Effet de l`élafine sur le cancer du pancréas

Effet de l’élafine sur le
cancer du pancréas
Léa MARTY, Elodie LASSERRE, Fatima EL ALAOUI
REMERCIEMENT
Nous souhaitons dans un premier temps remercier Remy POUPOT. Merci pour ses conseils
avisés, le temps qu’il a su nous consacrer, que ce soit à l’aéroport ou dans notre antre le mardi
soir, malgré son emploi du temps si chargé. Nous le remercions également pour les contacts
qu’il a pu nous faire partager.
Nous remercions Laurence NIETO pour ses conseils lors des différentes présentations orales.
Nous remercions Nathalie VERGNOLLE, qui a su répondre à nos questions concernant notre
publication de départ.
Nous remercions Pierre CORDELIER, passionné par son travail, pour le temps qu’il nous a
accordé et tous les renseignements qu’il a pu nous fournir sur l’ensemble du projet.
Enfin nous remercions Laurent PAQUEREAU, qui nous a permis d’intégrer ce Master, qui
est vraiment enrichissant à tous les niveaux. Nous le remercions d’avoir tout fait pour que nos
conditions d’études soient les meilleures et d’avoir été à l’écoute pendant ces quatre derniers
mois.
Merci à tous les professeurs, Vincent ECOCHARD, Éric CLOTTES, Samuel TRANIER,
François COUDERC et Pascal DEMANGE pour la qualité d’enseignement fourni. Ensemble,
ils ont participé à notre épanouissement intellectuel et scientifique.
Pour finir, merci aux étudiants EGPR : le groupe des timides, le groupe c’est pas sorcier, le
grenoblois, le canadien, l’égyptien et les petits fantômes, sans qui ces quatre mois n’auraient
pas été les mêmes. Merci pour votre aide et vos conseils concernant le projet.
Résumé
L’adénocarcinome canalaire pancréatique demeure une maladie incurable, en l’absence de
symptômes spécifiques, de méthode de diagnostic précoce et de traitements efficaces. La prise
en charge des patients atteints de ce cancer n’a que très peu évolué depuis plusieurs
décennies. Les traitements actuels se traduisent par des bénéfices cliniques très modestes
notamment concernant les patients diagnostiqués avec des maladies avancées (métastatiques)
en raison de la très forte résistante aux traitements des tumeurs. Il a été largement démontré
que le microenvironnement tumoral, ou stroma, jouait un rôle majeur sur la croissance et
l’invasion tumorale. Ce stroma représente 90% du volume tumoral. Il a une structure,
complexe et dynamique, caractérisée par une matrice extra cellulaire dense et par une
composante cellulaire. Les différents types de cellules du microenvironnement, dont les
granulocytes neutrophiles, produisent des groupes spécifiques de protéases. Ces granulocytes
contiennent quatre types de granules dont une produisant l’élastase neutrophile. Elle est une
enzyme capable de dégrader différents substrats. Il existe plusieurs inhibiteurs de cette
protéase trouvés à ce jour et l’élafine en fait partie. Celle-ci est sécrétée par les cellules
épithéliales et joue un rôle important dans les réponses immunitaires et inflammatoires.
Récemment, il a été montré que l’élafine jouait aussi un rôle dans le cancer. Notre projet est
donc de caractériser l’effet de l’élafine dans l’adénocarcinome canalaire pancréatique et son
microenvironnement.
Abréviations
PDAC : adénocarcinomes canalaires pancréatiques
ECM : extracellular matrix
CAF : cancer associated fibroblasts
ROS : Reactive oxygen species
NE : neutrophile elastase
TGF β: Transforming growth factor beta
PI3K : phosphoinositide 3-kinase
MMP : métalloprotéases matricielles
VEGF : Vascular endothelial growth factor
PNN : Polynucléaires neutrophiles
CXCL16 : Chemokine (C-X-C motif) ligand 16
CTL : Cytotoxic T lymphocytes
PR3 : proteinase 3
SKALP : skin-derived antileukoprotease
ESI : elastase specific inhibitor
PI3 : peptidase inhibitor 3
SCID : severe combined immunodefeciency
Gly : glycine
Gln : glutamine
Asp : aspartate
Pro : proline
Val : valine
Lys : lysine
WAP : Whey Acidic Protein
LPS : lipopolysaccharide
TLR : Toll-like Receptor
SDRA : syndrome de détresse respiratoire aiguë
LPA : lésion pulmonaire aiguë
HMEC : Human Mammary Epithelial Cells
C/EBP β: CCAAT/enhancer binding protein beta
HBSS : Hanks' Balanced Salt solution
FISH : fluorescence in situ hybridization
NBT : Nitrobleu de tetrazolium
FITC : fluorescéine isothiocyanate
rtTA : trans-activateur tétracycline
TRE : Tet Response Element
ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay
TUNEL : Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling
MCTS : Multicellular Tumor Spheroid
Table des matières
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE ...................................................................................................... 14
I)
PHYSIOPATHOLOGIE ET TRAITEMENTS DU CANCER DU PANCREAS ........................................ 14
II)
MICROENVIRONNEMENT DU CANCER DU PANCREAS .............................................................. 18
1.
Le stroma ............................................................................................................................... 18
2.
La matrice extracellulaire ...................................................................................................... 20
3.
L’élastase neutrophile (NE) ................................................................................................... 22
III)
ELAFINE.................................................................................................................................. 24
1.
La découverte ........................................................................................................................ 24
2.
Rôles dans l’inflammation et dans les réponses immunitaires ............................................. 26
Présentation d’un article ....................................................................................................................... 28
3.
Rôles dans le cancer .............................................................................................................. 40
NOTRE PROJET....................................................................................................................................... 42
I)
Expression de l’élafine dans le pancréas ................................................................................... 42
1.
Localisation de l’élafine ......................................................................................................... 42
2.
Quantification de l’élafine ..................................................................................................... 44
II)
Effet de l’élafine sur la mort cellulaire programmée ................................................................ 46
1.
Expression de l’élafine dans les lignées cellulaires tumorales pancréatiques ...................... 46
2.
Essai de prolifération ............................................................................................................. 46
3.
Essais d’apoptose .................................................................................................................. 48
4.
Activation des caspases ......................................................................................................... 48
5.
Choix du modèle.................................................................................................................... 48
III)
Les Sphéroïdes ....................................................................................................................... 52
1.
Formation des sphéroïdes ..................................................................................................... 52
2.
La viabilité des sphéroïdes .................................................................................................... 52
3.
Localisation de l’élafine ......................................................................................................... 54
4.
Mesure de l’activité élastolytique ......................................................................................... 54
5.
Présence des métalloprotéases MMP 8 et 9 dans le microenvironnement ......................... 54
6.
Caractérisation des sphéroïdes ............................................................................................. 54
CONCLUSION ......................................................................................................................................... 56
BIBLIOGRAPHIE ...................................................................................................................................... 58
Figure 1 : Anatomie du pancréas [1].
Le pancréas est situé en arrière de l’estomac et est composé de trois parties : la tête qui est encadrée par le duodénum, le
corps et la queue. Le tout est traversé par le canal de Wirsung, qui collecte les sucs digestifs pour les déverser dans le
duodénum.
13
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
I) PHYSIOPATHOLOGIE ET TRAITEMENTS
DU CANCER DU PANCREAS
Le pancréas est un organe du système digestif qui est enfoui profondément dans
l’abdomen, se situant derrière l’estomac et à proximité d’un réseau dense de vaisseaux
sanguins. Il mesure environ 15 cm de long pour un poids de 70 à 100g. C'est un organe
allongé qui comporte trois parties : la tête, le corps et la queue. La tête désigne la partie du
pancréas au contact direct avec l'intestin, elle se prolonge par le corps. Puis la queue du
pancréas est à la gauche de l'abdomen et à proximité d'un autre organe, la rate. L'intérieur du
pancréas est parcouru par un réseau de canaux qui sert à transporter le suc pancréatique. Ces
canaux rejoignent un canal principal qui traverse toute la longueur du pancréas, le canal de
Wirsung (Figure 1) [2].
Le cancer du pancréas apparaît lorsque des cellules de celui-ci se développent et se
multiplient de manière anarchique et incontrôlée jusqu’à former une tumeur maligne. La
plupart des tumeurs se situent sur la tête du pancréas, partie de l’organe proche de l’intestin.
