Chapitre 2.1.5.

CHAPITRE 2.1.5.
PESTE DES PETITS RUMINANTS
RÉSUMÉ
La peste des petits ruminants (PPR) est une maladie contagieuse aiguë, due à un Morbillivirus de
la famille des Paramyxoviridae. Elle affecte les petits ruminants, tout particulièrement les chèvres,
qui y sont très sensibles, et occasionnellement certains animaux sauvages. La PPR est présente en
Afrique (entre l’équateur et le Sahara), dans la péninsule arabique, dans la plupart des pays du
Moyen-Orient, ainsi qu’en Asie du Sud-Ouest.
La maladie clinique ressemble à la la peste bovine. Elle est généralement aiguë et se manifeste par
du larmoiement et un jetage séreux. La PPR est caractérisée par une hyperthermie sévère qui peut
durer 3 à 5 jours, des érosions au niveau de la muqueuse buccale, de la diarrhée et une
pneumonie. A l'autopsie, le gros intestin peut porter des zébrures caractéristiques, mais elles ne
sont pas systématiquement retrouvées. Des lésions touchent les poumons montrant une
congestion ou une bronchopneumonie lorsqu’elle est associée à une infection bactérienne.
La PPR doit être impérativement différenciée de la peste bovine, de la fièvre catarrhale du mouton,
de la fièvre aphteuse et d'autres affections vésiculeuses.
Identification de l'agent pathogène : Un diagnostic par isolement du virus ne peut être réalisé
qu'à l'aide de prélèvement effectués au moment le plus approprié. Les prélèvements doivent être
effectués pendant la phase aiguë de la maladie, lorsque les signes cliniques sont encore apparents.
Ils sont réalisés à partir du larmoiement des sécrétions nasales, des muqueuses buccale et rectale,
et du sang non coagulé.
Un diagnostic rapide est effectué à l'aide d'une méthode immuno-enzymatique (ELISA)
d'immuno-capture, par électro-synérèse (ou contre-immunoélectrophorèse), ou par immunodiffusion
en gélose. Une amplification en chaîne par polymérase (PCR) peut également être utilisée.
Épreuves sérologiques : Les épreuves sérologiques utilisées en routine comprennent un test de
séroneutralisation virale et un test ELISA de compétition. D'autres tests, comme l’électro-synérèse,
le test d’immunofluorescence indirecte et le test d'inhibition de la précipitation, peuvent être
employés.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
La vaccination a été initialement réalisée avec un vaccin contre la peste bovine obtenu en culture
tissulaire parce qu’il existe une parenté antigénique entre le virus de la peste bovine et celui de la
PPR. Un vaccin homologue a été élaboré et testé par des épreuves de terrain et est disponible
dans le commerce. L’utilisation de ce vaccin contre la PPR est fortement recommandée pour éviter
toutes confusions avec la peste bovine lors des enquêtes sérologiques.
A. INTRODUCTION
La peste des petits ruminants (PPR) est une maladie virale aiguë des petits ruminants, qui se manifeste par une
hyperthermie, des sécrétions oculaires et nasales, une stomatite, une diarrhée et une pneumonie. Les animaux
infectés présentent des signes cliniques similaires à ceux de la peste bovine chez les bovins, il faudra donc
différencier les deux maladies. Le virus de la PPR (PPRV) entraîne une maladie clinique chez les moutons et les
chèvres, alors que chez les bovins aucun signe clinique n'est visible. Il est transmissible par voie aérienne entre
animaux en contact étroit (17).
