ecole nationale veterinaire de lyon

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ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE LYON
Année 2005
- Thèse n°
APPORT DES TECHNIQUES DE REPRODUCTION
ASSISTEE DANS LE CADRE DE LA CONSERVATION DES
EQUIDES SAUVAGES : L’EXEMPLE DU TRANSFERT
D’EMBRYONS INTERSPECIFIQUE
THESE
Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I
(Médecine - Pharmacie)
et soutenue publiquement le 16 septembre 2005
pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire
par
Ecuer Emilie
Née le 20 juillet 1980
au Port (Ile de la Réunion)
2
3
4
A Monsieur le Professeur Guérin
De la Faculté de Médecine Lyon-Sud
Notre Président de Thèse,
Qui nous a fait l’honneur de présider notre jury de thèse,
Nous lui adressons nos respectueux hommages.
A Monsieur le Docteur Martinot
Directeur de l’Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon
Notre Maître de thèse,
Qui nous a fait l’honneur d’accepter d’encadrer ce travail,
Pour la confiance qu’il nous a accordé,
Qu’il veuille bien trouver ici l’expression de notre profonde gratitude.
A Madame le Professeur Rachail-Bretin
De l’Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon
Notre deuxième Assesseur,
Qui nous a fait l’honneur de participer à notre jury de thèse,
Pour avoir accepté de juger ce travail,
Qu’elle trouve ici l’expression de notre profonde reconnaissance.
A Monsieur le Professeur Allen
Pour sa gentillesse et son aide précieuse,
Sincères remerciements.
5
6
A ma mère,
Pour avoir toujours cru en moi,
Pour m’avoir permis d’arriver jusqu’ici,
Pour ton soutien et ta patience tout au long de ce parcours,
En témoignage de tout mon amour,
Merci pour tout...
A Léo et Odile,
Pour votre amour des chats,
Pour votre gentillesse et le réconfort que vous m’avez toujours apporté,
Avec toute mon affection.
A Luc,
Pour tous les services que tu m’as rendus,
Pour ta bonne humeur et toutes tes petites blagues,
Merci.
7
8
A Annie,
Pour m’avoir présenté Griselda et Wagoo,
Et pour tous tes petits thés,
Merci pour cette complicité indéfectible,
Tu resteras toujours une mère pour moi.
A Sandrine,
Et ces cinq années passées ensemble,
A notre amitié qui m’est si chère, entre tempête et beau fixe,
Puissent nos chemins ne pas rester séparés trop longtemps.
A Béton,
Notre Maître à tous,
En souvenir de nos petites discussions françaises ou québécoises qui furent si réconfortantes,
See you soon my dear friend.
A mon p’tit Juju,
Tu fais partie de ces personnes sur lesquelles on peut toujours compter,
Merci pour ton soutien sans failles.
A Fifi,
Pour ta sincérité et ta lucidité,
Que notre amitié grandisse encore.
A Hervé, Fanny, Céline, Freek, Nathalie, Agnès, Maëlle, Bertrand, Pin, Blick, Brasse,
A toutes ces soirées d’ici et d’ailleurs, ces fous rires inoubliables et ces années trop vites
passées,
Parce que sans vous rien n’aurait été pareil.
A Pignon,
Et toutes les vaches de la Franche-Comté,
Pour tous ces moments partagés.
9
10
A Héloïse,
Pour ces six mois de colocation fort sympathiques,
A deux le Québec c’était quand même mieux.
A Boro,
Mon fils chéri,
Et à tous les enfants et parents de notre groupe de clinique,
En souvenir de ces matinées en clinique.
Aux internes d’équine RHC,
A ces débuts prometteurs,
En espérant que cette bonne humeur nous portera tout au long de cette année.
A Arnaud,
Mon ex-beau coloc,
Pour ton calme olympien, ton scanner et ta gentillesse.
A Anne-Claire,
En souvenir de ces deux ans de prépa,
Et de nos petits repas.
A Stéphanie Lerouge et Chantal Masse,
Pour vos sourires chaleureux et votre aide si spontanée.
Aux Drs Marc Raynaud, Thyl Van de Velde et Sylvain Brosse,
Pour tout ce que vous m’avez appris,
Et pour m’avoir fait partagé l’amour de ce métier,
Merci.
A Kali, Tasman et Hermance,
Parce qu’il y a des choses qui ne se partagent pas…
11
12
A Clément,
Pour cette petite lumière que tu as su faire naître,
Parce que sans ton aide tout aurait été plus difficile,
Pour la patience et la compréhension dont tu sais faire preuve,
Pour tout ce que nous avons déjà partagé et surtout tout ce qui reste à venir,
A notre nouvelle vie, ensemble…
13
14
TABLE DES MATIÈRES
I.
MISE EN ŒUVRE DES PROGRAMMES DE REPRODUCTION
ASSISTEE POUR LA CONSERVATION DES EQUIDES SAUVAGES .................. 21
A.
Etat des lieux chez les équidés sauvages .................................................................................... 21
1.
2.
3.
B.
Le cheval .................................................................................................................................. 22
Les ânes .................................................................................................................................... 23
Les zèbres ................................................................................................................................. 26
Les techniques de reproduction assistée.................................................................................... 30
1.
2.
3.
4.
Nécessité de l’utilisation de ces techniques.............................................................................. 30
Les limites des programmes traditionnels d’élevage en captivité............................................. 31
Les objectifs des programmes de reproduction assistée ........................................................... 34
Les différentes techniques utilisées .......................................................................................... 38
II. ETUDE PRELIMINAIRE CHEZ LES EQUIDES DOMESTIQUES........... 46
A.
Rappels concernant le cheval ..................................................................................................... 46
1.
2.
B.
Le transfert d’embryons chez le cheval .................................................................................... 46
La formation des cupules endométriales chez la jument .......................................................... 60
Les transferts d’embryons interspécifiques chez les équidés domestiques............................. 79
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Les transferts interspécifiques d’embryons d’hybrides d’équidés............................................ 80
Les transferts interspécifiques d’embryons entre l’âne et le cheval ......................................... 81
Expression des antigènes du CMH par les cupules endométriales ........................................... 93
Expression des antigènes par le trophoblaste normal ............................................................... 95
Effets du génotype fœtal et de l’environnement utérin sur le développement placentaire ....... 99
Le transfert d’embryons de cheval et d’âne chez la mule....................................................... 102
III. LES TRANSFERTS D’EMBRYONS INTERSPECIFIQUES CHEZ LES
EQUIDES SAUVAGES .......................................................................................... 107
A.
Transfert non chirurgical d’embryons de zèbres à des juments domestiques ..................... 108
1.
2.
3.
4.
B.
Animaux utilisés pour l’expérience ........................................................................................ 108
Récolte des embryons et transfert........................................................................................... 108
Gestation et parturition ........................................................................................................... 109
Conclusion.............................................................................................................................. 110
Transferts d’embryons d’équidés sauvages à des juments et ânesses domestiques............. 110
1.
2.
3.
Matériel et méthode................................................................................................................ 111
Résultats ................................................................................................................................. 115
Discussion .............................................................................................................................. 123
15
IV. DIFFICULTES D’UTILISATION ET PERSPECTIVES DES TECHNIQUES
DE REPRODUCTION ASSISTEE CHEZ LES EQUIDES SAUVAGES .......................
............................................................................................................... 130
A.
Facteurs limitants et inconvénients de ces techniques............................................................ 130
1.
2.
3.
4.
B.
Applications futures .................................................................................................................. 137
1.
2.
16
Variabilité de la reproduction d’un point de vue physiologique, anatomique et comportemental
................................................................................................................................................ 131
Echec de la mise en place de la gestation ............................................................................... 133
Faible nombre d’individus disponibles................................................................................... 133
Règlements et supports institutionnels ................................................................................... 135
Etude du contenu génétique des gamètes et embryons........................................................... 137
Clonage et conservation des espèces ...................................................................................... 138
TABLE DES FIGURES
Figure 1 : Chevaux de Przewalski, d’après Terra Nova (2005a)
22
Figure 2 : Ane sauvage africain, d’après Terra Nova (2005a)
23
Figure 3 : Anes sauvages d’Asie, d’après Terra Nova (2005a)
24
Figure 4 : Zèbres de Grévy, d’après Terra Nova (2005b)
26
Figure 5 : Zèbres des plaines, d’après Terra Nova (2005b)
27
Figure 6 : Zèbres de montagne, d’après Terra Nova (2005b)
28
Figure 7 : Variation des concentrations de gonadotrophines (FSH et LH) et des hormones
stéroïdiennes dans le sang de la jument durant le cycle œstral, d’après Allen (1982a)
48
Figure 8 : Représentation schématique de la procédure de récolte d’embryons, d’après Vanderwall
(2000)
53
Figure 9 : Blastocyste mature équin, embryon de qualité grade 1, d’après Vanderwall (1996)
54
Figure 10 : Blastocyste mature équin, embryon de qualité grade 2, d’après Vanderwall (1996)
54
Figure 11 : Blastocyste mature équin, embryon de qualité grade 3, d’après Vanderwall (1996)
55
Figure 12 : Blastocyste mature équin, embryon de qualité grade 4, d’après Vanderwall (1996)
55
Figure 13 : Représentation schématique de la cinétique du développement des cupules endométriales,
d’après Allen et Short (1997) (avec permission)
64
Figure 14 : Représentation schématique de l’histogenèse des cupules endométriales, d’après Allen
(1973)
66
Figure 15 : Réponse immunitaire à médiation cellulaire exprimée par la jument vis-à-vis des
composantes invasives et non-invasives du trophoblaste intraspécifique de cheval, d’après Allen
et al. (1987) (avec permission)
67
Figure 16 : Comparaison de la taille et de l’apparence histologique des cupules endométriales et des
concentrations de PMSG sérique chez les juments et ânesses portant respectivement des
conceptus normaux de cheval et d’âne et des conceptus hybrides de mule et de bardot, d’après
Allen (1982b)
71
Figure 17 : Anesse receveuse et son poulain issu de transfert d’embryon interspécifique
(photographie aimablement prêtée par le Dr W.R. Allen)
82
Figure 18 : Conceptus interspécifique d’âne chez le cheval avorté à J87 de gestation, d’après Allen et
al. (1987) (avec permission).
85
Figure 19 : Jument receveuse et son ânon issu du transfert d’embryon interspécifique (photographie
aimablement prêtée par le Dr W.R. Allen)
87
Figure 20 : Coupes histologiques de l’interface allantochorion-endomètre chez (a) une jument
portant un conceptus intraspécifique viable de cheval à J85, et (b) une jument portant un
conceptus interspécifique d’âne à J82, d’après Allen (1992) (avec permission)
90
Figure 21 : Mule et son poulain né après transfert d’embryon (photographie aimablement prêtée par
le Dr Allen)
103
Figure 22 : Mule et son ânon né après transfert d’embryon (photographie aimablement prêtée par le
Dr Allen)
104
Figure 23 : Une des femelles zèbre de Grant utilisée comme donneuse d’embryons, d’après Kydd et
al. (1985).
111
Figure 24 : L’étalon de Przewalski de 12 ans utilisé durant la seconde année de l’étude, d’après Kydd
et al. (1985).
111
Figure 25 : Pouliche de Przewalski née après transfert d’embryon à une jument receveuse
(photographie aimablement prêtée par le Dr W.R. Allen)
118
Figure 26 : Pouliche zèbre (a) née après le transfert d’un blastocyste mature à J8 (b) à une ponette
welsh receveuse, d’après Summers et al. (1987) (avec permission)
119
Figure 27 : Foal zèbre de Grant né prématurément d’une ânesse à 292 jours de gestation et son
placenta, d’après Kydd et al. (1985)
120
Figure 28 : Ponette et sa pouliche zèbre qui vient de naître (photographie aimablement prêtée par le
Dr Allen)
121
Figure 29 : Ponettes receveuses et leur petit (ânon, zèbre et poulain de Przewalski) issu du transfert
interspécifique (photographie aimablement prêtée par le Dr Allen)
124
17
TABLE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Facteurs démographiques et stochastiques qui peuvent réduire la taille d’une population
animale, d’après Bainbridge et Jabbour (1998). ............................................................................. 36
Tableau 2 : Diamètre des embryons équins récolté dans la lumière utérine, d’après Vanderwall
(2000)................................................................................................................................................... 52
Tableau 3: Effet de l’âge de l’embryon équin sur le taux de récupération, d’après Vanderwall (2000)
.............................................................................................................................................................. 52
Tableau 4 : Traitements endocrinologiques administrés aux juments portant des conceptus
interspécifiques d’ânes, d’après Allen et al. (1987). ........................................................................ 86
Tableau 5 : Traitements immunologiques administrés aux juments portant des conceptus d’ânes et
expression des aspects immunoprotecteur et cytotoxique (rejet) de la mémoire immunitaire
maternelle lors des gestations suivantes, d’après Allen et al. (1987).............................................. 92
Tableau 6 : Modèle théorique du contrôle du développement endométrial lors des gestations chez les
Equidés d’après Allen et al. (1993) ................................................................................................. 100
Tableau 7 : Taux de récupération non-chirurgicale des embryons d’après Kydd et al. (1985) ......... 115
Tableau 8 : Relation entre le stade de récolte et le diamètre des embryons de cheval de Przewalski et
de zèbre de Grant d’après Summers et al. (1987) ......................................................................... 116
Tableau 9 : Taux de gestation après transfert d’embryons de cheval de Przewalski et de zèbre de
Grant à des juments et ânesses receveuses d’après Summers et al. (1987) et Hearn et Summers
(1986)................................................................................................................................................. 117
Tableau 10 : Profils de la sécrétion de PMSG chez les juments, ânesse et zèbres portant des conceptus
inter- et intraspécifiques, d’après Summers et al. (1987). ............................................................ 122
Tableau 11 : Développement d’anticorps lymphocytotoxiques chez les ânesses et juments receveuses
portant des conceptus de cheval de Przewalski ou de zèbre, d’après Summers et al. (1987). ... 123
Tableau 12 : Développement des cupules endométriales et survie fœtale lors de gestations
intraspécifiques, hybrides et interspécifiques chez les Equidés, d’après Allen et al. (1987)...... 127
18
19
INTRODUCTION
Les techniques de reproduction assistée sont actuellement déjà largement utilisées
chez le cheval domestique et les recherches dans ce domaine et celui plus général de la
reproduction se poursuivent afin de généraliser et faciliter leur utilisation. Le transfert
d’embryon chez la jument a ainsi connu un essor considérable ces dernières années.