Plusieurs facteurs de risque sont aujourd’hui évoqués dans la genèse de ce cancer, en
particulier le tabagisme (risque multiplié de 2 à 3 fois). Le diabète de type II, l’alcool,
l’obésité et le régime alimentaire riche en matières grasses sont également incriminés. Les
personnes qui ont été atteintes de pancréatite chronique ont une forte disposition au
développement du cancer du pancréas. Si cette pancréatite est sporadique, l’incidence est
multipliée par 20 et si elle est d’origine génétique, cette incidence est multipliée par 50.
Environ 10% des cas de cancer du pancréas sont héréditaires mais les gènes impliqués n’ont
pas encore été identifiés [3].
Les symptômes d’un cancer du pancréas apparaissent le plus souvent tardivement, lorsque la
tumeur s’est développée en dehors du pancréas. Les symptômes possibles ne sont pas
spécifiques de ce cancer et peuvent avoir d’autres causes. La plupart du temps, ils se
manifestent par des douleurs fortes et persistantes derrière l’estomac ou au niveau du dos. Les
douleurs sont particulièrement plus fortes lorsque le cancer est localisé au niveau de la queue
du pancréas.
Figure 2 : Traitements du PDCA [3].
Le seul traitement curatif de ce cancer est la chirurgie. Elle est possible dans 10 à 20% des cas. Si la tumeur est irrésécable
(30 à 40% des cas), un protocole de chimiothérapie suivi d’une radiothérapie est mis en place. Pour ce qui est de l’apparition
de métastases (50 à 60% des cas), le traitement choisi est la chimiothérapie palliative[3].
15
Des troubles de la digestion peuvent également survenir et une jaunisse apparait parfois
accompagnée de démangeaisons. Ces derniers signes sont plus fréquents pour un cancer se
développant à la tête du pancréas [3].
Il existe plusieurs types de cancer du pancréas, les tumeurs exocrines représentent environ
85% et les tumeurs endocrines environ 15% des cancers [4].
Parmi les cancers du pancréas exocrine, les adénocarcinomes canalaires pancréatiques ou
PDAC, sont de loin les plus fréquents et les plus graves. Ils touchent le plus souvent la tête du
pancréas et se développent à partir des cellules qui produisent le suc pancréatique, nécessaire
à la digestion des aliments. Ils surviennent principalement entre 60 et 70 ans avec une
incidence plus élevée chez l’homme. Ils représentent 90% des cancers du pancréas
diagnostiqués [3]. Le PDAC est la quatrième cause de décès par cancer dans les pays
occidentaux, avec une incidence annuelle estimée à plus de 10 000 nouveaux cas en France en
2010 [5].
Le pronostic du PDAC est très sombre et s’explique par un diagnostic tardif dû à une
expression clinique asymptomatique de la maladie. La plupart des patients présentent alors un
envahissement loco-régional ou même métastatique. L’unique traitement curatif est la
chirurgie qui n’est possible que dans 10 à 20% des cas. Elle consiste à retirer la partie du
pancréas sur laquelle la tumeur s’est développée. Lorsque la chirurgie n’est pas possible et
que le cancer est localement avancé, dans 30 à 40 % des cas, le traitement principal est une
chimiothérapie. En fonction du stade du cancer et de l’état de santé, différents protocoles de
chimiothérapie associant un ou plusieurs médicaments peuvent être proposés pour ralentir
voire arrêter la progression du cancer. Une radiothérapie est aussi parfois associée à ce
traitement, on parle de radiochimiothérapie. Dans le cas où il y a formation de métastases, 50
à 60% des cas, une chimiothérapie palliative est mise en place (Figure 2). Lorsque la tumeur
perturbe le passage des aliments ou l’écoulement de la bile et qu’elle ne peut être retirée par la
chirurgie, il est souvent nécessaire de poser une prothèse [3].
Malheureusement, ces tumeurs présentent souvent une résistance à tous les traitements
précédemment cités. En effet, la survie moyenne à 5 ans est de 5% et en cas de chirurgie
suivie de chimiothérapie, elle est de l’ordre de 20% [3]. Il est donc urgent de rechercher de
nouvelles options thérapeutiques pour ce cancer. Il a été largement démontré que le
microenvironnement tumoral jouait un rôle majeur sur la croissance et l’invasion tumorale, de
même que sur la résistance aux chimiothérapies [6].
Figure 3 : Interactions tumeur-stroma dans le cancer du pancréas [7].
Le PDAC est caractérisé par le développement d’une réaction desmoplasique, caractérisée par une matrice extracellulaire
dense (ECM) et par une composante cellulaire, comprenant des cellules endothéliales, des cellules immunitaires, et des
fibroblastes modifiés associés au cancer (CAF). La signalisation des facteurs de croissance conduit à une expression accrue
de facteurs de croissance tels que l'IGF, l'EGF et le TGFß. En outre, les interactions avec la cellule immunitaire et le
compartiment cellulaire endothélial contribuent à la tumorigénèse par la libération de ROS et des facteurs de croissance
supplémentaires. Les interactions avec chacun de ces compartiments contribuent à la croissance accrue des tumeurs dans le
PDAC.
17
II) MICROENVIRONNEMENT DU CANCER DU PANCREAS
1.
Le stroma
Le microenvironnement tumoral, ou stroma, est une structure complexe et dynamique
caractérisée par une matrice extracellulaire dense et par une composante cellulaire,
comprenant des cellules endothéliales, des cellules immunitaires, et des fibroblastes modifiés
associés au cancer (CAFs). Ce microenvironnement co-évolue avec le cancer. Dans
l’adénocarcinome du pancréas (PDAC), le stroma représente jusqu’à 90% du volume tumoral.
L’activation de ce stroma est aussi appelé réaction desmoplasique, c’est une forte production
de tissu fibreux et une activation des composantes cellulaires du microenvironnement (Figure
3) [8]. Ces composantes ont un effet sur les cellules cancéreuses. Il y a une augmentation de la
prolifération, de la résistance à l’apoptose, un échappement immunitaire et une modulation de
l’angiogénèse. Ceci favorise l’apparition de métastases et la résistance aux chimiothérapies
[6].
L’hypoxie résulte du stroma dense qui entoure la tumeur, du manque de vascularisation et de
la grande quantité d’apports métaboliques [9]. L'oxygénation moyenne d’un PDAC est
fortement diminuée par rapport aux tissus normaux. La densité des microvaisseaux est
hétérogène dans le PDAC, avec une densité faible et une hypovascularisation dans les zones
où la réaction desmoplasique est dense. L’association entre l’hypoxie, l’hypovascularisation
de la tumeur, l’activation de l’angiogénèse par les cellules cancéreuses et les cellules du
stroma conduit au développement d’un cancer très agressif. L’agressivité et la résistance aux
traitements existants du PDAC sont largement favorisés par son microenvironnement [9].
Ce microenvironnement est activé par les cellules épithéliales mutées qui deviennent
cancéreuses, et qui secrètent différentes molécules pour modifier son environnement et le
rendre plus propice à sa propre survie et croissance. Le PDAC surexprime de nombreux
facteurs de croissance mitogènes et abrite une fréquence élevée de mutations dans l'oncogène
K-ras, les gènes suppresseurs de tumeur p53 et Smad4. Ce dernier stimule une activation des
fibroblastes CAFs, ce qui va augmenter la production et la modification de la matrice
extracellulaire pro-tumorale [10]. Les MMPs sont des protéases zinc-dépendantes qui jouent
un rôle important dans la dégradation de la membrane basale et le remodelage de la matrice
extracellulaire ce qui va favoriser la migration et l’invasion de cellules cancéreuses et donc la
transition vers un PDAC [9].
Figure 4 : Effets des produits dérivés des granulocytes neutrophiles sur le microenvironnement des tumeurs (adapté
de Houghton et al., 2011 [11]).
Les granules azurophiles sécrètent des élastases neutrophiles qui vont avoir un effet sur la voie de signalisation PI3K et
entraîne la prolifération des cellules cancéreuses. Les granules spécifiques contiennent les metalloprotéases MMP-8 et MMP9 qui contribuent, par VEGF, à l’angiogénèse tumorale.
