Chapitre 2.1.5.

CHAPITRE 2.1.5.
PESTE DES PETITS RUMINANTS
RÉSUMÉ
La peste des petits ruminants (PPR) est une maladie contagieuse aiguë, due à un Morbillivirus de
la famille des Paramyxoviridae. Elle affecte les petits ruminants, tout particulièrement les chèvres,
qui y sont très sensibles, et occasionnellement certains animaux sauvages. La PPR est présente en
Afrique (entre l’équateur et le Sahara), dans la péninsule arabique, dans la plupart des pays du
Moyen-Orient, ainsi qu’en Asie du Sud-Ouest.
La maladie clinique ressemble à la la peste bovine. Elle est généralement aiguë et se manifeste par
du larmoiement et un jetage séreux. La PPR est caractérisée par une hyperthermie sévère qui peut
durer 3 à 5 jours, des érosions au niveau de la muqueuse buccale, de la diarrhée et une
pneumonie. A l'autopsie, le gros intestin peut porter des zébrures caractéristiques, mais elles ne
sont pas systématiquement retrouvées. Des lésions touchent les poumons montrant une
congestion ou une bronchopneumonie lorsqu’elle est associée à une infection bactérienne.
La PPR doit être impérativement différenciée de la peste bovine, de la fièvre catarrhale du mouton,
de la fièvre aphteuse et d'autres affections vésiculeuses.
Identification de l'agent pathogène : Un diagnostic par isolement du virus ne peut être réalisé
qu'à l'aide de prélèvement effectués au moment le plus approprié. Les prélèvements doivent être
effectués pendant la phase aiguë de la maladie, lorsque les signes cliniques sont encore apparents.
Ils sont réalisés à partir du larmoiement des sécrétions nasales, des muqueuses buccale et rectale,
et du sang non coagulé.
Un diagnostic rapide est effectué à l'aide d'une méthode immuno-enzymatique (ELISA)
d'immuno-capture, par électro-synérèse (ou contre-immunoélectrophorèse), ou par immunodiffusion
en gélose. Une amplification en chaîne par polymérase (PCR) peut également être utilisée.
Épreuves sérologiques : Les épreuves sérologiques utilisées en routine comprennent un test de
séroneutralisation virale et un test ELISA de compétition. D'autres tests, comme l’électro-synérèse,
le test d’immunofluorescence indirecte et le test d'inhibition de la précipitation, peuvent être
employés.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
La vaccination a été initialement réalisée avec un vaccin contre la peste bovine obtenu en culture
tissulaire parce qu’il existe une parenté antigénique entre le virus de la peste bovine et celui de la
PPR. Un vaccin homologue a été élaboré et testé par des épreuves de terrain et est disponible
dans le commerce. L’utilisation de ce vaccin contre la PPR est fortement recommandée pour éviter
toutes confusions avec la peste bovine lors des enquêtes sérologiques.
A. INTRODUCTION
La peste des petits ruminants (PPR) est une maladie virale aiguë des petits ruminants, qui se manifeste par une
hyperthermie, des sécrétions oculaires et nasales, une stomatite, une diarrhée et une pneumonie. Les animaux
infectés présentent des signes cliniques similaires à ceux de la peste bovine chez les bovins, il faudra donc
différencier les deux maladies. Le virus de la PPR (PPRV) entraîne une maladie clinique chez les moutons et les
chèvres, alors que chez les bovins aucun signe clinique n'est visible. Il est transmissible par voie aérienne entre
animaux en contact étroit (17).
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Chapitre 2.1.5. — Peste des petits ruminants
Du fait des similitudes qu'il présente avec ceux de la peste bovine, de la maladie de Carré et de la rougeole, le
PPRV a été classé dans le genre Morbillivirus, famille des Paramyxoviridae (14). Les virus membres de ce groupe
ont 6 protéines de structure : la protéine de capside nucléaire (Np), qui constitue une capsule entourant le
génome ARN du virus, la phosphoprotéine (P), qui s’associe avec la polymérase (ou protéine L pour “large” :
grande protéine), la protéine de matrice (M), la protéine de fusion (F) et l’hémagglutinine (H). La protéine de
matrice, intimement associée avec la face interne de l’enveloppe virale, effectue un lien entre la capside nucléaire
et les glycoprotéines externes virales: H et F, qui sont responsables de l’attachement et de la pénétration du virus
dans la cellule cible. La PPR a été décrite pour la première fois en Côte d'Ivoire (13), mais elle est présente dans
la plupart des pays africains entre le sud du Sahara et le nord de l’équateur (17), et dans presque tous les pays
du Moyen-Orient jusqu’à la Turquie (12, 18, 23, 31). La PPR est également répandue en Inde et en Asie centrale
(27).