L’intérêt porté par le grand public, mais également par les scientifiques, à la
préservation des espèces sauvages s’est, lui aussi, accru et la nécessité de mettre en place des
mesures permettant de maintenir au mieux la diversité des espèces apparaît aujourd’hui
comme une priorité. Le succès des techniques de reproduction assistée chez les animaux
domestiques a permis d’envisager leur utilisation chez les animaux sauvages. Parmi ces
animaux ceux qui possèdent une ou plusieurs espèces domestiques proches, comme c’est le
cas pour les équidés sauvages, sont les meilleurs candidats à l’application des techniques de
reproduction assistée.
Nous envisagerons donc dans une première partie l’intérêt que peuvent présenter les
programmes de reproduction assistée pour la préservation des équidés sauvages et les moyens
de leur mise en œuvre. Ceci sera précédé d’un indispensable inventaire des espèces d’équidés
sauvages et de leur statut.
La seconde partie constitue une étude des transferts d’embryons intraspécifiques et
interspécifiques chez les équidés domestiques afin de mettre en place les bases nécessaires à
la compréhension de la technique de transfert interspécifique.
Dans un troisième temps nous détaillerons la technique du transfert d’embryons
interspécifique chez les équidés sauvages, technique à laquelle nous avons choisi de nous
intéresser plus particulièrement.
Enfin nous reviendrons sur les différentes techniques de reproduction assistée en
évaluant les limites et les inconvénients posés par leur mise en œuvre pratique, dans le cadre
de programmes d’élevage chez les équidés sauvages, tout en envisageant de nouvelles
techniques utilisables dans le futur.
20
I.
Mise
en
œuvre
des
programmes
de
reproduction assistée pour la conservation des
équidés sauvages
La pression de sélection, qui pèse sur tous les être vivants, a abouti à la formation de
milliers d’espèces différentes de Mammifères, chacune possédant son propre bagage
génétique et chacune étant adaptée à son environnement. L’extinction des espèces fait partie
du processus naturel de l’évolution et est inévitable. (Comizzoli et al., 2000) Cependant, les
activités de la population humaine, en nombre toujours croissant, sont à l’origine d’un
processus d’extinction mondial très rapide de très nombreuses espèces animales. (Bainbridge
et Jabbour, 1998) Ainsi, durant les 200 dernières années, plus de 50 espèces de Mammifères
se sont éteintes et plus de 200 sont actuellement reconnues comme menacées d’extinction par
la “Convention on International Trade in Endangered Species” (CITES). (Loskutoff et
Betteridge, 1992) Les milieux de vie de nombreuses espèces sont réduits et fragmentés et,
dans certains cas ces espèces se sont réduites à de très petites populations fortement
menacées. Les conséquences néfastes d’un point de vue génétique de ces restrictions sont
évidentes. Un intérêt croissant est donc porté au concept de gestion génétique ex situ des
petites populations captives d’espèces menacées en vue de leur réintroduction à l’état
sauvage. (Bainbridge et Jabbour, 1998) Enfin, les risques de blessures ou de mort sont très
importants lors du transport d’animaux vivants. De plus, les coûts de transport et de
quarantaine sont des facteurs qui limitent largement les possibilités des plans d’élevage
traditionnels. (Durrant et Benirschke, 1981) Les techniques modernes de reproduction assistée
ont donc un rôle très important à jouer dans la mise en œuvre de ces programmes. (Bainbridge
et Jabbour, 1998)
Dans cette partie, nous ferons tout d’abord un état des lieux afin de connaître le statut
des différentes espèces d’équidés sauvages. Nous aborderons ensuite les techniques de
reproduction assistée qui sont actuellement disponibles.
A. Etat des lieux chez les équidés sauvages
Les Equidés appartiennent à l’ordre des Périssodactyles qui comprend également les
rhinocéros d’Asie et d’Afrique et les tapirs d’Asie et d’Amérique du Sud. (Short, 1975)
21
Les Périssodactyles, tout comme les Artiodactyles, sont particulièrement concernés
par les techniques de reproduction assistée car ils comptent des représentants domestiques
chez lesquels ces techniques sont déjà appliquées. (Wildt et al., 1986)
Beaucoup d’équidés sauvages sont menacés d’extinction. Ceci résulte principalement
de la restriction des habitats naturels, du morcellement des populations et des croisements
avec les espèces d’équidés domestiques. (Meintjes et al., 1997)
On distingue actuellement sept espèces d’équidés sauvages, ainsi que deux espèces
éteintes, limitées aux continents africain et asiatique. (Short, 1975)
1. Le cheval
Le cheval de Przewalski (E. ferus
przewalskii) (Figure 1) est la seule espèce
survivante de cheval sauvage. Les vastes plaines de Mongolie constituaient son habitat
d’origine. (Walker, 1975) Le dernier représentant sauvage, un étalon solitaire a disparu en
1969. (Moehlman, 2002)
Figure 1 : Chevaux de Przewalski, d’après Terra Nova (2005a)
Les raisons de ce déclin sont la chasse, les activités militaires et l’augmentation de
l’utilisation humaine de l’habitat. L’espèce est maintenant éteinte à l’état sauvage selon la
Liste Rouge de l’IUCN et survit grâce à l’élevage en captivité. Elle est également en Annexe I
de la CITES. On considère qu’environ 1 500 individus sont conservés en captivité, un certain
nombre d’entre eux n’étant pas génétiquement purs puisque descendants de croisements avec
des chevaux domestiques.
22
Des populations ont été réintroduites récemment en Mongolie. Quatre projets ont
également permis d’implanter des populations en dehors de leur habitat d’origine, en France,
en Ouzbékistan, en Hongrie et en Ukraine. Les techniques modernes sont largement utilisées
chez le cheval de Przewalski afin de gérer la diversité génétique de l’espèce. (Moehlman,
2002)
Le tarpan était une autre espèce de cheval sauvage mais il est désormais éteint. Il
occupait une grande partie de l’Europe et certaines régions d’Asie. (Walker, 1975)
2. Les ânes
a) L’âne sauvage africain
L’âne sauvage africain (E. africanus) (Figure 2) est originaire d’Afrique du Nord.
(Short, 1975) Il est considéré comme sévèrement en danger par la Liste rouge de l’IUCN.
(Moehlman, 2002)
Figure 2 : Ane sauvage africain, d’après Terra Nova (2005a)
On reconnaît deux sous-espèces principales : nubienne (E. africanus africanus) et
somalienne (E. africanus somaliensis).
Un petit nombre persiste à l’état sauvage, bien que des croisements aient eu lieu avec
des ânes domestiques retournés à l’état sauvage. (Short, 1975)
23
Les principales menaces qui pèsent sur cette espèce sont la chasse (pour sa viande
mais aussi à but médicinal), la compétition avec le bétail pour la végétation et l’eau ainsi que
de possibles croisements avec l’âne domestique. (Moehlman, 2002) Ce dernier a certainement
pour origine l’âne sauvage nubien. (Short, 1975)
Des études sont menées pour améliorer les connaissances concernant la taille des
populations, la reproduction et l’habitat. Des échantillons de matières fécales sont prélevés
afin de mieux connaître la diversité génétique de cette espèce et savoir si des croisements ont
eu lieu avec des ânes domestiques. (Moehlman, 2002)
b) L’âne sauvage d’Asie
L’âne sauvage d’Asie ou hémione (E. hemionus, 2n = 54) (Figure 3) est,
morphologiquement, un intermédiaire entre le cheval et l’âne. (Short, 1975) On le retrouve de
la Mongolie à la Syrie. (Walker, 1975)
Figure 3 : Anes sauvages d’Asie, d’après Terra Nova (2005a)
Le variant le plus connu est l’onagre de Perse (E. hemionus onager) qui a été
domestiqué par les Sumériens de Mésopotamie. (Short, 1975) Les autres sous-espèces sont le
khulan de Mongolie (E. hemionus hemionus) et de Gobi (E. hemionus luteus), dont on
suppose qu’ils appartiennent en fait à la même sous-espèce, le koulan (E. hemionus kulan),
l’âne sauvage indien du Rann de Kutch ou khur (E. hemionus khur) et l’âne sauvage syrien
(E. hemionus hemippus) qui est éteint depuis 1927. (Moehlman, 2002)
24
Sur la Liste Rouge de l’IUCN, l’onagre et le koulan sont considérés comme
sévèrement en danger, l’âne sauvage indien est en danger et le khulan de Mongolie et de Gobi
est vulnérable. Pour ce qui est de la CITES, le khulan de Mongolie et de Gobi ainsi que l’âne
sauvage indien sont en Annexe I tandis que le koulan et l’onagre sont en Annexe II. L’âne
sauvage d’Asie a fait l’objet de nombreuses réintroductions dans le but de sa conservation, le
succès de ces mesures a été variable.
Environ 150 ânes sauvages d’Asie sont détenus en captivité, il s’agit majoritairement
d’onagres ou de koulans. Il est important de souligner que de nombreux zoos ne possèdent
qu’un seul animal.
Cette espèce est principalement menacée par le braconnage pour la viande, le
surpaturage et la compétition pour l’eau. L’isolement géographique qui existe entre les
différentes populations est également à prendre en compte. Le khur est le plus menacé par
l’augmentation des activités humaines. (Moehlman, 2002)
c) Le kiang
Le kiang (E. kiang) était considéré jusqu’à récemment comme une sous-espèce de
l’hémione mais des analyses moléculaires ont permis de le définir comme une espèce
distincte.
Il est représenté par trois sous-espèces définies en fonction de leur répartition
géographique (E. kiang holdereri, E. k. polyodon et E. k. kiang ).
Cette espèce est considérée à faible risque par la Liste Rouge de l’IUCN bien que
celle-ci souligne un manque de données. Elle est placée en Annexe II par la CITES.
La population est évaluée a 60 000 à 70 000 individus qui se répartissent sur un vaste
territoire en Asie (Chine, Pakistan, Népal, Inde et peut-être le Bhutan). Les trois sous-espèces
occupent le Plateau Tibétain. Moins de 100 individus sont répertoriés en captivité et ils
appartiennent à une seule des sous-espèces. Aucune information n’existe en ce qui concerne
les individus des deux autres sous-espèces bien que des parcs zoologiques chinois soient
susceptibles d’en posséder. (Moehlman, 2002)
25
3. Les zèbres
a) Le zèbre de Grévy
Le zèbre de Grévy (E . grevyi, 2n = 46) (Figure 4) est originaire de Somalie et du nord
du Kenya. (Short, 1975) On le trouve actuellement en Ethiopie, au Kenya et au Soudan.
Figure 4 : Zèbres de Grévy, d’après Terra Nova (2005b)
Il est considéré comme en danger selon la Liste Rouge de l’IUCN et est placé en
annexe I par la CITES. La population totale est estimée à 3 000 à 3 500 individus alors qu’elle
s’élevait à 15 000 individus dans les années 70. (Moehlman, 2002)
Son ancien nom de zèbre Impérial donne une idée de sa beauté. On le différencie
facilement des autres zèbres par le dessin de ses rayures et ses grandes oreilles. Il présente une
quinzaine de rayures sur chaque flanc, qui épargnent le ventre blanc. (Short, 1975)
De nombreuses menaces pèsent sur cette espèce. Tout d’abord la diminution des
sources d’eau disponibles, la dégradation et la perte des habitats, la compétition avec les
espèces domestiques, le tourisme, la chasse et le commerce d’animaux vivants.
La population totale des animaux captifs s’élève à 600 zèbres, ce qui est considéré
comme largement suffisant pour maintenir la diversité génétique. Dans le cas où la diversité
26
génétique devrait être augmentée, il est envisagé d’utiliser la semence congelée d’étalons
sauvages. (Moehlman, 2002)
b) Le zèbre des plaines
On retrouve le zèbre des plaines ou zèbre commun (E. burchelli, 2n = 44) (Figure 5)
du Kenya jusqu’au Cap. (Short, 1975) Jusqu’à il y a 15 ans on trouvait le zèbre des plaines
dans presque tous les pays de l’est, du sud et du sud-ouest de l’Afrique. Il a depuis disparu de
nombreuses régions, bien qu’il soit aujourd’hui l’équidé sauvage le plus répandu et le plus
abondant. (Moehlman, 2002)
Figure 5 : Zèbres des plaines, d’après Terra Nova (2005b)
La taxinomie du zèbre des plaines n’a pas encore été totalement élucidée sur une base
génétique et il n’existe pas de consensus entre les différentes taxinomies traditionnelles.
L’IUCN définit six sous-espèces : zèbre de Grant (E. burchelli boehmi), de Crawshay (E.
burchelli crawshayi), Upper Zambezi (E. burchelli zembeziensis), de Chapman (E. burchelli
chapmanni), Damara (E. burchelli antiquorum) et de Burchell (E. burchelli burchellii). De
manière générale, le zèbre des plaines n’est pas considéré comme étant en danger par la Liste
Rouge de l’IUCN. Bien qu’il existe un manque de données pour certaines sous-espèces il est
inscrit sous la dénomination faible risque. Cependant le zèbre de Burchell est considéré
comme éteint. Le zèbre des plaines n’est pas inscrit dans les Annexes de la CITES.