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Du fait des similitudes qu'il présente avec ceux de la peste bovine, de la maladie de Carré et de la rougeole, le
PPRV a été classé dans le genre Morbillivirus, famille des Paramyxoviridae (14). Les virus membres de ce groupe
ont 6 protéines de structure : la protéine de capside nucléaire (Np), qui constitue une capsule entourant le
génome ARN du virus, la phosphoprotéine (P), qui s’associe avec la polymérase (ou protéine L pour “large” :
grande protéine), la protéine de matrice (M), la protéine de fusion (F) et l’hémagglutinine (H). La protéine de
matrice, intimement associée avec la face interne de l’enveloppe virale, effectue un lien entre la capside nucléaire
et les glycoprotéines externes virales: H et F, qui sont responsables de l’attachement et de la pénétration du virus
dans la cellule cible. La PPR a été décrite pour la première fois en Côte d'Ivoire (13), mais elle est présente dans
la plupart des pays africains entre le sud du Sahara et le nord de l’équateur (17), et dans presque tous les pays
du Moyen-Orient jusqu’à la Turquie (12, 18, 23, 31). La PPR est également répandue en Inde et en Asie centrale
(27).
La maladie naturelle affecte principalement les chèvres et les moutons. Elle est généralement plus grave chez les
chèvres et occasionne de lourdes pertes. Les cas graves chez les moutons ne sont qu'occasionnels. Il est
généralement admis que les bovins ne sont atteints que par des formes bénignes. Cependant, dans de
mauvaises conditions, il est possible que les bovins développent des lésions après une infection par le PPRV
dont les signes cliniques seront attribués à la peste bovine. Ainsi dans les années 1950, la maladie avec mortalité
a été décrite chez des bovins expérimentalement infectés par des cultures cellulaires de PPRV (27). De plus, le
PPRV a été isolé lors d’une épizootie d’une maladie ressemblant à la peste bovine chez des buffles en Inde en
1995 (15). L’implication du PPRV a également été suspectée dans l’épizootie qui a affectée des dromadaires en
Ethiopie en 1995-1996 (24, 25). L’antigène PPRV et l’acide nucléique du PPRV furent détectés dans quelques
échantillons pathologiques prélevés lors de cette épizootie, mais aucun virus vivant n’a été isolé. On a rapporté le
cas d'une maladie clinique chez des animaux sauvages, ayant causé la mort de gazelles Dorcas (Gazella dorcas),
de bouquetins de Nubie (Capra ibex nubiana), de gazelles gemsboks (Oryx gazella) et de moutons de Laristan
(Ovis orientalis laristanica) (12). Le daim à queue blanche (Odocoileus virginianus) peut être infecté
expérimentalement (16).
L'incubation dure de 4 à 6 jours, mais peut s'étendre de 3 à 10 jours. Le maladie clinique est aiguë, associée à
une hyperthermie pouvant atteindre 41°C et persister 3 à 5 jours. L'animal est abattu, il perd l'appétit, et a le
museau sec. Les sécrétions oculaires et nasales deviennent progressivement mucopurulentes, et si la mort
n'intervient pas entre temps, elles persistent pendant environ 14 jours. Au cours des 4 premiers jours de
l'hyperthermie, une congestion apparaît au niveau des gencives, et la cavité buccale présente des érosions
associées à une hypersalivation. Ces lésions peuvent évoluer vers la nécrose. Au stade terminal, une diarrhée
profuse non-hémorragique apparaît couramment, ainsi que d'autres signes cliniques : pneumonie, toux, râle
pleural, respiration abdominale. Le taux de morbidité peut atteindre 100 % tout comme le taux de mortalité
lorsque l'épizootie est particulièrement sévère. Lorsqu'elle est moins grave, le taux de mortalité ne dépasse guère
50 %. On peut tenter un diagnostic clinique de la PPR à partir de ces signes cliniques, mais en cas de présence
de la peste bovine chez les bovins, une confirmation en laboratoire est nécessaire.
A l'autopsie, les lésions sont très proches de celles caractérisant les bovins atteints de peste bovine. Les érosions
peuvent s'étendre à partir de la bouche jusqu'à la jonction entre le réseau et le rumen. Le gros intestin porte des
stries hémorragiques caractéristiques ou des zébrures, le plus souvent au niveau de la jonction caeco-colique,
mais un diagnostic définitif n’est. pas toujours possible ; toutefois une entérite nécrotique ou hémorrhagique est
habituellement présente Les noeuds lymphatiques sont hypertrophiéds,la rate peut présenter une nécrose et on
constate une pneumonie apicale.