La maladie naturelle affecte principalement les chèvres et les moutons. Elle est généralement plus grave chez les
chèvres et occasionne de lourdes pertes. Les cas graves chez les moutons ne sont qu'occasionnels. Il est
généralement admis que les bovins ne sont atteints que par des formes bénignes. Cependant, dans de
mauvaises conditions, il est possible que les bovins développent des lésions après une infection par le PPRV
dont les signes cliniques seront attribués à la peste bovine. Ainsi dans les années 1950, la maladie avec mortalité
a été décrite chez des bovins expérimentalement infectés par des cultures cellulaires de PPRV (27). De plus, le
PPRV a été isolé lors d’une épizootie d’une maladie ressemblant à la peste bovine chez des buffles en Inde en
1995 (15). L’implication du PPRV a également été suspectée dans l’épizootie qui a affectée des dromadaires en
Ethiopie en 1995-1996 (24, 25). L’antigène PPRV et l’acide nucléique du PPRV furent détectés dans quelques
échantillons pathologiques prélevés lors de cette épizootie, mais aucun virus vivant n’a été isolé. On a rapporté le
cas d'une maladie clinique chez des animaux sauvages, ayant causé la mort de gazelles Dorcas (Gazella dorcas),
de bouquetins de Nubie (Capra ibex nubiana), de gazelles gemsboks (Oryx gazella) et de moutons de Laristan
(Ovis orientalis laristanica) (12). Le daim à queue blanche (Odocoileus virginianus) peut être infecté
expérimentalement (16).
L'incubation dure de 4 à 6 jours, mais peut s'étendre de 3 à 10 jours. Le maladie clinique est aiguë, associée à
une hyperthermie pouvant atteindre 41°C et persister 3 à 5 jours. L'animal est abattu, il perd l'appétit, et a le
museau sec. Les sécrétions oculaires et nasales deviennent progressivement mucopurulentes, et si la mort
n'intervient pas entre temps, elles persistent pendant environ 14 jours. Au cours des 4 premiers jours de
l'hyperthermie, une congestion apparaît au niveau des gencives, et la cavité buccale présente des érosions
associées à une hypersalivation. Ces lésions peuvent évoluer vers la nécrose. Au stade terminal, une diarrhée
profuse non-hémorragique apparaît couramment, ainsi que d'autres signes cliniques : pneumonie, toux, râle
pleural, respiration abdominale. Le taux de morbidité peut atteindre 100 % tout comme le taux de mortalité
lorsque l'épizootie est particulièrement sévère. Lorsqu'elle est moins grave, le taux de mortalité ne dépasse guère
50 %. On peut tenter un diagnostic clinique de la PPR à partir de ces signes cliniques, mais en cas de présence
de la peste bovine chez les bovins, une confirmation en laboratoire est nécessaire.
A l'autopsie, les lésions sont très proches de celles caractérisant les bovins atteints de peste bovine. Les érosions
peuvent s'étendre à partir de la bouche jusqu'à la jonction entre le réseau et le rumen. Le gros intestin porte des
stries hémorragiques caractéristiques ou des zébrures, le plus souvent au niveau de la jonction caeco-colique,
mais un diagnostic définitif n’est. pas toujours possible ; toutefois une entérite nécrotique ou hémorrhagique est
habituellement présente Les noeuds lymphatiques sont hypertrophiéds,la rate peut présenter une nécrose et on
constate une pneumonie apicale.
La manipulation du PPRV ne comporte aucun danger pour l'homme, aucun cas d'infection n'a été signalé.
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1.
Identification de l'agent pathogène
a)
Prélèvements
Chez les animaux vivants, des écouvillonnages sont prélevés au niveau des muqueuses nasale et buccale.
Au cours de la phase très précoce de la maladie, on prélève du sang complet sur anti-coagulant pour
pouvoir isoler le virus et effectuer une PCR et une analyse hématologique. A l’autopsie (2 à 3 animaux), les
noeuds lymphatiques, et notamment les nœuds mésentériques et bronchiques, les poumons, la rate et la
muqueuse intestinale doivent être prélevés aseptiquement, refroidis sur de la glace et transportés sous froid.
Des fragments d’organes sont collectés pour l’histopathologie et placés dans du formol à 10 %. A la fin de
l’épizootie, le sang peut être collecté pour le diagnostic sérologique.
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b)
Immunodiffusion en gélose
L'immunodiffusion en gélose (IDG) est une épreuve simple et peu coûteuse que l'on peut effectuer dans
n'importe quel laboratoire voire directement sur le terrain. On obtient des antigènes viraux PPR standards à
partir des noeuds lymphatiques bronchiques et mésentériques, de la rate ou des poumons, puis on les met
en suspension au 1/3 dans une solution tamponnée. Ces suspensions sont centrifugées à 500 g pendant 10
à 20 min, le surnageant est ensuite conservé sous forme d'aliquots à –20°C. L’extrémité en coton issu du
coton-tige utilisé lors de l’écouvillonage nasal ou oculaire est enlevé à l’aide d’un scalpel et inséré dans une
seringue de 1 ml. Avec 0,2 ml de tampon phosphate (PBS, Phosphate Buffered Saline), l’échantillon est
extrait par des expulsions et des remplissages répétés de 0,2 ml de PBS dans un tube Eppendorf en
utilisant le piston de la seringue. L’échantillon extrait de l’écouvillonage nasal ou oculaire, peut être conservé
à –20°C jusqu’à utilisation, comme la suspension de matériel tissulaire préparé ci-dessus. Il peuvent être
conservés jusqu'à 3 ans. On prépare de la même façon un antigène témoin (témoin négatif) à partir de
tissus sains. On obtient de l'antisérum standard en hyperimmunisant des moutons avec 1 ml de PPRV titré à
104 DICT50 (dose de virus infectant 50 % de la culture tissulaire) par ml administrés chaque semaine
pendant 4 semaines. Les animaux sont saignés 5 ou 7 jours après la dernière injection (7). La détection des
antigènes PPR peut aussi s'effectuer à l'aide d'un antisérum hyperimmun standard anti-peste bovine.