27
La population du zèbre des plaines s’élève à plus de 600 000 individus mais celle-ci
est représentée à 75% par des zèbres de Grant. Plus de 1 000 individus sont maintenus en
captivité mais il s’agit principalement de zèbres de Grant et Damara. Aucun zèbre de
Crawshay ou Upper Zembezi ne semble être conservé en captivité. (Moehlman, 2002)
Toutes ces sous-espèces présentent 5 ou 6 rayures sur le flanc, bien qu’une grande
variabilité existe dans l’incidence de bandes plus claires. (Short, 1975) Il semble que du nord
au sud, entre les différentes sous-espèces, la largeur des rayures diminue, de même que la
surface du corps couverte par ces rayures alors que les bandes plus claires deviennent plus
fréquentes. De même, la taille des animaux diminue du nord au sud. Cette espèce est
principalement menacée par la perte de son habitat et par la chasse. (Moehlman, 2002)
c) Le zèbres de montagne
Le zèbre de montagne (E. zebra, 2n = 32) (Figure 6) se limite maintenant au sud-ouest
de l’Afrique. (Short, 1975) Il existe deux sous-espèces, le zèbre de Hartmann (E. zebra
hartmannae) (Short, 1975) et le zèbre du Cap (E. zebra zebra) qui est endémique en Afrique
du Sud (Skinner, 1985).
Figure 6 : Zèbres de montagne, d’après Terra Nova (2005b)
Actuellement, le zèbre de montagne est considéré comme en danger par la Liste Rouge
de l’IUCN. Le zèbre de Hartmann est placé en Annexe II de la CITES tandis que le zèbre du
28
Cap est placé en Annexe I. On suspecte que la population a diminué d’au moins 50% en dix
ans, soit trois générations. (Moehlman, 2002)
Historiquement, le zèbre du Cap occupait une vaste zone des montagnes du Cap,
cependant en 1936 il ne subsistait que 50 individus dans des régions montagneuses
inaccessibles. (Short, 1975) Il avait été décimé principalement en raison de la chasse et la
perte d’habitat due à l’agriculture. (Moehlman, 2002)
La création du Parc national du Zèbre de Montagne en 1937 a permis de réaugmenter
les effectifs. La population s’élevait ainsi à 235 animaux en 1984, 35 zèbres ayant servi à
repeupler d’autres zones que celle de la Province du Cap. (Skinner, 1985) Les effectifs ont
continué d’augmenter graduellement depuis et on atteint maintenant plus de 1 200 animaux.
Cependant un grand nombre d’entre eux sont détenus dans des fermes privées. (Moehlman,
2002)
Les principales menaces qui pèsent sur la survie du zèbre de montagne incluent les
risques de croisements entre les deux sous-espèces (avec la perte de diversité génétique qui en
résulterait), la sécheresse, et le nombre relativement faible d’individus sauvages, ce qui
signifie que la perte d’une seule population pourrait réduire la population totale d’environ
30%. (Moehlman, 2002)
Le zèbre de montagne est facilement identifiable par rapport aux deux autres espèces
par ses rayures transverses formant un grillage à la base de la queue et par un nombre
intermédiaire (environ douze) de rayures sur les flancs. (Short, 1975)
d) Le quagga
Le quagga (E. quagga) parcourait autrefois la Colonie du Cap en immenses troupeaux
mais il a été totalement exterminé au cours du siècle dernier. Il ne possédait aucune rayure sur
le train postérieur. (Short, 1975)
Cette espèce est considérée comme éteinte depuis 1878. (Skinner, 1985)
Suite à des analyses de l’ADN mitochondrial ainsi que des analyses immunologiques,
le quagga est considéré par certains comme une sous-espèce de zèbre des plaines. Cependant
ces analyses ne portaient que sur un faible nombre de paires de bases et les études
anatomiques laissent penser qu’il s’agirait plutôt d’une espèce à part entière. (Moehlman,
2002)
29
B. Les techniques de reproduction assistée
Nous allons voir tout d’abord en quoi l’utilisation de ces techniques semble
indispensable actuellement. Puis nous envisagerons les limites des programmes traditionnels
d’élevage en captivité ainsi que les objectifs des programmes de reproduction assistée. Enfin,
nous aborderons les différentes techniques utilisées.
1. Nécessité de l’utilisation de ces techniques
L’examen de données, telles que la liste rouge de l’IUCN (The Red List Consortium,
2005), confirme qu’un nombre immense d’espèces de Mammifères sont en danger ou
menacées d’extinction dans tous les habitats de par le monde. Les menaces qui pèsent sur ces
espèces sont diverses et souvent multifactorielles. Dans certains cas, des influences néfastes,
telles que la chasse ou l’introduction d’un prédateur non indigène ou d’une espèce en
compétition directe, s’exercent sur une seule espèce, mais dans la plupart des cas la menace
concerne la destruction d’écosystèmes dans leur ensemble suite à l’empiétement humain et à
la pollution. (Bainbridge et Jabbour, 1998)
Le problème se pose donc de l’intérêt de sauvegarder une espèce en particulier s’il est
peu probable qu’elle puisse être réintroduite dans son habitat sauvage. Ainsi, les techniques
de gestion de la reproduction utilisées en captivité doivent toujours être considérées dans un
contexte plus large de conservation de l’environnement. (Bainbridge et Jabbour, 1998)
La conservation des espèces animales a ainsi pour but de maintenir la biodiversité car
la disparition d’une seule espèce animale peut affecter le fonctionnement d’un écosystème
dans son ensemble. (Comizzoli et al., 2000)
Une espèce est considérée comme en danger quand sa survie à l’état sauvage est peu
probable si les facteurs à l’origine de sa diminution sont maintenus. Les populations dites
menacées peuvent être éteintes à l’état sauvage et sont composées de moins de 50 animaux
maintenus en captivité.
Ainsi, la conservation ex situ a pour but d’établir une population captive viable
permettant une éventuelle réintroduction et la cryoconservation des ressources génétiques
animales. (Comizzoli et al., 2000)
30
La gestion génétique des populations devrait désormais être mise en œuvre le plus tôt
possible plutôt que le plus tard possible comme cela a été fait jusqu’à maintenant. En effet,
pour être efficaces ces programmes doivent être mis en place avant que les populations aient
totalement décliné et que les espèces soient génétiquement “non-viables”. (Bainbridge et
Jabbour, 1998) En effet, lorsque les populations captives ne peuvent être fondées qu’avec une
ou deux paires d’individus restants, même si ce groupe est viable socialement et que les
individus commencent à se reproduire, les problèmes d’ordre génétique ne peuvent être
évités. La variabilité génétique est tellement limitée que ces individus ne peuvent être
considérés
comme
représentatifs
de
l’espèce,
l’adaptation
aux
changements
environnementaux n’est plus possible. (Kear, 1976)
La variabilité génétique de la population fondatrice utilisée pour amorcer les
programmes d’élevage en captivité est vue, de plus en plus, comme la ressource
fondamentale. Elle doit être préservée durant les périodes de captivité puisqu’elle permettra à
l’espèce d’être réintroduite avec succès à l’état sauvage et de s’adapter aux changements
ultérieurs de leur habitat. La variabilité génétique est probablement un meilleur indicateur du
succès des plans d’élevage en captivité que le nombre d’animaux engendrés. Les populations
d’animaux menacés devraient donc être considérées davantage comme des réservoirs
génétiques que comme des populations d’individus. Le concept de banque de ressources
génétiques, ou encore de “zoo surgelé” se situe donc au centre d’une telle gestion de la
reproduction. Il s’agit d’un dépôt de matériel génétique sous la forme de sperme, d’ovules et
d’embryons cryopréservés et maintenus en état d’interaction constante avec la population
“vivante” par l’utilisation des techniques de reproduction assistée. (Bainbridge et Jabbour,
1998)
2. Les limites des programmes traditionnels d’élevage en
captivité
Il existe de nombreux exemples du succès des programmes traditionnels d’élevage en
captivité et dans certains cas ces programmes restent suffisants pour prévenir l’extinction
d’une espèce donnée. Cependant, il existe six facteurs qui limitent souvent le succès de ces
programmes. (Lasley et al., 1994) Ces facteurs sont les mêmes quelle que soit l’espèce.
31
a) Espace physique
L’environnement joue un des rôle les plus important dans le succès de la reproduction
des animaux sauvages captifs. Ceci est particulièrement vrai pour les espèce de grande taille
ou solitaires (Lasley et al., 1994) ainsi que pour les grands prédateurs qui ont besoin de très
grands territoires (Wildt, 1992). Les tentatives mises en œuvre pour préserver la diversité
génétique parmi un large nombre d’espèces en péril, dans l’espace disponible, limitent le
nombre de descendants pour un individu donné. Ceci élimine certains individus du
programme d’élevage bien avant la fin de leur vie de reproducteurs.
De plus, bien que les enclos inadaptés ou dont l’environnement est peu stimulant
soient de plus en plus rares, les véritables besoins de certaines espèces pour assurer leur
reproduction sont toujours inconnus. (Lasley et al., 1994)
b) Santé et bien-être
Actuellement il existe un conflit pour la construction et l’entretien des enclos dont on
attend qu’ils soient sûrs, hygiéniques et esthétiques à la fois du point de vue du public et des
animaux. Ces exigences sont souvent opposées. (Lasley et al., 1994)
L’évaluation de la santé des animaux dans un troupeau de reproducteurs est un point
essentiel du succès d’un programme d’élevage. (Lasley et al., 1981) Cependant, le dépistage
des maladies contagieuses chez les espèces non domestiques est une science incomplète et
certaines maladies peuvent échapper à la détection malgré une méthodologie stricte. Les
conséquences sont en général majeures, pouvant aller jusqu’à décimer la totalité d’un
troupeau. (Lasley et al., 1994)
c) Comportement
Le respect du comportement social est particulièrement important pour la reproduction
et la prise en charge de la progéniture. Sur plus de 4000 espèces de mammifères, moins de
100 ont été étudiées en détail en ce qui concerne leur comportement et leur physiologie de la
reproduction.
Les comportements d’agressivité exacerbés surviennent en général lorsque les
animaux sont maintenus en surnombre. Le surnombre survient du fait de la nécessité de
conserver la diversité génétique et de maintenir un nombre suffisant d’individus pour
32
poursuivre un programme d’élevage. Le surnombre peut être accru lorsqu’une variété
d’espèces différentes sont présentées dans un espace limité. (Lasley et al., 1994)
d) Alimentation
La contribution des facteurs nutritionnels dans le succès de la reproduction est
totalement inconnue chez les espèces non domestiques. Pour la plupart des espèces le type
d’alimentation idéal ou du mois adéquat n’est pas connu ou n’est pas disponible. Dans
certains cas cette nourriture peut être disponible mais ce type d’alimentation ne peut être
utilisé (cas des proies vivantes chez les carnivores par exemple). (Lasley et al., 1994)
e) Gestion génétique
Les caractères génétiques de la population fondatrice sont un facteur décisif lorsque
l’on débute un programme d’élevage. L’instabilité démographique, la réduction de la diversité
génétique et les effets délétères de la consanguinité sont les principaux problèmes rencontrés
dans les petites populations captives. La mise en évidence d’une diminution de la fécondité,
d’une mortalité fœtale et néonatale augmentée, d’une plus grande sensibilité aux maladies et
de tératospermie a attiré l’attention sur l’importance de la gestion génétique. (Lasley et al.,
1994) Nous reviendrons sur ces facteurs contre lesquels il semble difficile de lutter dans le
cadre des programmes d’élevage traditionnels où les groupes d’animaux sont en général de
très petite taille.
f) Echec de la reproduction
Les facteurs physiologiques, bien que très souvent impliqués, ne sont pas toujours
responsables des échecs de la reproduction. Ces échecs peuvent être le résultat direct de
conditions sociales et environnementales inadéquates. Il est donc possible, dans certains cas,
d’améliorer la reproduction par de simples changements environnementaux ou des habitudes
de gestion des animaux. (Lasley et al., 1994)
Tous ces problèmes sont bien souvent difficiles à résoudre. (Lasley et al., 1994) Les
zoos n’ont tout simplement pas les ressources nécessaires, à la fois financières et en terme
d’espace, pour lutter contre le nombre impressionnant d’espèces menacées d’extinction ou
susceptibles de le devenir. (Wildt, 1992) Les limites et les risques inhérents aux approches
traditionnelles de la reproduction des populations captives apparaissent comme évidents, de
33
même que l’intérêt que peuvent apporter les méthodes de reproduction assistées dans la
gestion de ces problèmes. (Lasley et al., 1994)
3. Les objectifs des programmes de reproduction assistée
La viabilité des populations animales maintenues en petits groupes d’élevage captifs
est menacée par deux facteurs principaux. Tout d’abord, les animaux subissent une adaptation
génétique à la captivité. En effet, les animaux sont progressivement sélectionnés pour les
caractères qui améliorent leur aptitude à vivre dans des conditions artificielles. On pense que
ce type d’adaptation se met en place relativement rapidement et peut sérieusement
compromettre le succès d’une réintroduction à l’état sauvage.
De plus, la reproduction au sein de petites populations aboutit à la consanguinité. Il y a
perte génétique au cours de la reproduction et une fraction de la variabilité génétique d’une
génération donnée est invariablement perdue lors de la production de la génération suivante.
Ceci aboutit pour la population à la perte rapide et irréversible d’allèles potentiellement
précieux (variants génétiques) et à une progression vers un état dans lequel tous les individus
sont homozygotes pour la plupart des loci des gènes. La consanguinité peut affecter de façon
importante les performances reproductrices. (Bainbridge et Jabbour, 1998) Elle entraîne
également une mortalité augmentée chez les jeunes. Il a ainsi été démontré que chez le zèbre
(Equus burchelli) la mortalité juvénile est significativement plus élevée lors de consanguinité.
(Ralls, 1979) On remarque également, lors de consanguinité, une incidence plus élevée de
tératospermie ainsi qu’une plus grande sensibilité aux maladies. (Wildt et al., 1992)
La sélection artificielle suite à la captivité ainsi que la consanguinité (associée à de la
mortalité juvénile et une durée de vie plus courte) sont des problèmes très importants et
récurrents dans les populations de chevaux de Przewalski. On considère que 60% de la
diversité génétique de l’espèce a été perdue depuis qu’elle est maintenue en captivité.
