène
n’est pas le résultat d’un ancêtre commun ou d’une convergence lors de l’évolution. Ce
serait plutôt l’infection d’une même cellule par les deux virus qui aurait permis au HHV-6
d’obtenir par recombinaison non-homologue le gène Rep. Par la suite, l’une de ses
expériences vint appuyer fortement sa proposition lorsqu’il démontra qu’un mutant du
AAV-2 délétant du gène Rep pouvait, grâce à l’apport de U94 en trans, regagner la
capacité de se répliquer (124).
La comparaison des séquences homologues entre ces deux protéines révèle l’importance
des domaines et acides aminés conservées. Tel que mentionné, la protéine Rep68/78
possède quatre activités nécessaires à la réplication et par conséquent à l’intégration
chromosomique : la liaison à l’ADN simple et double brin, l’activité ATPase, l’activité
hélicase et l’activité endonucléase spécifique. Des expériences de mutagenèse sur la
protéine Rep ont permis d’identifier les domaines et résidus nécessaires aux activités (128,
129). Par conséquent, nous avons aligné les séquences des protéines Rep68, U94A et U94B
(figure 6) et observé les homologies. On s’aperçoit assez rapidement que U94 possède
théoriquement les domaines nécessaires pour avoir les mêmes activités biochimiques que la
24
protéine Rep68 du AAV-2. D’ailleurs, il a été démontré que la protéine U94 est en mesure
de lier l’ADN simple brin et que cette activité serait plus évidente avec l’ajout d’extrait
cellulaire à la réaction in vitro (33).
25
Y164F
Mutant
endonucléase
GK343AH
Mutant hélicase
K395A
Mutant de liaison
Figure 6 : Alignement des séquences en acides aminés de Rep68 et U94A
Alignement des séquences en acides aminés des protéines Rep68 du AAV-2, U94A et
U94B du HHV-6. Les acides aminés nécessaires aux activités biochimiques de la protéine
Rep68 (liaison à l'ADN, ATPase, hélicase et endonucléase) sont en rouge. Les rectangles
noir délimitent les différents domaines responsables de l'activité hélicase de la protéine
Rep68. L'arginine du site actif de l'activité hélicase est en bleu. Les acides aminés
retrouvés dans la séquence des trois protéines sont marqués d'un astérisque (*), les acides
aminés conservés, d'un deux points (:) et les semi-conservés, d'un point (.).
26
5.3 Latence et transactivation
Mis à part le rôle potentiel de la protéine U94 dans l’intégration chromosomique, on lui
reconnait déjà un rôle dans la latence virale. Ainsi, lors de l'infection d'une cellule in vitro
l'expression de transcrits d'U94 pendant le cycle lytique est très faible (102). À l'inverse,
seuls les transcrits de l'ORF U94 sont présents lors d'une infection latente de PBMC
d’individus sains (107). La réplication du HHV-6 et des autres β-herpèsvirus est inhibée en
transfectant des cellules avec un vecteur qui exprime U94 (17). Pour mieux comprendre
l’effet de la protéine U94 sur la réplication virale, le laboratoire du Dr. Di luca a infecté une
lignée de cellules lymphoïdes exprimant de façon stable la protéine U94. Les cellules
permissives à l’infection n’ont révélé aucun effet cytopathique (107).
Bref, la protéine U94 joue un rôle important dans la latence et semble être impliquée dans
la régulation de la réplication virale. Ceci suggère que U94 serait un transactivateur
important chez le HHV-6. En effet, dans des cultures in vitro de fibroblastes la protéine
U94 peut lier le promoteur LTR du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 et
l’activer (124). U94 influence également différents éléments cellulaires puisqu'il a été
démontré que la protéine U94 est capable de lier le facteur de transcription humain TATA
Binding Protein (hTBP) pour ainsi moduler la réponse cellulaire (87) et supprimer la
transformation cellulaire causée par l’oncogène H-ras (6).
6. Hypothèse et objectifs de recherche
6.1 Hypothèse
Il a été observé depuis plus d’une vingtaine d’années que le HHV-6 est en mesure de
s’intégrer dans les chromosomes cellulaires. Depuis, plusieurs cas raportés permettent
d’affirmer que l’intégration s’effectue dans les régions subtélomériques/télomériques des
chromosomes. Le virus de la maladie de Marek, un α-herpèsvirus chez le poulet, s’intègre
lui aussi au niveau des télomères probablement via les séquences télomériques répétées de
son génome. Ces mêmes séquences sont présentes dans les régions directement répétées du
génome du HHV-6. Le AAV-2, quant à lui, adopte la forme d’un provirus en absence de
virus auxilliaire nécessaire pour le déclenchement de son cycle lytique. Il partage avec le
27
HHV-6 une homologie de séquence en acides aminés de 24% pour la protéine Rep/U94.
Cette protéine, qui est associée à l’intégration du AAV-2, a la capacité de cibler le locus de
l’insertion via une recombinaison non-homologue. À partir de ces connaissances et du rôle
que joue U94 dans la latence du HHV-6, nous émettons l’hypothèse que la protéine U94 du
HHV-6 est impliquée dans le processus de l’intégration chromosomique. La démonstration
que la protéine U94 partage les mêmes activités biochimiques que la protéine Rep du
AAV-2 permettrait d’appuyer fortement cette hypothèse. Éventuellement des tests
d’intégration in vitro à l’aide d’un mutant délétant de U94 seraient nécessaires afin de bien
cerner la problématique. Enfin, ces observations serviraient à mieux comprendre
l’intégration chromosomique du HHV-6.
6.2 Objectif principal
L’objectif du projet est de vérifier si la protéine U94 possède les activités biochimiques de
la protéine Rep essentielles à l’intégration du AAV-2. Ces activités sont la liaison à l’ADN
simple brin et double brin, l’ATPase, l’hélicase et l’endonucléase. Pour ce faire, des tests in
vitro seront faits dans un premier temps en radioactivité, puis dans un second temps à l’aide
d’appareils spécialisés.
6.3 Objectifs spécifiques
Les objectifs spécifiques sont:
1- De produire la protéine U94 en fusion avec une étiquette immunogénique (Flag)
grâce à une construction dans un vecteur eucaryote pour permettre son
expression dans des lignées cellulaires.
2- Produire une protéine de fusion entre la protéine qui lie le maltose (MBP) et
U94 pour obtenir une protéine soluble dans un système bactérien et faciliter sa
purification.
28
3- Élaborer des mutants de la protéine U94 par mutagenèse dirigée pour les quatre
activités biochimiques.
4- Déterminer
la
localisation
cellulaire
de
la
protéine
U94
par
immunofluorescence.
5- Vérifier l’activité de liaison à l’ADN simple et double brin par des essais de
retards sur gels. Étudier la spécificité de la liaison pour un type d'ADN avec le
Proteon™ XPR36.
6- Effectuer des tests d’ATPase pour vérifier la capacité de U94 à hydrolyser
l'ATP.
7- Immunoprécipiter
la
protéine
FLAG-U94
pour
de
futurs
essais
d'immunoprécipitation sur la chromatine et de co-immunoprécipitation avec des
protéines partenaires potentiels d'U94.
8- Séquencer et comparer le gène U94 de souches virales de laboratoire et de
souches virales intégrées.
29
Matériel et méthodes
Construction de vecteurs procaryotes codant pour U94A et U94B
Le gène U94 du HHV-6 a été amplifié par PCR à partir des deux espèces du virus : A
(souche GS) et B (souche Z29). La réaction PCR a été faite dans un volume final de 50 μl,
avec 2,5 U de polymérase Expand High Fidelity
PLUS
PCR System (Roche Diagnostics) à
partir des amorces (5'-CGCGGATCCTTTTCCATAATAAATCC-3') en sens et (5'CGCAAGCTTTTATAAAATTTTYGG-3') antisens à la concentration de 0,4 μM. L’une
contient le site de restriction BamH1 et l’autre le site HindIII à leurs extrémités
respectivement (souligné). La réaction consiste en un premier cycle à 94°C pendant 2 min ;
en 10 cycles de 30 s à 94°C, 30 s à 50°C et 2 min à 72°C ; puis en 20 cycles de 30 s à 94°C,
30 s à 50°C et 2 min + 10 s à 72°C pour se terminer par un dernier cycle de 7 min à 72°C.
Ensuite, les produits PCR ont été séparés sur gel d’agarose 0,8% dans un tampon Trisbase/Acide acétique/EDTA (TAE) 0,5X. Les bandes correspondantes au gène U94 ont été
extraites du gel avec le kit QIAquick Gel extraction (Qiagen). L’ADN obtenu a été dosé et
les sites de restrictions situés dans les amorces ont servi à liguer le gène U94 dans le
vecteur d’expression procaryote pMAL-c2 préalablement digéré par BamH1 et HindIII
(New England Biolabs Inc.). Les ligations ont été faites toute la nuit (O/N) à 16°C avec
l'ADN ligase du phage T4 (New England Biolabs, Inc), puis ont été transformées dans des
cellules bactériennes E. coli TOP10 (Life Technologies Corporation) et ensemencées sur
pétris LB (milieu Luria-Bertoni) avec 100 µg/mL d’ampicilline à 37°C O/N. L’ADN de 8
colonies a été extrait avec le kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen), digéré avec l'enzyme de
restriction EcoR1 et les clones attendus ont été envoyés à la Plateforme de séquençage et de
génotypage du Centre de recherche du CHUL. Les séquences ont permis de vérifier la
continuité du cadre de lecture entre MBP et U94. L’amorce FLAL55 sens et située en
amont dans le vecteur a été utilisée (GCAAAGTGGTACGCTCAAGC) (Integrated DNA
Technologies). Enfin, une plus grande préparation d’ADN a été faite avec le kit Plasmid
Maxi Prep (Qiagen) et conservée à -20°C.
30
Construction de vecteurs eucaryotes codant pour U94A et U94B
Deux types de construction ont été faits à partir de vecteurs d'expression eucaryotes. D'une
part, l'ORF U94 de l'espèce A a été cloné en fusion avec l'étiquette FLAG en N-terminale.
Le protocole utilisé pour l’amplification du gène U94A de la souche GS a été le même que
celui utilisé pour la construction dans le vecteur procaryote. Les amorces utilisées étaient
flaquées des sites Xho1 et HindIII pour être insérées dans le vecteur pENTR4-FLAG. Ce
vecteur doit être fusionné avec un vecteur de destination qui contient le promoteur
nécessaire à l'expression de la protéine de fusion. Pour ce faire, 25 ng de pENTR4-FLAGU94 a été ajouté à 50 ng de vecteur de destination pLentiCMV/TO Puro Dest (Addgene),
en présence de 1 μl d’enzyme Clonase (Gateway® LR Clonase® II Enzyme mix de Life
technologies Corporation) et 1 μl
de tampon de réaction 5X. La réaction dure 3h à
température pièce et le produit est transformé dans des E coli. stbl3 (Life technologies
Corporation) et ensemencé sur pétri LB avec ampicilline (100 μg/ml). Une maxiprep
d’ADN a été préparée et stockée à -20°C. D'autre part, les oligonucléotides sens et antisens
correspondant aux séquences télomériques parfaites du HHV-6 ont été insérés dans le
vecteur pcDNA4/hismaxC (Invitrogene). L' oligonucléotide sens (5'-TCGAGGGGTTAGG
GTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAC-3')
et
l'oligonucléotide antisens (5'-TCGAGTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTA
ACCCTAACCCTAACCCC-3')
ont
été
phosphorylés
par
l’USB®
Optikinase™
(Affymetrix) à 37°C pendant 30 min suivit d'un traitement à 65°C pendant 20 min pour
désactiver l'enzyme. Les oligonucléotides ont été chauffés à 100°C dans une solution de
citrate de sodium salin 1X (SSC) pendant 5 min et refroidis à TP pendant la nuit pour
favoriser leur appariement. Quant au vecteur, il a été digéré par l'enzyme de restriction
Xho1 (New England BioLabs) et déphosphorylé 2 heures à 37°C par la phosphatase
alkaline (Thermo scientific). L'insert et le vecteur ont été dosés par spectrométrie à 260 nm
grâce à l’appareil Infinite® 200 PRO NanoQuant (Tecan) pour ensuite être ligués à 16°C
durant 4 heures. La ligation a été transformée dans des E coli. DH5α et les préparations
d'ADN ont été séquencées avec l'amorce CMV fwd (5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG
-3').