19
2. La matrice extracellulaire
La matrice extracellulaire a initialement été considérée comme une barrière contre
l’invasion tumorale. Elle va en réalité modifier la cancérogénèse. En effet, la matrice
influence la croissance, la différenciation, la survie et la mobilité des cellules cancéreuses
formant une structure physique. La matrice est aussi un réservoir pour différents facteurs
solubles qui seront libérés lors de sa dégradation. La matrice extracellulaire est composée de
plusieurs protéines, comme le collagène, la fibronectine, la laminine, qui jouent des rôles
différents dans le développement du cancer [12]. Les différents types de cellules du stroma
produisent des groupes spécifiques de protéases, qui sont libérées dans l'espace extracellulaire
et se régulent spécifiquement avant leur action dans le microenvironnement de la tumeur. Les
granulocytes neutrophiles ou polynucléaires neutrophiles (PNNs) sont fréquemment observés
dans le microenvironnement, mais leurs rôles physiopathologiques dans le contexte des
tumeurs ne sont pas encore très bien connus[13]. Le PDAC a une capacité à attirer les
granulocytes neutrophiles (PNNs) grâce à une chemiokine C-X-C à ligand 16 (CXCL16) [14].
Un granulocyte neutrophile est un leucocyte. Il est caractérisé par son noyau polylobé et la
présence de nombreux granules cytoplasmiques. Chez un patient sain, les PNNs constituent la
plus importante population leucocytaire du sang circulant (60 à 70% des leucocytes sanguins)
et représentent les principales cellules phagocytaires dans la circulation sanguine. Les PNNs
contiennent quatre types de granules : les granules azurophiles (ou primaires), les granules
spécifiques (ou secondaires), les granules gélatinases (ou tertiaires) et les vésicules sécrétoires
[11]. La formation de ces diverses granules est initiée au stade précoce promyélocytaire de
différentiation du granulocyte dans la moelle osseuse. Elles sont classées en fonction de leur
contenu protéique et leur capacité à être exocytées après l’activation du PNN par un stimulus
inflammatoire. Les granules azurophiles contribuent à la dégradation intracellulaire des
microorganismes et à l’élimination du pathogène à l’intérieur du phagolysosome. Elles sont
définies par trois sérine protéases : l’élastase neutrophile (NE), la cathépsine G (CG) et la
protéinase 3 (PR3)[15].
La NE, ainsi que les métalloprotéases MMP-8, MMP-9, peuvent moduler la composition de la
matrice extracellulaire et faciliter la formation de métastases (Figure 4) [16].
21
3. L’élastase neutrophile (NE)
La NE est exprimée par le granulocyte neutrophile. Elle appartient à la famille des
sérine protéases et possède un fort degré d’homologie (au niveau ADN et protéique) avec les
granzymes des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et les chymases et tryptases des
mastocytes. Les sérine protéases humaines et murines contiennent, dans une triade catalytique
bien conservée, l’histidine, l’acide aspartique et la sérine. La NE est synthétisée sous forme
d’un précurseur (zymogène) de 267 acides aminés et subit deux phases de maturation au cours
de la différentiation du neutrophile pour être stockée sous forme active dans les granules
azurophiles. La NE est stockée sous forme mature de 30 kDa (218 acides aminés) dans les
granules et est libérée dans l’environnement lorsque les granulocytes neutrophiles (PNN) sont
exposés à des stimuli inflammatoires. La NE est inactive dans les granules en raison du pH
intragranulaire acide et du fait de son association à des protéoglycanes chargés négativement
[17]. Le pH élevé dans le milieu extracellulaire ainsi que la dissociation des complexes par
des mécanismes dépendants du flux d’ion potassium (K+) permettraient de révéler son
activité protéolytique [18]. L’enzyme mature est une glycoprotéine extrêmement cationique
avec un point isoélectrique très basique de 10-11 [19].
La NE est une enzyme peu spécifique. Elle est capable de dégrader différents substrats.
Plusieurs études, in vitro, ont montré que la NE peut cibler les récepteurs membranaires, les
médiateurs inflammatoires, les immunoglobulines, et les facteurs de coagulation. La NE
dégrade également l’élastine, la fibronectine, la laminine, le collagène de type I et IV, les
protéoglycanes, les récepteurs plaquettaire IIb/IIIa, les récepteurs du complément, la
thrombomoduline, les protéines du surfactant, les cadhérines ainsi qu’une variété de protéines
plasmatiques [19].
Il existe plusieurs inhibiteurs de la NE trouvés à ce jour et l’élafine en fait partie [20].
23
III)
ELAFINE
1.
La découverte
Pour la première fois, l’élafine a été identifiée en 1991 dans les lésions cutanées
associées à la maladie auto-immune de la peau, le psoriasis. Sa caractérisation a permis de
déterminer son poids moléculaire qui est de 9 kDa et sa fonction qui est inhibiteur de sérine
protéases telles que les élastases neutrophiles, l’élastase leucocytaire humaine et la protéinase
3 (PR3). L’élafine est exprimée par les cellules épithéliales de manière constitutive. Plusieurs
groupes de recherche ont identifié cette protéine simultanément, ce qui a donné plusieurs
appellations différentes dans la littérature telles que SKALP pour skin-derived
antileukoprotease ou ESI pour elastase specific inhibitor [21]. Ici, l’élafine sera utilisée
comme nomenclature dans ce mémoire.
Le gène exprimant l’élafine est identifié comme étant le gène PI3 situé sur la région
chromosomique 20q13. Ce gène est composé de trois exons séparés par deux introns. Après
transcription et traduction, l’élafine est présente sous deux formes dites précurseur et mature.
La forme précurseur de 117 acides aminés porte un peptide signal de sécrétion en N-terminal.
Celui-ci est par la suite clivé dans le réticulum endoplasmique réduisant ainsi la longueur de
l'élafine à 85 acides aminés, correspondant à la forme mature. À la suite de ce clivage,
l'élafine est sécrétée [22].
La structure de l’élafine est connue et contient deux domaines fonctionnels : le premier est
situé à l’extrémité N-terminale, c’est un domaine de liaison à la transglutaminase, appelé
cementoin. Ce domaine est constitué de plusieurs motifs répétés avec la séquence consensus
Gly-Gln-Asp-Pro-Val-Lys qui sert de substrat pour l'enzyme transglutaminase [22]. Cette
dernière catalyse la liaison covalente entre le domaine cementoin et des composants de la
matrice extracellulaire tels que la laminine, la fibronectine, la béta-crystalline, le collagène
IV, le fibrinogène et l'élastine. La réaction se traduit par la formation d’une liaison covalente
entre la fonction amine d’une lysine et la fonction amide d’une glutamine. Le second domaine
situé à l’extrémité C-terminale est stabilisé par quatre ponts disulfures, appelé domaine Whey
Acid Protein (WAP). Ce motif structural a d'abord été observé pour la lactosérum protéine
acide qui est une composante abondante du lait, d’où l’appellation domaine WAP [22]. Celuici forme une boucle responsable de la fonction inhibitrice de protéase. En effet, il a été montré
qu’en absence du domaine WAP, l’élafine ne peut plus jouer son rôle d’inhibiteur de sérine
25
protéases et la délétion du domaine cementoin à l’extrémité N-terminale n’affectait pas
l’activité inhibitrice. Cependant, le mécanisme d’inhibition exact n’est pas connu à ce jour.
[23].
2.
Rôles dans l’inflammation et dans les réponses immunitaires
L’élafine possède d’autres fonctions indépendantes de l’inhibition de sérine protéases.
Elle joue aussi un rôle important dans les réponses inflammatoires et immunitaires. En effet,
une récente étude de l’équipe de J.-P. Motta, a montré l’effet de l’élafine dans deux maladies
inflammatoires intestinales [20].
Figure 5 : L’homéostasie élastolytique est rompue dans les tissus de côlons de patients MICI.
(A) L’activité élastolytique détectée dans les tissus de côlon provenant de patients CD (maladie de Crohn) et de patients sains
(n=5 biopsies provenant de différents patients dans chaque groupe). La couleur de la barre d’échelle indique l’intensité de
l’activité détectée. (B) Activité élastolytique dans les surnageants de cultures de biopsies de côlons provenant de patients
MICI et patients sains. (C) Images de FISH montrant l’expression d’ARNm de l’élafine des échantillons de biopsies de la
muqueuse du côlon de patients CD ou UC (colite ulcérative). Les limites de la muqueuse du colon sont définies par
microscopie optique en traçant une ligne en pointillée à la bordure de la lamina propria. La couleur de la barre d’échelle
indique l’intensité de l’ARNm détectée. (D) Quantification de la fluorescence dans le tissu muqueux avec le logiciel ImageJ.