(Moehlman, 2002)
La reproduction et la variabilité génétique sont donc fortement liées et la conservation
de cette variabilité est un des buts essentiels des programmes d’élevage en captivité.
(Bainbridge et Jabbour, 1998)
On doit cependant remarquer que toutes les espèces ne sont pas affectées de la même
manière par la consanguinité. Son impact dépend de la structure sociale de l’espèce, de son
34
mode de reproduction et d’autres facteurs comportementaux. (Raffin et Vourc’h, 1992) Ainsi
une espèce pour laquelle le nombre d’individus est à l’origine naturellement réduit sera moins
affectée par la consanguinité.
La consanguinité et l’adaptation génétique à la captivité ne semblent pas pouvoir être
totalement évitées mais une gestion génétique prudente permet de les réduire. Dans cette
optique, certains paramètres de la population semblent particulièrement importants et leur
bonne gestion pourrait être la clé de la mise en œuvre pratique des plans de reproduction.
(Bainbridge et Jabbour, 1998)
a) Taille de la population
Afin d’augmenter la diversité génétique au départ d’un programme d’élevage, le
nombre d’animaux de la population fondatrice devrait être aussi grand que possible.
Cependant, en pratique, il est souvent limité par les animaux disponibles à l’état sauvage et
captif. La population captive totale est inférieure à 200 individus dans de nombreuses espèces,
ce nombre étant considéré comme un minimum raisonnable pour une population fondatrice.
Une fois le programme d’élevage mis en place, la taille de la population doit être maintenue
ou même augmentée car la consanguinité survient plus rapidement dans les petits groupes.
Le maintien de grandes populations captives représente un problème considérable en
termes de coût financier et d’espace physique. Une solution à ce problème est désormais
disponible avec le développement récent des techniques de reproduction assistée et des
banques de ressources génétiques. Ainsi une "pseudo-population" de grande taille pourrait
être maintenue de façon relativement peu onéreuse et le nombre d’animaux “vivants” pourrait
être réduit au minimum nécessaire à la propagation de la descendance provenant de la banque
génétique. (Bainbridge et Jabbour, 1998)
b) Intervalle entre les générations
Puisqu’il y a une perte de matériel génétique durant la production des gamètes, il a été
suggéré d’augmenter l’intervalle entre les générations dans les populations captives. Une
option intéressante dans ce but est l’utilisation du stockage d’embryons cryopréservés (ou des
gamètes utilisés pour les produire). Ces embryons pourraient être conservés sur de longues
périodes avant d’être décongelés pour produire de nouveaux individus. (Bainbridge et
Jabbour, 1998)
35
c) Facteurs démographiques et stochastiques
Les modèles permettant d’étudier les pertes génétiques dans les populations ne
tiennent pas compte des fluctuations, liées au hasard, de certains paramètres qui apparaissent
dans les populations réelles tels que le sex-ratio de la descendance.
Ces facteurs démographiques et stochastiques sont présentés dans le Tableau 1. Ils
représentent une menace majeure pour le succès des programmes d’élevage en captivité. La
solution à ce problème est d’appliquer sur le groupe d’animaux captifs des mesures
d’accouplements randomisés grâce auxquelles chaque individu contribue à part égale à fournir
le matériel génétique de la génération suivante. Les techniques de reproduction assistée
peuvent permettre la mise en œuvre de ces mesures. Un tel protocole élimine également les
pressions de sélection qui entraînent une adaptation génétique à la captivité.
Tableau 1 : Facteurs démographiques et stochastiques qui peuvent réduire la taille
d’une population animale, d’après Bainbridge et Jabbour (1998).
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
10)
Variation de la taille des portées
Variation du sex-ratio de la progéniture
Polygynie
Polyandrie
Accouplement préférentiel entre certains individus
Fluctuations des taux de natalité et mortalité
Chevauchement entre les différentes générations
Séparation en petites populations, par exemple suite à la migration
Mutations génétiques
Liaison génétique (linkage) (tendance de deux gènes à être hérités ensembles en
raison de leur association physique sur un même chromosome)
11) Sélection
Il est cependant important (afin d’éviter l’apparition de nouvelles pressions de
sélection), que les animaux ne soient pas exclus des programmes d’élevage en raison de
difficultés de collecte, de conservation ou de transfert de leurs gamètes ou de leurs embryons.
(Bainbridge et Jabbour, 1998)
36
d) Variations
génétiques
en
fonction
des
zones
géographiques
Les espèces sauvages existent souvent sous la forme de nombreuses sous-populations,
parfois distribuées sur de grandes zones géographiques. Ces sous-populations peuvent porter
des allèles génétiques différents qui leur ont permis de s’adapter à leurs différents habitats.
Pour assurer le maintien de ces allèles potentiellement utiles, il a été suggéré que les
individus utilisés pour mettre en œuvre un programme d’élevage en captivité devraient être
collectés sur une zone géographique aussi large que possible. Par ailleurs, on pourrait aussi
penser que ces petites populations sauvages devraient être propagées séparément en captivité
afin d’encourager le maintien des allèles spécifiques. Cependant une telle subdivision est en
conflit avec la nécessité d’une population de taille maximale et choisie de façon randomisée,
comme elle a été décrite préalablement. En dépit de ces mises en garde, il est pourtant
probable que dans de nombreux cas la subdivision d’une espèce en populations régionales
serait souhaitable afin de conserver leur aptitude à une réintroduction à l’état sauvage.
(Bainbridge et Jabbour, 1998)
Le problème des sous-populations est un facteur majeur dans la sauvegarde des
espèces de zèbres et des équidés sauvages de manière générale. (Moehlman, 2002)
e) Réintroduction de matériel génétique sauvage
L’introduction occasionnelle de matériel génétique d’origine sauvage constitue une
solution aux problèmes de consanguinité et d’adaptation génétique à la captivité. Un transfert
de gènes sous la forme de gamètes, par exemple grâce à une collecte unique de semence sur
un individu sauvage anesthésié, pourrait être un moyen efficace et peu dangereux pour les
animaux. (Bainbridge et Jabbour, 1998) Nous avons vu que cette option a été envisagée dans
le cas du zèbre de Grévy.
Cependant il faut souligner que cette réintroduction de matériel génétique n’est pas
possible pour toutes les espèces menacées puisqu’un certain nombre d’entre elles sont éteintes
à l’état sauvage et ne subsistent que grâce aux populations captives. C’est d’ailleurs le cas du
cheval de Przewalski. La situation de ces espèces est particulièrement critique et nécessite une
gestion minutieuse. (Gibbons et Durrant, 1987)
37
f) Considérations logistiques et médicales
Les techniques de reproduction assistée pourraient permettre de réduire de façon
avantageuse les problèmes logistiques et les risques de maladies. Le transport d’embryons ou
de gamètes est beaucoup moins coûteux et moins risqué d’un point de vue sanitaire que le
transport d’animaux vivants. (Bainbridge et Jabbour, 1998) De plus, il est généralement admis
que le risque potentiel de transmission de maladies par transfert d’embryons est largement
inférieur à celui de la semence. (Schiewe et al., 1995)
Les techniques de reproduction assistée permettent également de recueillir le matériel
génétique d’animaux qui sont incapables de s’accoupler ou de porter une progéniture à terme.
La collecte de gamètes sur des animaux débilités a été décrite, entre autres, chez le cheval de
Przewalski. La collecte de gamètes post mortem a également été décrite chez de nombreuses
espèces. (Bainbridge et Jabbour, 1998)
4. Les différentes techniques utilisées
Les techniques de reproduction assistée peuvent être divisées en trois grandes
catégories.
Les premières peuvent être considérées comme des techniques préliminaires, elles ne
mettent pas en jeu le transfert de matériel génétique mais permettent d’amener les animaux à
un statut reproducteur optimal pour donner ou recevoir des gamètes ou des embryons. Les
deux procédures les plus fréquemment utilisées sont le contrôle du développement des
follicules ovariens (synchronisation de l’ovulation) et la stimulation du développement d’un
nombre supraphysiologique d’ovocytes matures (superovulation) ; cette dernière procédure ne
pouvant être utilisée à l’heure actuelle chez les Equidés.
La seconde série de techniques permet le transfert de matériel génétique entre
individus, sous la forme de sperme, ovules ou embryons.
Les avantages d’un stockage à long terme des gamètes et embryons ont entraîné le
développement d’un troisième type de techniques qui ont permis la création de banques de
ressources génétiques congelées. (Bainbridge et Jabbour, 1998)
38
a) Synchronisation de l’ovulation
Les processus de l’ovulation et de la mise en place de la gestation sont très fortement
liés puisque deux produits de l’ovulation sont nécessaires à la gestation : un ovocyte
fertilisable et au moins un corps jaune sécrétant de la progestérone.
La détection du comportement d’œstrus et de l’ovulation est souvent difficile chez les
Mammifères. Les manifestations comportementales de l’œstrus peuvent être inhibées par la
captivité et les modifications endocrinologiques sont difficiles à contrôler et dépendantes de
l’espèce. En raison de ces problèmes, il est souvent plus efficace d’induire artificiellement
l’ovulation dans un groupe de femelles.
La méthode utilisée pour induire l’ovulation à un moment donné doit imiter le
processus qui induit l’ovulation de manière naturelle. Ainsi, chez les Equidés et les ruminants
on peut induire l’ovulation par des injections de prostaglandine F2α ou d’un analogue ou par
le retrait d’un implant de progestérone. (Bainbridge et Jabbour, 1998)
b) Superovulation
En règle générale, le taux d’ovulation détermine la taille de la portée mais on suppose
que des interactions physiologiques complexes déterminent également la taille de la portée.
La balance qui existe entre le développement et l’atrésie des follicules ovariens est décisive.
Elle semble être contrôlée par une série de mécanismes de régulation intra-ovariens, interovariens et extra-ovariens qui ne sont pas totalement compris.
Le but du contrôle artificiel du taux d’ovulation est d’augmenter sélectivement la
propagation du matériel génétique femelle en induisant la formation d’un plus grand nombre
d’embryons pouvant être viables par collecte. Une superovulation peut être obtenue par
l’administration de gonadotrophines exogènes telles que la PMSG ou la FSH. Ces hormones
influent sur le processus de sélection folliculaire en favorisant leur développement et en
limitant l’atrésie. (Bainbridge et Jabbour, 1998)
Cependant, nous verrons qu’à ce jour aucune molécule ne s’est montrée efficace chez
les Equidés.
39
c) Insémination artificielle (IA)
L’IA est la technique la plus fréquemment utilisée pour le transfert de matériel
génétique chez les Mammifères non domestiques.
Trois méthodes de collecte de semence peuvent être utilisées dans le cadre des
programmes d’élevage : un vagin artificiel, l’électroéjaculation et la collecte post mortem.
L’utilisation d’un vagin artificiel peut être dangereuse pour le personnel manipulant l’animal
comme c’est le cas chez les Equidés.
En ce qui concerne l’électroéjaculation, elle a été utilisée avec succès chez de
nombreuses espèces. Cependant cette procédure présente des inconvénients : les animaux
doivent en général être anesthésiés ou fortement sédatés et les échantillons de semence
peuvent être contaminés par de l’urine.
Des spermatozoïdes viables peuvent également être collectés à partir de la queue de
l’épididyme dans un délai court après la mort. (Bainbridge et Jabbour, 1998)
Chez les Equidés, la première technique est la plus fréquemment utilisée.
L’électroéjaculation semble peu efficace et elle est, de plus, déconseillée sur des chevaux
debouts ou sédatés. Un certain succès de cette technique a cependant été rapporté chez des
chevaux de Przewalski immobilisés chimiquement. La collecte de sperme dans l’épididyme
est une technique efficace bien que peu utilisée. (Cary et al., 2004)
Chez les espèces non domestiques, on a cherché à développer, lorsque cela était
possible des méthodes d’IA non invasives. (Lasley et al., 1994) Les femelles peuvent ainsi
être inséminées par voie vaginale dans le vagin crânial, le col ou l’utérus en fonction de
l’anatomie de l’espèce. Cependant dans de nombreuses espèces l’insémination intra-utérine
par laparoscopie donne de meilleurs résultats. (Bainbridge et Jabbour, 1998) Nous verrons
cependant que chez les Equidés le passage du col utérin se fait facilement, l’IA par voie
vaginale est donc la méthode de choix. (Bainbridge et Jabbour, 1998)
L’IA permet le contrôle de la propagation du matériel génétique de mâles sélectionnés,
il s’agit de la technique de reproduction assistée la plus largement utilisée. (Comizzoli et al.,
2000)
L’un des principaux succès de l’IA chez une espèce sauvage est son utilisation
particulièrement fructueuse dans la gestion d’une espèce dangereusement menacée, le putois
40
d’Amérique (Mustela nigripes) puisqu’elle a permis de régénérer une population sauvage
viable. (Bainbridge et Jabbour, 1998)
Enfin, la cryopréservation de la semence est un complément extrêmement important
de l’IA car elle permet de s’affranchir des contraintes de temps et de distance et de préserver
le matériel génétique sans occuper d’espace dans les zoos. (Loskutoff et Betteridge, 1992)
d) Transfert d’embryons
Le transfert d’embryons d’une femelle donneuse à une receveuse présente un avantage
significatif par rapport à l’IA car le matériel génétique de la femelle est propagé sélectivement
au même titre que celui du mâle. (Bainbridge et Jabbour, 1998)
La technique de transfert d’embryons a été utilisée chez de très nombreuses espèces
d’ongulés sauvages (bovidés, camélidés, cervidés…). (Bainbridge et Jabbour, 1998) Elle
permet d’augmenter le nombre de naissances par année pour certains animaux sélectionnés ou
pour l’ensemble du groupe. (Summers, 1986)
Chez les grands Mammifères (bovidés, cervidés, équidés) la collecte et le transfert
transcervical sont utilisés. Cependant, le transfert d’embryon par laparoscopie est la méthode
appliquée lorsque les méthodes non chirurgicales sont inutilisables. (Comizzoli et al., 2000)
e) Techniques de transfert d’embryons interspécifique
Il s’agit de la technique à laquelle nous allons nous intéresser plus particulièrement par
la suite.