31
Mutagenèse dirigée des protéines U94A/B
Des amorces ont été synthétisées (Integrated DNA Technologies) afin de muter le gène de
U94 à 3 endroits différents. Les trois mutations ont été faites séparément : Y164F
(endonucléase), GK343AH (ATPase) et K395A (liaison à l’ADN). Chaque réaction PCR
contient 100 ng de vecteur pMAL-c2-U94, 125 ng de chacun des oligos, 10 mM de dNTPs,
2,5 U de la polymérase PFU Turbo (Stratagene), le tampon de réaction à 1X et de l’eau
pour un volume final de 50 μl. Les températures de dénaturation (Tm) qui ont été
utilisées sont : 45°C pour le mutant K395A et 53,4°C pour les autres mutants. Le
programme PCR utilisé pour l'amplification correspond à un premier cycle à 95°C pour 30
s, suivit de 18 cycles de 30 s à 95°C, 1 min au Tm correspondant (45 ou 53,4°C), 17 min à
68°C et d’un dernier cycle de 7 min à 68°C. Après la réaction, l’ADN parental a été digéré
avec Dpn1 suivi d’une transformation bactérienne et d'un ensemencement sur pétris LBampicilline.
Quelques clones ont été repiqués et l’ADN envoyé au séquençage pour
confirmer les mutations. Les amorces utilisées pour chaque mutation sont : 5-'CTTCAGTC
TAAGTTTCATCCCCTTTGCCC-3' (Y164F en amont) et 5'-GGGCAAAGGGGATGAA
ACTTAGACTGAAG-3' (Y164F en aval) ; 5'-TTTAATATTATAGCATCCCTCCTTGGA
GGTC-3' (K395A en amont) et 5'-GACCTCCAAGGAGGGATGCTATAATATTAAA-3'
(K395A en aval) ; 5'-CACCCGGATGTGCACACTCGATGTTAACG-3' (GK343AH en
amont) et 5'-CGTTAACATCGAGTGTGCACATCCGGGTG-3' (GK343AH en aval).
Production des protéines dans E. coli BL21-RIL
Les vecteurs d'expression procaryotes permettent de produire de grande quantité de
protéines à l'aide de cultures bactériennes. De fait, les protéines MBP, Rep68, U94A, U94B
et les 6 mutants d'U94 ont été produites dans E. coli BL21-RIL. La première étape de la
production de protéines a consisté à transformer les bactéries BL21-RIL avec 100 ng de la
construction pMal-c2. Ensuite, les bactéries ont été ensemencées sur pétri LB avec 100
μg/ml d'ampicilline et 25 μg/ml de chloramphénicol et mis à 37°C O/N à 250 rpm. Le
lendemain, une préculture de 20 ml de LB liquide avec les mêmes antibiotiques a été
ensemencée et mise à 37°C à 250 rpm O/N. Le jour suivant, 500 ml de milieu LB liquide
avec antibiotiques ont été ensemencés avec 5 ml de la préculture et mise à 37°C jusqu'à ce
qu'une D.O.600
nm
de 0,4-0,6 soit atteinte. Ensuite, 0,3mM d'isopropyl β-D-1-
32
thiogalactopyranoside (IPTG) a été ajouté et la culture a été placée à température pièce (TP)
O/N. Le lendemain matin, la culture bactérienne a été centrifugée dans le rotor H6000A de
la centrifugeuse Sorvall RC 3C PLUS à 4000 x g pendant 20 min et le surnageant a été
écarté pour conserver que le culot. Puis, le culot a été homogénéisé dans 20 ml de tampon
de lyse (Tris-HCl 20 mM pH 7.5, DTT 1 mM, EDTA 1 mM, NaCl 200 mM) et séparé dans
quatre tubes Falcon de 50 ml. Pour libérer les protéines produites, les bactéries ont été
lysées sur glace avec le soniqueur Sonifier 450 (Branson) à puissance 3.5 pendant 2,5 min
de façon intermittente pour éviter de surchauffer le lysat. Par la suite, les 4 échantillons d'un
même lysat ont été rassemblés et placés à 4°C pour ensuite être centrifugés à 9000 x g
pendant 30 min dans le rotor fixe JA-20 de la centrifugeuse Avanti J-E (Beckman Coulter).
Le surnageant ainsi obtenu contient les protéines qui doivent être purifiées. Deux méthodes
ont été utilisées en parallèle. L’une manuelle, qui sera décrite ici, et l’autre automatique,
avec l’ÄKTAprime plus, (GE Healthcare) qui permet de la même façon que la méthode
manuelle de purifier les protéines sur colonne d'amylose, mais qui est plus efficace quant à
la pureté et à la quantité de protéines obtenues. D'abord, la résine d'amylose (Dextrin
SepharoseTM High Performance de GE Healthcare) a été ajoutée à la colonne de
chromatographie. Ensuite, la résine a été lavée par trois volumes de colonne (10 ml) de
tampon de lyse. Le lysat bactérien a ensuite été ajouté à la colonne pour permettre à la MBP
de se lier à la résine et à la solution d’être éluée. Puis, la colonne a été lavée par 30 ml de
tampon de lyse. La protéine a ensuite été éluée par une solution de tampon de lyse
additionnée de maltose 100 mM. Dans le cadre de ce projet, toutes les protéines purifiées
ont été éluées dans les deux premières fractions de 1 mL. Pour obtenir une préparation de
protéines plus pure, l'extrait protéique a été dialysé dans une cassette Slide-A-Lyzer Dialysis
de 10K MWCO (Thermo Scientific). Pour ce faire, la cassette qui contient l'extrait purifié
doit être plongée dans quatre litres de tampon phosphate salin (PBS) 1X pour 1h, puis dans
un nouveau quatre litres de PBS 1X pour une deuxième heure. Finalement, la protéine
obtenue est dosée par la méthode de l'acide bicinchoninique (BCA).
33
Immunobuvardage et coloration au bleu de coomassie
Les protéines U94A, U94B, Rep68, MBP et les mutants d'U94 ont été mises sur gel de
polyacrylamide pour vérifier leur poids moléculaire et leur pureté relative. 100 ng et 500 ng
de protéines purifiées et dialysées ont été séparées sur gel 7,5% de polyacrylamide-SDS
(SDS-page). De ces gels, la moitié a été directement colorée au bleu de coomassie, tandis
que l'autre moitié a été utilisée pour faire un immunobuvardage. La coloration au bleu de
coomassie a été faite pendant 3h à TP, suivit de deux décolorations subséquentes de 1h30
chacune sur plaque agitatrice. La solution de décoloration est composée de 40 % de
méthanol, 10% d'acide acétique glacial et 50% d'eau. Enfin, le gel a été déposé sur papier
whatman (Fisher) et séché sous vide pendant 2h avec le Air Dryer Model 543 (Bio-rad).
Autrement, les protéines sur les gels utilisés pour l'immunobuvardage ont été transférées
sur une membrane de PVDF (Immobilon® Millipore) à 4°C pendant 1h. Ensuite, les
membranes ont été bloquées pendant 1h dans une solution TBS 1X /Tween-20 0,1%
(TBST) avec 5% de lait. Après trois lavages de 5 min au TBST, l'anticorps primaire a été
ajouté. Il s'agissait d'une dilution 1/1000 dans du TBST de l'anticorps polyclonal anti-MBP
de lapin (Abm). Après 1h d'incubation à TP sous agitation, 3 lavages de 5 min au TBST ont
été faits. Puis, l'anticorps secondaire, un chèvre anti-lapin couplé à la peroxydase (Jackson
ImmunoResearch Laboratories, Inc), a été ajouté à la dilution de 1/10000. Enfin, les
membranes on été lavées à trois reprises avec du TBST durant 5 min et les protéines
révélées par l'ajout du substrat de la peroxydase ECL (Western Lightning® Plus-ECL,
PerkinElmer, Inc).
Construction GST-vFlip
Le gène vFlip a été amplifié par PCR à partir du vecteur pcDNA3-vFlip et des amorces
sens (5'-CCTTAAGCTTCTATGGTGTATGGCGATAGTG-3') et antisens ( 5'-GCCACTT
ACGAGGTTCTCTG-3') en suivant le programme utilisé pour l'amplification d'U94. Pour
insérer le produit PCR à bouts francs dans le vecteur pGEX-2T, ce dernier a été digéré par
EcoRI et traité par la Pfu ADN polymérase (Thermo Scientific) pour générer des bouts
complémentaires au produit PCR. Ensuite, le vecteur résultant a été utilisé pour produire la
protéine GST-vFlip dans un système bactérien (E. coli), inductible à l'IPTG (0,3mM) à la
34
manière d'U94. La colonne utilisée pour la purification d'affinité a été une GSTrap HP de 1
ml (GE Healthcare Life Sciences).
Transfection des cellules et immunofluorescence
Les vecteurs pLentiCMV/TO-Puro-FLAG-U94A et pcDNA3.1(-) (Invitrogen) ont été
transfectés dans des cellules Hela. 24 heures avant la transfection, les cellules ont été
passées et distribuées dans des pétris de 35 mm au compte de 400 000 cellules. Le
lendemain matin, 2,5μg de vecteur pcDNA3.1(-) ou de vecteur FLAG-U94A ont été
transfectés pendant 48h avec le réactif de transfection TransIT®-LT1 (Mirus Bio) tel que
recommandé par le fabricant.
Les pétris de 35 mm qui contiennent les cellules Hela transfectées ont été lavés 3 fois avec
du PBS 1X. Les cellules ont été fixées avec 1 ml de paraformaldehyde 1% pendant 20 min
à TP. Après 2 lavages au PBS 1X, 1 ml de 0,1 M glycine/PBS a été ajouté pour neutraliser
le paraformaldehyde. 2 lavages au PBS ont été faits, puis les cellules ont été perméabilisées
avec une solution de 0,5% triton/PBS pendant 5 min. 4 Lavages, deux fois avec du PBS 1X
et 2 autres avec du PBS/ 1% BSA ont été faits avant de bloquer la surface du pétri avec la
solution de PBS/ 1% BSA. Après avoir bloqué la surface pendant 30 min, le premier
anticorps a été ajouté à une dilution de 1/50; il s'agissait d'un anticorps anti-FLAG de souris
(abm). Les pétris ont été placés dans une chambre humide pendant 2 heures. Ensuite, 3
lavages au PBS/BSA 1% ont été faits avant d'ajouter le second anticorps à une dilution de
1/500. Celui-ci était un anticorps de chèvre anti-souris IgG couplé au fluorophore Alexa
fluor® 488 (Invitrogen). Enfin, 3 lavages au PBS/BSA 1% ont été faits avant de regarder
les pétris au microscope en contraste de phase et en fluorescence avec l'objectif 40X. Pour
ce faire, la solution dans le pétri a été enlevée complètement pour ne remettre que 2 gouttes
et une lamelle a été déposée au fond du pétri.
Essais de liaison à l’ADN avec le Proteon™ XPR36
Pour ce projet, l'utilisation d'une puce NLC était indiquée. Celle-ci contient des molécules
de neutravidine préalablement liées aux groupements alginates de surface. Contrairement
aux autres types de puce, la NLC ne nécessite pas l'activation de la surface d'alginate
35
puisque des molécules y sont déjà liées. La première étape consiste donc à initialiser la
puce à l'air (première utilisation) ou au glycérol (seconde utilisation). Ensuite, il faut
préconditionner la puce par l'injection de 1 M de NaCl et 50 mM de NaOH dans les 6
canaux. Dès lors, la surface de la puce est conditionnée pour la liaison des oligonucléotides
à sa surface. Nous avons effectué une première expérience de mise au point où 6 ADN de
natures différentes ont été utilisés. Les ADN ont été dilués dans du PBST 0,05% tween à la
concentration de 5x10-5 μg/μl dans l'ordre suivant: séquence télomérique riche en G (5'Biotine/- GGTTGAGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAG
-3'), séquence télomérique riche en C (5'-Biotine/-CTAACCCTAACCCTAACCCTAACC
CTAACCCTAACCCTAACCCTAACC-3'), séquence télomérique virale riche en C (5'CTAACCCTAACCCTAACCCTAGGCCCTAACCCTAACCCTAGGTCTAACCCT/Bioti
ne-3'), séquence aléatoire (5'-GGTATCGGTATCGGTATCGGTATCGGTATCGGTATCG
GTATCGGTATCGATCAGT-3'), séquence télomérique virale double brin (brin sens et
antisens des TRS du HHV-6) et l'ADN correspondant au site de liaison AAVS1 de la
Rep68 (5'-GATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGC
C/Biotine-3'). La réponse en RU (Response Unit) que nous avons obtenue pour la liaison
des oligonucléotides à la surface de la puce a été de 60 RU. Une réponse assez élevée
indiquant qu'une bonne quantité d'ADN est liée à la surface de la puce, mais pas trop élevée
pour saturer la surface. De cette façon, les protéines vont majoritairement lier qu'un ADN à
la fois, puisque ceux-ci ne sont pas trop rapprochés les uns des autres. Ensuite, nous avons
bloqué la surface avec 1nM de biotine dans un tampon PBST 0,05% pour bloquer les sites
neutravidines encore libres. Une première étape de régénération de la surface a été faite
pour enlever les molécules qui auraient adhérées à la surface de façon non covalente. Pour
y arriver, trois injections consécutives ont été faites : NaCl 2 M, 5 mM NaOH + 0,5 M
NaCl, 0,1% SDS. La régénération de la surface doit être faite après chaque injection de
protéine ou d'ADN pour éviter d'accumuler des molécules par liaison non covalente. Pour
débuter les injections de protéines, il faut d'abord changer le tampon d'expérience qui était
jusqu'ici le PBST 0,05% par le tampon de liaison (NaHEPES, pH 7.4, 20 mM ; NaCl 0,1 M
; MgCl2 10 mM, Tween-20 0,1 % ; BSA 1 mg/ml ; 0,83 mM d'ATP). Ensuite, les protéines
MBP et MBP-U94B ont été injectées. La MBP a été le témoin négatif des expériences de
liaison puisqu'elle n'est pas connue pour lier l'ADN. La Rep68 est le témoin positif puisqu'il
36
a déjà été démontré qu'elle pouvait lier le site AAVS1 du AAV-2. D'abord, les
concentrations auxquelles les protéines sont injectées doivent être vérifiées par essaiserreurs. L'important est d'obtenir après l'injection une courbe d'association croissante qui se
rapproche le plus possible à l'état d'équilibre. En effet, afin d'obtenir de bonnes valeurs
d'association et de dissociation il est important de s'approcher au maximum de l'équilibre de
la réaction. Autrement, s'il est atteint trop rapidement pendant l'injection, il est préférable
de diminuer la quantité de protéines, puisqu'elles risquent de saturer la surface et de se lier
de façon non spécifique. Les concentrations auxquelles les protéines ont été injectées sont
les suivantes : 800 nM, 400 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM et 0 nM.