Les données dans (B) et (D) sont moyennées ± SEM (n = 4 dans chaque groupe, ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05,
utilisant Kruskal-Wallis suivi du test de Dunn’s).
27
Présentation d’un article
Food-Grade Bacteria Expressing Elafin Protect Against Inflammation and Restore
Colon Homeostasis [20]
Les maladies inflammatoires du côlon se caractérisent par l’inflammation de la
muqueuse intestinale. Dans cet article, les auteurs se sont intéressés à deux maladies : la
maladie de Crohn qui touche la muqueuse de manière profonde et la colite ulcéreuse qui
touche la muqueuse du côlon et du rectum de manière plus superficielle. L’implication des
élastases a été montrée dans ces deux pathologies. Les élastases constituent une famille
d’enzymes induisant une activité élastolytique, qui se traduit par l’hydrolyse de l’élastine.
L’élastine quant à elle, confère une élasticité et solidité aux tissus. Dans la littérature, il a été
montré qu’une protéine inhibitrice des élastases, nommée l’élafine, joue un rôle dans la
protection de l’organisme contre les inflammations intestinales.
Dans cette étude, l’activité élastolytique est analysée chez des patients atteints de maladie
inflammatoire chronique de l’intestin (MICI) et des patients sains. Cette activité est étudiée
par zymographie in situ sur des tissus de côlons ainsi que par le dosage des surnageants
provenant de biopsies de côlon de patients MICI. Une forte activité élastolytique est détectée
au niveau de la sous-muqueuse chez les patients atteints de la maladie de Crohn (Figure 5A).
De plus, une augmentation est observée pour l’activité élastolytique des surnageants
provenant de biopsies des zones enflammées ou non enflammées de patients MICI (Figure
5B).
Les auteurs ont voulu savoir si l’élafine était présente à la surface du côlon des patients MICI
car celle-ci est naturellement présente chez les patients sains. Pour ce faire, ils ont regardé son
expression au niveau transcriptionnel sur les tissus de côlon de patients MICI en réalisant une
FISH. Dans les tissus de côlons provenant des patients sains, l’ARNm de l’élafine est détecté
au niveau de la muqueuse et sous-muqueuse ainsi que dans l’épithélium intestinal. Cependant,
elle est considérablement diminuée dans les tissus de patients MICI (Figure 5C). Puis une
quantification de la fluorescence est réalisée, confirmant que l’expression de l’élafine est
diminuée dans les tissus de patients MICI (Figure 5D).
Figure 6 : Effet de l’élafine sur différents paramètres de la forme aiguë de l’inflammation.
(A et B) L’activité élastolytique des lavages des colons provenant des souris ayant bu de l’eau contenant ou non du DSS
pendant 7 jours et traitées oralement avec L. lactis exprimant ou non l’élafine (A), L. casei exprimant ou non l’élafine (B). (C
à E) Le score des dommages macroscopiques (C), l’épaisseur du côlon (D), et l’activité MPO (E) sont montrés dans les
tissus de côlon des souris. Les souris ont eu accès à de l’eau contenant ou non du DSS pendant 7 jours et traitées oralement
avec du PBS ou avec des LAB exprimant ou non l’élafine. (F et G) Concentration de cytokines détectées dans la muqueuse
du côlon de souris ayant bu de l’eau avec du DSS ou de l’eau claire pendant 7 jours et ayant un traitement journalier avec du
PBS ou L. casei exprimant ou non l’élafine. (H) Quantification de l’intensité de marquage démontrant l’effet de l’élafine
exprimée par L. lactis sur les neutrophiles marqués avec un anticorps anti-Ly-6G. Les souris ont eu accès à de l’eau contenant
ou non du DSS pendant 7 jours et traitées oralement avec du PBS ou avec L. lactis exprimant ou non l’élafine. Les données
sont moyennées ± SEM, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, utilisant Kruskal-Wallis suivi du test de Dunn (n = 10 dans
chaque groupe).
29
Ces résultats suggèrent qu’il y a une corrélation entre l’augmentation de l’activité
élastolytique dans les tissus de côlons de patients MICI et la réduction de l’expression de
l’élafine.
Pour pallier à ce manque d’élafine à la surface de la muqueuse chez les patients MICI, les
auteurs ont utilisé L. lactis et L. casei, bactéries lactiques non pathogènes (LAB), afin de
délivrer l’élafine à la surface de la muqueuse. Leur objectif est donc de restaurer
l’homéostasie du côlon par les LAB exprimant l’élafine ce qui permettrait une protection
contre les agressions inflammatoires.
Les auteurs ont dans un premier temps regardé l’effet de l’élafine sur les différents
paramètres de la forme aiguë de l’inflammation. Les souris CD57BL/6 ont été traitées ou non
au Dextran Sodium Sulfate (DSS), dilué dans l’eau de boisson, induisant une inflammation de
tout le tube digestif. Puis les souris traitées sont gavées ou non tous les jours avec des LAB
exprimant ou non l’élafine. Ce traitement dure 7 jours et est réalisé pour toutes les
expériences. Au bout du 7ième jour, les souris sont sacrifiées pour réaliser l’étude.
Le premier paramètre de l’inflammation étudié est l’activité élastolytique. Elle a été mesurée
par dosage de substrats chromogène et fluorogène des élastases. Ces mesures ont été faites sur
des lavages de côlon des différentes souris.
Les souris traitées au DSS présentent une augmentation de l’activité élastolytique comparée
aux souris non traitées. L’administration journalière des LAB exprimant l’élafine permet une
baisse de l’activité élastolytique (≈ 60%) chez les souris présentant une inflammation. Cela
suggère que l’élafine permettrait une réduction de l’activité élastolytique (Figure 6A). Les
résultats avec L. casei mènent aux mêmes conclusions que ceux avec L. lactis (Figure 6B).
L’impact de l’élafine sur l’inflammation est ensuite étudié grâce aux paramètres de
sévérité de l’inflammation. Les dommages macroscopiques sont évalués par différents scores
selon la gravité de l’inflammation. Ils regroupent la diarrhée, les érythèmes, les œdèmes, les
hémorragies, les ulcérations… Ces scores sont ensuite additionnés entre eux pour ne former
qu’un seul paramètre. Un des autres paramètres étudiés est l’activité de la myéloperoxidase
(MPO). Son dosage permet de regarder l’infiltration des granulocytes (Figure 6E). Enfin le
dernier paramètre de sévérité pris en compte est l’épaisseur du côlon (Figure 6D).
Figure 7 : Effets de l’élafine sur différents paramètres sur deux modèles de souris développant la forme chronique de
l’inflammation soit par traitement au DSS (A-C) ou aux lymphocytes CD45RB (D).
(A et D) Score des dommages macroscopiques (B) Épaisseur du côlon (C) Activité élastolytique dans les tissus du côlon. (A
à C) Souris CD57BL/6 traitées avec 3 cycles de 7 jours avec de l’eau claire ou de l’eau contenant du DSS pour induire
l’inflammation. (D) La colite chronique est induite par l’injection intrapéritonéale de lymphocytes T actifs (CD45RB high)
dans les souris SCID alors que les souris contrôles reçoivent des lymphocytes T inactifs (CD45RB low). Les souris sont
traitées par du PBS ou avec des LAB exprimant ou non l’élafine. Les données sont moyennées ±SEM, *P < 0.05, **P <
0.01, ***P < 0.001, utilisant ANOVA suivi du test de Bonferroni (n = 10 dans chaque groupe).
31
Lors de l’induction de l’inflammation par le DSS, ces trois paramètres augmentent et en
présence de L. lactis-Elafine, ils diminuent. L’élafine permettrait donc de diminuer les
paramètres de sévérités de l’inflammation (Figure 6C, D et E).
Ils ont également voulu savoir si l’élafine avait un effet sur les marqueurs moléculaires de
l’inflammation comme le kératinocyte chemoattractant (KC) aussi appelé interleukine 8 et
l’interleukine 6 (IL-6). Ces cytokines ont été quantifiées par cytométrie en flux. Lorsque les
souris sont traitées au DSS, les concentrations des cytokines augmentent. Le traitement avec
les LAB exprimant l’élafine entraine une diminution de l’expression de ces marqueurs
(Figure 6F et G).