i)
Dans des boîtes de Petri, déposer 1 % de gélose en milieu isotonique contenant un agent
bactériostatique comme de l'azide de sodium (1,25 g/litre) ou du thiomersal (0,4 g/litre) (6 ml/5 cm) ;
ii)
Creuser les puits dans la gélose, selon un schéma hexagonal comportant un puits central. Les puits
ont 5 mm de diamètre et sont distants de 5 mm ;
iii)
Remplir le puit central avec de l'antisérum positif, puis 3 puits périphériques avec de l'antigène positif et
un autre avec de l'antigène négatif. Saturer enfin les 2 autres puits périphériques avec l'antigène à
tester de telle sorte que l’antigène à tester et le témoin négatif alternent avec les témoins positifs ;
iv)
De façon générale, 1, 2 ou 3 lignes de précipitation vont se former entre le sérum et les antigènes dans
un délai de 18 à 24 h (9, 29). On les fait mieux ressortir en lavant la gélose à l'aide d'acide acétique
glacial à 5 % pendant 5 min (on procédera à ce lavage sur toutes les épreuves apparemment
négatives avant de pouvoir les considérer comme telles). Les réactions positives présentent des lignes
d’identité avec l’antigène utilisé comme témoin positif.
On obtient des résultats en 24 h, mais l’épreuve n'est pas assez sensible pour détecter les formes bénignes
de PPR du fait de la quantité insuffisante d'antigène viral excrété.
c)
Méthode immuno-enzymatique par immunocapture
La méthode immuno-enzymatique (ELISA) par immunocapture (19) utilise plusieurs anticorps monoclonaux
anti-N (AcMs), et permet une identification différentielle rapide de la peste bovine et de la PPR. Cette
différenciation est essentielle : les 2 maladies avaient jusqu’à récemment la même répartition géographique
et pouvaient affecter les mêmes espèces animales.
i)
Les plaques de microtitrage (ex : les plaques de haute capacité d’adsorption Maxisorb Nunc) sont
sensibilisées avec 100 µl de la solution d’AcMs pièges (diluée selon les instructions du Laboratoire de
référence procurant la trousse). Ces AcMs réagissent avec les 2 virus, peste bovine et PPR ;
ii)
Après un lavage, 50 µl de suspension de prélèvement sont ajoutés dans 4 puits, les puits témoins
contenant du tampon ;
iii)
Immédiatement après, on ajoute dans deux des puits, 25 µl d’AcMs de détection du virus de la PPR
biotynilé et 25 µl de peroxydase/streptavidine, ainsi que 25 µl d’AcMs de détection du virus de la peste
bovine et 25 µl de peroxydase/streptavidine dans les 2 autres ;
iv)
Les plaques sont incubées à 37°C pendant 1 h, sous agitation continue ;
v)
Après 3 lavages complets, 100 µl d'ortho-phénylènediamine (OPD) dans de l'eau oxygénée sont
ajoutés, puis les microplaques sont incubées pour 10 min de plus à température ambiante ;
vi)
On arrête la réaction en ajoutant 100 µl d'acide sulfurique 1 N. L'absorption est mesurée à 492 nm sur
un lecteur spectrophotométrique de plaques ELISA.
La limite au delà de laquelle les échantillons sont considérés comme positifs est calculée à partir de chaque
blanc (blanc de PPR et blanc de peste bovine) comme étant 3 fois la moyenne des valeurs d’absorbance.
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On peut également effectuer un test ELISA sandwich : le prélèvement est d'abord amené à réagir avec
l’AcM révélateur, le complexe immun est alors piégé par le second AcM adsorbé sur la plaque ELISA.
Cette épreuve est très spécifique et très sensible (elle peut détecter 100,6 DICT50/puits pour le PPRV, et 102,2
DICT50 pour celui de la peste bovine). Les résultats sont obtenus en 2 h.
d)
Méthodes de reconnaissance des acides nucléiques
Des clones d'ADNc marqués au 32P ont été utilisés pour différencier la PPR et la peste bovine (5) mais leur
utilisation systématique pour le diagnostic est déconseillée : la période du 32P est réduite et un équipement
de protection est nécessaire pour l'utilisateur.