Une seconde expérience a été faite au regard des résultats obtenus avec le premier essai.
D'abord, les protéines ont été injectées à des concentrations plus élevées que pour le
premier essai afin d'obtenir des valeurs significatives de liaison (1 μM, 0,5 μM, 0,25 μM,
0,125 μM, 0,0625 μM et 0 μM). Dans cet essai, nous voulions vérifier dans un premier
temps si les protéines U94 pouvaient lier l'ARN de la télomérase (TERC) et dans un second
temps, si U94A et U94B pouvaient lier les séquences télomériques cellulaires double brin.
Les ARN et ADN ont été liés à la concentration de 5x10-5 μg/μl dans l'ordre suivant: ARN
de la télomérase (5'-Biotine/-rGrUrGrGrCrCrArUrUrUrUrUrUrGrUrCrUArArCrCrCrUrAr
ArCrUrGrArGrArArGrGrGrCrGrUrArG-3'), ARN de la télomérase muté (5'-Biotine/rGrUrGrGrCrCrArUrUrUrUrUrUrGrUrGrArUrUrGrGrGrArUrUrCrUrGrArGrArArGrGrG
rCrGrUrArG-3'), l'équivalent en ADN du TERC (5'-Biotine/-GTGGCCATTTTTTGTCTA
ACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG-3'), la séquence télomérique riche en C (même que
celle du premier essai), la séquence télomérique cellulaire double brin et la séquence
AAVS1 double brin liée par Rep68.
Essais de liaison à l’ADN en radioactivité
Les essais de liaison sur gel ont été faits avec les séquences TRS du HHV-6: TRS sens
riche en G (5'-AGGGTTAGACCTAGGGTTAGGGTTAGGGCCTAGGGTTAGGGTTAG
GGTTAG/Biotine-3') et TRS antisens riche en C (5'-CTAACCCTAACCCTAACCCTAGG
CCCTAACCCTAACCCTAGGTCTAACCCT/Biotine-3'). Les oligonucléotides utilisés
pour les compétitions hétérologues ont été: la séquence aléatoire pour l'essai en simple brin
37
(5'-GGTATCGGTATCGGTATCGGTATCGGTATCGGTATCGGTATCGGTATCGATC
AGT-3') et la séquence AAVS1 pour le double brin (5'-GATGGAGTTGGCCACTCCCTC
TCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCC/Biotine-3'). Les oligonucléotides ont été
synthétisés et dosés par la compagnie (Integrated DNA Technologies). L’appariement des
oligonucléotides pour en faire de l’ADN double brin s’est fait à concentration équimolaire
des deux brins dans une solution de citrate de sodium salin 1X (SSC). Les tubes ont été
déposés dans l’eau bouillante (100°C) pendant 5 min et refroidie graduellement à TP sur la
paillasse. Ensuite, L’ADN a été dosé par spectrométrie à 260 nm et la pureté analysée par le
ratio de l’absorbance à 260 nm sur 280 nm (A260/280) grâce à l’appareil Infinite® 200 PRO
NanoQuant (Tecan). Les oligonucléotides simples et doubles brins ont ensuite été marqués
à leurs extrémités 5’ par l’USB® Optikinase™ (Affymetrix) avec de l’ATP γ-32P 10
Ci/mmol (PerkinElmer). À partir du marquage des oligonucléotides par la radioactivité et
jusqu'à la fin, les manipulations ont été faites dans une chambre de radioactivité. Donc, 10
pmoles d’ADN ont été marquées par 15 μCi d’ATP radioactif incorporés par 20 unités (2
μl) d’Optikinase à 37°C durant 30 min. Puis, les échantillons ont été placés pendant 20 min
à 65°C pour désactiver l’enzyme. La totalité de la réaction a ensuite été filtrée sur une
colonne ProbeQuant™ G-50 (GE Healthcare life sciences) pour enlever l’ATP nonincorporé. Dès lors, la réaction de liaison a pu se faire selon les différentes protéines (U94,
Rep68, MBP, mutants) et les différents oligonucléotides (ADN simple et double brin, TRS,
ITR). La concentration utilisée de protéines a été de 1 μg pour toutes celles à 95 kDa, tandis
que pour la MBP elle a été de 0,5 μg pour respecter le nombre de molécules entre chaque
essais. Pour quantifier les ADN, 1μl a été dosé au compteur à scintillation et 10 000 cpm de
chaque ADN a été utilisé par réaction. Le tampon de réaction était composé de 30 mM
HEPES-KOH pH 7.5, 7 mM MgCl2, 4 mM ATP, 1 mM DTT, 0,1 mg/ml de BSA et 5 %
glycérol. La réaction a été faite dans 20 μl de volume final, à TP pendant 30 min. Pour
arrêter la réaction, 10 μl de tampon de migration 2X (TAE 1X, 0,025 % bleu de
bromophénol, 0,025 % xylène cyanol et 6 % glycérol) ont été ajoutés. Les échantillons ont
été migrés sur un gel de polyacrylamide (29:1) 6% de format 15 cm x 12 cm x 0,75 cm
(Hoefer) dans du tampon Tris-borate et EDTA 1X (TBE). Le gel a été transféré sur un
papier whatman (Fisher Scientific) de même grandeur et séché sous vide avec le Air Dryer
Model 543 (Bio-rad). Il a ensuite été transféré dans une cassette pour l'exposer sur un film
38
sensible à la radioactivité. Enfin, le film a été révélé grâce à l’analyseur BAS-1800II
(Fujifilm).
Essais ATPase par HPLC
L’activité ATPase a été mesurée par chromatographie liquide de haute affinité (HPLC).
Pour ce faire, 0,5 μg de la protéine à l'étude a été ajoutée à la réaction, dont le volume final
était de 10 μl. L’essai a permit de vérifier la capacité qu'a une protéine liée à un ADN (0,2
μg / réaction) simple brin ou double brin (TRS ou autre nature) d’utiliser l’ATP du milieu
réactionnel à la concentration de 1,25 x 10-10 moles d’ATP / 10 μl. Le tampon de réaction
était composé de 50 mM TRIS-HCl pH 8, 20 mM NaCl et 2,5 mM MgCl2. L'expérience a
été faite à TP pendant 0 à 60 min, puis les échantillons ont été placés directement sur glace
de manière à arrêter la réaction. Par la suite, les échantillons ont été traités avec 20 μl de
HClO4 8 M, pendant 3 min pour ensuite être équilibrés à pH neutre avec 60 μl de K2HPO4
4 M. Cette étape permet de se débarrasser des contaminants en les faisant précipiter. Puis,
une centrifugation à 12 000 g pendant 5 min à 4°C permettait de séparer les contaminants
retrouvés au fond, des nucléotides phosphatés (ATP, ADP, AMP) du surnageant. Enfin, les
échantillons ont été conservés à -80°C jusqu’au jour de l'expérience de HPLC. Celle-ci
permet de séparer selon leur polarité et de quantifier les différents nucléotides phosphatés
selon la méthode décrite par le Dr. Ranogajec (101).
Immunoprécipitation d'U94
24 heures avant la transfection, une culture cellulaire de 293T a été passée et mise en pétri
de 35 mm au nombre de 400 000 cellules par pétris. Le lendemain matin, ces cellules ont
été transfectées selon la méthode décrite dans la section transfection des cellules. Après
deux jours, les cellules ont été recueillies et centrifugées à 3300 rpm pendant 5 min à 4 °C.
Les culots ont été lysés dans 1 ml de tampon RIPA ( 30 mM TRIS-HCl pH 7.5, 150 mM
NaCl, 10 % glycérol, 1 % triton, 1X Halt Protease Inhibitor Cocktail (Thermo scientific)) à
4 °C pendant 30 min. Après centrifugation, 50 μl de surnageant a été mis de côté et
mélangé avec 50 μl de tampon Laemmli comme témoin pour l'immunobuvardage (Extrait
total). 2 μl d'anticorps monoclonal de souris anti-FLAG ont été ajoutés au surnageant pour
être incubé à 4 °C durant 1 h. Puis, puisque l'anticorps primaire était d'isotype IgG2b, 10 μl
39
de protéine G on été ajoutés. Le tout a été incubé toute la nuit à 4 °C sous agitation rotative.
Le lendemain, les échantillons ont été centrifugés à 10 000 rpm pendant 10 min à 4 °C et
les culots ont été lavés 4 fois avec 1 ml de tampon de lyse. Finalement, les protéines liées
aux billes ont été lysées dans 50 μl de tampon Laemmli et un immunobuvardage a été fait
selon la technique décrite dans la section immunobuvardage et coloration au bleu de
coomassie. L'anticorps primaire (anti-FLAG) et secondaire (âne anti-souris, Jackson
ImmunoResearch Laboratories, inc.) ont été utilisés pour compléter l'expérience.
Alignement des séquences de U94 provenant de souches de laboratoire ou de
personnes intégrées
L'ADN des cellules intégrées par différentes souches du HHV-6 a été isolé avec le kit
QIAamp DNA Blood Mini (Qiagen). À partir de cet ADN, une PCR quantitative (qPCR) a
permis de vérifier s'il s'agissait de l'espèce A ou de l'espèce B en amplifiant un gène non
homologue entre les deux espèces. Ensuite, une PCR a été faite selon le même programme
PCR utilisé pour la construction dans un vecteur procaryote. Les amorces utilisées sont les
suivantes: 5'-CTCGGATCCGATTACAAGGATGAC-3' (sens) et 5'-ACTATAAAAAAC
TTGGGAGGCGCAAACGGT-3' (anti-sens). 6 μl des 50 μl obtenus de l'amplification ont
servis à vérifier le produit de la PCR sur gel d'agarose 0,8 %. Lorsque le produit
correspondait à un ADN de 1,5 kb de taille le 44 μl restants de la réaction étaient purifiés
avec le kit QIAquick PCR Purification (Qiagen). Pour séquencer la totalité du gène U94, le
produit PCR a été inséré dans le vecteur Topo TA cloning (Invitrogen). Pour ce faire, une
courte réaction PCR de 20 min à 70°C et l'apport en nucléosides triphosphates (NTP) au
milieu réactionnel permet à la Taq polymérase (New England Biolabs, Inc) d'ajouter aux
extrémités 3' une adénosine triphosphate. Une seconde réaction à TP pendant 30 min où 4
μl de la réaction PCR sont ajoutés à 1 μl de solution saline et 1 μl vecteur TOPO® permet
d'insérer le produit PCR dans le vecteur TOPO®. Ensuite, cette préparation a été
transformée dans les E. coli TOP10 et les bactéries ont été ensemencées sur pétri LB toute
la nuit à 37°C. Le lendemain, l'ADN de 8 colonies a été isolé avec le kit QIAprep Spin
Miniprep (Qiagen) et dosé par spectrométrie. Une digestion par l'enzyme de restriction
EcoRV a permis de vérifier si le patron de digestion (2 bandes: 4500 Pb et 885 Pb)
correspondait au vecteur avec l'insert U94. Les échantillons positifs ont ensuite été envoyés
40
à la plateforme de séquençage et de génotypage du Centre de recherche du CHUL pour être
séquencés à partir des amorces M13 reverse (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3') et T7
promotor (5'-TAATACGACTCACTATAGG G-3'). Enfin, les séquences d'ADN ont été
transformées en séquences protéiques et alignées grâce à l'outil bio-informatique CLC
Sequence Viewer 6.