Un des marqueurs cellulaires a aussi été observé par immunohistochimie. Des sections de
tissus provenant des biopsies de patients MICI ont été incubées avec un anticorps dirigé
contre un marqueur des neutrophiles (Ly-6G). La quantification de ce marqueur a augmenté
chez les souris traitées au DSS. Celle-ci a diminué lors de l’administration orale des LAB
exprimant l’élafine (≥ 50%) (Figure 6H). Les résultats révèlent que les marqueurs cellulaires
et moléculaires de l’inflammation sont diminués par l’élafine.
L’élafine permet donc de diminuer la forme aiguë de l’inflammation.
Parallèlement, les auteurs se sont intéressés à l’effet de l’expression de l’élafine par les
LAB sur la forme chronique de l’inflammation. Pour cela, deux modèles de souris
développant de manière différente la forme chronique sont utilisés. Des souris CD57BL/6
sont traitées au DSS dissout dans l’eau pendant 3 périodes de 7 jours, intercalées d’un
traitement de 7 jours à l’eau claire. Le second modèle de souris utilisé, est le modèle de souris
SCID (severe combined immunodefeciency) ne possédant pas de réponse immune adaptative.
Dans ces dernières, l’inflammation est déclenchée par l’injection intrapéritonéale de
lymphocytes T actifs (CD45RBhigh).
Différents paramètres de sévérité de l’inflammation notamment le score des dommages
macroscopiques sur les tissus de côlons de ces souris ainsi que l’épaisseur du côlon sont
observés. Pour les deux modèles de souris, une augmentation du score des dommages
macroscopiques est observée chez les souris développant la forme chronique (DSS ou
CD45RBhigh). D’autre part, le traitement des LAB n’exprimant pas l’élafine ne modifie pas le
score des dommages macroscopiques. Mais, l’administration orale des LAB exprimant
l’élafine le diminue (Figure 7A et D). Les résultats obtenus sont similaires pour le second
paramètre qui est l’épaisseur du côlon pour les souris traitées à L. lactis exprimant l’élafine.
Figure 8 : Effets de l’Elafine sur les cellules épithéliales intestinales humaines.
(A) Des cultures de monocouches de cellules épithéliales humaines de l’intestin (Caco-2-cells) sont exposées au TNF-α et la
perméabilité a été testée grâce au dextran-FITC quand les cellules ont été exposées au medium seul ou à L. lactis exprimant
ou non l’élafine, (B) et l’expression des ARNm de CXCL-8 a été étudiée grâce à une RT-qPCR. Des cultures de
monocouches de cellules épithéliales humaines de l’intestin (Caco-2-cells) sont exposées aux surnageants provenant des
biopsies des tissus du côlon des patients atteints de la maladie de Crohn (CD) (triangles pleins) et des patients atteints de la
colite ulcéreuse (UC) (cercles ouverts) ou provenant des patients sains (cercles pleins). (C, D et F) La perméabilité des
macromolécules est testée quand les cellules épithéliales sont exposées au medium seul (HBSS) (croix) ou au surnageants des
patients sains ou MICI (C) et quand les cellules épithéliales sont co-cultivées avec L. lactis exprimant ou non l’élafine (D).
L’expression des ARNm de CXCL-8 est quantifiée dans des cellules épithéliales exposées au medium seul (HBSS) ou au
surnageants MICI (E) et en présence de L. lactis exprimant ou non l’élafine (F). Les données sont moyennées ± SEM, *P <
0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, utilisant le test ANOVA suivi du test de Bonferroni [n = 24 (A), n = 18(B)].
33
Cependant, les souris CD57BL/6 traitées à L. casei exprimant ou non l’élafine ne montrent
pas de diminution de l’épaisseur du côlon (Figure 7B).
Ces résultats indiquent que l’élafine exprimée par L. lactis permet de diminuer les différents
paramètres de sévérité de la maladie chronique et restaure l’homéostasie du côlon.
Ensuite, l’effet de l’élafine sur l’activité élastolytique a été mesurée sur des lavages de côlons
excisés de souris CD57BL/6 comme précédemment.
Une augmentation de l’activité élastolytique chez les souris traitées au DSS est observée. Par
contre, en présence de L. lactis exprimant l’élafine, l’activité élastolytique diminue.
Cependant, pour les souris traitées à L. casei exprimant l’élafine, l’activité élastolytique n’est
pas diminuée (Figure 7C). De ce fait, les auteurs se sont focalisés sur L. lactis pour la suite
des expériences. Ces résultats montrent que l’élafine permet donc la réduction de l’activité
élastolytique seulement chez les souris traitées par L. lactis.
L’élafine permet donc de diminuer la forme chronique de l’inflammation.
Il est connu que lors de l’inflammation, les cellules épithéliales intestinales deviennent
perméables aux macromolécules. Les auteurs ont donc voulu savoir si l’élafine avait un effet
sur la perméabilité paracellulaire en utilisant des monocouches de cellules épithéliales
intestinales (Caco-2). Pour cela, ils visualisent le transport du dextran-FITC du pôle apical au
pôle basal des cellules. Ils ont utilisé deux systèmes d’induction de l’inflammation. La
première induction est au TNFα qui est une molécule produite par le système immunitaire
jouant un rôle important dans le développement et le maintien d’une réaction inflammatoire.
La production excessive de TNFα est l’un des éléments majeurs du dysfonctionnement du
système immunitaire chez les patients atteints de MICI. Les cellules Caco-2 sont exposées ou
non durant 24h au TNFα, au TNFα + L. lactis WT ou au TNFα + L. lactis-Elafine.
La seconde induction est réalisée par l’exposition des cellules Caco-2 aux surnageants de
biopsies de patients MICI. Les monocouches de cellules Caco-2 sont mises en solution avec
du HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution) ou mises en co-culture avec des surnageants
provenant des biopsies des patients MICI. Par la suite, ces dernières sont mises en présence de
bactéries L. lactis exprimant ou non l’élafine.
L’exposition au TNFα et aux surnageants provenant des biopsies des patients MICI
augmentent la perméabilité aux macromolécules des monocouches des cellules Caco-2 visible
par le transport du dextran-FITC (Figure 8A et C). La présence de l’élafine permet une baisse
de cette perméabilité. Les résultats révèlent que l’élafine protège l’épithélium du colon en
diminuant la perméabilité (Figure 8A et D).
35
Par ailleurs, lors de l’inflammation, des cytokines pro-inflammatoires sont fortement
exprimées comme l’Interleukine-8 (CXCL-8). À partir des co-cultures réalisées
précédemment, des RT-qPCR ont été effectuées.
L’expression de l’ARNm de l’IL-8 est augmentée pour les deux formes d’induction de
l’inflammation (Figure 8B et E). En présence de TNFα, l’expression de l’ARNm de l’IL-8
est diminuée lorsque la bactérie L. lactis est ajoutée. Cette diminution est inchangée même en
présence de l’élafine (Figure 8B). De plus, lors des co-cultures des cellules Caco-2 avec les
surnageants de biopsies de patients MICI, l’expression de l’ARNm de l’IL-8 diminue en
présence de l’élafine (Figure 8F).
Les résultats révèlent que L. lactis protège l’épithélium du côlon et que l’élafine diminue
l’expression des molécules pro-inflammatoires.
Nous savons que l’élafine n’est plus exprimée chez les patients MICI, c’est pour cela que les
auteurs ont utilisé les LAB pour de nouveau l’exprimer. Grâce à ce système, ils ont pu déduire
que l’élafine permet de :
-
Réduire l’activité élastolytique
-
De diminuer les différents paramètres de sévérités de la maladie ainsi que les
marqueurs cellulaires et moléculaires de l’inflammation
-
De protéger l’épithélium du côlon en diminuant la perméabilité
Tout ceci va permettre de restaurer l’homéostasie du côlon.
D’une part, l’élafine est décrite comme une composante critique de la barrière épithéliale pour
l’activité des sérine protéases, notamment des NE. Dans l’ensemble des maladies
inflammatoires examinées, les taux d'élafine sont généralement diminués, favorisant ainsi
l’activité protéolytique des NE. S’en suit un déséquilibre entre les NE et l’élafine qui est
impliqué dans de nombreuses maladies caractérisées par une inflammation aiguë ou
chronique. Étant donné le rôle important des NE dans la régulation de l'inflammation et de la
destruction des tissus, la perte d'élafine apparaît comme un facteur critique dans la
pathogenèse des maladies inflammatoires. Ceci a été démontré dans deux maladies
inflammatoires du côlon comme vu précédemment, mais aussi pour deux maladies
inflammatoires du poumon comme la lésion pulmonaire aiguë (LPA) ou bien le syndrome de
détresse respiratoire aiguë (SDRA). En effet, l’administration d'adénoviraux exprimant
l’élafine dans les poumons de souris a significativement réduit la LPA induite par l'infection
37
par Pseudomonas aeruginosa [24]. Ensuite, une autre étude a révélé que chez des patients
atteints de LPA, l’expression de l’élafine est augmentée dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire deux jours suivant l'apparition de la maladie par rapport aux patients sains.