Une technique d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) basée sur l’amplification des gènes des
protéines Np et F a été développée pour le diagnostic spécifique de la PPR (4, 11). Cette technique est très
sensible par comparaison à d’autres épreuves et elle donne des résultats en 5 h, extraction de l'ARN
comprise. Le Laboratoire de référence de l'OIE et de la FAO pour la PPR en France (se reporter à la liste de
la partie 3 de ce Manuel terrestre) peut fournir de plus amples informations quant à l'utilisation de cette
technique.
e)
Contre-immunoélectrophorèse
L’électro-synérèse (ou contre-immunoélectrophorèse) (CIEP) est l’épreuve la plus rapide pour rechercher un
antigène viral (9, 21). Une surface horizontale sert de support à l’épreuve, associée à une cuve
d'électrophorèse appropriée comportant 2 compartiments reliés par un pont. L'appareil est branché sur un
courant haute-tension. On dépose sur des lames porte-objet des volumes de 3 ml de gélose ou d'agarose (1
à 2 %, [m/v]) dissout dans un tampon d'acétate de barbitone 0,025 M. On creuse dans la gélose solide 6 à 9
paires de trous. On utilise les mêmes réactifs que pour l’IDG. On remplit la cuve d'électrophorèse avec du
tampon d'acétate de barbitone 0,1 M. Les puits de gélose sont remplis avec les réactifs : les puits de l'anode
avec des sérums et les puits de la cathode avec de l'antigène. La lame est placée sur le pont de liaison, on
relie ses extrémités au tampon à l'aide de papier poreux humidifié. On recouvre l'appareil, et on applique à
chaque lame un courant de 10 à 12 mA pendant 30 à 60 min, après lesquelles on coupe le courant et on
observe les lames sous un éclairage intense. La réaction est positive quand apparaissent 1 à 3 lignes de
précipitation entre les paires de puits. Aucune réaction entre les puits témoins négatifs ne doit être observée.
f)
Méthodes d'isolement et de culture
En vue d'un examen plus approfondi, le virus doit toujours être isolé à partir de prélèvements de terrain en
culture tissulaire, et ce même si le diagnostic a déjà été effectué par des techniques rapides (9, 17).
Le PPRV peut être isolé sur cellules primaires de rein d'agneau ou sur cellules rénales de singe vervet
d'Afrique (Vero). On ensemence des cultures en monocouche avec le matériel suspect (prélévement
d’écouvillonage, culot leucocytaire ou suspensions tissulaires à 10 %), puis on vérifie quotidiennement si un
effet cytopathogène (ECP) apparaît. L'ECP produit par le PPRV peut se développer en 5 jours et se
manifeste par l'arrondissement puis par l'agrégation des cellules qui s'organisent pour former des
syncytiums pour les cellules de rein d’agneau. Pour les cellules Vero, il est parfois difficile de voir les
syncytiums. S’ils existent, ils sont très petits. Cependant, dans les cellules Vero infectées et marquées, de
petits syncytiums sont toujours visibles. Les syncytiums se caractérisent par un arrangement circulaire des
noyaux donnant aux cellules une apparence de « cadran d'horloge ». Un ECP apparaîtra avant le cinquième
jour pour des cultures sur lamelles porte-objet. Apparaissent également des inclusions intracytoplasmiques
et intranucléaires. Certaines cellules ont une vacuole. Des modifications cellulaires peuvent être aussi
observées sur les coupes histopathologiques colorées des tissus contaminés. Après 5 ou 6 jours, des
passages aveugles doivent être effectués car l'ECP peut ne pas apparaître immédiatement.
g)
Autres techniques de détection du virus
D’autres techniques de détection du virus présentent des avantages potentiels, mais leur utilisation n’est pas
pour l’instant très répandue. Alors que l’isolement du virus nécessite que les échantillons pathologiques
soient conservés au froid jusqu’au début de leur traitement, il est possible de les conserver à température
ambiante dans une solution formolée de fixation et de les analyser plus tard directement par
immunofluorescence (IF) ou par épreuve immunochimique (2, 3, 28). L’IF a été utilisée avec succés sur des
frottis de conjonctive et sur des tissus collectés lors de l’autopsie ; les frottis sont fixés en acétone froide. Il a
été démontré que contrairement au virus de la peste bovine mais comme les virus de la rougeole, le PPRV a
une capacité d’hémagglutination. Cette caractéristique a été utilisée pour le diagnostic spécifique, rapide et
peu coûteux de l’infection PPR (15, 33).
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2.
Épreuves sérologiques
Les chèvres et les moutons infectés par le PPRV produisent des anticorps, ce qui peut confirmer le diagnostic par
recherche du virus ou des antigènes. Les tests couramment utilisés sont la séroneutralisation virale (SN), et
l’ELISA de compétition. D'autres tests, comme le CIEP (10), l'IDG (31), l'inhibition de la précipitation et la
fluorescence indirecte (8), ont fait l'objet de descriptions mais ils ne présentent que peu d'intérêt face aux tests de
SN et ELISA.
a)
Séroneutralisation virale (épreuve prescrite pour les échanges internationaux)
Ce test est sensible et spécifique, mais il demande du temps. La séroneutralisation standard est réalisée en
culture en tubes sous agitation de cellules primaires de rein d’agneau, ou de cellules Vero quand les cellules
primaires ne sont pas disponibles.
i)
Diluer 1 ml de sérum inactivé, 2 fois dans une dilution en séries et mélanger avec une suspension
virale stock contenant approximativement 103 DICT50/ml ;
ii)
Incuber le mélange virus/sérum soit 1 h à 37°C, soit toute la nuit à 4°C ;
iii)
Inoculer 0,2 ml du mélange à chacun des 5 tubes roulants, suivi immédiatement par 1 ml de la
suspension de cellules Vero en milieu de culture à un taux de 2 x 105 cellules/ml ;
iv)
Incuber les tubes en pente pendant 3 jours à 37°C ;
v)
Eliminer les tubes présentant un ECP spécifique du virus ; remplacer le milieu dans les tubes restant
avec le milieu de culture, et faire tourner les tubes pendant 7 autres jours. La dose d’épreuve virale est
acceptable si elle se situe entre 101,8 et 102,8 DICT50/ tube. Tout anticorp détectable à une dilution de
1/8, est considéré comme positif.