La manipulation du PPRV ne comporte aucun danger pour l'homme, aucun cas d'infection n'a été signalé.
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1. Identification de l'agent pathogène
a) Prélèvements
Chez les animaux vivants, des écouvillonnages sont prélevés au niveau des muqueuses nasale et buccale.
Au cours de la phase très précoce de la maladie, on prélève du sang complet sur anti-coagulant pour
pouvoir isoler le virus et effectuer une PCR et une analyse hématologique. A l’autopsie (2 à 3 animaux), les
noeuds lymphatiques, et notamment les nœuds mésentériques et bronchiques, les poumons, la rate et la
muqueuse intestinale doivent être prélevés aseptiquement, refroidis sur de la glace et transportés sous froid.
Des fragments d’organes sont collectés pour l’histopathologie et placés dans du formol à 10 %. A la fin de
l’épizootie, le sang peut être collecté pour le diagnostic sérologique.
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b) Immunodiffusion en gélose
L'immunodiffusion en gélose (IDG) est une épreuve simple et peu coûteuse que l'on peut effectuer dans
n'importe quel laboratoire voire directement sur le terrain. On obtient des antigènes viraux PPR standards à
partir des noeuds lymphatiques bronchiques et mésentériques, de la rate ou des poumons, puis on les met
en suspension au 1/3 dans une solution tamponnée. Ces suspensions sont centrifugées à 500 g pendant 10
à 20 min, le surnageant est ensuite conservé sous forme d'aliquots à –20°C. L’extrémité en coton issu du
coton-tige utilisé lors de l’écouvillonage nasal ou oculaire est enlevé à l’aide d’un scalpel et inséré dans une
seringue de 1 ml. Avec 0,2 ml de tampon phosphate (PBS, Phosphate Buffered Saline), l’échantillon est
extrait par des expulsions et des remplissages répétés de 0,2 ml de PBS dans un tube Eppendorf en
utilisant le piston de la seringue. L’échantillon extrait de l’écouvillonage nasal ou oculaire, peut être conservé
à –20°C jusqu’à utilisation, comme la suspension de matériel tissulaire préparé ci-dessus. Il peuvent être
conservés jusqu'à 3 ans. On prépare de la même façon un antigène témoin (témoin négatif) à partir de
tissus sains. On obtient de l'antisérum standard en hyperimmunisant des moutons avec 1 ml de PPRV titré à
104 DICT50 (dose de virus infectant 50 % de la culture tissulaire) par ml administrés chaque semaine
pendant 4 semaines. Les animaux sont saignés 5 ou 7 jours après la dernière injection (7). La détection des
antigènes PPR peut aussi s'effectuer à l'aide d'un antisérum hyperimmun standard anti-peste bovine.
i) Dans des boîtes de Petri, déposer 1 % de gélose en milieu isotonique contenant un agent
bactériostatique comme de l'azide de sodium (1,25 g/litre) ou du thiomersal (0,4 g/litre) (6 ml/5 cm) ;
ii) Creuser les puits dans la gélose, selon un schéma hexagonal comportant un puits central. Les puits
ont 5 mm de diamètre et sont distants de 5 mm ;
iii) Remplir le puit central avec de l'antisérum positif, puis 3 puits périphériques avec de l'antigène positif et
un autre avec de l'antigène négatif. Saturer enfin les 2 autres puits périphériques avec l'antigène à
tester de telle sorte que l’antigène à tester et le témoin négatif alternent avec les témoins positifs ;
iv) De façon générale, 1, 2 ou 3 lignes de précipitation vont se former entre le sérum et les antigènes dans
un délai de 18 à 24 h (9, 29). On les fait mieux ressortir en lavant la gélose à l'aide d'acide acétique
glacial à 5 % pendant 5 min (on procédera à ce lavage sur toutes les épreuves apparemment
négatives avant de pouvoir les considérer comme telles). Les réactions positives présentent des lignes
d’identité avec l’antigène utilisé comme témoin positif.