41
Résultats
Localisation cellulaire
Le laboratoire du Dr Mori avait déjà observé lors d'une infection de cellules MT-4 par la
souche HST du HHV-6B que la protéine U94 était localisée au noyau (87). Dans le cadre
de ce projet, nous nous attendions fortement à obtenir le même résultat. En fait, si la
protéine U94 est moindrement impliquée dans l'intégration chromosomique, elle doit
pouvoir accéder au génome cellulaire. Pour contre-vérifier les résultats obtenus par le
laboratoire du Dr Mori, nous avons fait une immunofluorescence sur la protéine de fusion
FLAG-U94A. Pour ce faire, des cellules Hela transfectées avec FLAG-U94A ont été fixées
avec de la paraformaldehyde et perméabilisées à l'aide d'une solution 0,5% triton. La
protéine fut révélée grâce à un anticorps anti-FLAG suivi par un anticorps couplé à un
fluorophore vert (Alexa-fluor 488). Un vecteur vide, le pcDNA3.1(-) a servi de témoin
négatif, tandis que l'un des pétris de cellules transfectées par le FLAG-U94A n'a pas été
exposé au premier anticorps permettant de contrôler la reconnaissance par l'anti-FLAG de
la protéine de fusion. La figure 7 présente les photos en contraste de phase et en
fluorescence des deux témoins négatifs ainsi que de la protéine de fusion. En (A) le témoin
négatif (vecteur vide) ne réagit pas avec l’anti-FLAG. En (C) à la figure 7 nous voulions
nous assurer que le deuxième anticorps ne réagit pas directement avec les cellules sans la
présence du premier anticorps. Enfin, la protéine U94A en fusion avec l'étiquette FLAG est
majoritairement localisée aux noyaux des cellules, tandis qu'une faible proportion est
localisée au cytoplasme (B).
42
Microscopie en contraste de
phase
Microscopie en fluorescence
A
40X
40X
40X
40X
40X
40X
B
C
Figure 7 : Localisation cellulaire de la protéine de fusion Flag-U94A
Le vecteur FLAG-U94A a été transfectée dans des cellules Hela avec le TransIT®-LT1 (Mirus
Bio). Après 48 heures, les cellules ont été fixées au paraformaldéhyde et perméabilisées avec
0,1% triton. Enfin, une immunofluorescence avec l'anticorps primaire anti-Flag et le second
anticorps Alexa-fluor 488 a été faite. Les cellules ont ensuite été observées en microscopie à
contraste de phase et en fluorescence (objectif 40X). (A) pcDNA3.1(-) (B) FLAG-U94A (C)
FLAG-U94A sans premier anticorps
43
Protéines purifiées
Dans le but de vérifier si la protéine U94 possède les 4 activités biochimiques nécessaires à
l'intégration chromosomique à la manière de la protéine Rep68 du AAV-2, nous avons
produit de grandes quantités de protéines MBP-U94A et MBP-U94B. La méthode décrite
dans la section matériels et méthodes est inspirée de celle utilisée dans les études sur la
protéine Rep68 (24). Depuis 1994, Rep68 est produite de façon très efficace en fusion avec
la MBP dans E. coli. En effet, les protéines produites en fusion avec le gène malE de
Escherichia coli ont une grande affinité pour l'amylose et le maltose ce qui facilite leur
purification. De plus, la protéine produite est soluble et conserve ses activités biochimiques.
Par conséquent, les ORF U94 du HHV-6A et du HHV-6B ont été insérés avec succès dans
le vecteur pMalc-2 tel que vérifié par séquençage de la construction. À partir de 1 litre de
culture bactérienne transformée, plus de 1 mg de protéines purifiées sur colonne d'amylose
a été obtenu. Les protéines purifiées ont été dialysées avec une cassette de dialyse dans un
tampon PBS 1X. Enfin des immunobuvardages ont été faits avec 10 et 100 ng de protéines
purifiées et une coloration au bleu de coomassie a été réalisée en parallèle avec 250 et 500
ng de protéines (figure 8). Dans le cadre de l'étude biochimique de la protéine U94, il est
évident que le meilleur témoin positif consiste en la protéine Rep68 puisqu'elle possède
elle-même les 4 activités à l'étude. Nous avons ainsi obtenu du laboratoire du Dr. Owens
suffisamment de vecteurs pMalc-2 contenant l'ORF codant pour la protéine Rep68 pour
produire de grandes quantités de protéines (figure 8). Quant au témoin négatif, il s'agit de la
MBP, produite à partir du vecteur pMalc-2 d'origine dans E. coli (figure 8). Ce contrôle qui
n'est pas connu pour avoir l'une de ces 4 activités biochimiques permet de s'assurer que la
partie MBP de la fusion MBP-U94 n'est pas responsable de l'activité observée dans les tests
biochimiques in vitro.
44
Bleu de coomassie
100 kDa
250ng
Immunobuvardage
10ng
500ng
100ng
100 kDa
MBP-U94A
Bleu de coomassie
100 kDa
250ng
500ng
Immunobuvardage
10ng
100ng
100 kDa
MBP-U94B
Bleu de coomassie
Bleu de coomassie
500ng
50 kDa
500ng
100 kDa
MBP-Rep68
MBP
Figure 8 : Immunobuvardage et bleu de coomassie des protéines purifiées
Les protéines purifiées et dialysées ont été séparées sur gel de polyacrylamide 7,5 % aux
concentrations indiquées sur la figure. Quatre des gels ont servis à une coloration au bleu
de coomassie pour vérifier la taille de la protéine et deux autres gels ont été utilisés pour
un immunobuvardage contre la protéine de fusion MBP avec un anti-MBP de lapin dilué
1/1000 (abm). L'anticorps secondaire utilisé a été un chèvre anti-lapin couplé à la
péroxydase (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc).
45
Protéines mutées purifiées
L'équipe du Dr. Owens a réalisé deux études de mutagenèse sur la protéine Rep68 (128,
129). Ces études ont permis d’identifier les acides aminés nécessaires aux activités
biochimiques de la protéine. Puisque les protéines Rep68 et U94 ont une homologie de
séquence de 24%, il a été possible d'associer les acides aminés essentiels aux fonctions
biochimiques de Rep68 à la séquence de la protéine U94 pour reproduire les mêmes
mutations (123). Les mutants ont été obtenus par mutagenèse dirigée grâce à la PCR. Pour
ce faire, les constructions pMalc-2-U94A et pMalc-2-U94B ont été utilisées comme gabarit
permettant ainsi de produire les protéines mutantes dans E coli. de la même façon que les
protéines originales. Trois mutations ont été faites sur U94A et U94B contre les activités :
ATPase, endonucléase et de liaison à l'ADN. Si ces mutants ont démontré une perte de
fonction sur Rep68, il n'est pas certain que ce soit le cas sur U94. Or, il ne s'agit pas de
contrôles négatifs pour chaque activité, mais plutôt d'un exercice en parallèle pour tenter
d'associer les acides aminés essentiels aux activités qui pourraient être observées avec U94.
La figure 9 présente en immunobuvardages les 3 mutants de la MBP-U94, le témoin négatif
GST-Flip, la protéine MBP-U94 originale et la MBP. La coloration au bleu de coomassie y
est aussi présentée. La bande majeure à 95 kDa correspond à la protéine U94 en fusion avec
la MBP. Les protéines ont toutes été dialysées et conservées à -20 °C.
46
MBP-U94A
GK343AH
GST-Flip
K395A
Y164F
MBP
MBP-U94B
GK343AH
GST-Flip
K395A
Y164F
MBP
U94
U94
MBP
MBP
100 kDa
100 kDa
U94
U94
MBP
MBP
Figure 9 : Immunobuvardages et bleu de coomassie des protéines mutées purifiées
Les colorations au bleu de coomassie ont été faites à partir de la migration sur gel de
polyacrylamide 7,5 % de 500 ng de protéines purifiées. Quant aux immunobuvardages
ils ont été faits à partir de la migration de 100 ng de protéines. L’anticorps primaire
polyclonal de lapin l’anti-MBP (abm) a été dilué 1/1000. L’anticorps secondaire, un
chèvre anti-lapin couplé à la péroxydase (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc) a
permis de révéler les protéines à l’ajout d’ECL. La protéine GST-Flip était ici le témoin
négatif, puisque non reconnue par l’anti-MBP et la MBP était le témoin positif.
47
Études de retard sur gel (EMSA) à l'aide d'ADN simple brin
Une étude menée en 2002 par le laboratoire du Dr. Mori a démontré que la protéine U94 du
HHV-6 possède une activité de liaison à l'ADN simple brin sans toutefois identifier les
séquences reconnues (33). Tel que mentionné dans l'introduction, le HHV-6 possède des
séquences télomériques aux extrémités de son génome et à la manière du virus de Marek
nous pensons qu'il puisse s'intégrer via ces séquences dans les télomères cellulaires. Par
conséquent, nous avons répété une expérience de retard sur gel avec les mêmes conditions
que celles utilisées dans l'expérience décrite ci-haut. Pour mieux répondre à notre
hypothèse, nous avons utilisé des oligonucléotides identiques aux séquences télomériques
du virus. D'abord, nous voulions vérifier si la protéine U94 a une préférence pour le brin
sens (riche en G et contenant le motif TTAGGG) ou antisens (riche en C avec le motif
CCCTAA) des séquences télomériques. Dans le cadre de ce projet nous les avons appelés
brin riche en G et brin riche en C, respectivement. Cette première expérience révèle que les
protéines MBP-U94A et MBP-U94B lient l'ADN simple brin (figure 10). Les essais avec la
protéine MBP indiquent qu'elle n'est pas celle qui confère l'activité de liaison. Les
compétitions avec brin homologue non marqué et 100 fois plus concentré indique que le
signal obtenu est bien la résultante du complexe protéine-ADN. Nous pouvons affirmer à
partir de cet essai de retard sur gel qu'il ne semble pas avoir de préférence pour l'un des
deux brins.
48
Figure 10: Retard sur gel en présence d'ADN simple brin riche en G et riche en C
Une séquence de 60 nucléotides sens (riche en G) et antisens (riche en C) correspondant
aux TRS du HHV-6 sont marquées à l’ATP γ-32P par l’enzyme USB® Optikinase™.
Puis, 10 000 cpm de ces oligonucléotides simple brin sont ajoutés aux réactions
correspondantes, en plus du 1 μg de protéines. Les échantillons sont ensuite séparés sur
gel de polyacrylamide 6 %. Il s’agit de vérifier la liaison de la protéine à l’ADN avec
compétition du même oligonucléotides 100 fois plus concentré non marqué. Le témoin
négatif est la protéine MBP.
49
Dans une seconde expérience, nous voulions vérifier davantage la spécificité de la liaison à
l'ADN. Nous avons fait cette expérience avec le brin sens (riche en G) seulement, puisqu'il
ne semble pas y avoir de différence entre celui-ci et le brin antisens. Pour ce faire, des
compétitions hétérologues avec un ADN de séquence aléatoire 100 fois plus concentré ont
été faites. De plus, nous avons vérifié l'activité de liaison pour le mutant K395A (acide
aminé soupçonné d'être impliqué dans la liaison à l'ADN) des protéines U94A et U94B.
Les résultats présentés à la figure 11 montrent encore que la protéine MBP-U94 lie l'ADN
riche en G, mais l'activité ne semble pas restreinte à ce type de séquence. En effet, la perte
du signal dans les essais de compétitions hétérologues indique que la protéine MBP-U94
peut aussi lier une séquence d'ADN aléatoire. Par ailleurs, les essais faits avec le mutant de
liaison K395A cause une perte majeure d'activité de liaison. L'expérience indique que la
protéine MBP-U94A mutée conserve une très faible activité de liaison, tandis que la
protéine MBP-U94B mutée semble perdre presque la totalité. Ces résultats suggèrent que la
lysine à la position 395 est essentielle à l’activité de liaison, mais ceux-ci pourront être
vérifiés au Proteon™ XPR36.