Cependant, les niveaux d'élafine ont diminué en fonction du temps en raison de la dégradation
de celle-ci par le protéasome 20S, conduisant ainsi à l'augmentation de l'activité des NE [25].
Puis, l’équipe de Wang et al. a montré l’implication du déséquilibre élafine/NE dans le sérum
de patients souffrant de SDRA, les auteurs ont remarqué un faible taux d’expression de
l’élafine ainsi qu’une forte expression des NE [26].
D’autre part, l’élafine a été montré pour avoir un rôle dans les réponses immunitaires, elle a
un effet bactéricide en perturbant les membranes bactériennes par sa charge fortement
cationique. Et elle est aussi capable de se lier au lipopolysaccharide (LPS) présent à la surface
de la membrane externe des bactéries Gram négatif, pour ainsi moduler l'activité de la voie de
signalisation des récepteurs de type Toll (TLR) [27]. Quant aux souris traitées au LPS, la
surexpression de l’élafine a montré une réduction de l'infiltration de neutrophiles ainsi que des
taux de cytokines et chimiokines [28].
Figure 9 : L'expression de l'élafine dans des cellules de cancer du sein Rb négatives entraîne une apoptose (adapté de
Caruro J. et al., [30])
Les lignées cellulaires immortalisées de cellules épithéliales mammaires MCF-7, ZR75.1, T47D, et les lignées cellulaires
dérivées de tumeurs du sein MDA-MB-157, MDA-MB-436 et MDA-MB-468 ont été traitées avec du PBS (P), de la
luciférase adénovirale (L) ou de l'élafine adénovirale (E).
(A) La prolifération cellulaire a été analysée par un test au bleu de trypan toutes les 24 heures pendant 96 heures.
L'expression de l’élafine a provoqué une différence significative du nombre de cellules. (B) La prolifération cellulaire a été
évaluée 48 heures après le traitement en mesurant l'incorporation du BrdU. (C) L'apoptose a été évaluée 72 heures après le
traitement par l'analyse TUNEL. Toutes les expériences ont été répétées en triplicat.
39
3.
Rôles dans le cancer
Ces dernières années, des études ont montré que l'élafine pouvait aussi avoir un rôle
dans le cancer. En effet, celle-ci induirait l'arrêt de la croissance cellulaire et/ou l'apoptose lors
de son expression dans des lignées cellulaires cancéreuses du sein et de la peau. Ce qui
suggère que l’élafine possède une activité suppresseur de tumeur [29, 30].
L’élafine est retrouvée sous-exprimée dans les carcinomes épidermoïdes cutanés peu
différenciés de la peau, de la tête, et d’autres parties du corps, comparés aux tumeurs bien
différenciées. Ce qui évoque un éventuel rôle de la perte d’expression de l’élafine dans le
phénotype tumoral peu différencié et agressif des cellules cancéreuses [31]. L’équipe de
Zhang M. et al. montre qu’il y a perte d’expression de l’élafine dans plusieurs lignées
cellulaires provenant de tumeurs mammaires comparées aux cellules épithéliales mammaires
humaines normales (HMEC). Dans les HMEC, l'expression d'élafine est régulée par des
éléments transcriptionnels tel que le facteur CCAAT/enhancer binding protein beta (C/EBP
β). L’élafine est sous-exprimée en raison de la surexpression de C/EBP β [32, 33]. Par la
suite, l’équipe de Hunt K.et al. a utilisé différentes lignées cellulaires immortalisées de
cellules épithéliales mammaires MCF-7, ZR75.1, T47D, et des lignées cellulaires dérivées de
tumeurs du sein MDA-MB-157, MDA-MB-436 et MDA-MB-468 traitées avec du PBS, de la
luciférase adénovirale ou de l'élafine adénovirale afin d’évaluer la prolifération cellulaire.
L'expression de l’élafine a provoqué une diminution significative du nombre de cellules
tumorales (Figure 9A et B). Le traitement à l’élafine des différentes lignées montre une
augmentation significative de cellules tumorales en apoptose (Figure 9C). Puis, ces
expériences ont été reproduites in vivo et ont montré que l’injection d’adénoviraux exprimant
l’élafine dans des souris ayant subi une xénogreffe de cellules cancéreuses de sein, a diminué
la croissance et la progression de la tumeur [30].
Une autre étude a révélé une faible expression de l’élafine dans des échantillons de tissus de
mélanome. Lors de son expression induite par la doxycycline (Dox) dans la lignée de
mélanome A2058, les auteurs ont observé une diminution significative du nombre de cellules
tumorales après traitement 48 heures et 96 heures à la Dox (Figure 10A). L’effet proapoptotique de l’élafine sur la lignée de mélanome a été montré par un test TUNEL en
présence et absence de doxycycline (Figure 10B). Par la suite, l’injection de l’élafine dans
des modèles de souris portant des xénogreffes de lignées de mélanomes, a inhibé la formation
de tumeurs. Les auteurs ont ensuite montré que l’élafine induisait l’apoptose par la voie
intrinsèque [29].
Figure 10 : L’expression inductible sous la doxycycline de l’élafine provoque l’apoptose des cellules de mélanome
A2058 (adapté de Yu KS. et al., [29]).
Les lysats cellulaires et les surnageants de culture ont été préparés à partir de cellules A2058, transfectées de manière stable
par le plasmide pGR288 exprimant l’élafine ou un plasmide témoin (Mock) en absence ou en présence de doxycycline (Dox).
(A) Le comptage des cellules 48 et 96 heures après le traitement à la Dox a été réalisé. *, P <0,05. (B) Les cellules positives
au test TUNEL ont été examinées sous un microscope à fluorescence en l'absence ou en présence de la Dox. Le DAPI a été
utilisé pour la coloration des noyaux. Bar, 20 µm.
41
NOTRE PROJET
L'inflammation et la présence de neutrophiles dans le microenvironnement tumoral
sont considérées comme des composantes essentielles de la progression des cellules
cancéreuses. L’élafine a un effet anti-tumoral dans le mélanome et dans le cancer du sein
comme nous l’avons vu précédemment. Sachant qu’aucune étude n’a montré à ce jour son
effet dans le cancer pancréas, notre projet consisterait donc à regarder son expression et sa
localisation dans les lignées cellulaires cancéreuses pancréatiques ainsi que dans les biopsies
de patients atteints du cancer du pancréas. Puis de voir si l’élafine a un effet apoptotique sur
ces lignées et enfin déterminer son effet sur le microenvironnement du PDAC.
I)
Expression de l’élafine dans le pancréas
À ce jour, aucune étude n’a montré l’expression de l’élafine dans le pancréas de patients
sains ou atteins du cancer. Nous allons donc dans un premier temps déterminer sa localisation
puis la quantifier. Nous allons avoir besoin de biopsies de patients considérés comme sains
(n=10). Ceci étant compliqué à obtenir, nous considèrerons comme sains des patients atteints
d’une pancréatite. Il nous faudra également des biopsies de patients atteints du cancer du
pancréas (n=10). Les 5 premières biopsies de chaque condition seront utilisées afin de
localiser l’élafine et les restantes seront utilisées pour la quantification. Celles-ci seront
prélevées par écho-endoscopie au cancéropole de TOULOUSE par l’équipe de Pierre
Cordelier et placé dans 2ml d’HBSS, milieu stérile isotonique, à 37°C pendant 1h [20]. Un
consentement écrit et oral seront obtenus auprès des patients avant qu’ils ne s’engagent dans
l’étude. Le protocole de recherche doit avant tout être approuvé par le comité d’éthique.
1. Localisation de l’élafine
Nous allons réaliser une immunohistochimie afin de localiser la forme protéique de l’élafine.