Habituellement, on effectue un test de séroneutralisation croisée avec le virus de la peste bovine. Un sérum
est considéré comme positif vis-à-vis de la PPR lorsque le titre neutralisant est au moins 2 fois plus élevé
pour le virus de la PPR que pour celui de la peste bovine.
b)
Méthode immuno-enzymatique de compétition
Des ELISA de compétition utilisant des AcMs anti-nucléoprotéine et une nucléoprotéine recombinante
produite en baculovirus ont été décrits (20).
i)
Sensibiliser les plaques de microtitrage (ex : plaques à haute capacité d’adsorption Maxisorb Nunc)
avec 50 µl d'une dilution connue de protéines N-PPR (produites par un baculovirus recombinant), et
laisser les 1 h à 37°C sous agitation continue ;
ii)
Laver les plaques 3 fois et laisser sécher ;
iii)
Placer 45 µl de tampon bloquant (PBS + 0,5 % de Tween 20 + sérum de veau foetal à 0,5 %) dans
chaque puits, puis ajouter 5 µl de sérums à analyser dans les puits tests (dilution finale de 1/20e) et 5 µl
de sérums témoins différents (sérum fortement positif, faiblement positif et négatif) dans les puits
témoins ;
iv)
Ajouter 50 µl de l’AcMs dilué au 1/100e dans du tampon bloquant, et incuber à 37°C pendant 1 h ;
v)
Laver les plaques 3 fois et laisser sécher ;
vi)
e
Ajouter 50 µl de conjugué anti-souris dilué au 1/1 000 et incuber à 37°C pendant 1 h ;
vii)
Laver les plaques 3 fois ;
viii) Préparer de l'OPD dans une solution d'eau oxygénée. Ajouter 50 µl de mélange substrat/conjugué
dans chaque puits. Arrêter la réaction au bout de 10 min à l'aide de 50 µl d'acide sulfurique 1 M ;
ix)
Lire les résultats avec un lecteur de plaques ELISA à 492 nm
L'absorption est convertie en pourcentage d'inhibition (PI) selon la formule :
PI = 100 - (absorption des puits testés / absorption des puits témoins AcMs) x 100
Les sérums dont le PI est supérieur à 50 % sont considérés comme positifs.
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Deux autres techniques d’ELISA de compétition, basés sur l’utilisation d’un AcM anti-hémagglutinine (H), ont
également été décrites (1, 26).
C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS
BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE
Les moutons et les chèvres ayant survécu à la PPR, développent, une fois guéris, une immunité active contre la
maladie. Des anticorps ont été mis en évidence 4 ans après l'infection (8), mais l’immunité est probablement à
vie. Un vaccin homologue de la PPR est disponible. En 1998, le Comité International de l’OIE a approuvé
l’utilisation de ce vaccin dans les pays ayant décidé de suivre la « procédure de l’OIE » pour la surveillance
épidémiologique pour la peste bovine afin d’éviter toute confusion lors des enquêtes sérologiques.
1.
Gestion des semences virales
a)
Caractéristiques de la semence virale
Le vaccin homologue contre la PPR est un vaccin vivant cultivé sur des cellules Vero. La souche initiale du
virus pour le vaccin homologue contre la PPR est la souche PPR 75/1, qui a été isolée au Nigeria en
1975 (30). Elle a été atténuée par passages sur cultures cellulaires Vero (6). La souche utilisée pour
fabriquer le vaccin correspond au 70e passage sur cellules Vero (PPRV 75/1 LK6 BK2 VERO70). Il est
stocké sous forme lyophilisée à –20°C et peut être obtenu auprès des Laboratoires de références (se
reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre). Des tests d'activité du vaccin montrent qu'il conserve
son pouvoir protecteur (à une dose de 103 DICT50) jusqu'au 120ème passage en cellules Vero, qui reste
jusqu'à présent le dernier passage testé.
b)
Méthode de culture
•
Cellules
Le vaccin PPR est produit sur cellules Vero, qui doivent être exemptes de toute contamination bactérienne,
fongique ou virale.
•
Milieu de culture
Le milieu de culture consiste en du milieu essentiel minimum (MEM) auquel on ajoute des antibiotiques (par
exemple de la péniciline et de la streptomycine à des concentrations finales respectives de 100 UI (Unités
Internationales) /ml et 100 µg/ml), et un agent antifongique (nystatine [Mycostatine] à une concentration
finale de 50 µl/ml). Le milieu est enrichi avec 10 % de sérum de veau foetal (milieu complet) pour la
croissance des cellules. Cette proportion est réduite à 2 % pour un milieu d'entretien une fois que la tapis
cellulaire est complet.