50
MBP-Rep68
MBP-U94A MBP-U94B MBP-ΔU94A
MBP-ΔU94B
Figure 11: Retard sur gel de la protéine U94 sur ADN simple brin
Une séquence d’ADN correspondant aux TRS du HHV-6 de 60 nucléotides est marquée
à l’ATP γ-32P par l’enzyme USB® Optikinase™. Puis, 10 000 cpm de cet oligonucléotide
simple brin sont ajoutés aux réactions correspondantes, en plus du 1 μg de protéines. Il
s’agit de vérifier la liaison de la protéine à l’ADN avec compétition du même
oligonucléotide à 100X froid, avec compétition avec un ADN muté 100X froid et sans
compétition. Le témoin négatif est la protéine MBP et le témoin positif est la protéine
MBP-Rep68.
51
Études de retard sur gel (EMSA) avec la protéine U94 sur l'ADN double brin
Une troisième et dernière expérience de retard sur gel nous a permis de vérifier l'activité de
liaison sur ADN double brin (figure 12). Cette activité qui est présente pour la protéine
Rep68 n'a jamais été démontrée chez U94. L'ADN utilisé dans cet essai correspond aux
brins appariés sens et antisens du TRS viral. Nous avons aussi tenté de vérifier si la
spécificité pour le TRS viral était plus grande que pour le double brin aléatoire. Pour ce
faire, nous avons compétitionné cet ADN contre un ADN de séquence aléatoire 10 fois plus
concentré. Les résultats démontrent que la protéine MBP-U94B peut lier l'ADN double brin
sans spécificité apparente pour une séquence d'ADN. La liaison à l’ADN double brin est
beaucoup moins évidente pour la protéine MBP-U94A. Les essais au Proteon™ XPR36
permettront de vérifier si cette protéine est en mesure de lier l’ADN double brin. Quant aux
mutants de liaison K395A, la perte de fonction semble presque total pour le mutant de la
protéine MBP-U94B. Malgré plusieurs temps d'exposition, il est difficile d'affirmer que le
mutant MBP-U94A subit une perte d'activité, si une quelconque activité existe.
52
MBP-U94A
MBP-U94B
K395A (U94A) K395A (U94B)
Figure 12: Retard sur gel de la protéine U94 sur ADN double brin
Une séquence d’ADN double brin correspondant aux TRS du HHV-6 de 60 nucléotides
est marqué à l’ATP γ-32P par l’enzyme USB® Optikinase™. Puis, 10 000 cpm de cet
ADN double brin est ajouté aux réactions correspondantes, en plus du 1 μg de protéines.
Il s’agit de vérifier la liaison de la protéine à l’ADN avec compétition homologue à 10X
et 100X froid, avec compétition hétérologue à 10X et 100X froid et sans compétition.
De plus, l’exercice a été fait avec les mutants de liaison de la protéine MBP-U94
(K395A).
53
Étude d'affinité de la protéine U94 sur l'ADN à l'aide du Proteon™ XPR36
L'étude de l'affinité de liaison de la protéine U94 a été faite avec le Proteon™ XPR36
(Biorad), un appareil basé sur la technologie des plasmons de surface. En bref, la réaction
se produit à la surface d’une puce (figure 13) où nous avons lié dans des conduits dinstincts
six oligonucléotides biotinylés différents. Grâce à un système optique situé en dessous de la
puce, l’appareil mesure quantitativement (response unit) et qualitativement (KD, ka, kd) la
liaison entre les protéines injectées dans le système et les oligonucléotides liés à la surface
de la puce. Les injections se font elles aussi dans six conduits différents ce qui permet
d’injecter autant de concentrations pour chaque protéine (1 μM, 0,5 μM, 0,25 μM, 0,125
μM, 0,625 μM). L’appareil transmet à l'ordinateur les données qui sont ensuite mises sous
la forme de graphiques décrivant les 3 étapes de la réaction (l’association, l'équilibre, la
dissociation) en fonction du temps.
Figure 13 : Schéma de la puce utilisée pour les expériences avec le Proteon™ XPR36
Cette illustration est inspirée du document 5449 en ligne sur le site web de Biorad à
l'adresse suivante : https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5449.
pdf
54
Les valeurs d'affinité calculées par l'ordinateur sont valides seulement lorsque l'erreur
(Chi2) sur le Rmax (réponse maximale) correspond à moins de 10%. Au dessus de cette
limite, les valeurs ne peuvent pas être prises en considération. Un essai de liaison à partir de
cet appareil requiert plusieurs témoins tant au niveau des protéines injectées que des ADN
liés. Tel que prévu, les protéines MBP et Rep68 ont été de très bon témoins négatif et
positif, respectivement (figures 14 et 16). Dans notre premier essai, l'ADN de séquence
aléatoire a été notre témoin négatif, tandis que notre témoin positif a été la séquence
AAVS1 double brin du AAV-2 qui est reconnue pour être spécifiquement liée par la
protéine Rep68. La première expérience visait à vérifier les résultats obtenus par retard sur
gel et à mettre au point les concentrations de protéines à injecter (figures 14 et 15). Le
résultat le plus surprenant fut la liaison spécifique pour la séquence télomérique antisens
(riche en C) par la protéine de fusion MBP-U94B, tandis que la séquence riche en G ne fut
pas liée (figure 15). De fait, 1,37x10-8 M est la valeur d'affinité obtenue pour la liaison de la
MBP-U94B sur l'ADN télomérique antisens. Conséquemment, la séquence télomérique
riche en C du HHV-6 (TRS) est la seule autre séquence à avoir été liée. Par contre, la valeur
d'affinité obtenue pour cette séquence n'est pas significative. Par ailleurs, MBP-U94B
semble être en mesure de lier les séquences télomériques double brin du HHV-6 toutefois,
les valeurs ne sont pas significatives. Quant à la MBP, elle n'a pu lier aucun des ADN
présent à la surface de la puce (figure 14).
55
Figure 14: Expérience de mise au point de la liaison de la protéine MBP à l'ADN
simple et double brin au Proteon™ XPR36
Expérience de mise au point où 5x10-5 μg/μl de 6 oligonucléotides différents biotinylés
ont été liés à la surface de la puce dans du PBS/Tween 0,05% (Séquence AAVS1 pas
présentée). Cette figure présente la liaison de la protéine MBP, le témoin négatif. La
protéine mélangée dans un tampon de liaison a été injectée sur la surface de la puce
pendant 3 minutes selon 6 concentrations différentes soit: 800 nM (rose foncé), 400 nM
(azure), 200 nM (bleu), 100 nM (vert), 50 nM (rose) et 0 nM (orange). Les graphiques et
les valeurs obtenues indiquent que la protéine MBP ne lie aucun des 6 ADN liés sur la
puce.
56
Figure 15: Expérience de mise au point de la liaison de la protéine MBP-U94B à
l'ADN simple et double brin au Proteon™ XPR36
Expérience de mise au point où 5x10-5 μg/μl de 6 oligonucléotides différents biotinylés
ont été liés à la surface de la puce dans du PBS/Tween 0,05% (Séquence AAVS1 pas
présentée). Cette figure présente la liaison de la protéine U94B. La protéine mélangée
dans un tampon de liaison a été injectée sur la surface de la puce pendant 3 minutes
selon 6 concentrations différentes soit: 800 nM (rose foncé), 400 nM (azure), 200 nM
(bleu), 100 nM (vert), 50 nM (rose) et 0 nM (orange). Les graphiques et les valeurs
obtenues indiquent que U94B lie favorablement la séquence télomérique riche en C et
de façon moindre la séquence télomérique double brin.
57
Figure 16: Témoins négatif et positif du test de liaison à l'ADN simple et double
brin au Proteon™ XPR36
Étude de la liaison sur l'ARN de la télomérase et sur l'ADN simple et double brin. Les
oligonucléotides ont été injectés à la concentration de 5x10-5 μg/μl à la surface de la puce
dans du PBS/Tween 0,05%. Cette figure présente les témoins négatif et positif de cette
étude. Les protéines mélangées dans un tampon de liaison ont été injectées sur la surface
de la puce pendant 3 minutes selon 6 concentrations différentes soit: 1 μM (rose foncé),
0,5 μM (azure), 0,25 μM (bleu), 0,125 μM (vert), 0,0625 μM (rose) et 0 μM (orange).
Les graphiques et les valeurs obtenues indiquent que la protéine MBP lie aucune
séquence, tandis que la Rep68 lie fortement la séquence AAVS1 double brin.
58
Le second essai visait à vérifier la liaison des protéines de fusions MBP-U94A et MBPU94B sur l'ARN de la télomérase (TERC) qui est composé d'une répétition CCCTAA
retrouvée en plusieurs copies dans la séquence télomérique riche en C (figures 17 et 18).
Les résultats obtenus confirment la liaison des protéines MBP-U94A et MBP-U94B à
l'ADN antisens des télomères (riche en C). Selon les valeurs obtenues, MBP-U94B est en
mesure de lier cet ADN avec une affinité de 3,43x10-8 M, soit 20 fois plus que la force de
liaison de 1,62x10-7 M de la protéine MBP-U94A pour le même ADN. Autrement, ces deux
mêmes protéines n'ont aucune affinité pour l'ARN de la télomérase, ni pour l'ARN de
séquence aléatoire. L'équivalent en ADN de cet ARN de la télomérase n'est pas lié par les
protéines MBP-U94. Enfin, seul la protéine MBP-U94B a démontrée une affinité pour
l'ADN double brin des télomères de la cellule. En effet, une valeur significative de 6,89x108
M a été obtenue. Cet évènement semble plus rare que la liaison à l'ADN simple brin
lorsqu'on compare la réponse en RU de l'ADN simple brin (309,61 RU) de celle obtenue
pour l'ADN double brin (37,19 RU).
59
Figure 17: Test de liaison de la protéine MBP-U94A à l'ADN simple et double brin
au Proteon™ XPR36
Étude de la liaison sur l'ARN de la télomérase et sur l'ADN simple et double brin. Les
oligonucléotides ont été injectés à la concentration de 5x10-5 μg/μl à la surface de la puce
dans du PBS/Tween 0,05%. Cette figure présente la liaison de la protéine U94A. La
protéine mélangée dans un tampon de liaison a été injectée à la surface de la puce
pendant 3 minutes selon 6 concentrations différentes soit: 1 μM (rose foncé), 0,5 μM
(azure), 0,25 μM (bleu), 0,125 μM (vert), 0,0625 μM (rose) et 0 μM (orange). Les
graphiques et les valeurs obtenues indiquent que la protéine U94A lie la séquence
télomérique riche en C, mais ne semble pas être en mesure de lier l'ADN double brin.
60
Figure 18: Test de liaison de la protéine U94B à l'ADN simple et double brin au
Proteon™ XPR36
Étude de la liaison sur l'ARN de la télomérase et sur l'ADN simple et double brin. Les
oligonucléotides ont été injectés à la concentration de 5x10-5 μg/μl à la surface de la puce
dans du PBS/Tween 0,05%. Cette figure présente la liaison de la protéine U94B. La
protéine mélangée dans un tampon de liaison a été injectée à la surface de la puce
pendant 3 minutes selon 6 concentrations différentes soit: 1 μM (rose foncé), 0,5 μM
(azure), 0,25 μM (bleu), 0,125 μM (vert), 0,0625 μM (rose) et 0 μM (orange). Les
graphiques et les valeurs obtenues indiquent que U94B lie fortement la séquence
télomérique riche en C et de façon significative la séquence télomérique double brin.
61
Dans la seconde expérience, nous avons injecté les mutants K395A de la protéine MBPU94 (figures 19 et 20). D'abord, la protéine MBP-U94A mutée perd la grande majorité de
sa liaison pour l'ADN simple brin. En effet, la réponse en RU maximale est deux fois moins
élevée que pour la protéine sauvage. D'ailleurs, les différentes concentrations de protéine
injectées s'entremêlent ce qui confirme que la réponse en RU n'est pas seulement la
conséquence d'une liaison spécifique. Puis, les valeurs d'affinité obtenues à partir de la
réaction ne sont pas significatives. Ensuite, l'injection du mutant de liaison de la protéine
MBP-U94B a perdu toute activité de liaison pour l'ADN simple brin et l'ADN double brin.
62
Figure 19: Test de liaison de la protéine MBP-U94A mutée à l'ADN simple et
double brin au Proteon™ XPR36
Étude de la liaison sur l'ARN de la télomérase et sur l'ADN simple et double brin. Les
oligonucléotides ont été injectés à la concentration de 5x10-5 μg/μl à la surface de la puce
dans du PBS/Tween 0,05%. Cette figure présente la liaison de la protéine U94A mutée
(K395A). La protéine mélangée dans un tampon de liaison a été injectée à la surface de
la puce pendant 3 minutes selon 6 concentrations différentes soit: 1 μM (rose foncé), 0,5
μM (azure), 0,25 μM (bleu), 0,125 μM (vert), 0,0625 μM (rose) et 0 μM (orange). Les
graphiques et les valeurs obtenues indiquent que la protéine mutée lie sensiblement la
séquence riche en C, bien que les valeurs obtenues ne soient pas significatives.
