UE8-Médecine-Génome-Analyse des chromosomes

UE8-Médecine-Génome-Analyse des chromosomes Pr Rochette
Tutorat PACES Amiens 1
Analyse des chromosomes
I) Le caryotype classique
Permet voir gros remaniement avec les K
Ex : utilise cette méthode pour diagnostic trisomie 21
1) Extraction des chromosomes
A certains nb de condition à respecter pour caryotype :
- Se fait sur lymphocytes le plus souvent (récupérer par prise de sang)
- Doit traiter les cell et doit les avoir en cours de division cellulaire
Pour avoir accès à l’analyse des K entier, besoin de nombreuse métaphase et de bonne qualité
Pour avoir de bonne métaphase, cell = traiter
Les mets ds milieu de culture (proche des conditions humaines), introduit ds milieu une lectine qui a très fort
pouvoir mitogène (phytohémagglutinine ou PHA) pour permettre stimulation de la croissance des lymphocytes T
Pour avoir métaphase, va bloquer les cellules en métaphase grâce colchicine (empêche polym des tubulines
donc formation du fuseau mitotique)
Si veut faire caryotype du fœtus, récupère des cellules du liquide amniotique car = cell du bébé
Peut mettre en évidence que de grosse délétion et grosse insertion
Quand à commencer culture cell en présence de lectine, doit arrêter la mitose pour que K reste visible
Empêche K d’aller aux 2 extrémités de la cell en cassant la cell avec agent de lyse cellulaire tout en respectant
l’intégrité des K
Quand a lyser cell, tout contenu cellulaire = libérer, prend pipette et étale K sur lame de verre, K reste groupés et
peut mettre colorant pour bien individualiser les K du reste
2) Identification des chromosomes
Ex : par coloration au Giemsa pour colorer ADN en bleu
Quand coloration = jugé suffisante, à une série d’intensité et à région K très intensément coloré et d’autre plus pale
qui forme bande
Bande sont spé de chaque K ce qui permet id d’un K par rapport à un autre
Elles ont chacune un contenu spé en ADN
Traite les K pour marquer encore plus les bandes, en dénaturant par enzyme et d’autre par chaleur pour augmenter
les différences :
- Bande G obtenues par dénaturation enzymatique
- Bandes R par dénaturation thermique
= technique qualitative permettant ainsi un repérage complémentaire
Pour 1 K, peut id jusqu’à 600 bandes
Peut aussi ajouter colorant spé de certaines régions du K
Ex : région qui code ARN des ribosomes = repérés facilement
Peut aller en pro-métaphase et observe encore plus de bande
3) Classification des chromosomes
Les K sont classés, regarde les K au microscope, prend en photo puis découpe pour ranger les K par paire
Quand à fait ça, peut examiner photo avec plus de précision, les numérotes, …
Mais cette technique ne se fait plus car trop possibilité d’erreur et en plus c’est long

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La taille des K varie aussi en fonction des numéros (1 très grand, 22 tout petit)
Quand à repérer bandes pour savoir exactement ds quelle zone du K on est, a nomenclature internationale installé
Quand parle du bras p d’un K = bras court et q = bras long
Ex : 6p12
= région située sur chromosome 6, sur le bras court, et = 2e bande de la région 1
Caryotype sert à :
- Compter (normalement 2 par paire)
- Regarder si un K = raccourcit ou allonger
Étude grossière mais permet diagnostic d’une anomalie de nombre ou de la qualité (ex : translocation)
Exemple :
Si prend maladie génétique qui n’affecte que individu sexe masculin, femme = porteuse anomalie, et homme peut
porter gène hémophilie
Pour raison génétique, si sait anomalie génétique ds famille, sait que la proba que enfant = malade = ½ si le frère =
hémophile
Fait caryotype et avec caryotype à sexe :
- Si fille pas malade
- Si homme = risque malade et donc fait analyse plus profonde
4) Limites
La résolution d’un caryotype, cad erreur que l’on peut mettre en évidence, est celle d’1 bande
Cad peut voir si il y a une bande en plus ou en moins soit environ 5 à 10 millions de pb
Pas très précis, mais peut faire diagnostic facile
Rqe : ce n’est pas la taille de la mutation qui fait la gravité de la maladie
Pas forcément parce que manque beaucoup matos que très pathogène
II) FISH (Fluorescence in situ hybridization)
1) Généralité
Utilise des sondes nucléiques dont la spécificité = variable
Peuvent être utilisés conjointement en grand nombre
Elles sont fluorescentes en présence d’un dispositif d’observation spécifique et un marqueur approprié qui sera
révélé par un anticorps dirigé contre ce même marqueur
Fluorescence = choisit pour repérer région ADN et composé fluo = prot modifié repéré grâce anticorps
Et union des protéines de cette façon = fluorescent
Peut faire la FISH à différent stade de la division cellulaire
Ce qui permet de s’affranchir de la culture sans trop les traiter car comme pouvoir résolution = meilleur, a besoin
moins cell
Donc sonde on longueur variable et doit choisir les régions que l’on veut examiner car si veut tout examiner, peut
pas tout interpréter
Se débrouille pour que signal = visible en microscope à fluorescence  doit avoir hybridation de plus de 150kb pour
permettre une observation
Comme = discriminatif et que recherche liaison sur 1K, pas besoin avoir multitude de chose, ce qu’on veut = noyau
entier