•
Lot de semences primaires du virus vaccin
Ceci concerne le virus lors de son 70e passage en cellules Vero (PPRV 75/1 LK6 BK2 VERO70). Le contenu
lyophilisé d'un flacon de la banque de semences est reconstitué avec 2 ml d'eau stérile (ou de milieu de
culture cellulaire sans sérum). Ce liquide est mélangé aux cellules Vero en suspension dans un milieu de
culture complet afin d'assurer au moins 0,001 DICT50 par cellule. On remplit les flacons de culture cellulaire
avec ce mélange virus/cellule (environ 2x107 cellules VERO dans un récipient de 175 cm3), et on les place
en incubation à 37°C. On examine régulièrement les cellules cultivées à la recherche d'un éventuel ECP. Le
milieu est renouvelé tous les 2 jours, en réduisant la proportion de sérum à 2 % une fois que le tapis
cellulaire est constitué. La première récolte de virus a lieu lorsque l'ECP atteint 40 ou 50 %. Cette
suspension virale est conservée à –70°C. Les récoltes suivantes s'effectuent tous les 2 jours jusqu'à ce que
l'ECP atteigne 70 ou 80 %. Il convient alors de congeler les flacons de culture (généralement 2 récoltes
supplémentaires sont encore possibles avant la congélation finale des supports de culture). Toutes les
suspensions de virus ainsi récoltées font l'objet de 2 cycles de congélation/décongélation, puis elles sont
réunies pour former un lot unique, qui servira de lot de semence primaire. Ce lot est divisé en aliquots placés
dans des flacons conservés à –70°C. Les contenus de cinq de ces flacons sont décongelés et titrés (titre
minimum exigé : 105 DICT50/ml). Mieux vaut lyophiliser la semence afin de la conserver à –20°C. Dans ce
cas, il sera nécessaire de titrer le virus lyophilisé (5 flacons). Un lot obtenu de cette manière, doit satisfaire
tous les tests de stérilité.
Lors de la préparation des lots de semence, il est important de ne pas ensemencer les cellules avec une
quantité excessive de virus (haut degré de multiplicité de l'infection), ceci favoriserait l’accumulation de
particules défectives dans la suspension virale produite, et abaisserait ainsi le titre des produits ultérieurs.
D'autre part, une très faible multiplicité de l’infection (par exemple 0,001) prolongera le temps de culture.
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•
Préparation du lot de semence de travail
Cette préparation s'effectue dans les mêmes conditions que celle du lot de semence primaire. Une grande
quantité de virus est produite, à partir de laquelle sera fabriqué le vaccin final. Ce lot est réparti dans des
récipients et conservé à –70°C. Il doit satisfaire tous les tests de stérilité. On titre 5 prélèvements (titre
minimum exigé : 106 DICT50/ml).
c)
Validation de la semence candidate comme semence vaccinale
Il est nécessaire de confirmer ou d'infirmer, la présence de PPRV dans le produit testé. On utilise dans ce
but du sérum anti-virus PPR afin de neutraliser le virus présent dans la culture cellulaire.
•
Protocole
i)
Mélanger les contenus de 2 flacons de vaccin à de l'eau bidistillée stérile, de façon à reconstituer le
volume existant avant la lyophilisation ;
ii)
Effectuer des dilutions de 10 en 10 du vaccin reconstitué dans un milieu de culture sans sérum
(0,5 ml de suspension virale + 4,5 ml de milieu) ;
iii)
Réaliser, sur une microplaque à 96 puits, 2 séries de mélanges avec les dilutions virales de chaque
flacon, de la façon suivante :
Série 1: Dilutions de la suspension virale :
Suspension virale (en µl)
Milieu de culture (en µl)
–1
50
50
–2
50
50
–3
50
50
–4
50
50
Série 2: Dilutions de la suspension virale :
Suspension virale (en µl)
Antisérum de la PPR (en µl)
–1
50
50
–2
50
50
–3
50
50
–4
50
50
(Note : l'antisérum utilisé dans ce cas est préparé sur mouton puis il est lyophilisé. Il est reconstitué
avec 1 ml d'eau bidistillée stérile, à une dilution de 1/10).
iv)
Incuber les mélanges à 37°C pendant 1 h ;
v)
Ajouter dans chaque puits 100 µl de suspension cellulaire en milieu de culture complet
(30 000 cellules/puits) ;
vi)
Incuber la microplaque à 37°C, en présence de CO2 ;
vii)
Procéder à la lecture de la microplaque après 10 à 15 h d'incubation.
Normalement, l'ECP n'est observé que dans les puits contenant des cellules infectées par le mélange viral et
le milieu de culture. S'il apparaît dans les puits de la série 2, il faut procéder à l'identification du PPRV par
immunofluorescence, à l'aide d'un AcM de la PPR, ou par immunocapture (l’AcM spécifique de la PPR et la
trousse de diagnostic sont disponibles auprès du Laboratoire de référence de l'OIE pour la PPR en France
(se reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre). Si cette identification confirme la présence d'un
PPRV, cela signifie que l’antisérum PPR utilisé devait être trop faible ou que le lot devra être changé. Si
l’épreuve d'immunofluorescence ou d'immunocapture est négatif, la présence d'un contaminant viral ne fait
plus aucun doute, les substances analysées doivent donc être détruites.