63
Figure 20: Test de liaison de la protéine MBP-U94B mutée à l'ADN simple et
double brin au Proteon™ XPR36
Étude de la liaison sur l'ARN de la télomérase et sur l'ADN simple et double brin. Les
oligonucléotides ont été injectés à la concentration de 5x10-5 μg/μl à la surface de la puce
dans du PBS/Tween 0,05%. Cette figure présente la liaison de la protéine U94B mutée
(K395A). La protéine mélangée dans un tampon de liaison a été injectée à la surface de
la puce pendant 3 minutes selon 6 concentrations différentes soit: 1 μM (rose foncé), 0,5
μM (azure), 0,25 μM (bleu), 0,125 μM (vert), 0,0625 μM (rose) et 0 μM (orange). Les
graphiques et les valeurs obtenues indiquent que la protéine mutée a perdu sa capacité de
lier l'ADN simple et double brin.
64
Activité ATPase des protéines U94 sur ADN simple brin
La seconde activité biochimique étudiée après avoir vérifié l'activité de liaison à l'ADN est
l'activité ATPase. En effet, puisque les activités hélicase et endonucléase nécessitent
l'apport d'énergie exogène via l'adénosine triphosphate, il est logique de vérifier que la
protéine U94 utilise d'abord cette énergie. L'expérience a déjà été faite pour la protéine
Rep68 par d’autres laboratoires et donc les conditions utilisées lors de ces essais ont été
utilisées (132). La réaction a été faite dans un volume total de 10 μl où 0,2 μg d’ADN
simple ou double brin était mis en présence de la protéine d'intérêt et d'ATP (1,25 x10-7
mmol). Le temps de réaction était délimité par l’ajout d’ATP pour démarrer la réaction et
les échantillons étaient mis sur glace pour la terminer. Le traitement acide-base permettait
de se débarrasser de tout, sauf des nucléotides phosphatés qui allaient être quantifiés et
séparés sur HPLC. Une première expérience a été menée à partir d’ADN simple brin de
nature télomérique riche en G (figure 21). L'essai a aussi été réalisé avec un ADN riche en
C, mais puisque les résultats sont les mêmes, nous ne les présentons pas ici. L'essai
démontre que les protéines MBP-U94A et MBP-U94B utilisent l’énergie de l’ATP
lorsqu’elles sont liées à un ADN simple brin. En effet, près de 20% de l'ATP total est
transformée en ADP par U94. On remarque aussi une faible activité ADPasique donnant
lieu à la formation d'un peu plus de 4% d'AMP. Lorsqu’aucune protéine n’est ajoutée au
milieu réactionnel, il n’y a pas de transformation d’ATP observable, donc aucune
dégradation spontanée de l’adénosine triphosphate (résultats non présentés). Puis, on
observe qu’avec la MBP il y a un niveau de dégradation de base de l’ATP d'environ 10%
qui n’évolue pas dans le temps. Or, l’ATP serait dégradé faiblement, mais sans constituer
une activité intrinsèque de la protéine MBP. Par conséquent, les valeurs obtenues avec les
protéines MBP-U94A et MBP-U94B dépendent seulement de la portion U94 de la protéine
de fusion MBP-U94. Le témoin positif MBP-Rep68 suggère que les conditions de
l’expérience sont celles nécessaires à l’observation d’une activité ATPase pour des
protéines de ce genre et que son activité ATPase est plus importante que U94. De fait, la
transformation de l'ATP en ADP est totale et près de 10% de celle-ci est ensuite convertie
en AMP.
65
Figure 21 : Essais d'ATPase (HPLC) avec un oligonucléotide simple brin
Essais d'ATPase faits avec les quatre protéines de fusion d'intérêts (MBP, Rep68, U94A,
U94B) purifiées et 0,2 ug d'oligonucléotide simple brin (5'-CAGGGTTAGACCTAGG
GTTAGGGTTAGGGCCTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA-3') TRS riche en G. En bref,
0,5 ug de protéine ont été mise en présence d'ADN simple brin dans un tampon de
réaction (50 mM Tris-HCl pH8, 20 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2) et 2,5x10-7 mmol d’ATP
ont été ajoutée pour débuter la réaction. Les temps de réaction étaient de 0, 1, 5, 10, 30,
60 minutes. Les valeurs obtenues pour chaque temps représentent la moyenne de trois
échantillons indépendants. Cette moyenne est soustraite par le niveau de base
d'hydrolyse de l'ATP obtenu par les échantillons sans protéine. Puis, la valeur est divisée
par la quantité d'ATP de départ, multipliée par 100.
66
Activité ATPase des protéines U94 sur ADN double brin
Après avoir vérifié l’activité ATPase des protéines MBP-U94 en présence d'ADN simple
brin, il est intéressant de vérifier si cette activité est aussi possible en présence d’un ADN
double brin. En fait, les deux activités qui nécessitent l’hydrolyse de l’ATP sont
l’endonucléase et l’hélicase. Les expériences menées sur Rep68 et ses activités
biochimiques suggèrent que la protéine doit lier l’ADN double brin pour faire son activité
hélicase et ensuite doit lier l’ADN simple brin pour exercer son activité endonucléase
spécifique à un site simple brin de l’ADN (54, 67, 83, 109, 117). Puisque les résultats de
liaison à l’ADN en retard sur gel démontrent que la protéine U94 lie l’ADN simple et
double brin, on peut s’attendre à ce que la protéine MBP-U94 soit en mesure d’hydrolyser
l’ATP sur ces deux types d’ADN. Une seconde expérience d’ATPase a donc été faite avec
0,2 μg d’ADN double brin du vecteur pcDNA4-HismaxC et de ce même vecteur avec une
séquence TRS insérée (figure 22). L’expérience démontre que MBP-U94A et MBP-U94B
peuvent hydrolyser près de 40% d’ATP en présence d’ADN double brin, mais l’activité ne
semble pas spécifique à la séquence TRS introduite dans le pcDNA4-HismaxC. La protéine
MBP ne semble pas dégrader plus de 20% de l’ATP du milieu, tandis que la présence de la
protéine MBP-U94A fait grimper l’hydrolyse à plus de 40%. Dans le cas de la MBP-U94B,
l’hydrolyse est tout de même plus forte que pour la MBP, mais demeure faible (près de
10% plus que la MBP). Il est important de remarquer que la quantité d’ATP au temps 0 est
inférieure dans les essais avec les protéines MBP-U94 qu’avec la MBP ce qui laisse penser
que la quantité injectée dans la colonne de chromatographie du HPLC était inférieure et
donc les résultats obtenus ne tiendraient pas compte d’un volume de réaction aussi
important que pour la MBP.
67
Figure 22 : Essais d'ATPase (HPLC) avec ADN double brin
Essais d'ATPase faits avec les quatre protéines d'intérêts (MBP, Rep68, U94A, U94B)
purifiées et 0,2 ug du vecteur pcDNA4/hismaxC (Invitrogen) ou du même vecteur avec
une séquence TRS riche en G insérée. En bref, 0,5 ug de protéine était en contact avec
l'ADN dans un tampon de réaction (50 mM Tris-HCl pH8, 20 mM NaCl, 2,5 mM
MgCl2) et 1,25x10-7 mmol d’ATP ont été ajoutée pour débuter la réaction. Les réactions
étaient de 0 et 60 minutes et chaque échantillon était fait en duplicata. Le calcul du
pourcentage se fait à partir de la moyenne du duplicata soustrait du niveau de base de
l'hydrolyse d'ATP obtenu par les échantillons sans protéine. Puis, cette valeur est divisée
par la quantité d'ATP présente au départ dans chaque échantillon, multipliée par 100.
68
Mise au point du protocole d'immunoprécipitation de la protéine Flag-U94A
Dans le but de pouvoir immunoprécipiter U94, le gène a été inséré dans le vecteur
pENTR4-FLAG fusionné avec le vecteur de destination pLentiCMV/TO Puro Dest. Par la
suite, la transfection du vecteur fusionné a permis d’exprimer la protéine de fusion en
grande quantité dans les cellules 293T transfectées. La protéine de fusion Flag-U94B n'a
pas encore été obtenue. Pour ce qui est de l’immunoprécipitation de la protéine Flag-U94A,
elle a été possible grâce à l'anticorps monoclonal de souris anti-FLAG et révélée par le
même anticorps en immunobuvardage. La figure 23 présente l’immunoprécipitation d’un
témoin négatif sans étiquette Flag (pcDNA3.1) et de la protéine de fusion d’intérêt. Dans
chacun des cas, l’extrait total de la lyse cellulaire ainsi que l’immunoprécipitation ont été
vérifiés. Enfin, on peut apercevoir les chaînes lourdes et légères de l’anticorps dans les
fractions immunoprécipitées. Sachant que cet anticorps précipite bien la protéine de fusion
FLAG-U94A,
la
même
construction
sera
faite
avec
la
protéine
U94B.
L'immunoprécipitation de la protéine de fusion FLAG-U94 se révèlera un outil
indispensable
lorsque
viendra
le
temps
d'effectuer
les
expériences
de
co-
immunoprécipitation et d'immunoprécipitation sur la chromatine (ChIP). Ces essais
permettront de connaître d'une part les partenaires cellulaires possibles de la protéine U94
et d'autre part, les séquences d'ADN que U94 lie spécifiquement.
69
1
50 kDa
2
3
4
Bande
non-spécifique
FLAG-U94A
Figure 23 : Immunoprécipitation de la protéine de fusion Flag-U94A
La construction Flag-U94A a été réalisée à partir du vecteur pENTR4-FLAG (Addgene)
et le gène U94A de la souche GS. Le vecteur résultant a été fusionné avec le vecteur de
destination pLentiCMV/TO Puro Dest (Addgene) afin d’exprimer la protéine FlagU94A dans des cellules eucaryotes. Des cellules 293T ont été transfectées par la
méthode Mirus et une immunoprécipitation à partir des lysats cellulaires a été faite.
Enfin un immunobuvardage des extraits totaux [1] (témoin négatif) [3] (Flag-U94A) et
de l’immunoprécipitation [2] (témoin négatif) [4] (Flag-U94A) a été réalisé avec un
anticorps monoclonal de souris anti-Flag (abm) à 1/1000.
70
Alignement des séquences U94 des souches intégrées vs souches de laboratoires
L’ORF U94 a une homologie de séquence nucléique de 97% entre toutes les souches des
deux espèces du HHV-6 ce qui fait de ce gène l’un des plus conservés du virus (35, 57). Au
laboratoire, nous disposons d’échantillons provenant de 5 donneurs ayant la forme intégré
d’HHV-6. En ce sens, nous voulions vérifier si les séquences de l’ORF U94 des souches de
laboratoire (GS, U1102, SIE, Z29 et HST) sont conservées dans les souches intégrées.
Nous avons donc séquencé 3 souches intégrées pour le HHV-6A (PL, Nkvl, 184) et 2
souches pour l’espèce B (Rowick, DL). Par la suite, les séquences ont été alignées avec le
programme CLC Sequence Viewer 6 (résultat non montrés). Nous avons observé aucune
différence entre les séquences de l’ORF U94 des virus intégrés ou de laboratoire, ce qui
permet de penser que les virus intégrés peuvent exprimer la protéine U94. Par conséquent,
il serait envisageable que le virus intégré puisse se réactiver via l’expression de la protéine
U94 et produire après plusieurs années de latence, une infection active.
71
Discussion
Le HHV-6 se distingue des autres herpèsvirus humain par sa capacité à s'intégrer aux
chromosomes cellulaires. Selon les cas reportés et les récentes études on estime que 1% de
la population mondiale aurait une copie de génome viral du HHV-6 intégré par cellule (52,
73, 100, 119, 131). Malgré tout, le mécanisme entourant l'intégration chromosomique reste
un mystère. Sachant que le MDV s'intègre via ses séquences télomériques (61, 105), que
l'ORF U94 distingue, en partie, le HHV-6 des autres herpèsvirus (85) et que la protéine
U94 partage une homologie importante avec la protéine Rep68 du AAV-2 (123), elle-même
responsable de l'intégration de ce virus, nous avons émis l'hypothèse que U94 était
responsable de l'intégration du HHV-6. Pour ce faire, nous pensons qu'elle doit posséder les
quatre activités biochimiques de la protéine Rep68 soit : la liaison à l'ADN simple et double
brin, l'ATPase, l'hélicase et l'endonucléase (54, 97). Dans le cadre de ce projet, nous avons
étudié les deux premières activités biochimiques.