Comme nous l’avons vu, dans les espèces qui ont été réduites à de très petites
populations, le nombre de femelles capables de porter des embryons à terme peut être un
facteur limitant majeur dans la production d’une population viable lors d’un programme
d’élevage. Le transfert d’embryon interspécifique offre une solution à ce problème. Des
femelles d’une espèce proche abondante sont alors utilisées comme receveuses. (Bainbridge
et Jabbour, 1998) Cette technique représente un défi supplémentaire puisque son succès
dépend de la sélection appropriée du couple d’espèces donneuse/receveuse. (Lasley et al.,
1994)
La sélection d’une receveuse pour un transfert d’embryon interspécifique repose en
général sur des similarités concernant le cycle œstral et la gestation. La capacité de deux
41
espèces à s’hybrider peut également être un indicateur du succès d’une gestation
interspécifique (cas du cheval de Przewalski avec le cheval domestique). (Lasley et al., 1994)
Il pourrait également être envisageable, chez les Equidés, d’utiliser des hybrides comme
receveurs d’embryons. (Loskutoff et Betteridge, 1992)
Lorsqu’une espèce receveuse adaptée est identifiée, elle peut servir non seulement à
propager rapidement l’espèce menacée mais également à l’introduire dans des régions ou des
zoos où aucun représentant de cette espèce menacée n’est présent. (Durrant et Benirschke,
1981)
Le transfert d’embryons interspécifique a été réalisé avec succès chez les équidés
sauvages (Summers et al., 1987 ; Bennett et Foster, 1985), comme nous l’étudierons par la
suite, mais aussi entre le mouflon (Ovis musimon) et le mouton domestique (Ovis aries), entre
le zébu (Bos indicus) et le bœuf (Bos taurus), entre le gaur (Bos gaurus) et des bovins
domestiques, entre l’eland et le bongo (Bainbridge et Jabbour, 1998) et entre le chat indien du
désert (Felis silvestris) et le chat domestique (Felis catus) (Comizzoli et al., 2000).
Malgré ces succès, les taux de gestation peuvent être bas après transfert d’embryon
interspécifique. Les raisons de ces échecs sont variées et peu claires. Dans certains cas il
semblerait que le fœtus ne sécrète pas les bons facteurs en quantité correcte et au bon moment
pour empêcher la lutéolyse, ce qui entraînerait la perte de la gestation. Il peut aussi y avoir
incompatibilité physiologique entre les deux espèces ce qui est à l’origine de troubles
immunologiques ou endocriniens ou entraîne la formation d’un placenta inadapté.
(Bainbridge et Jabbour, 1998)
f) Fécondation in vitro (FIV) et techniques associées
Il s’agit de la technique la plus efficace pour la propagation des petites populations
mais c’est également la méthode la plus coûteuse. (Comizzoli et al., 2000) La production
d’embryons par FIV n’est d’ailleurs pas une procédure de routine chez le cheval domestique.
(Squires et al., 2003)
L’utilisation de la FIV offre une opportunité sans équivalent pour contrôler l’avenir
génétique des populations captives. Les ovocytes et les spermatozoïdes peuvent être prélevés
sur des animaux sélectionnés. Un second avantage de la FIV est que les ovocytes obtenus sur
des femelles stimulées par des gonadotrophines sont exposés aux effets délétères de ces
gonadotrophines sur une période plus courte que les embryons récupérés lors de procédure
42
conventionnelle de transfert d’embryons. (Bainbridge et Jabbour, 1998) De plus, le nombre
d’embryons pouvant être produit est plus élevé que lors de récolte embryonnaire pour
transfert, ce qui présenterait un intérêt non négligeable chez les Equidés. (Loskutoff et
Betteridge, 1992) Les gamètes peuvent être collectés par des procédures variées. Cependant,
la capacité à collecter les ovocytes et à transférer les embryons par laparoscopie sous sédation
plutôt que par laparotomie sous anesthésie générale doit être largement recherchée pour les
espèces captives de valeur. (Bainbridge et Jabbour, 1998) Chez les Equidés (mais aussi chez
les bovins) la collecte par voie transvaginale sous contrôle échographique est également
utilisée. (Loskutoff et al., 1995) Cette procédure est d’autant plus intéressante qu’elle permet
de répéter les récoltes d’ovocytes. (Polge, 1985) Elle a tout d’abord été réalisée avec succès
chez la jument domestique, y compris chez la jument gestante. Elle a par la suite été appliquée
efficacement chez des zèbres sauvages dans le Transvaal en Afrique du Sud. Trois procédures
de collecte sous anesthésie générale ont été réalisées sur une période de 28 jours chez 5
femelles zèbres de Burchell, sans traitement hormonal préalable. En moyenne, 7 ovocytes ont
été récupérés sur chacune des 4 femelles non gestantes (51% d’efficacité de la récolte) et 5
ovocytes ont été récupérés après aspiration de 9 follicules (56% d’efficacité) chez une femelle
gestante sans que la gestation soit affectée. (Loskutoff et al., 1995)
La FIV permet également de contourner le problème de la détection du moment de
l’ovulation qui est rencontré avec l’IA. La FIV rend possible l’utilisation d’animaux souffrant
de certains types d’infertilité (endométrite, obstruction tubaire), elle permet de réduire la
quantité de sperme nécessaire à la fécondation par rapport à l’IA. Il est, de plus,
potentiellement possible de récupérer le matériel génétique d’une femelle après sa mort.
(Lasley et al., 1994)
La procédure de FIV est divisée en quatre phases : maturation ovocytaire, capacitation
des spermatozoïdes, fécondation et culture embryonnaire. (Bainbridge et Jabbour, 1998)
La maturation ovocytaire est une étape au cours de laquelle des processus complexes
qui concernent à la fois le noyau, le cytoplasme et le cytosquelette surviennent
simultanément. Ils rendent la cellule apte à être fécondée. (Bainbridge et Jabbour, 1998) La
maturation in vitro des ovocytes immatures a constitué une des limites de la FIV chez
certaines espèces dont les Equidés. (Loskutoff et al., 1995) Cependant la méthode de
maturation in vitro est a présent maîtrisée chez le cheval. (Hinrichs et al., 2002) La maturation
in vitro des ovocytes ainsi que leur fécondation a également été étudiée chez deux espèces de
43
zèbres, le zèbre des plaines (Equus burchelli) et le zèbre de montagne de Hartmann (Equus
zebra hartmannae). (Comizzoli et al., 2000)
La capacitation des spermatozoïdes est également un processus complexe au cours
duquel surviennent les changements des constituants de la membrane qui sont à la base de la
préparation des spermatozoïdes pour pénétrer dans l’ovule. (Bainbridge et Jabbour, 1998)
Dans certains cas, l’utilisation de sperme épididymal pour la FIV peut permettre d’éviter
d’avoir recourt à des traitements supplémentaires (par exemple du calcium ionophore) pour
induire la capacitation in vitro. Ceci a été démontré chez l’étalon zèbre des plaines. (Loskutoff
et al., 1995)
La fécondation est le processus le mieux compris, elle se traduit par la perte de
l’acrosome et la fusion des deux cellules. (Bainbridge et Jabbour, 1998) Les taux de
fertilisation ont été largement améliorés chez le cheval grâce à l’utilisation d’une procédure
simple de préfertilisation appelée le zona drilling (ZD). (Meintjes et al., 1997) Le ZD consiste
à créer une perforation de façon mécanique dans la zone pellucide de l’ovocyte de manière à
faciliter le passage de spermatozoïdes dans la zone pellucide. (Hamamah et Entezami, 2001)
Cette technique s’est révélée efficace également chez le zèbre. (Meintjes et al., 1997)
Le développement des procédures de culture in vitro des embryons d’espèces non
domestiques est encore assez limité. (Loskutoff et al., 1995)
Dans le but de surmonter les difficultés liées à la capacitation et à la fécondation, les
techniques d’injection intracytoplasmique ou sous-zonale de spermatozoïdes (ICSI et SUZI),
qui sont utilisée avec succès lors de FIV chez l’homme, sont maintenant adaptées pour être
utilisées chez l’animal. (Bainbridge et Jabbour, 1998) Des embryons de cheval et de zèbre ont
pu être produits grâce à ces techniques. (Loskutoff et al., 1995)
Les techniques de fécondation in vitro offrent donc un haut degré de flexibilité dans le
contrôle du matériel génétique des espèces menacées. Cependant, ces techniques sont
difficiles à mettre en œuvre, coûteuses et restent associées à de faibles taux de gestations.
(Bainbridge et Jabbour, 1998)
g) Banques de données génomiques
Les banques de données génomiques permettent la collecte, le stockage et l’utilisation
des gamètes, embryons et autres matériaux biologiques. (Comizzoli et al., 2000) Ces
44
matériaux sont alors stocké à des températures auxquelles leur métabolisme et leur
développement sont stoppés. (Wildt, 1991)
En association avec les techniques de reproduction assistée, ces banques de données
constituent l’interface pour la conservation in situ et ex situ. Utilisées correctement, ces
banques de données peuvent potentiellement ralentir la perte de diversité génétique dans les
populations captives par réintroduction de matériel génétique original sans prélever
d’individus sauvages de grande valeur génétique. (Comizzoli et al., 2000)
Ces banques de données constituent la clé de l’utilisation pratique des techniques de
reproduction assistée. Elles permettent ainsi les mouvements de matériel génétique entre les
populations d’animaux (sauvages et captives) en maintenant ainsi la vigueur génétique. Elles
fournissent également une assurance contre l’éventuelle disparition d’une espèce ou d’une
population ; les petites populations étant fortement sensibles aux épizooties, aux catastrophes
naturelles…
Ces banques de données fournissent également la matière nécessaire aux biologistes
pour la recherche fondamentale et appliquée nécessaire pour la compréhension des espèces
menacées. (Wildt, 1992)
La présentation de ces différentes techniques met en évidence la contribution
potentiellement très importante que les techniques de reproduction assistée pourraient
apporter, nous seulement pour l’augmentation des effectifs, mais également dans la réduction
de la consanguinité et l’adaptation génétique à la captivité chez les petites populations
d’espèces de Mammifères menacées et donc chez certaines espèces d’équidés sauvages.
(Bainbridge et Jabbour, 1998)
45
II.
Etude
préliminaire
chez
les
équidés
domestiques
Lors de cette étude, nous ferons tout d’abord quelques rappels concernant le cheval
afin de bien connaître la technique du transfert d’embryons et d’expliquer certains points de
physiologie de la reproduction chez cette espèce. Dans un deuxième temps nous nous
intéresserons aux expériences de transferts d’embryons qui ont été réalisées chez les équidés
domestiques.
A. Rappels concernant le cheval
Dans cette première partie, nous verrons tout d’abord la technique de transfert
d’embryons telles qu’elle est utilisée chez la jument domestique. Nous aborderons ensuite un
point important de la physiologie de la gestation chez les Equidés : la formation des cupules
endométriales, avec le cas particulier des hybrides âne/cheval. Cette partie permettra donc de
mettre en place les bases nécessaires à la compréhension du transfert d’embryons
interspécifique.
1. Le transfert d’embryons chez le cheval
Le premier transfert d’embryon réalisé avec succès chez le cheval a eu lieu en 1972.
Cependant ce n’est que dans les années 80 que cette technique est devenue une procédure
courante dans la filière d’élevage du cheval.
Le transfert d’embryon est actuellement la technique de reproduction assistée la plus
largement utilisée chez la jument. Les applications de cette technique sont nombreuses ; il
s’agit d’obtenir des poulains de juments en compétition ou plusieurs poulains d’une même
jument chaque année ou encore d’obtenir des poulains de juments âgées de deux ans. Cette
technique est également utile pour une jument présentant des problèmes de santé autres que
reproducteurs. Enfin, le transfert d’embryon est largement utilisé comme outil de recherche.
(Vanderwall, 2000)
Nous allons décrire ici les différentes étapes d’un transfert d’embryon chez des
juments domestiques.
46
a) Le cycle œstral de la jument
Le cheval est un animal polyœstrien saisonnier dont la saison de reproduction s’étend
du printemps au début de l’automne. Le cycle œstral normal est de 21 à 23 jours
correspondant à 16 à 17 jours de diœstrus et 4 à 7 jours d'œstrus.
Huit à douze follicules de plus de 1 cm de diamètre sont en général présents sur les
ovaires le premier jour de l’œstrus mais un seul d’entre eux (parfois deux) progresse jusqu’à
l’ovulation. Le follicule ovulatoire atteint un diamètre de 3 à 5 cm et est ainsi palpable à
travers le rectum. L’ovulation a lieu 12 à 36 heures avant la fin du comportement d’œstrus. La
lutéinisation du corps hémorragique survient rapidement engendrant une augmentation rapide
de la progestérone plasmatique. (Figure 7) La mesure quotidienne de la progestérone peut
donc permettre de détecter efficacement le jour de l’ovulation dans le but d’un transfert
d’embryon. (Allen, 1982a) Cependant, cette méthode est peu utilisée en pratique, la
synchronisation de l’ovulation étant la méthode de choix.
Les variations de sécrétion des gonadotrophines pituitaires au cours du cycle sont très
différentes chez la jument par rapport aux autres grandes espèces domestiques.
Les variations de la concentration plasmatique de l’hormone stimulant les follicules
(FSH) suivent une courbe biphasique avec un pic principal en milieu de cycle et un second
plus petit associé à l’ovulation. La concentration de l’hormone lutéinisante (LH) quant à elle
se maintient basse durant le diœstrus mais augmente régulièrement durant l’œstrus pour
présenter un pic 1 à 3 jour après l’ovulation. (Figure 7) Cette sécrétion prolongée de LH
durant l’œstrus chez la jument contraste vivement avec la sécrétion rapide et pulsatile qui a
lieu 24 à 30 heures avant l’ovulation chez les autres espèces.