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2) Principe
D’un côté a cible, et de l’autre à sonde
Les 2 doivent être simple brin pour hybrider
Sonde = marquer avec prot qui est elle-même éclairer par un fluorochrome
Dénature les 2 et se débrouille pour les mettre ds des conditions ou par complémentarité, va hybrider avec ADN que
l’on veut étudier
Quand l’hybridation aura eu lieu, si mets un anticorps capable reco la prot qui contient le fluorochrome, a émission
lumière qui dépend de la couleur que l’on a choisi
Fluo ne se fera que si hybridation de 2 brins ADN (cible + sonde)
Exemple :
Chromosome Philadelphie = K chimérique, = K spé d’une leucémie
Accident moléculaire = translocation = passage d’un K9 au K22
Ds la leucémie myéloïde chronique, on aperçoit un petit K anormal = K Philadelphie résultant transposition partie
distale du bras long du K9 (gène Abl) à la place de la majeur partie du bras long du K22 (gène Bcr)
A la limite de ces 2 parties de K, à gène qui se forme qui comprends exon 1 à 14 de Bcr et de 2 à 11 du gène Adl
Gène fonctionne et prot résultante = 210kDa qui comporte domaine tyrosine kinase normalement contrôlé par le
promoteur et les exons 1 du gène Abl
Du fait du remaniement, contrôle se fait sous dépendance du gène Bcr, ce qui entraine l’absence de contrôle de la
prot tyrosine kinase permet activation cascade et prolif des lymphocytes
Leucémie
Sonde verte indique présence gène Bcr et rouge = présence gène Adl
= sur K différent (9 et 22)
A aussi autre point lumineux = situation patho ou sonde verte et rouge = mélangé  les 2 gènes = côtes à côtes

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3) Mécanisme moléculaire
D’un point vu moléculaire, extrémité du bras long du K9,
contient gène Abl
Sur K 22, à autre gène
Les 2 gènes se sont rassemblés et obtiens un nouveau K 
échange déséquilibré
Niveau des séquences des gènes, a fusion des rectangles rouge
Le domaine de la protéine qui contrôlait phosphorylation des
tyrosines est sous influence du nouveau gène
Dérégulation de la prot tyrosine kinase
Leucémie
Grâce à technique FISH, peut mettre en évidence mutation de
ce type
Applications :
Utilisation qui sont les mêmes que le caryotype :
- Nombre de K
- Diagnostic prénatal
- Anomalie chromosomique associé au cancer
- Diagnostic préimplantatoire
- Peut faire un examen des ovocytes et spz pour fécondation in vitro
Va plus vite avec FISH car est plus rapide et plus précis que le caryotype et ds grossesse à risque, on a besoin d’aller
vite donc utilise plus facilement la FISH
FISH = plus résolutive que le caryotype, plus rapide et plus fiable
III) La CGH array (hybridation génomique comparative)
1) Généralité
Méthode basé sur hybridation a nouveau
Va hybrider un génome entier par rapport à un génome de référence
Méthodes permet d’être plus précis encore que FISH
Se fait aussi sur personne saine pour témoin
= « caryotype moléculaire »
Utilise principe de puce pour comparer les ADN d’individu normaux et individu atteins de telle ou telle maladie
Peut utiliser des K entiers pour témoins, ou des séquences d’oligonucléotides
2) Principe
L’Homme a 2n K et donc matériel à examiner se trouve sous 2 exemplaires
Nb de copies d’une région d’ADN peut varié d’un individu à autre et variation peuvent être resp d’une maladie
Peut avoir région dupliqué, tripliquer, …
Mais peut aussi perdre matos génétique = délétion
Utilise méthode qui va renseigner sur le nb de copie du nb de délétion K
Ne peut mettre en évidence que perte ou gain de matériel génétique, si même quantité, ne peut pas le voir
Mais problème, peut mettre évidence augmentation/diminution matériel, mais pas pour autant dire où ça se situe
exactement

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a) Avec chromosome témoins
Va utiliser des sondes fluorescente et ADN de la région chromosomique d’un individu en vert, pour le témoin = en
rouge
Pour ça dispose K bien étaler fixer sur un support
Ce mets ds cas fréquent pour savoir si tumeur est due à augmentation du matos génétique des cell = cell tumorale
ou si cell tumorale ont dégénéré par perte matos génétique
Extrait d’une cell tumorale l’ADN, marque sonde pas fluorescéine qui marque en vert = ADN totale d’une celle
tumorale d’un organe
Extrait aussi l’ADN total d’une cell non tumorale qui sera marqué en rouge
Quand marquage = réaliser, prend sonde et hybride ADN puis regarde le résultat final :
 Si totalité d’ADN des séquences = la même ds les cell, aura pas de reste, pas de couleur
 Si a résultat vert (= vert en excès)  gain de matériel génétique pour la cell tumorale
 Si a résultat rouge (= rouge en excès)  perte de matériel génétique pour la cell tumorale
K en métaphase = sur puce, et hybride
Si trouve beaucoup de rouge  manque du vert, cad cell tumorale a perdu ADN
Si à vert en excès  manque du rouge, cad cell tumorale a gagné ADN
Si parfaite égalité de qADN de chaque séquence, à mélange
Sonde verte provient ADN tumorale, rouge vient cell non tumorales
Mélange vert + rouge = orange
Technique permet de détecter si quantité ADN est augmenter ou diminuer
C’est surtout une question sur la quantité de l’ADN, l’endroit de là où ça s’est passé n’est pas immédiat
Si a eu translocation, ne le verra pas non plus
C’est exclusivement quantitatif ici
Exemple d’utilisation dans les cancers :
 Si le nombre de copies est augmenté dans les cellules tumorales, la sonde tumorale marquée en vert s'hybridera
préférentiellement et le segment de chromosome apparaitra en vert.
 Si le nombre de copies est diminué dans les cellules tumorales, la sonde de tissu sain s'hybridera
préférentiellement et le segment de chromosome apparaitra en rouge.
 Si le nombre de copies n'est pas modifié, les deux sondes s'hybrideront en quantité équivalente et le segment de
chromosome apparaitra en orangé.