Flag-U94A est localisée au noyau
Notre premier objectif est de démontrer que la protéine U94 est localisée au noyau. Dans le
contexte de l'intégration chromosomique, il est indéniable que U94 doit y avoir accès pour
permettre l'intégration. On sait que la protéine Rep68 possède une séquence NLS à son
extrémité C-terminal qui lui procure sa localisation au noyau. L'alignement entre Rep68,
U94A et U94B ne permet pas d'identifier ce type de séquence NLS pour U94 (18). Par
contre, une étude du laboratoire du Dr. Mori révèle que 48 heures après l'infection de
cellules MT-4 par la souche HST du HHV-6B, U94 est localisée au noyau (87). Pour
s'assurer de l'emplacement de la protéine U94, nous avons entrepris de cloner le gène U94A
avec l'étiquette moléculaire FLAG dans un vecteur eucaryote. Nous avons choisi d'utiliser
un vecteur d'expression, au lieu de l’infection parce que nous ne possédons pas en
laboratoire d'anticorps contre U94A. D'ailleurs, l'expression de la protéine de fusion (FlagU94) et l'immunofluorescence de celle-ci donne une image claire et sans bruit de fond de la
localisation cellulaire. Nos résultats vont dans le même sens que ceux déjà obtenus avec
U94B par d'autres laboratoires (87).
72
Les protéines sont produites en fusion avec la MBP
Sachant que la protéine U94 peut avoir accès au génome cellulaire, nous avons entrepris de
produire en fusion avec la MBP, la protéine U94A et U94B dans un système procaryote.
L'idée d'utiliser ce système nous vient des expériences menées sur Rep68 (24). La protéine
ainsi produite ne perd pas ses activités intrinsèques, est soluble et facile à purifier. En ce
sens, nous avons produit les protéines MBP, MBP-Rep68, MBP-U94A et MBP-U94B. La
première allait servir de témoin négatif dans les expériences sur les activités biochimiques,
tandis que la seconde serait un parfait témoin positif. Certaines conditions expérimentales
ont dû être ajustées pour optimiser l'efficacité de la production protéique: la concentration
d'IPTG pour induire la production, la température de croissance, le temps en culture, la
sonication, la purification, la dialyse et la conservation après production. Les protéines que
nous avons produites ont atteint un degré de pureté élevée tel que démontré sur coloration
au bleu de coomassie. La bande près de 95 kDa correspond à la fusion entre la protéine U94
(50,91 kDa) et MBP (42,5 kDa), tandis que d'autres bandes de poids moléculaires inférieurs
sont visibles. Nous suspectons qu'une fraction de la protéine puisse s'être dégradée. De
plus, les gels ont été faits quelques temps après la production protéique et donc les
protéines furent assujetties à une conservation à -20°C. Il est connu que la conservation des
protéines à une telle température combinée aux cycles de gel-dégel favorisent la
dégradation des protéines (99). Pour ces raisons, nous avons utilisé des aliquots frais lors
des tests biochimiques. Enfin, nous n'avons pas caractérisé l'activité des protéines
dégradées. Il serait intéressant de les caractériser pour comprendre davantage d'où provient
cette dégradation et son effet sur la protéine U94.
Mutagenèse de l'ORF U94 en trois parties et production des mutants
Des études de mutagenèse menées sur la protéine Rep68 ont permis de localiser les
domaines inhérents aux activités biochimiques (128, 129). Nous avons ainsi aligné les
protéines U94A, U94B et Rep68 dans le but de vérifier si ces domaines se retrouvaient
dans la séquence d'U94. L'alignement des protéines démontre que U94 conserve dans sa
séquence les résidus spécifiquement mutés dans les expériences sur Rep68. Par mutagenèse
dirigée nous avons muté l'ORF U94 à trois endroits dans le but d'affecter les quatre
activités biochimiques. Mis-à-part l'activité de liaison simple brin déjà observée par le
73
laboratoire du Dr. Mori, la présence de ces acides aminées ne garantie pas que U94 ait
conservée les activités biochimiques de Rep68 (33). Par conséquent, les mutants obtenus ne
consistent pas en témoins négatifs. Nous voulons vérifier si les mutations imputées à la
protéine auront un effet de perte de fonction dans le cas où les tests biochimiques sont
positifs. L'obtention de ces mutants fut possible à la manière des protéines dites sauvages.
La bande à 95 kDa correspond à la protéine mutée, tandis que les bandes inférieures
semblent être dues encore une fois aux produits de dégradation (figure 10).
U94 A et B lient préférentiellement l'ADN simple brin riche en C et U94B lie l'ADN double
brin des télomères cellulaires.
Le laboratoire du Dr. Mori a déjà décrit que la protéine U94 a la capacité de lier l'ADN
simple brin, sans toutefois démontrer l'existence d'une spécificité pour une séquence
quelconque (33). Toujours selon l'hypothèse que l'intégration chromosomique doit se faire
à partir des séquences TRS virales, nous avons fait des retards sur gel dans les mêmes
conditions que celles décrites dans leur publication, mais en utilisant comme ADN simple
brin des séquences sens et antisens des TRS du HHV-6. Les premier résultats démontrent
que les protéines MBP-U94A et MBP-U94B lient l'ADN simple brin en quantité égale.
Seulement à partir des essais de retard sur gel, les protéines n'ont jusqu'ici démontré aucune
préférence quant à une séquence d'ADN en particulier. Effectivement, elles sont en mesure
de lier les séquences riche en C et riche en G ainsi que la séquence aléatoire utilisée dans
les compétitions hétérologues. Nous avons aussi obtenu un très faible signal de liaison pour
la protéine MBP. Nous pensons que les conditions saturantes du retard sur gel peuvent
provoquer un faible niveau de liaisons non spécifiques entre la protéine et l'ADN. Au final,
ce type de signal nous inquiète plus ou moins puisque la force du signal obtenu avec les
protéines MBP-U94A et MBP-U94B est beaucoup plus importante. Quant à l'activité de
liaison des mutants, elle confirme la spécificité du signal obtenu, puisqu'on obtient une
baisse du signal comparativement aux signaux obtenus avec les protéines sauvages. Par
contre, il est impossible de confirmer à partir des essais EMSA, que la mutation impute la
totalité de l'activité de la protéine U94, puisque le signal résiduel est peut être dû à
l'interaction non spécifique de la portion MBP de la fusion MBP-U94. En bref, les
conclusions à tirer à partir des essais EMSA semblent limités. L'environnement clos ainsi
74
que la présence constante du 1μg de protéines avantage la liaison et ne permet pas de
vérifier s'il y a une différence d'affinité entre les différents ADN.
Par la suite, nous avons effectué des tests de liaison de même nature sur le Proteon™
XPR36. Même si les quantités de protéines et d'ADN utilisées sont semblables à celles
utilisées dans les essais EMSA, l'un des grands avantages de cet appareil réside dans le fait
que les ADN sont assujettis à un courant continu de protéines. Or, les interactions sont
dynamiques et ne sont pas la résultante d'une rencontre obligée constante entre les ADN et
les protéines. Nous avons d'abord effectué une expérience de mise au point avec les
protéines MBP, MBP-Rep68 et MBP-U94B. Lors de cet essai, nous avons ajusté les
conditions pour obtenir les résultats les plus significatifs possibles. Nous avons vérifié la
spécificité de liaison pour la séquence sens (riche en G) et antisens (riche en C). La liaison
à une séquence télomérique double brin a aussi été mesurée. Dans un premier temps, la
protéine MBP, qui consiste en notre témoin négatif de liaison, n'a liée aucun des ADN
présent sur la puce. Par conséquent, une plus grande confiance sera faite aux résultats
obtenus sur le Proteon™ XPR36. Les graphiques de liaison obtenus avec la protéine MBPU94B sont surprenants, puisqu'aucune liaison sur la séquence télomérique cellulaire sens
(TTAGGG) n'a pu être observée. À partir des essais de retard sur gel, nous pouvions penser
que l’affinité était la même pour les deux brins (riche en C et riche en G). Malgré le fait que
la séquence sens ne fut pas liée par MBP-U94B, la séquence antisens contenant 7
répétitions du motif (CCCTAA)7 des télomères cellulaires s'est révélée être le meilleur
substrat de liaison. Pour appuyer ce résultat, la séquence télomérique virale antisens qui
consiste en trois répétitions du motif (CCCTAA)3, mais entremêlée de quelques
irrégularités a été le second substrat à être lié par la protéine MBP-U94B. Ces résultats
suggèrent que plus il y a de répétitions consécutives du motif (CCCTAA), plus forte sera
l'affinité pour cette séquence. Quant aux valeurs d'affinité obtenues pour la séquence
antisens cellulaire, elles ne sont pas valables. L'erreur calculée de 24,58 (Chi2) représente
plus de 10% de la valeur du Rmax (160,22 RU) ce qui fait en sorte que les valeurs calculées
de la réaction ne sont pas significatives. Pour obtenir des valeurs significatives, nous
aurions dû obtenir une courbe d’association qui tend davantage vers l'équilibre de la
réaction. Pour corriger le tir, les concentrations des protéines injectées seront augmentées à
75
1 μM au lieu de 0,8 μM. Pour ce qui est de la liaison sur l'ADN double brin, la quantité de
protéine MBP-U94B qui s'y lie (RU de 20,77) est vraiment inférieure à la séquence simple
brin antisens (RU= 160,22). Par contre, puisque la valeur de l'erreur sur le R max est
inférieure à 10%, on peut conclure que la protéine lie l'ADN double brin de nature
télomérique avec une affinité de 1,08x10-7 M.
Après avoir analysé les résultats de ce premier essai, nous nous sommes questionné sur
l'utilité de lier l'ADN antisens des télomères et sur les implications de cette liaison. En ce
sens, il se trouve que l'ARN de la télomérase contient un motif riche en C (CCCTAA).
Puisque cette enzyme est située aux bouts des télomères, nous pensions que U94 pourrait
interagir avec l'ARN de la télomérase (TERC) et ainsi moduler l’activité de cette enzyme.
Les résultats obtenus avec le témoin positif confirment que les conditions de l'expérience
sont favorables à la liaison à l'ADN pour ce type de protéine. Les graphiques de liaison de
la MBP indiquent que cette protéine est incapable de lier l’un des ADN fixés à la surface de
la puce. Les valeurs obtenues pour la protéine de fusion MBP-U94A confirment les
résultats des essais de retard sur gel, soit que la protéine lie l'ADN simple brin antisens.
Pour ce qui est de l’ADN double brin, elle n’est pas en mesure de le lier dans les conditions
actuelles. Les résultats indiquent aussi que la protéine MBP-U94A ne lie pas l'ARN de la
télomérase, ni son équivalent en ADN. Le fait que la MBP-U94A ne puisse pas lier
l'équivalent en ADN (qui comporte une répétition du motif CCCTAA) suggère que la
protéine peut lier seulement les séquences qui ont plusieurs répétitions consécutives du
motif CCCTAA. Le même constat peut être appliqué à la protéine MBP-U94B qui n'a pas
pu lier l'équivalent en ADN du TERC. L’expérience au Proteon™ XPR36 nous permet
aussi de comparer la spécificité de liaison sur l’ADN simple brin entre la protéine MBPU94B et MBP-U94A. Les résultats indiquent que la protéine MBP-U94B lie plus
facilement l'ADN simple brin que la protéine MBP-U94A. En fait, la réponse maximale
(Rmax) obtenu avec la MBP-U94B est de 309,61 RU comparativement à 195,24 RU avec la
protéine MBP-U94A. D'ailleurs, l'affinité de la liaison est 20 fois plus forte avec la MBPU94B (3,43x10-8) contre (1,62x10-7) avec la protéine MBP-U94A. Pour ce qui est de la
liaison à l'ADN double brin, seulement la protéine MBP-U94B en est capable avec une
affinité de 6,89x10-8 M et un Rmax de 37,19 RU. Cette réponse maximale de la liaison de la
76
MBP-U94B sur ADN double brin nous semble faible. Il semble que la protéine a plus de
difficultés à lier l’ADN double brin que l’ADN simple brin. Cette différence dans la
quantité de liaison à la surface de la puce s’explique selon l’hypothèse qui suit. Les
domaines hélicases associés à la protéine U94B font partie de la famille des hélicases SF3.