47
La barre horizontale représente l’œstrus et OV indique le jour de l’ovulation.
Figure 7 : Variation des concentrations de gonadotrophines (FSH et LH) et des
hormones stéroïdiennes dans le sang de la jument durant le cycle œstral, d’après Allen
(1982a)
La grande variabilité, qui existe à la fois dans la durée de l’œstrus et le moment de
l’ovulation par rapport aux signes d’œstrus, empêche toute référence à l’œstrus pour calculer
l’âge de l’embryon dans le but de déterminer le moment de sa récupération. Le moment de
l’ovulation est le seul paramètre qui puisse être utilisé dans ce but. On appelle donc en général
J0 le premier jour où l’on repère l’ovulation. Il en résulte que, si les juments donneuses sont
examinées une fois par jour, soit par palpation trans-rectale, soit par mesure de la
progestérone plasmatique, le moment de l’ovulation est détecté avec une incertitude pouvant
48
atteindre 24 heures. Ceci explique les variations considérables de développement observées
sur les blastocystes récupérés à J7 ou J8 pour les transferts d’embryons chez le cheval. (Allen,
1982a)
b) Gestion des juments
La jument donneuse doit subir un examen reproducteur complet afin de s’assurer
qu’elle soit apte à être utilisée dans le cadre d’un programme de transfert d’embryon. Il est
nécessaire d’observer son comportement reproducteur. La réalisation d’une palpation et d’une
échographie transrectales permet de déterminer l’activité folliculaire ovarienne. Lorsqu’elle
est en chaleur, la jument est examinée chaque jour, ce qui permet de déterminer le moment
optimal de l’insémination. (Vanderwall, 2000)
Une sélection et une gestion correctes des juments receveuses sont les facteurs les plus
influents sur le succès d’un programme de transfert d’embryons. La jument receveuse doit
présenter un cycle œstral normal et une absence d’anomalie ovarienne ou utérine. L’âge
optimum pour une jument receveuse se situe entre 3 et 10 ans. (Vanderwall, 2000) Il a été
démontré que la tonicité de l’utérus et du col sont les facteurs les plus importants pour la
sélection des receveuses. (Squires et al., 2003)
c) Synchronisation de l’ovulation
Le degré d’asynchronie peut être –1 à +3 jours, en considérant la receveuse par rapport
à la donneuse. (Vanderwall, 2000)
La période critique pour la reconnaissance de la gestation se situe autour de J14 après
l’ovulation. L’embryon induit alors la suppression de la sécrétion cyclique de prostaglandine
F par l’endomètre à la fin du diœstrus. Cette sécrétion étant en principe à l’origine de la
lutéolyse. Il faut noter que la récolte et le transfert du blastocyste peuvent momentanément
altérer son développement. Dans certains cas le blastocyste pourra donc ne pas être
suffisamment mature pour prévenir la lutéolyse bien qu’il soit, théoriquement, suffisamment
développé.
L’une des conditions de l’utilisation à grande échelle du transfert d’embryons chez le
cheval est la possibilité de synchroniser le moment de l’ovulation entre les groupes de
juments donneuses et receveuses. La capacité d’une seule injection d’une dose relativement
faible de prostaglandine F2α (PGF2α), ou de divers analogues de la prostaglandine, à induire
49
une lutéolyse rapide chez la jument en diœstrus a fourni les bases des méthodes de traitement
utilisées pour contrôler l’ovulation chez la jument. (Allen, 1982a) La PGF2α peut être utilisée
seule ou combinée avec l’utilisation de progestérone exogène. (Vanderwall, 2000) Un schéma
de synchronisation utilisable dans le cadre d’un transfert d’embryon correspond à deux
injections de 250g chacune d’un analogue de la prostaglandine : le fluprostenol, à 14 ou 15
jours d’intervalle chez des juments cyclées. Il en résulte que 90% des juments présentent un
œstrus 6 jours après la deuxième injection et environ 75% ovulent dans les 20 à 24 jours après
la première injection. Ceci peut être associé ou non à l’utilisation de human Chorionic
Gonadotrophin (hCG) pour déclencher l’ovulation lors des œstrus induit par la
prostaglandine. (Allen, 1982a) Ainsi l’ovulation est fréquemment déclenchée, en particulier
chez la donneuse, grâce à l’utilisation de hCG (5 UI/kg IV ou IM) ou de deslorelin acétate, un
agoniste de la Gonadotropin Releasing Hormone (GnRH) (Ovuplant® ; 2,2 mg pellet SQ).
(Vanderwall, 2000)
Il est possible de répéter les injections de prostaglandine afin d’obtenir plusieurs
cycles raccourcis successifs et augmenter ainsi la fréquence des ovulations. Cette méthode
montre de bons résultats apparemment sans effets secondaires indésirables. Ainsi une
injection de chloprostenol, un analogue de la prostaglandine, après la récupération d’un
embryon induit un œstrus dans les 2 à 3 jours et la jument doit donc ovuler dans les 4 à 5
jours qui suivent. Suite à un accouplement, la récupération d’un embryon sera donc à nouveau
possible 7 jours plus tard. Cette méthode permet donc d’obtenir des cycles de 13 à 15 jours.
(Allen, 1982a)
d) Superovulation chez la jument
L’entretien des juments receveuses qui sont préparées, mais non utilisées pour le
transfert faute d’embryon récolté, représente l’un des coûts principaux du transfert
d’embryon. L’induction d’une ovulation multiple qui permet d’augmenter le nombre
d’embryons récoltés par donneuse permet de réduire ce coût. (Squires et al., 2003)
La Pregnant Mare Serum Gonadotrophin (PMSG) est une hormone glycoprotéique de
haut poids moléculaire qui possède la capacité unique de présenter à la fois une activité FSHlike et LH-like. Elle est largement utilisée chez les animaux d’élevage afin de stimuler une
superovulation. Pourtant, l’utilisation de PMSG est totalement inefficace chez la jument pour
stimuler un développement folliculaire. En effet, les récepteurs sont capables de différencier
50
leur propre gonadotrophine chorionique (PMSG) et les gonadotrophines pituitaires (FSH et
LH). Cette faculté apparaît peu étonnante quand on considère que de très grandes quantités de
PMSG (jusqu’à 1 million d’U.I.) circulent dans le sang d’une jument gestante au pic de
sécrétion, c’est à dire à 60 jours de gestation. Sans ce mécanisme de protection les ovaires
seraient hyper-stimulés lors de chaque gestation.
Il n’existe donc pas de substance hormonale disponible dans le commerce permettant
d’induire des ovulations multiples chez la jument. (Squires et al., 2003)
L’utilisation des gonadotrophines pituitaires dans le but d’obtenir une superovulation a
été étudiée également. L’administration de gonadotrophine pituitaire équine en quantité
suffisante pourrait induire un certain degré d’ovulations multiples chez certaines juments.
(Allen, 1982a) Bien que la réponse soit beaucoup plus faible que chez les bovins, le nombre
d’embryons récoltés est trois à quatre fois plus élevé chez les juments traitées à l’aide
d’extrait pituitaire équin que chez les juments ovulant spontanément. (Squires et al., 2003)
Il a été démontré que les taux de gestation des embryons collectés chez des juments
superovulées et transférés à des receveuses sont identiques à ceux obtenus chez des juments
ovulant spontanément.
On cherche actuellement à déterminer la dose et la fréquence d’administration de
l’extrait pituitaire équin permettant d’obtenir les meilleurs résultats.
Cette technique permettrait de congeler les embryons supplémentaires mais serait
également utile dans le cadre de la fécondation in vitro ou du transfert d’ovocytes. Ce type de
produit sera sans doute disponible dans le commerce dans les années à venir. (Squires et al.,
2003)
e) La récolte des embryons
Les embryons équins sont transportés depuis l’oviducte jusque dans l’utérus à J5½ ou
J6 post-ovulation. A cette période ils sont au stade morula compactée ou jeune blastocyste.
(Vanderwall, 2000) Ils présentent une épaisse zone pellucide. (Iuliano, 1985) Après son
entrée dans la lumière utérine, la taille de l’embryon augmente très rapidement alors qu’il se
développe en blastocyste mature (Tableau 2). (Vanderwall, 2000) La zone pellucide est alors
remplacée par une couche acellulaire dense. (Iuliano, 1985) Le moment optimum pour la
récupération se situe entre J7 et J8. (Vanderwall, 2000) Le taux de récupération est moins bon
51
si l’embryon est récupéré plus tôt (Tableau 3). Par contre, l’âge de l’embryon n’affectera pas
le taux de gestation. (Iuliano, 1985)
Tableau 2 : Diamètre des embryons équins récolté dans la lumière utérine, d’après
Vanderwall (2000)
Diamètre des embryons (mm)
Jours post-ovulation
Nombre
d’embryons
Moyenne
Valeurs
6
121
0,208
0,132 – 0,756
7
144
0,406
0,136 – 1,460
8
142
1,132
0,120 – 3,980
9
41
2,220
0,730 – 4,520
Tableau 3: Effet de l’âge de l’embryon équin sur le taux de récupération, d’après
Vanderwall (2000)
Jour post-ovulation Nombre d’embryons Pourcentage
6
192/332
58%
7
311/509
61%
8
716/1109
65%
9
61/86
71%
Hormis le jour de la récolte, les autres facteurs qui affectent le taux de récolte sont le
nombre d’ovulations, l’âge de la jument donneuse et la qualité de la semence. (Squires et al.,
2003)
Les caractéristiques anatomiques de l’appareil reproducteur de la jument rendent le
procédé de lavage utérin beaucoup plus simple que chez la vache. Chez la jument le col utérin
est court et facile à distendre en diœstrus, permettant ainsi l’insertion d’un cathéter de plus
large diamètre que chez la vache. (Allen, 1982a)
La méthode consiste à passer l’instrument permettant le lavage à travers le col jusque
dans le corps de l’utérus. (Allen, 1982a)
52
L’aire périnéale de la jument est lavée avec un détergent doux, rincée abondamment
avec de l’eau claire puis séchée. Le manipulateur met un gant de fouille stérile et applique du
lubrifiant. Un cathéter stérile muni d’un ballonnet gonflable est ensuite introduit dans le vagin
puis passé à travers le col de l’utérus. Il existe différents modèles de cathéter utilisables. Le
ballonnet est ensuite gonflé avec environ 80 cc d’air ou de saline stérile. Une légère tension
vers l’arrière est appliquée sur le cathéter de façon à ce que le ballonnet soit appliqué contre
l’anneau cervical interne et empêche ainsi tout écoulement du fluide.
Une fois le cathéter correctement placé, l’utérus est lavé trois à quatre fois avec de la
saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) tiède, pure ou modifiée. Ce milieu de
rinçage contient égalent 1% de sérum de veau (fœtus ou nouveau-né), de la pénicilline (100
UI/mL) et de la streptomycine (100 µg/mL). L’utérus est rempli avec 1 à 2 litres de DPBS à
chaque lavage. Une fois l’utérus plein, on laisse le liquide s’écouler par le cathéter (Figure 8).
Le liquide passe à travers un filtre à embryons de 0,75 µm. Après être passé à travers le filtre,
le liquide est récupéré afin de pouvoir évaluer le volume récupéré. A partir du deuxième
lavage l’utérus est massé par voie transrectale ce qui aide à mettre l’embryon en suspension et
permet une meilleure récupération du fluide.
La majorité du liquide (plus de 90%) qui a été introduit dans l’utérus doit être récupéré
et il ne doit pas contenir de débris cellulaires ou de sang. (Vanderwall, 2000)
Figure 8 : Représentation schématique de la procédure de récolte d’embryons, d’après
Vanderwall (2000)
A la fin du lavage utérin, le contenu du filtre est vidé dans une boite de Petri
quadrillée, rincé avec du DPBS et observé au microscope (grossissement ×15 environ). Une
53
fois l’embryon identifié, il est ensuite “lavé” en le transférant successivement dans au moins 3
gouttes de 1 mL de DPBS avec 10% de sérum. L’embryon est ensuite placé dans une petite
boite de Petri contenant le même milieu puis observé à un grossissement plus important afin
d’être gradé sur une échelle de 1 (excellent) à 4 (mauvais). (Vanderwall, 2000) (Figures 9 à
12) La qualité de l’embryon a une influence très importante sur le taux de gestation. (Squires
et al., 2003)
Barre = 100 µm
Figure 9 : Blastocyste mature équin, embryon de qualité grade 1, d’après Vanderwall
(1996)
Barre = 100 µm
Figure 10 : Blastocyste mature équin, embryon de qualité grade 2, d’après Vanderwall
(1996)
54
Barre = 100 µm
Figure 11 : Blastocyste mature équin, embryon de qualité grade 3, d’après Vanderwall
(1996)
Barre = 100 µm
Figure 12 : Blastocyste mature équin, embryon de qualité grade 4, d’après Vanderwall
(1996)
La majorité des embryons ont un diamètre de 0,4 à 1,0 mm et sont au stade jeune
blastocyste ou blastocyste mature. (Squires et al., 2003)
Ensuite, soit l’embryon est transféré à une jument receveuse, soit il est préparé
rapidement pour le transport car après 3 heures sa viabilité diminue s’il est stocké dans du
DPBS. (Vanderwall, 2000)
D’autres méthodes existent mais elles ne sont plus utilisées actuellement. Il s’agit du
lavage d’une seule des deux cornes (corne ipsilatérale à l’ovulation) et de la récupération
chirurgicale des embryons. (Allen, 1982a)
55
f) Le transfert des embryons
Suivant que les embryons sont transférés immédiatement ou refroidis et transportés
avant le transfert des embryons, la procédure peut être réalisée chirurgicalement ou non.