2.
Méthode de production
a)
Production du vaccin
Cette opération s'effectue à plus grande échelle. Les cellules peuvent être infectées avec un virus à
multiplicité d'infection comme celle vue précédemment ou avec des doses plus élevées, par exemple jusqu’à
0,01. Après 2 cycles de congélation-décongélation, les produits des différentes récoltes sont rassemblés
(afin de former un produit final) et conservés à –70°C en attendant les résultats du titrage et des tests de
stérilité. Le vaccin est lyophilisé si ces résultats sont satisfaisants.
b)
Lyophilisation
Le milieu de lyophilisation (milieu Weybridge) est composé de 2,5 % (m/v) de lactalbumine, 5 % (m/v) de
saccharose, et 1 % (m/v) de glutamate de sodium, pH 7,2.
178
Manuel terrestre de l’OIE 2005
Chapitre 2.1.5. — Peste des petits ruminants
Pour la lyophilisation, on mélange un volume de ce mélange à un volume égal de suspension virale (qui doit
avoir été préalablement diluée pour pouvoir disposer du nombre nécessaire de doses de vaccin par flacon).
Le mélange ainsi obtenu est réfrigéré, homogénéisé, réparti dans des flacons et lyophilisé. A la fin d'un cycle
de lyophilisation, on règle la sonde à 35°C pour 4 h. Une fois l'opération terminée, les flacons sont scellés
sous vide. Des échantillons prélevés au hasard (par ex. 5 %) dans le lot final sont soumis à des tests
d'innocuité, d'efficacité, et de stérilité. L'humidité résiduelle est estimée par la méthode de Karl Fisher
(optimum ≤ 3,5 %). Si les résultats des tests ne s'avèrent pas satisfaisants, le lot entier doit être détruit.
3.
Contrôles en cours de fabrication
On doit s'assurer que les cellules utilisées pour les cultures ont une apparence normale et qu'elles ne sont
contaminées par aucun virus, noramment le virus de la diarrhée virale bovine. Un titrage du virus doit être
effectué sur le lot de semence : à l'aide d'un milieu MEM (sans sérum), on effectue une série de dilutions
décimales (0,5 ml de virus + 4,5 ml de diluant) de façon à ce que leur concentration en produit à titrer atteigne 10–
6
. Les cellules Vero d'un flacon sont trypsinisées et mises en suspension en milieu de culture complet
(300.000/ml). Elles sont ensuite placées sur une microplaque à 96 trous (30 000 cellules par puits, soit 100 µl de
suspension cellulaire). Puis, 100 µl de virus en dilution décimale sont ajoutés aux cellules (dilutions comprises
entre 10–2 et 10–6). Une rangée de puits joue le rôle de témoin pour les cellules infectées auxquelles on ajoute du
milieu de culture sans virus (100 µl). La microplaque est incubée à 37°C en présence de CO2. La lecture de la
plaque (recherche d'ECP) s'effectue 10 ou 15 jours après l'infection.
Le titre du virus est déterminé par la méthode Spearman-Kärber. Le titre minimum par dose est de
102,5DICT50/ml.
4.
Contrôles des lots
a)
Identité
L'identité du contenu d'un des récipient de chaque lot de répartition doit être vérifiée par culture après
neutralisation par un antisérum spécifique.
b)
Stérilité
Il s'agit de rechercher une éventuelle contamination par un virus, une bactérie ou un champignon. On teste
les cellules et les sérums avant qu'ils soient utilisés pour la production du vaccin et la réserve de semence et
le vaccin avant et après le processus de lyophilisation. Tout produit ne satisfaisant pas ce test sera détruit.
Les tests de stérilité et de non-contamination par du matériel biologique sont décrits dans le Chapitre
I.1.5., « Contrôle de la stérilité ou de l’absence de contamination des matériels biologiques ».
c)
Innocuité
On effectue ce test sur des rongeurs afin de rechercher toute toxicité non-spécifique associée au produit. Ce
test nécessite un vaccin reconstitué dans du solvant (contenus de 5 flacons mélangés), 6 cobayes pesant
entre 200 et 250 g, 10 souris non-sevrées (17 à 22 g, lignée Swiss ou équivalente).
Le vaccin, 0,5 ml, est injecté par voie intramusculaire dans l'une des pattes postérieures de 2 cobayes,
0,5 ml dans la cavité péritonéale de 2 autres cobayes et enfin 0,1 ml dans la cavité péritonéale de 6 souris.