On obtient des résultats en 24 h, mais l’épreuve n'est pas assez sensible pour détecter les formes bénignes
de PPR du fait de la quantité insuffisante d'antigène viral excrété.
c) Méthode immuno-enzymatique par immunocapture
La méthode immuno-enzymatique (ELISA) par immunocapture (19) utilise plusieurs anticorps monoclonaux
anti-N (AcMs), et permet une identification différentielle rapide de la peste bovine et de la PPR. Cette
différenciation est essentielle : les 2 maladies avaient jusqu’à récemment la même répartition géographique
et pouvaient affecter les mêmes espèces animales.
i) Les plaques de microtitrage (ex : les plaques de haute capacité d’adsorption Maxisorb Nunc) sont
sensibilisées avec 100 µl de la solution d’AcMs pièges (diluée selon les instructions du Laboratoire de
référence procurant la trousse). Ces AcMs réagissent avec les 2 virus, peste bovine et PPR ;
ii) Après un lavage, 50 µl de suspension de prélèvement sont ajoutés dans 4 puits, les puits témoins
contenant du tampon ;
iii) Immédiatement après, on ajoute dans deux des puits, 25 µl d’AcMs de détection du virus de la PPR
biotynilé et 25 µl de peroxydase/streptavidine, ainsi que 25 µl d’AcMs de détection du virus de la peste
bovine et 25 µl de peroxydase/streptavidine dans les 2 autres ;
iv) Les plaques sont incubées à 37°C pendant 1 h, sous agitation continue ;
v) Après 3 lavages complets, 100 µl d'ortho-phénylènediamine (OPD) dans de l'eau oxygénée sont
ajoutés, puis les microplaques sont incubées pour 10 min de plus à température ambiante ;
vi) On arrête la réaction en ajoutant 100 µl d'acide sulfurique 1 N. L'absorption est mesurée à 492 nm sur
un lecteur spectrophotométrique de plaques ELISA.
La limite au delà de laquelle les échantillons sont considérés comme positifs est calculée à partir de chaque
blanc (blanc de PPR et blanc de peste bovine) comme étant 3 fois la moyenne des valeurs d’absorbance.
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On peut également effectuer un test ELISA sandwich : le prélèvement est d'abord amené à réagir avec
l’AcM révélateur, le complexe immun est alors piégé par le second AcM adsorbé sur la plaque ELISA.
Cette épreuve est très spécifique et très sensible (elle peut détecter 100,6 DICT50/puits pour le PPRV, et 102,2
DICT50 pour celui de la peste bovine). Les résultats sont obtenus en 2 h.
d) Méthodes de reconnaissance des acides nucléiques
Des clones d'ADNc marqués au 32P ont été utilisés pour différencier la PPR et la peste bovine (5) mais leur
utilisation systématique pour le diagnostic est déconseillée : la période du 32P est réduite et un équipement
de protection est nécessaire pour l'utilisateur.
Une technique d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) basée sur l’amplification des gènes des
protéines Np et F a été développée pour le diagnostic spécifique de la PPR (4, 11). Cette technique est très
sensible par comparaison à d’autres épreuves et elle donne des résultats en 5 h, extraction de l'ARN
comprise. Le Laboratoire de référence de l'OIE et de la FAO pour la PPR en France (se reporter à la liste de
la partie 3 de ce Manuel terrestre) peut fournir de plus amples informations quant à l'utilisation de cette
technique.