Historiquement, le transfert chirurgical permettait d’obtenir des taux de gestation plus élevés,
en général autour de 70 à 75% une semaine après le transfert. Cependant, des études récentes
ont montré que les résultats du transfert non chirurgical peuvent égaler voir dépasser ceux du
transfert chirurgical. (Vanderwall, 2000) Les taux de gestation plus faible parfois obtenus par
transfert non chirurgical peuvent s’expliquer par le site de dépôt de l’embryon, les dommages
causés à l’embryon durant le transfert, l’expulsion possible de l’embryon en dehors de
l’utérus et enfin l’introduction possible de contaminants dans l’utérus, pouvant donner lieu à
une infection de bas grade. (Iuliano, 1985)
(1) Le transfert non chirurgical
Il s’agit d’une méthode très simple chez la jument. (Allen, 1982a) Trois types de
dispositifs sont employés couramment pour le transfert non chirurgical d’embryons : une
pipette d’insémination standard, un “pistolet à insémination” en plastique à usage unique ou
encore un “pistolet à insémination” en acier réutilisable. Quel que soit l’instrument utilisé, il
est en général placé à l’intérieur d’une gaine de protection. (Vanderwall, 2000)
L’embryon est placé dans 0,2 à 0,5 mL de milieu. Une réserve d’air de 1 à 2 mL est
placée dans la pipette avant l’embryon de façon à assurer une expulsion complète du milieu et
de l’embryon lorsque le piston de la seringue ou du pistolet est enfoncé. (Allen, 1982a)
Pour le transfert la jument est placée dans un travail, sous sédation, et l’aire périnéale
est préparée comme pour la récolte des embryons. Le manipulateur enfile un gant de fouille
stérile ainsi qu’un gant de chirurgie stérile placé par dessus, il applique ensuite du lubrifiant.
Le bout de l’instrument (recouvert de la gaine de protection) est placé dans la paume de la
main et l’extrémité est protégée par le pouce du manipulateur. L’instrument est introduit dans
le vagin et l’extrémité de la gaine de protection est introduite d’environ 0,5 cm dans l’anneau
cervical externe. Puis l’instrument est avancé à travers la gaine de protection et passe à travers
le col jusque dans l’utérus. L’embryon est déposé soit dans le corps soit dans une des cornes
de l’utérus, l’instrument est alors guidé par manipulation transrectale jusque dans la corne.
Une fois que l’instrument est correctement positionné, l’embryon est déposé et dans le même
56
temps l’instrument est reculé légèrement de façon à ce que son extrémité ne vienne pas
toucher l’endomètre. (Vanderwall, 2000)
La position du blastocyste transféré dans l’utérus revêt beaucoup moins d’importance
que le fait de procéder au transfert aussi rapidement que possible avec un minimum de
manipulations de l’appareil reproducteur de la receveuse. Ainsi il est possible que les
manipulations supplémentaires nécessaires pour placer un blastocyste dans la corne plutôt que
juste dans le corps de l’utérus de la jument receveuse soient suffisantes pour entraîner une
diminution du taux de gestation. (Allen, 1982a)
Il semble que le transfert non chirurgical présente un meilleur taux de réussite avec des
embryons à J7 plutôt qu’à J8. Ceci serait dû au fait qu’un embryon plus vieux, donc plus gros
puisse plus facilement être endommagé lors du transfert. (Iuliano, 1985)
(2) Le transfert chirurgical
(i) Méthode par laparotomie par le flanc
La jument est debout, sous sédation et anesthésie locale. L’incision est réalisée au
niveau du flanc. La corne utérine est extériorisée à travers l’incision et ponctionnée à l’aide
d’une aiguille de suture à bord tranchant. La plaie de ponction est élargie grâce à des écarteurs
à iris placés dans la lumière de l’utérus. L’embryon, contenu dans un petit volume de liquide
est déposé dans la lumière utérine. La plaie de ponction n’est pas refermée, la corne utérine
est replacée dans l’abdomen et l’incision chirurgicale est refermée. En raison de la mobilité de
des embryons équins dans l’utérus, le transfert peut se faire soit dans la corne ipsilatérale soit
dans la corne controlatérale au côté de l’ovulation. (Vanderwall, 2000)
(ii) Méthode par laparotomie ventrale
Cette technique n’est plus utilisée en routine chez le cheval, cependant c’est l’une de
celle utilisée chez les équidés sauvages, la procédure de transfert d’embryons ne pouvant,
chez eux, être réalisée debout sur animal vigile.
La corne ipsilatérale est extériorisée à travers l’incision de laparotomie ventrale et une
petite incision est réalisée dans la paroi de l’utérus et de l’endomètre au premier tiers de la
corne environ. L’opération est réalisée à l’aide d’une aiguille 18 gauge émoussée, l’utilisation
d’une telle aiguille réduit considérablement le risque d’hémorragie de l’endomètre dans la
57
lumière de l’utérus. L’embryon est placé dans un volume minimal de liquide (0,05 à 0,1 mL)
au bout d’une pipette de Pasteur attachée par une faible longueur de tubulure à une seringue à
tuberculination de 1mL. L’extrémité de la pipette est glissée à travers le trou dans la paroi
utérine et avancée jusqu’à dépasser de 2 à 3 cm dans la lumière utérine avant que l’embryon
soit doucement expulsé. (Allen, 1982a)
Ainsi peut-on dire pour conclure que dans l’idéal le transfert d’embryon par méthode
chirurgicale doit être mené entre J6 et J8 après l’ovulation, que l’embryon doit être transféré
dans les 3 heures après la récupération et maintenu pendant le transfert à 30 ou 33°C dans un
faible volume de milieu enrichi en sérum. Le transfert doit également se faire grâce à une
petite incision dans la paroi de l’utérus, dans la portion antérieure de la corne utérine et si
possible en absence de saignement de l’endomètre. Si l’ensemble de ces conditions est réuni,
on peut espérer un taux de gestation supérieur à 70%. (Allen, 1982a)
Il semble que le transfert chirurgical permette une flexibilité légèrement plus
importante dans la synchronisation entre donneuse et receveuse. D’autre part, lors de transfert
non chirurgical, le taux de gestation est plus élevé au milieu de la saison de reproduction
physiologique que dans les périodes de transitions. Par contre la saison n’affecte pas le taux
de gestation en cas de transfert chirurgical. Enfin, le taux de perte d’embryons n’est pas plus
élevé lors de transfert non chirurgical ou chirurgical et n’est pas différent non plus de celui
obtenu lors d’insémination artificielle courante. (Iuliano, 1985)
g) Stockage et transport des embryons équins
Il existe deux techniques de stockage des embryons, la première consiste à les refroidir
et permet seulement un stockage à court terme avant transfert, la seconde consiste à congeler
les embryons et offre la possibilité d’un stockage à long terme.
(1) Stockage d’embryons refroidis
La technique de stockage des embryons à 5°C développée ces dernières années a
constitué un changement majeur dans le transfert d’embryons chez les Equidés. Elle permet
de refroidir les embryons afin de les transporter à une station centrale pour les transférer aux
juments receveuses. (Squires et al., 2003)
58
La méthode actuellement utilisée pour refroidir et transporter les embryons utilise le
mélange nutritif de Ham F-10 comme milieu de maintien et de refroidissement. Il doit
auparavant être tamponné en utilisant un mélange constitué de 90% de N2, 5% de O2 et 5% de
CO2 qui diffuse à travers le milieu durant 3 à 5 minutes. Ce milieu est également supplémenté
avec 1% de sérum de veau (fœtus ou nouveau-né), de la pénicilline (100 UI/mL) et de la
streptomycine (100 µg/mL), tout comme l’était le DPBS. (Vanderwall, 2000)
Pour le stockage, l’embryon est transféré avec précaution dans un tube de 5 mL
contenant le milieu Ham F-10 stérilisé par filtration lui-même placé dans un tube à
centrifugation de 50 mL contenant également le milieu Ham F-10 mais non stérilisé.
L’ensemble est ensuite placé dans un Equitainer® qui refroidit l’embryon à 5°C et le
maintient viable pour au moins 24 heures. (Vanderwall, 2000) L’intervalle entre la collecte et
le transfert des embryons stockés est en général de 12 à 30 heures. (Squires et al., 2003)
Il n’existe pas de différence significative entre les taux de gestation obtenus avec des
embryons refroidis et transportés et avec des embryons frais transférés immédiatement après
la collecte.
Il a également été tenté de conserver les embryons dans le milieu Ham F-10 à une
température de 15 à 18°C. Il semble que les embryons peuvent être stockés à cette
température pour une durée allant jusqu’à 18 heures sans effet défavorable sur le taux de
gestation. Des solutions permettant le stockage des embryons ont également été développées
et sont maintenant disponibles dans le commerce, il semble que ces produits offrent une
bonne alternative à l’utilisation du milieu Ham F-10 pour le stockage d’embryons refroidis
pour 24 heures. (Squires et al., 2003)
(2) Congélation d’embryons
Le transfert d’embryons congelés est beaucoup moins répandu chez les chevaux que
chez les bovins. La plupart des registres des races n’autorisent pas l’inscription des poulains
nés après transfert d’embryons préalablement congelés. De plus, les techniques de
superovulation n’étant pas efficaces, il est rare que des embryons surnuméraires soient
récoltés, ce qui offrirait l’occasion de les congeler.
D’un point de vue biologique, l’embryon équin est unique puisqu’il est pourvu d’une
membrane protéique acellulaire appelée capsule, qui empêche la pénétration des
cryoprotecteurs. A ce jour, la majorité des embryons qui ont été congelés n’ont pas été
59
transférés mais sont utilisés comme moyen de préservation du matériel génétique (banque
d’embryons).
La première naissance d’un poulain suite au transfert d’un embryon congelé à J6 a eu
lieu en 1982. Il semble que les petits embryons à J6 supportent mieux la cryopréservation que
les embryons à J7. Le cryoprotecteur utilisé est en général le glycérol (il peut être additionné
de diverses substances réduisant le taux de mort cellulaire) et les embryons sont refroidis
progressivement.
Il existe une autre technique de congélation d’embryons, appelée vitrification, mais
celles-ci a été très peu étudiée jusqu’ici. (Squires et al., 2003)
2. La formation des cupules endométriales chez la jument
Nous allons maintenant nous intéresser à la formation d’une structure particulière à la
gestation des Equidés, les cupules endométriales, dont nous verrons par la suite le rôle majeur
lors des transferts d’embryons interspécifiques.
Nous étudierons tout d’abord les caractéristiques de ces cupules. Nous rappellerons
ensuite les points importants de l’embryogenèse et de la placentation chez le cheval afin de
mieux comprendre les étapes du développement des cupules endométriales. Puis nous
évoquerons les facteurs pouvant influencer la sécrétion de PMSG ainsi que l’influence du
génotype fœtal puisque les Equidés ont la particularité de pouvoir donner naissance à des
hybrides viables. Enfin nous aborderons le rôle des antigènes du Complexe Majeur
d’Histocompatibilité dans la formation des cupules endométriales et leur expression par ces
mêmes cupules.
a) Caractéristiques des cupules endométriales
La formation des cupules endométriales est une caractéristique particulière de la
gestation équine. Elle a lieu durant la première moitié de la période de gestation dont la durée
totale est de 340 jours. Elles prennent tout d’abord l’apparence d’une série de petites
excroissances de l’endomètre, ressemblant à des ulcères, situées dans la corne utérine où a
lieu la gestation. Les cupules sont visibles au microscope à partir de J38-J40, sous forme de
plaques pâles et légèrement surélevées. Elles grossissent régulièrement durant les 30 à 40
jours suivants et prennent la forme de soucoupes en raison du fait que la croissance se
poursuit en périphérie alors que la partie centrale de chaque structure dégénère. Vers J80, elle
60
deviennent plus pâles et commencent à sécréter une substance collante couleur miel qui
adhère à la surface de l’allantochorion. Cette phase exocrine marque le début de la phase de
dégénérescence qui progresse régulièrement. Entre J120 et J150 le tissu nécrotique des
cupules mélangé au coagulum formé par la sécrétion est finalement éliminé de la surface de
l’endomètre.
Microscopiquement chaque cupule est formée d’un assemblage de cellules
épithélioïdes qui possèdent un cytoplasme de couleur claire, floculent et deux noyaux de
grande taille, euchromatiques, avec des nucléoles denses. Durant la vie des cupules, un
nombre croissant de lymphocytes, cellules plasmatiques et éosinophiles s’accumulent dans le
stroma endométrial environnant. Ces cellules donnent l’impression d’isoler chaque cupule du
tissu stromal adjacent et jouent un rôle actif dans la destruction des cellules des cupules et
finalement dans la déhiscence du tissu nécrotique de la surface de l’endomètre.
Il n’existe pas de connexion physique directe entre les cupules et la membrane de
l’allantochorion. Pourtant les cupules sont d’origine fœtale, les cellules épithélioïdes de
cupules étant issues de cellules trophoblastiques spécialisées de la région de la ceinture
chorionique, appartenant donc aux membranes fœtales qui envahissent l’endomètre entre J36
et J38 après l’ovulation.
Les cupules sont la source de la gonadotrophine chorionique (PMSG) retrouvée à des
concentrations élevées dans le sang de la jument durant la première moitié de la gestation.
Cette hormone glycoprotéique unique exprime à la fois l’activité biologique de la FSH et de
la LH et elle est sécrétée par les grosses cellules fœtales des cupules endométriales. De très
hautes concentrations de PMSG sont retrouvées dans la sécrétion exocrine des cupules
endométriales et dans le tissu des cupules lui-même.
L’apparition de la PMSG dans le sérum maternel vers J40 coïncide avec la formation
du premier des corps jaunes secondaires qui se développent au niveau des ovaires jusqu’au
milieu de la gestation. Il en résulte un second pic de concentration en progestérone
plasmatique vers J40. Cette concentration reste élevée durant les 100 jours qui suivent puis
décline alors que les corps jaunes primaire et secondaire régressent. A partir de J150 les
ovaires maternels ne contiennent ni follicules ni corps jaune et le placenta sécrète la
progestérone nécessaire au maintien de la gestation. (Allen, 1982b)
61
b) Embryogenèse et placentation chez la jument
La placentation ne se fait pas avant J45 chez le cheval. (Allen, 1973) Le placenta
équin est classiquement décrit comme étant non-invasif en ce qui concerne son activité,
épithéliochorial pour ce qui est de sa structure et d’architecture diffuse.