Les biopsies précédemment citées seront préalablement fixées au formol et inclues en
paraffine. Des coupes de 4 mm seront préparées. Les étapes suivantes seront les mêmes que
celles réalisées par l’équipe de C-F. Flach [34]. L’anticorps anti-élafine utilisé est FL-117
(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA).
43
2. Quantification de l’élafine
Nous voulons ensuite quantifier l’élafine à la fois dans des biopsies et dans des lignées
immortalisées de cellules épithéliales pancréatiques (hTERT-HPNE et HPDE6-C7) ainsi que
dans des cellules dérivées de cancers pancréatiques (MIA-Paca2, CAPAN-2 et Panc-1). Les
lignées cellulaires HPDE6-C7 seront commandées chez Kerafast, Inc. et les autres chez LGC
Standards-ATCC. Les lignées tumorales sont choisies du fait qu’elles sont les plus utilisées
dans la littérature [35]. Elles se différencient par leurs niveaux d’agressivité, leurs origines,
leurs âges et leurs degrés de différentiation (LGC Standards-ATCC).
a) Expression de l’élafine sur des biopsies
Dans le but de quantifier l’expression de protéique de l’élafine dans les biopsies (n=5), nous
réaliserons un western blot. Dans un premier temps, les tissus de biopsies seront
homogénéisés dans de l’eau distillée. Puis l’homogénat obtenu sera centrifugé et le surnageant
sera récupéré. Un western blot sera effectué à partir de ce surnageant. [36].
b) Expression de l’élafine sur des lignées cellulaires
Nous procèderons à une quantification de l’élafine par ELISA. Les anticorps anti-élafine
seront achetés chez R&D Systems (kit Duoset®) et les mesures seront effectuées selon le
protocole du fabricant. Les échantillons devront être dilués au 1/20 comme dans l’étude de S.
Paczesny [37].
Dans le cas où nous n’arriverions pas à quantifier l’élafine au niveau du PDCA, nous
pourrions nous pencher sur un autre cancer comme le cancer colorectal. Nous ferions alors
dans un premier temps les différentes expériences précédemment citées puis celles qui vont
suivre. Des biopsies ainsi que des lignées cellulaires seraient utilisées.
Lorsque nous aurons localisé et quantifié l’élafine, nous pourrons alors déterminer l’effet de
l’élafine sur la mort cellulaire programmée. En effet, des études ont montré que l’élafine
induisait la mort cellulaire dans le cancer du sein ainsi que dans le cancer de la peau.
Figure 11 : Système d’expression Tet-On (adapté de Beluchon B. et al.[35]).
Une double transfection des cellules a été réalisée de rtTA et de l’élafine. (A) Le plasmide pTet-On permettra une expression
de la protéine rtTA sous contrôle du promoteur CMV. Les cellules seront sélectionnées à l’aide de la néomycine. (B) La
séquence codant pour l’élafine sera clonée dans le vecteur pTRE. (C) Les cellules exprimant rtTa seront transfectées avec
pTRE, puis sélectionnées à l‘aide de l’hygromicine. La doxycycline interagira avec pTRE et induira la transcription de
l’élafine.
45
II)
EFFET DE L’ÉLAFINE SUR LA MORT CELLULAIRE PROGRAMMÉE
In vitro
1. Expression de l’élafine dans les lignées cellulaires tumorales pancréatiques
Afin de voir si l’élafine a un rôle dans l’apoptose, les lignées cellulaires dérivées de
cancers pancréatiques MIA-Paca2, CAPAN-2 et Panc-1 et les lignées immortalisées de
cellules épithéliales pancréatiques hTERT-HPNE, HPDE6-C7 seront utilisées. Ces lignées
cellulaires exprimant l’élafine de façon inductible seront obtenues en utilisant le système
d’expression Tet-On (Clontech) (Figure 11) [35]. Dans le cas où l’élafine serait toxique pour
les cellules, ce système nous permettra de contrôler l’expression de l’élafine en choisissant le
moment d’expression afin de suivre l’effet de l’élafine. Chose que nous ne pourrons pas
observer avec un système d’expression constitutive. De plus, grâce à l’intensité de réponse en
fonction de la dose de la doxycycline utilisée, nous pourrons établir une dose réponse de
l’élafine.
Dans un premier temps, les cellules seront transfectées de manière stable avec le plasmide
pTet-On, qui va permettre l’expression de la trans-activateur tétracycline (rtTa). Les cellules
sont ensuite sélectionnées à l’aide de la néomycine (Thermo Fisher Scientific). Puis, les
cellules exprimant la rtTa seront transfectées par le vecteur pTRE dans lequel a été cloné la
séquence codante pour l’élafine. Elles seront ensuite sélectionnées par l’hygromycine
(SigmaAldrich). Ainsi, les cellules transfectées vont produire la protéine rtTa qui en présence
de la doxycycline (analogue de la tétracycline), va interagir avec le promoteur TRE. Ceci
induira l’expression de l’élafine [29]. Ensuite, son expression sera vérifiée par western blot
avec l’anticorps FL-117 dirigé contre l’élafine sur les lignées cellulaires en absence ou en
présence de la doxycycline. [29].
Ainsi, après s’être assuré d’avoir exprimé l’élafine en présence de la doxycycline, nous
procèderons à un test de prolifération.
2. Essai de prolifération
La prolifération cellulaire des différentes lignées sera mesurée par l’incorporation au
bromodésoxyuridine (BrdU) par les cellules. Celles-ci seront incubées en présence de BrdU
(Invitrogen), puis avec l’anticorps anti-BrdUrd conjugué au FITC (BD Biosciences). La
fluorescence émise par FITC sera mesurée en utilisant un cytomètre de flux (FACSCalibur
BD Biosciences) et analysée en utilisant le logiciel FlowJo [30].
47
3. Essais d’apoptose
Puis, pour visualiser les cellules en apoptose, deux expériences seront réalisées.
Premièrement, nous utiliserons un kit de détection d'apoptose d'annexine V-FITC / iodure de
propidium (Molecular Probes). L’annexine V possède une forte affinité pour les
phosphatidylsérines qui se retrouvent exposées durant l'apoptose du côté extracellulaire de la
membrane. Le marquage de celle-ci par FITC nous permettra ensuite d’analyser les cellules
en cytométrie de flux (FACSCalibur BD Biosciences). Ensuite, la seconde expérience sera
basée sur le test TUNEL. La fragmentation de l'ADN sera évaluée à l'aide d'un essai de
marquage de l'extrémité des acides nucléiques par la désoxynucléotidyl-transférase terminale
(TUNEL assays Promega). Les cellules seront ensuite analysées en cytométrie de flux
(FACSCalibur BD Biosciences) [30].
Au vu des résultats qu’ils seront obtenus, la présence de marqueurs protéiques impliqués dans
l’apoptose sera par la suite contrôlée.
4. Activation des caspases
Afin de confirmer au niveau protéique l’implication de l’élafine sur l’apoptose des cellules
cancéreuses ou non, l’expression de différentes caspases dans l’apoptose sera déterminée par
western blot. Pour cela, l’anticorps primaires anti-caspase 3 (Cleaved Caspase 3 Asp 175, Cell
Signaling Technology), anti-caspase 8 (Cleaved Caspase-8 Asp391, Cell Signaling
Technology), anti-caspase 9 (C9, Cell Signaling Technology) seront utilisés [29].
Lorsque que nous obtiendrons des résultats reproductibles in vitro, nous pourrons passer aux
expériences in vivo.
In vivo
5. Choix du modèle
Afin de voir quel serait l’effet de l’élafine in vivo, nous avons pensé à utiliser des modèles de
souris nude athymiques dans lesquels nous pouvons greffer les lignées cancéreuses
pancréatiques en sous-cutané. Cependant, le microenvironnement sous-cutané obtenu est
différent de celui du pancréas. Nous avons donc choisi d’utiliser un modèle de souris
orthotopiques NOD/SCID où la greffe des cellules cancéreuses se fait directement dans le
pancréas. Pour cela, nous utiliserons 2 groupes de souris (n=10 pour chaque groupe) pour la
greffe des cellules cancéreuses exprimant l’élafine ou la GFP en tant que contrôle.
49
La procédure qui sera utilisée est identique à celle de l’équipe de Huynh AS [38]. Il faudra
veiller à respecter les règles de conformité établies par le comité d’éthique.