e) Contre-immunoélectrophorèse
L’électro-synérèse (ou contre-immunoélectrophorèse) (CIEP) est l’épreuve la plus rapide pour rechercher un
antigène viral (9, 21). Une surface horizontale sert de support à l’épreuve, associée à une cuve
d'électrophorèse appropriée comportant 2 compartiments reliés par un pont. L'appareil est branché sur un
courant haute-tension. On dépose sur des lames porte-objet des volumes de 3 ml de gélose ou d'agarose (1
à 2 %, [m/v]) dissout dans un tampon d'acétate de barbitone 0,025 M. On creuse dans la gélose solide 6 à 9
paires de trous. On utilise les mêmes réactifs que pour l’IDG. On remplit la cuve d'électrophorèse avec du
tampon d'acétate de barbitone 0,1 M. Les puits de gélose sont remplis avec les réactifs : les puits de l'anode
avec des sérums et les puits de la cathode avec de l'antigène. La lame est placée sur le pont de liaison, on
relie ses extrémités au tampon à l'aide de papier poreux humidifié. On recouvre l'appareil, et on applique à
chaque lame un courant de 10 à 12 mA pendant 30 à 60 min, après lesquelles on coupe le courant et on
observe les lames sous un éclairage intense. La réaction est positive quand apparaissent 1 à 3 lignes de
précipitation entre les paires de puits. Aucune réaction entre les puits témoins négatifs ne doit être observée.
f) Méthodes d'isolement et de culture
En vue d'un examen plus approfondi, le virus doit toujours être isolé à partir de prélèvements de terrain en
culture tissulaire, et ce même si le diagnostic a déjà été effectué par des techniques rapides (9, 17).
Le PPRV peut être isolé sur cellules primaires de rein d'agneau ou sur cellules rénales de singe vervet
d'Afrique (Vero). On ensemence des cultures en monocouche avec le matériel suspect (prélévement
d’écouvillonage, culot leucocytaire ou suspensions tissulaires à 10 %), puis on vérifie quotidiennement si un
effet cytopathogène (ECP) apparaît. L'ECP produit par le PPRV peut se développer en 5 jours et se
manifeste par l'arrondissement puis par l'agrégation des cellules qui s'organisent pour former des
syncytiums pour les cellules de rein d’agneau. Pour les cellules Vero, il est parfois difficile de voir les
syncytiums. S’ils existent, ils sont très petits. Cependant, dans les cellules Vero infectées et marquées, de
petits syncytiums sont toujours visibles. Les syncytiums se caractérisent par un arrangement circulaire des
noyaux donnant aux cellules une apparence de « cadran d'horloge ». Un ECP apparaîtra avant le cinquième
jour pour des cultures sur lamelles porte-objet. Apparaissent également des inclusions intracytoplasmiques
et intranucléaires. Certaines cellules ont une vacuole. Des modifications cellulaires peuvent être aussi
observées sur les coupes histopathologiques colorées des tissus contaminés. Après 5 ou 6 jours, des
passages aveugles doivent être effectués car l'ECP peut ne pas apparaître immédiatement.
g) Autres techniques de détection du virus
D’autres techniques de détection du virus présentent des avantages potentiels, mais leur utilisation n’est pas
pour l’instant très répandue. Alors que l’isolement du virus nécessite que les échantillons pathologiques
soient conservés au froid jusqu’au début de leur traitement, il est possible de les conserver à température
ambiante dans une solution formolée de fixation et de les analyser plus tard directement par
immunofluorescence (IF) ou par épreuve immunochimique (2, 3, 28). L’IF a été utilisée avec succés sur des
frottis de conjonctive et sur des tissus collectés lors de l’autopsie ; les frottis sont fixés en acétone froide. Il a
été démontré que contrairement au virus de la peste bovine mais comme les virus de la rougeole, le PPRV a
une capacité d’hémagglutination. Cette caractéristique a été utilisée pour le diagnostic spécifique, rapide et
peu coûteux de l’infection PPR (15, 33).