Cette famille d’hélicases est connue pour être en mesure de former des complexes de six à
huit protéines, sous forme de cercle, pour exercer leur activité (82). Or, dans le cas où
U94B a réellement une activité hélicase intrinsèque et donc que cette protéine lie l’ADN
double brin pour effectuer cette activité, il est fort probable que U94B doit former un
complexe de 6 à 8 protéines U94B pour lier l’ADN double brin. En ce sens, il est probable
que les conditions pour vérifier cette liaison ne soient pas les mêmes que celles utilisées
dans nos essais. Autrement, il est difficile d'imaginer que U94A et U94B avec leur
homologie de séquence de plus de 98 % interagissent de façon différente en présence
d’ADN double brin. On peut penser que la préparation protéique de la MBP-U94A est
moins conservée l'activité de la protéine. Aussi, il se pourrait que les quelques acides
aminés qui diffèrent entre les deux protéines aient un rôle important dans le repliement et
ainsi pourraient modifier l'affinité pour une séquence donnée. Puisque les conditions de
l’expérience sont très importantes et influentes sur la liaison à l’ADN et que les deux
espèces du HHV-6 ne sont naturellement pas des virus qui infectent les mêmes systèmes du
corps humain, il se peut que nos conditions ne soient pas les bonnes pour vérifier la liaison
de la protéine U94A sur l'ADN double brin.
Enfin, les résultats obtenus avec les mutants de liaison (K395A) des protéines MBP-U94A
et MBP-U94B mettent en lumière davantage de différence entre les deux protéines. Dans
les deux cas, le mutant a causé une perte d'activité de liaison très prononcée, mais cette
perte l'est moins pour le mutant de la protéine MBP-U94A. Cet essai démontre que la
lysine à la position 395 est essentielle à l'activité de liaison des protéines U94A et U94B.
Cette conclusion est valable pour l'ADN simple brin et l'ADN double brin. Pour ce qui est
de la différence entre l'espèce A et B, il est difficile d'expliquer la raison pour laquelle le
mutant de la protéine MBP-U94B a un plus grand effet sur l'activité. De la même façon que
précédemment, il est peut-être question du repliement divergent des protéines U94A et
U94B. D'un autre sens, il se pourrait que les conditions de production protéique du mutant
77
de la protéine MBP-U94B est occasionnés une perte totale de l'activité intrinsèque de la
protéine mutante.
U94A et U94B hydrolysent l'ATP en présence d'ADN simple et double brin
Plusieurs études ont été menées sur l'activité ATPase de la protéine Rep68. Elles révèlent
que l'hydrolyse de l'ATP est beaucoup plus efficace en présence d'ADN simple brin,
puisqu'un maigre 5% d'ATP est dégradé en absence d'ADN (132, 133). Quant à la protéine
U94, aucune expérience n'a encore été faite sur cette activité. À partir de l'alignement des
deux protéines, nous supposions que U94 a les domaines nécessaires pour utiliser l'ATP. En
plus, maintenant que nous avons démontré son activité de liaison à l'ADN, nous avons plus
de chances de mesurer une activité ATPase. De fait, nous sommes parvenu à démontrer que
les protéines MBP-U94A et MBP-U94B ont une activité ATPase en présence d'un ADN
simple et double brin. Par contre, il semble que l'activité mesurée pour les protéines MBPU94A et MBP-U94B dans les essais avec l'ADN double brin soit sous estimé. En effet, la
quantité d'ATP présente au temps 0 est inférieure à la quantité utilisée pour l'essai. On peut
ainsi supposer que la quantité d'intermédiaire phosphatés mesurés correspond à une fraction
du volume total. C'est pour cette raison, que l'activité de la protéine MBP-U94B n'est pas
beaucoup plus élevée que le niveau de base obtenue avec la MBP qui est favorisée par une
quantité de près de 100 % d'ATP mesurée au départ. Autrement, cet essai fait à partir du
vecteur pcDNA4-HismaxC démontre que la présence d'une séquence TRS ne favorise pas
l'hydrolyse de l'ATP. Pour être en mesure d'élaborer davantage sur la nature de l'ADN
favorisant l'activité, des essais avec différents ADN simple brin s'imposent. Aussi, il serait
intéressant de vérifier le niveau d'activité en absence d'ADN.
Immunoprécipitation de la protéine FLAG-U94A, un outil indispensable
Les résultats que nous avons obtenus quant aux activités de liaison et d'ATPase ont été
faites avec des protéines purifiées. Si ces activités sont intrinsèques à U94, rien n'est aussi
certain pour les activités d'hélicase et d'endonucléase. Du moins, la présence des domaines
Walker A, Walker B, B' et C, communes aux hélicases SF3, dans la séquence de U94
permet de penser que l'activité hélicase sera aussi intrinsèque à la protéine. L'idée que la
protéine U94 puisse interagir avec des protéines cellulaires a été soulevée dans certaines
78
publications (8, 33, 87). Dans ce contexte, la construction de la protéine de fusion à partir
de l'étiquette FLAG et de la protéine U94 devient donc un outil important dans l'étude des
interactions protéine-protéine. L'emploi d'un vecteur d'expression a été privilégié à
l'infection de cellules puisque la protéine U94 est peu exprimée pendant l'infection, ce qui
réduirait grandement nos chances de la détecter. Par conséquent, nous avons employé la
méthode de transfection pour insérer le vecteur dans les cellules. Nous avons utilisé les
cellules 293T puisqu'elles sont facilement transfectables en comparaison avec les HSB2 ou
les MOLT3; des cellules facilement infectables par le HHV-6A et le HHV-6B
respectivement. Grâce à cet outil, une expérience de co-immunoprécipitation permettrait de
connaître les partenaires cellulaires d'U94 et d'étudier leur rôle potentiel dans les activités
biochimiques de la protéine. En effet, il est possible que par l'interaction avec un partenaire,
U94 puisse être beaucoup plus spécifique pour un site de liaison. Dans le cas où U94 joue
un rôle dans l'intégration chromosomique, il est fort possible qu'elle puisse interagir avec
des protéines humaines associées aux télomères.
Par ailleurs, cet outil moléculaire sera d'une utilité fort appréciable pour cibler les
séquences liées par la protéine. Une expérience d'immunoprécipitation sur la chromatine
permettrait de connaître les séquences liées par U94 dans un contexte cellulaire. Ensuite,
ces séquences pourraient être incorporées aux essais biochimiques.
Aucune différence entre les souches intégrées et non intégrées
Le gène U94 est conservé à plus de 97% entre les deux espèces du HHV-6 (35, 57). Par
ailleurs, on sait aussi qu'il diverge de moins de 0,2 à 0,6% entre les différentes souches
d'une même espèce (102). Après avoir séquencé l’ORF U94 de 5 souches intégrées du
HHV-6 et comparé avec les souches de laboratoire non intégrées, nous arrivons à la
conclusion qu’aucune différence ne permet de les départager. On peut alors supposer que le
virus intégré est en mesure d’exprimer la protéine U94 complète, de la même façon que
tout autre gène présent dans le génome viral. Par conséquent, il serait possible que le virus
puisse se réactiver via l’activité de la protéine U94. Par contre, reste à démontrer que la
réactivation est possible, que la protéine U94 joue un rôle dans la réactivation du virus et
que l’ORF U94 est exprimé lors de celle-ci.
79
Conclusions et perspectives
L'herpèsvirus humain de type 6 est le seul virus de la famille des Herpesviridae humain à
s'intégrer aux chromosomes des cellules. Des observations cliniques permettent de croire
que le ciHHV-6 serait associé à une augmentation des rejets de greffes solides et des
infections bactériennes post-transplantation (72). De plus, les taux anormalement élevés
d'ADN viral dans le sang due au HHV-6 intégré serait trop souvent confondus avec une
infection active, menant à de mauvais diagnostiques (51). Pour être en mesure de mieux
comprendre les effets de l'intégration du HHV-6, la lumière doit être faite sur son
mécanisme.
Dans un premier temps, nous nous sommes intéressé à la localisation cellulaire de la
protéine. Dans le contexte de l'intégration chromosomique, l'emplacement de la protéine
U94 revet un élément cruciale. En effet, à quoi bon découvrir que la protéine est en mesure
d'effectuer les activités biochimiques, si elle n'est pas localisée dans le même compartiment
que le génome cellulaire. Une première étude avait démontrée lors d'une infection que la
protéine U94 était localisée au noyau (87). Nos résultats confirment cette étude et appuient
l'hypothèse d'un rôle potentiel de la protéine dans l'intégration.
Dans un second temps, nous avons vérifier les activités biochimiques de la protéine in
vitro. La capacité de la protéine U94 a lier l'ADN simple brin avait déjà été révélée par
l'étude du Dr. Dhepakson (33). L'idée selon laquelle le HHV-6 pourrait s'intégrer via les
séquences télomériques virales et cellulaires nous a amené à vérifier la liaison de la
protéine sur ces séquences. Nos résultats démontrent que les protéines U94A et U94B lient
fortement les séquences antisens (CCCTAA) des télomères cellulaires. Cette liaison semble
dépendre du nombre de répétition consécutives du motif (CCCTAA) puisque la liaison
d’un ADN composé d’un seul motif est impossible. Quant à l'activité de liaison sur l'ADN
double brin, la protéine U94B a démontré une forte affinité pour ce type de substrat. À
l’inverse, la protéine U94A ne semble pas lier l’ADN double brin comme le démontre les
essais EMSA et l’appareil XPR36. À partir des résultats de liaison sur l'ADN simple brin,
nous nous sommes demandé si les protéines U94 pouvaient lier l’ARN de la télomérase,
80
puisque celui-ci contient une répétition du motif (CCCTAA) et que cet enzyme est localisé
aux bouts des télomères. Aucune liaison n’a pu être observée sur cet ARN. Au regard de
ces résultats, nous nous permettons d'émettre quelques hypothèses de recherche. Une étude
menée sur des protéines cellulaires liant de façon spécifique les séquences riches en C
(CCCTAA)n suggère que ces protéines jouent un rôle dans la régulation de la télomérase
(70). En liant le brin antisens, ces protéines pourraient déformer la structure aux extrémités
des télomères et ainsi moduler l’activité de la télomérase. En ce sens, il serait intéressant de
vérifier l’activité de la télomérase dans des cellules transfectées avec U94.
Nous avons aussi déterminé que la protéine U94 pouvait utiliser l'énergie de l'ATP
lorsqu'elle était en présence d'ADN simple et double brin de n'importe quelle nature. Par
contre, d'autres essais devront être faits pour mesurer l'impact de la nature de la séquence
en ADN sur l'activité ATPase. Ce résultat permet de penser que la protéine puisse effectuer
l'activité hélicase. En effet, la séquence d'U94 indique qu'elle est composée de tous les
domaines des hélicases SF3 nécessaires à cette activité soit: Walker A, Walker B, B' et C
(116). Des essais hélicases sur l'ADN double brin complet ou avec des extrémités simple
brin permettront de vérifier ces observations. Aussi, il sera important de constater le sens
dans lequel cette activité est possible (5'-3' et 3'-5').
Quant à l'activité endonucléase, il semble que pour la protéine Rep68 cette activité soit
spécifique à une séquence très restreinte, la séquence AAVS1. Par conséquent, nous
croyons qu'un essai d'immunoprécipitation sur la chromatine (ChIP) avec la protéine
FLAG-U94 permettrait d'abord de connaître les séquences liées spécifiquement par U94
pour qu'ensuite celles-ci soient utilisées dans des tests d'endonucléase.
Il est important de garder en mémoire qu'il est possible qu'U94 nécessite l'aide de
partenaires cellulaires et/ou viraux pour permettre l'intégration. En ce sens, tel que
mentionné dans l'introduction, l'expérience du Dr. Dhepakson démontrait que l'ajout
d'extrait cellulaire de cellules Supt1 favoraisait l'activité de liaison au simple brin (33). De
fait, il serait intéressant de faire une co-immunoprécipitation de la protéine U94 en contexte
cellulaire pour vérifier si elle interagit avec des protéines de la cellule. Le développement
81
d'un anticorps contre U94 capable d'immunoprécipiter sa cible serait nécessaire à la
découverte de protéines virales qui interagissent avec U94.
L'élaboration d'un mutant du HHV-6 délétant de l'ORF U94 permettrait de vérifier si le
virus peut s'intégrer, se répliquer, voir infecter une cellule. Pour se faire, la méthode de
mutagénèse En passant décrite par le Dr. Osterrieder (125) serait utilisée. En distinguant les
cellules intégrées des cellules avec épisomes par la méthode du gel de Gardella, il serait
possible de vérifier l'effet causé par l'absence de l'ORF U94.
L’ensemble de ces expériences permettront de mieux comprendre le rôle biologique de la
protéine U94 dans le contexte de l’intégration chromosomique. De façon plus générale,
l’étude de la protéine U94 pourrait permettre d’élucider le mécanisme de l’intégration
chromosomique du HHV-6. Ultimement, nous pourrons comprendre l’utilité de
l’intégration chromosomique dans la biologie du HHV-6.
82
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