Par la suite, des échographies seront réalisées après la greffe des cellules pour suivre la
progression des tumeurs pancréatiques. Au bout de deux semaines, les xénogreffes se seront
développées et celles-ci seront ensuite prélevées afin de terminer leur taille et leur poids. Puis,
elles seront fixées dans le paraformaldéhyde et incubées dans la paraffine afin de réaliser les
essais de prolifération par incorporation au BrdU et d’apoptose par TUNEL comme vu
précédemment comme dans l’étude de Yu KS [29].
Nous choisissons de greffer les cellules cancéreuses Capan-2 car celles-ci seront utilisées pour
des
expériences
de
formations
microenvironnement du PDAC.
de
sphéroïdes
permettant
de
rapprocher
du
Figure 12: Génération de sphéroïdes Capan-2 (inspiré de Dufau et al. [39]).
Les sphéroïdes sont produits dans des plaques 96 Puits à fond rond (cuve noire) préalablement recouvertes avec du polyHema
(Poly (2‐ Hydroxyethyl methacrylate) (vert) à 20mg/ml. Le milieu est supplémenté en EGF. 100µL d’un une suspension, de
104 cellules/mL de Capan-2 est déposé dans chaque puits. Les plaques sont centrifugées 6 minutes à 1200rpm puis placées à
5% CO2 et à 37°C. Les sphéroïdes incubent pendant 7 jours. Il y a un sphéroïde par puits. Diamètre = 500 µm.
51
III)
LES SPHÉROÏDES
Le modèle multicellulaire de sphéroïde tumoral (MCTS) est généralement considéré
comme un meilleur modèle que la culture bidimensionnelle. Il est maintenant admis que les
sphéroïdes sont plus prédictif de la réponse aux traitements médicamenteux [39]. La
croissance des sphéroïdes s'accompagne de la mise en place d'un gradient décroissant
d'oxygène de la périphérie vers le centre où peut apparaître une région hypoxique. De ce fait,
les cellules centrales meurent et une zone nécrotique se forme. Il est bien établi que
l'environnement d’une tumeur solide induit un niveau de résistance aux agents
chimiothérapeutiques. Ce phénomène, appelé résistance multicellulaire, émerge dès que les
cellules cancéreuses ont établi des contacts avec des cellules environnantes ou une matrice
extracellulaire, c'est-à-dire son microenvironnement. Dans les sphéroïdes, les cellules
cancéreuses peuvent acquérir cette résistance multicellulaire en interagissant efficacement
avec leur environnement. Nous allons utiliser deux lignées du cancer du pancréas : les
Capan-2 exprimant l’élafine, que l’on aura déjà utilisée pour la deuxième partie du projet et
des Capan-2 non modifiées [39].
1. Formation des sphéroïdes
Pour obtenir des sphéroïdes, nous allons utiliser les Capan-2 qui ont déjà été utilisées afin de
former des sphéroïdes. La méthode utilisée sera la même que celle de l’équipe d’Isabelle
Dufau [39].
Les sphéroïdes seront produits dans des plaques de 96 puits à fond rond
préalablement recouvertes avec du polyHema (Poly 2‐ Hydroxyethyl methacrylate, Sigma) à
20 mg/ml, afin d’empêcher l’adhésion des cellules. Un milieu contenant une suspension,
supplémenté en EGF, de 104 cellules/mL de Capan-2 sera déposé dans chaque puits. Les
plaques seront centrifugées 6 minutes à 1200 rpm puis placées à 5% CO2 et à 37°C. Nous
laisserons ensuite incuber les sphéroïdes pendant 7 jours. Cette technique permet l’obtention
d’un seul sphéroïde, d’environs 500 µm de diamètre, par puits (Figure 12).
2. La viabilité des sphéroïdes
La viabilité des sphéroïdes va être quantifiée par le suivi de luminescence, grâce à l'ATP qui
est un marqueur de la viabilité cellulaire, avec le système de dosage Perkin Elmer ATPlite ™.
Ce système est basé sur la production de lumière provoquée par la luciférase en présence
d'ATP et de la D-luciférine.
Figure 13 : Exemple de microscopie Brightfield (adapté de M. J. Ware et al. [40]).
Images provenant de microscopie Brightfield de sphéroïdes (incubé 7 jours) des lignées cancéreuses PANC-1, MIA PaCa-2
et Capan-1 (Échelle blanche ¼ 1000 mm et échelle rouge ¼ 500 mm).
53
L’équipe d’Isabelle Dufau [39] a adapté la procédure d'essai ATPlite pour l'application de
sphéroïdes. Nous procèderons de la même manière. Le signal de luminescence sera lu sur un
lecteur de plaques Envision® (Perkin Elmer).
3. Localisation de l’élafine
Nous allons ensuite déterminer la localisation de l’élafine sur les différents niveaux d’un
sphéroïde. Ceci nous permettra de savoir si l’élafine se situe au niveau de la tumeur ou
seulement au niveau du stroma. Après fixation au formol 4% (Sigma), les sphéroïdes seront
congelés sous forme de coupes de 5 μm. L’immunofluorescence sera réalisée comme dans
l’étude de l’équipe d’Isabelle Dufau [39]. Nous allons nous servir de l’anticorps anti-élafine
FL-117,
des
anticorps
secondaires
et
du
substrat
comme
pour
l’expérience
l’immunohistochimie.
4. Mesure de l’activité élastolytique
Nous allons mesurer l’activité élastolytique des NEs pour déterminer leur présence au sein
d’un microenvironnement du PDAC. Nous comparerons l’activité obtenue avec les sphéroïdes
Capan-2 et les sphéroïdes Capan-2 exprimant l’élafine sur des coupes congelées. L’activité
élastolytique sera mesurée avec le substrat Bodypy-FL-Elastin (0.5µm) de manière similaire à
l’équipe de J.P. Motta [20]. La fluorescence sera détectée par un lecteur de microplaque
NOVOstar (BMG Labtech).
5. Présence des métalloprotéases MMP 8 et 9 dans le microenvironnement
Connaître la présence ou non des MMPs dans les sphéroïdes est important pour caractériser le
stroma. Les MMPs remoduleraient la MEC. Nous regarderons leur présence dans les deux
types de sphéroïdes. Dans ceux où l’élafine est exprimée, nous ne devrions plus les détecter.
Pour les expériences, des lysats des sphéroïdes seront préparés et les transferts de western blot
seront réalisés de la même façon que dans l’équipe de P. Longati [41]. Les anticorps primaires
utilisés seront l’anti-MMP8 (MAB3316 EMD Millipore), et l’anti-MMP9 (HPA001238
Sigma). Les anticorps secondaires seront couplés à la peroxydase (Amersham). La révélation
se fera avec l’Immun-Star Western Chemiluminescence Kit (BIO-RAD).
6. Caractérisation des sphéroïdes
Nous allons utiliser le système d’imagerie Brightfield pour l'analyse de la distribution de taille
et la forme du stroma des deux types de sphéroïdes (Figure 13).
55
Nous mesurerons la densité optique du stroma. Cela nous permettra de caractériser la capacité
de l’élafine à moduler le stroma. Nous utiliserons les méthodes de l’équipe de M.J. Ware pour
capturer les images [40].
CONCLUSION
À la fin de notre projet, nous devrions savoir si l’élafine a un effet ou non sur l’apoptose et sur
le microenvironnement. Mais pour être comparable au génotype des patients atteints du
PDAC, il serait intéressant de faire d’autres expériences sur des souris triple transgéniques
KPC (Cre, K-ras, TP53) qui ont un génotype modifié. Alors nous pourrions connaitre l’effet
réel de l’élafine.

Dans le cas où elle induirait l’apoptose, il faudrait déterminer la voie de signalisation
impliquée. Sachant cela, nous pourrions l’utiliser comme molécule thérapeutique dans
le PDAC.

Dans le cas où elle n’induirait pas l’apoptose et qu’elle fragiliserait le
microenvironnement, il faudrait alors combiner l’élafine avec une autre molécule,
comme la gemcitabine qui est un anticancéreux de première ligne. Cette combinaison
permettrait à la gemcitabine de rentrer plus facilement dans le microenvironnement de
la
tumeur
et
d’accéder
aux
cellules
cancéreuses.
La
fragilisation
du
microenvironnement serait probablement due à l’inhibition des MMPs, qui ne
remoduleraient plus la MEC.

Dans le cas où elle n’aurait aucun effet dans le PDAC, il serait intéressant de regarder
son effet sur un autre cancer, comme le cancer colorectal.
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