Deux cobayes et 4 souris non-inoculés sont conservés comme témoins. On garde les animaux en
observation pendant 3 semaines. Si un cobaye ou 2 souris viennent à mourir, le test doit être renouvelé. On
procède à l'autopsie des animaux morts afin de s'assurer de la cause de cette mort. Au bout des 3 semaines
d'observation, on sacrifie les animaux pour les autopsier. On note tous les résultats. Le vaccin est considéré
comme satisfaisant si, pour le premier ou le second test, plus de 80 % des animaux restent en bonne santé
durant les 3 semaines d'observation, et si aucune lésion n'est décelée à l'autopsie.
d)
Activité et efficacité sur les petits ruminants
Ce test nécessite ce qui suit : un vaccin reconstitué en soluté isotonique (contenus de 5 flacons mélangés)
de façon à disposer de 100 doses et de 0,1 dose/ml, 6 chèvres et 6 moutons, tous âgés d'environ 1 an et ne
possédant pas d'anticorps contre la peste bovine ou la PPR, des seringues et des aiguilles stériles, et du
PPRV pathogène préalablement titré sur des chèvres, et dilué en soluté isotonique de façon à disposer de
103 doses léthales pour 50 % des chèvres (LD50).
Vacciner 2 chèvres et 2 moutons par voie sous-cutanée à raison de 100 doses par animal. Vacciner
2 chèvres et 2 moutons par voie sous-cutanée avec 0,1 dose par animal. Maintenir les autres animaux en
contact avec les animaux vaccinés pour qu'ils jouent le rôle de témoins. Garder les animaux en observation.
Manuel terrestre de l’OIE 2005
179
Chapitre 2.1.5. — Peste des petits ruminants
Prendre leur température quotidiennement pendant 3 semaines. A la fin de cette période, on prélève du
sang sur tous les animaux en vue de la préparation des sérums. On injecte 1 ml de suspension de PPRV
pathogène (103 LD50 par animal) par voie sous-cutanée à tous les animaux. Pendant 2 semaines, on les
garde en observation et on relève leur température corporelle quotidiennement.
Le vaccin est considéré comme satisfaisant si tous les animaux vaccinés résistent à l'épreuve virulente
d'infection, alors qu'au moins la moitié des animaux témoins développent des signes de PPR. L’épreuve de
SN doit révéler la présence d’anticorps de la PPR (pour un sérum dilué au moins au 1/10e) chez les animaux
vaccinés, uniquement dans des prélèvements effectués 3 semaines après la vaccination. Si l'un des témoins
est également positif, l'expérience doit être renouvelée avec un autre lot de PPRV pathogène. Le lot de
vaccin sera détruit si les animaux réagissent à l'épreuve d'infection.
•
Titrage des anticorps neutralisants de la PPR
Cette épreuve nécessite ce qui suit : des suspensions cellulaires à 600 000/ml, des microplaques de culture
cellulaire à 96 trous, des sérums à titrer (inactivés par chauffage à 56°C pendant 30 min), du milieu de
culture cellulaire, du PPRV dilué de manière à contenir 1 000 ; 100 ; 10 et 1 DICT50/ml.
Diluer les sérums à 1/5, puis faire une dilution 2 fois en milieu de culture. Dans les puits d'une plaque de
culture cellulaire, mélanger 100 µl de virus à 1 000 DICT50/ml (de façon à contenir 100 DICT50 dans chaque
puits) à 100 µl de sérum d'une dilution donnée (en utilisant 6 puits par dilution). Disposer une série de puits
témoins pour le virus et les cellules infectées de la façon suivante : 6 puits avec 100 DICT50 (100 µl) par
puits, 6 puits avec 10 DICT50 (100 µl) par puits, 6 puits avec 1 DICT50 (100 µl) par puits, 6 puits avec
0,1 DICT50 (100 µl) par puits, et 6 autres avec 200 µl de culture sans virus (cellules témoins) par puits.
Compléter les puits contenant le virus témoin avec du milieu de culture complet pour atteindre un volume de
100 µl, et incuber les plaques pendant 1 h, à 37°C. Ajouter 50 µl de suspension cellulaire à chaque puits.
Incuber les plaques à 37°C en présence de CO2. Procéder à la lecture des plaques après 1 ou 2 semaines
d'incubation. Les résultats devraient être les suivants : 100 % d'ECP pour les puits de témoins viraux de 100
et 10 DICT50, 50 % d'ECP pour les dilutions à 1 DICT50, absence d'ECP pour les dilutions à 0,1 DICT50,
absence d'ECP dans les puits où le virus a été neutralisé par le sérum pendant l’épreuve et présence d'ECP
dans les puits où le virus ne l'a pas été.
e)
Durée de l'immunité
La durée de l'immunité est de 3 ans au moins.
f)
Stabilité
Le vaccin lyophilisé peut être conservé au moins 2 ans entre 2°C et 8°C (une température de conservation
de –20°C est cependant plus conseillée), s'il est maintenu sous vide et à l'abri de la lumière. Récemment, il
a été démontré que ce vaccin en suspension dans du milieu contenant du tréhalose et soumis à la méthode
ultra rapide de déshydratation, peut résister à une température de 45°C pendant 14 jours avec une perte
minimale d’efficacité (32).
5.
Contrôles du produit fini
a)
Innocuité
Voir Partie C.4.c.
b)
Activité
Voir Partie C.4.d.
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NB : Il existe plusieurs Laboratoires de références de l’OIE pour la Peste des petits ruminants (se reporter à la
liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre ou consulter le site internet de l’OIE pour une liste actualisée :
www.oie.int).
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Manuel terrestre de l’OIE 2005