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2. Épreuves sérologiques
Les chèvres et les moutons infectés par le PPRV produisent des anticorps, ce qui peut confirmer le diagnostic par
recherche du virus ou des antigènes. Les tests couramment utilisés sont la séroneutralisation virale (SN), et
l’ELISA de compétition. D'autres tests, comme le CIEP (10), l'IDG (31), l'inhibition de la précipitation et la
fluorescence indirecte (8), ont fait l'objet de descriptions mais ils ne présentent que peu d'intérêt face aux tests de
SN et ELISA.
a) Séroneutralisation virale (épreuve prescrite pour les échanges internationaux)
Ce test est sensible et spécifique, mais il demande du temps. La séroneutralisation standard est réalisée en
culture en tubes sous agitation de cellules primaires de rein d’agneau, ou de cellules Vero quand les cellules
primaires ne sont pas disponibles.
i) Diluer 1 ml de sérum inactivé, 2 fois dans une dilution en séries et mélanger avec une suspension
virale stock contenant approximativement 103 DICT50/ml ;
ii) Incuber le mélange virus/sérum soit 1 h à 37°C, soit toute la nuit à 4°C ;
iii) Inoculer 0,2 ml du mélange à chacun des 5 tubes roulants, suivi immédiatement par 1 ml de la
suspension de cellules Vero en milieu de culture à un taux de 2 x 105 cellules/ml ;
iv) Incuber les tubes en pente pendant 3 jours à 37°C ;
v) Eliminer les tubes présentant un ECP spécifique du virus ; remplacer le milieu dans les tubes restant
avec le milieu de culture, et faire tourner les tubes pendant 7 autres jours. La dose d’épreuve virale est
acceptable si elle se situe entre 101,8 et 102,8 DICT50/ tube. Tout anticorp détectable à une dilution de
1/8, est considéré comme positif.
Habituellement, on effectue un test de séroneutralisation croisée avec le virus de la peste bovine. Un sérum
est considéré comme positif vis-à-vis de la PPR lorsque le titre neutralisant est au moins 2 fois plus élevé
pour le virus de la PPR que pour celui de la peste bovine.
b) Méthode immuno-enzymatique de compétition
Des ELISA de compétition utilisant des AcMs anti-nucléoprotéine et une nucléoprotéine recombinante
produite en baculovirus ont été décrits (20).
i) Sensibiliser les plaques de microtitrage (ex : plaques à haute capacité d’adsorption Maxisorb Nunc)
avec 50 µl d'une dilution connue de protéines N-PPR (produites par un baculovirus recombinant), et
laisser les 1 h à 37°C sous agitation continue ;
ii) Laver les plaques 3 fois et laisser sécher ;
iii) Placer 45 µl de tampon bloquant (PBS + 0,5 % de Tween 20 + sérum de veau foetal à 0,5 %) dans
chaque puits, puis ajouter 5 µl de sérums à analyser dans les puits tests (dilution finale de 1/20e) et 5 µl
de sérums témoins différents (sérum fortement positif, faiblement positif et négatif) dans les puits
témoins ;
iv) Ajouter 50 µl de l’AcMs dilué au 1/100e dans du tampon bloquant, et incuber à 37°C pendant 1 h ;
v) Laver les plaques 3 fois et laisser sécher ;
vi) Ajouter 50 µl de conjugué anti-souris dilué au 1/1 000e et incuber à 37°C pendant 1 h ;
vii) Laver les plaques 3 fois ;
viii) Préparer de l'OPD dans une solution d'eau oxygénée. Ajouter 50 µl de mélange substrat/conjugué
dans chaque puits. Arrêter la réaction au bout de 10 min à l'aide de 50 µl d'acide sulfurique 1 M ;
ix) Lire les résultats avec un lecteur de plaques ELISA à 492 nm
L'absorption est convertie en pourcentage d'inhibition (PI) selon la formule :
PI = 100 - (absorption des puits testés / absorption des puits témoins AcMs) x 100
Les sérums dont le PI est supérieur à 50 % sont considérés comme positifs.
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