Comme nous l’avons vu plus tôt, chez la jument, le transport dans l’oviducte est
prolongé et l’embryon n’arrive pas dans l’utérus avant J5 ou J6 alors qu’il est déjà au stade
blastocyste.
Bien que l’embryon s’extrait de la zone pellucide à J8-9, il reste complètement
encapsulé dans une seconde membrane, non cellulaire et translucide, jusqu’à J17. Jusqu’à
environ J40-45 le conceptus reste de forme sphérique et n’est pas attaché dans l’utérus. Il est
maintenu en place à la base d’une des deux cornes utérines par l’augmentation de tonicité de
l’utérus qui apparaît à partir de J18. C’est seulement vers J42 qu’un contact intime et stable
s’établit entre le trophoblaste et l’épithélium de l’endomètre.
A J21 la vésicule embryonnaire mesure 6 à 7 cm de diamètre. Elle est recouverte dans
sa partie externe par une couche de cellules trophoblastiques qui constituent le chorion, à la
surface interne duquel se trouve la couche splanchnique du mésoderme, qui forme elle-même
la couche externe du sac vitellin. L’embryon est situé à un pôle du sac et est, à ce stade,
complètement enfermé dans l’amnios. Le mésoderme vascularisé se développe entre le
trophectoderme et les couches de l’endoderme. Durant les 15 jours suivants, le mésoderme
vascularisé continue de s’étendre entre le chorion et le sac vitellin bien qu’il n’atteigne jamais
le pôle anembryonnaire si bien qu’une petite aire circulaire d’omphalopleure persiste dans
cette région. (Allen, 1982b) Le contact entre les tissus fœtaux et maternels est limité à cette
zone jusqu’à la placentation. (Allen, 1973) L’allantoïde grossit rapidement au pôle
embryonnaire alors que dans le même temps le sac vitellin commence à régresser. Cela se
traduit par le fait que l’embryon, qui est attaché au sac vitellin au niveau de l’ombilic, semble
se déplacer à travers le blastocoele d’un pôle à l’autre. La fusion de l’allantoïde et du chorion
donne naissance au véritable allantochorion qui deviendra finalement le placenta définitif.
(Allen, 1982b)
A la jonction de l’allantoïde en développement et du sac vitellin en régression, le
mésoderme est avasculaire et à ce niveau la ceinture chorionique va se développer (Figure
62
13a). A J25, la ceinture prend la forme d’une série d’ondulations peu profondes de la couche
de cellules trophoblastiques. (Allen, 1973)
Cette crête, formée par les ondulations, se développe progressivement durant les 10
jours suivants. Les cellules trophoblastiques au sommet des crêtes se multiplient très
rapidement si bien que chaque pli prend l’apparence d’une villosité allongée formée de
cellules hyperplasiques. Cette région bien définie du chorion est donc nommée la ceinture
chorionique et est visible à l’œil nu dès J28 sous la forme d’une bande annulaire pâle située
entre l’équateur de la vésicule et le pôle embryonnaire. (Allen, 1982b)
L’allantoïde ne participe pas à la formation des villosités mais semble plutôt former un
point d’ancrage pour les projections. Chaque villosité est couverte par une couche de cellules
du chorion très différenciées et le centre des villosités contient des assemblages de ces
cellules chorioniques et d’autres éléments cellulaires non spécifiques. (Allen, 1973)
Vers J34-36, la ceinture semble s’être déplacée vers l’autre hémisphère de la vésicule
(c’est à dire vers le pôle anembryonnaire), l’allantoïde grossissant et le sac vitellin diminuant.
A ce stade, on peut observer, au microscope, des projections en doigts de gant entremêlées et
formées de petites cellules trophoblastiques de teinte foncée, se multipliant rapidement. Ces
dernières libèrent d’importantes quantités d’une sécrétion exocrine amorphe, teintée par le
bleu alcian. Cette substance permet à la surface de la ceinture d’adhérer à l’épithélium de
l’endomètre. Puis entre J36 et J38, la totalité de la ceinture se détache des membranes fœtales
et les cellules constituant la ceinture commencent à envahir activement l’endomètre pour
former les cupules (Figure 13b). (Allen, 1982b)
Il existe peu de différences structurales entre les cellules normales du chorion, qui
formeront le placenta allantochorionique, et celles qui forment la ceinture chorionique avant
l’invasion. La caractéristique qui distingue les cellules de la ceinture est leur grand noyau
euchromatique avec un immense nucléole. Il semblerait que les corps multivésiculaires
sécrètent le matériel extracellulaire et que celui-ci aide à la digestion des débris des cellules
endométriales.
Les cellules de la ceinture ont de nombreuses caractéristiques communes avec les
cellules des cupules endométriales matures. Elles possèdent cependant des caractéristiques
particulières associées à leur fonction migratoire. Ils s’agit principalement des villosités et des
63
pseudopodes qui se trouvent au pôle apical des ces cellules et qui s’étendent vers la surface de
l’endomètre à travers la matrice extracellulaire. (Allen, 1973)
a
b
c
a. Invasion de l’endomètre par les cellules trophoblastiques spécialisées provenant
de la région de la ceinture chorionique du conceptus.
b. Accroissement et différenciation des cellules de la ceinture dans le stroma
endométrial pour former les cupules endométriales définitives.
c. Développement de la réponse maternelle à médiation cellulaire vis-à-vis des
cellules fœtale des cupules, ce qui accélère la nécrose des cupules et leur
éventuelle desquamation de la surface de l’endomètre.
Figure 13 : Représentation schématique de la cinétique du développement des cupules
endométriales, d’après Allen et Short (1997) (avec permission)
64
Dans les 2 à 3 jours suivant la séparation de la ceinture, le sac vitellin a complètement
régressé et le conceptus est maintenant entouré par le véritable allantochorion. Dès lors, un
contact de plus en plus intime s’établit entre la couche trophoblastique et l’épithélium de
l’endomètre. Le placenta ainsi formé est de type microcotylédonnaire. (Allen, 1982b)
c) Développement et régression des cupules endométriales
Les cellules de la ceinture envahissent l’endomètre très rapidement, sur une période de
24 à 48 heures à partir de J36-38. Les cellules de la ceinture forment de grosses projections,
semblables à des pseudopodes. (Allen, 1982b) Les premiers signes d’invasion correspondent
à l’apposition de ces pseudopodes à la surface du plasmalemme des cellules de l’endomètre.
Ces points d’apposition s’étendent ensuite à de plus grandes surfaces de contact cellulaire et
aboutit, pour les cellules de l’endomètre, à la perte des villosités. La quantité de matériel
extracellulaire diminue également entre les cellules de la ceinture et les cellules de
l’endomètre. (Allen, 1973)
Les cellules chorioniques n’envahissent pas l’épithélium de l’endomètre uniquement
via les espaces intercellulaires. (Allen, 1973) Celles-ci s’enfoncent entre les cellules
épithéliales ou directement à travers ces cellules, couvrant ainsi la surface luminale de
l’endomètre. (Allen, 1982b) Le processus d’invasion et la disparition des cellules de
l’épithélium endométrial sont extrêmement rapides. Les cellules du chorion séquestrent les
cellules épithéliales et finalement les phagocytent. (Allen, 1973) Les cellules progressent sous
les glandes de l’endomètre puis finissent par traverser également la lame basale. (Allen,
1982b) Cela se passe de la même façon que l’invasion initiale de l’épithélium. Les
pseudopodes forcent le passage à travers la lame basale, suivis par le reste de la cellule.
(Allen, 1973) Les cellules passent à travers la lame basale et descendent dans le stroma de
l’endomètre. (Allen, 1982b)
Le processus d’invasion et de phagocytose décrit ici ne concerne que l’épithélium à la
surface de l’endomètre. Par contre, l’epithélium glandulaire utérin n’est pas attaqué de cette
façon et les cellules de la ceinture chorionique migrent le long des glandes entre les cellules
épithéliales et leur membrane basale sans endommager les cellules épithéliales glandulaires.
Ce processus de formation des cupules endométriales chez la jument, celles-ci dérivant
de cellules trophoblastiques spécialisées du fœtus, est illustré dans la Figure 14. (Allen, 1973)
65
Figure 14 : Représentation schématique de l’histogenèse des cupules endométriales,
d’après Allen (1973)
Peu après leur entrée dans le tissu stromal, les cellules de la ceinture commencent à
subir une série de changements morphologiques et fonctionnels très marqués. Elles perdent
leur capacité de migration, deviennent plus régulières, avec des contours arrondis et
commencent à grossir de façon importante. Le cytoplasme devient pâle et d’apparence
mousseuse ; un second noyau euchromatique, de grande taille, se développe. Les cellules
typiques des cupules endométriales sont ainsi formées.
L’épithélium de l’endomètre, qui est presque entièrement détruit durant la phase
initiale d’invasion par les cellules ceintures, se régénère rapidement et a, en général, recouvert
la surface luminale des cupules à J45. La portion apicale de la plupart des glandes
endométriales a également été détruite par les cellules de la ceinture mais la portion fundique
reste intacte et continue à produire les sécrétions exocrines. Ces substances s’accumulent dans
66
la lumière, entraînant une distension de plus en plus importante des glandes. Il y a peu de
vaisseaux sanguins au niveau des cupules mais beaucoup de gros sinus lymphatiques se
développent dans le stroma endométrial en dessous des cupules, ceux-ci permettent à la
PMSG de gagner la circulation sanguine maternelle, via la lymphe. (Allen, 1982b)
Immédiatement après la phase initiale d’invasion par les cellules de la ceinture
chorionique, à J36-38, les leucocytes commencent à s’accumuler dans le stroma endométrial
autour de chaque cupule. (Allen, 1982b) Initialement il s’agit presque exclusivement de petits
lymphocytes (lymphocytes T CD4+ et CD8+ (Baker et al., 1999)) mais, alors que la gestation
progresse, des cellules plasmatiques et un nombre considérable d’éosinophiles s’y rajoutent.
(Allen, 1982b)
a. Leucocytes accumulés autour du
trophoblaste invasif à la base d’une
cupule endométriale à J65.
b. L’interface allantochorion-endomètre, à
J83, montrant l’absence de leucocytes
associés au trophoblaste non-invasif.
Figure 15 : Réponse immunitaire à médiation cellulaire exprimée par la jument vis-à-vis
des composantes invasives et non-invasives du trophoblaste intraspécifique de cheval,
d’après Allen et al. (1987) (avec permission)
Les leucocytes tendent à rester groupés dans le stroma et ne pénètrent pas en
profondeur dans le tissu des cupules lui-même. Ainsi à J70-80, ils forment une bande
compacte de cellules qui sépare chaque cupule des tissus maternels environnants. C’est
67
seulement à partir de J80-90, une fois que la régression de l’ensemble des cupules a débuté,
que les leucocytes commencent à envahir le tissu des cupules et à détruire les grosses cellules
qui le constituent (Figure 15). Dans le même temps, les cellules des cupules qui sont situées à
la surface luminale de la région centrale de chaque cupule, et donc qui sont les plus éloignées
des leucocytes accumulés à la périphérie, commencent à dégénérer et à se détacher de la
surface. Cela permet la libération des sécrétions exocrines accumulées. Celles-ci se mélangent
avec les cellules des cupules autolysées pour former un coagulum couleur miel qui adhère à la
surface des cupules et de l’allantochorion sous-jacent. Ce coagulum contient une forte
concentration de PMSG.
La dégénérescence et la mort des cellules des cupules endométriales se poursuit en
périphérie des cupules, aboutissant finalement à une nécrose complète du tissu des cupules.
(Allen, 1982b)
d) Facteurs influençant la sécrétion de PMSG
Différents facteurs peuvent influer sur la sécrétion de PMSG.
L’un de ces facteurs est la taille de la jument. En effet il a été constaté que les
concentrations plasmatiques observées au pic de sécrétion de PMSG sont considérablement
plus élevées chez les ponettes que chez les juments de grande race. Cet effet est sans doute dû
tout simplement à un effet de dilution plus important en raison du plus grand volume sanguin
chez les juments de grande taille.
On suppose également une diminution de la sécrétion de PMSG avec le nombre de
gestations.
Cependant, ces effets sont d’autant plus difficiles à évaluer du fait qu’il existe
d’énormes variations individuelles à la fois dans les concentrations plasmatiques retrouvées
mais aussi pour ce qui est de la production totale de PMSG. Ces grandes différences sont sans
doute reliées à la quantité ou au volume total du tissu des cupules endométriales qui se
développe chez chaque jument, par conséquent cela dépend de la proportion de tissu de la
ceinture chorionique, par rapport à la surface totale, qui envahit l’endomètre maternel à J3638.
De plus l’endomètre présente une surface très irrégulière face au conceptus et la
quantité de plis peut varier énormément d’un animal à l’autre. Chez les juments pour
68
lesquelles l’endomètre est très plissé, avec des cryptes profondes, la surface de l’endomètre
réellement en contact avec la ceinture chorionique, et par conséquent accessible à l’invasion
par les cellules de la ceinture, sera relativement faible. Par contre, chez les juments dont les
plis de l’endomètre sont peu prononcés, la contractilité du myomètre, qui maintient le
conceptus en place à J36, assurera le contact de quasiment la totalité de la surface de la
ceinture avec l’endomètre. L’invasion par les cellules de la ceinture sera donc plus
importante.
Il en résulte que les différences individuelles importantes entre les juments semblent
dépendre davantage des facteurs qui influencent la configuration de l’endomètre que de ceux
qui affectent le taux de production des cupules endomètriales individuellement ou encore des
cellules des cupules individuellement. (Allen, 1982b)
e) Influence du génotype fœtal sur le développement des
cupules
L’étude des croisements entre cheval (Equus caballus, 2n = 64) et âne (Equus asinus,
2n = 62), aboutissant à la gestation d’hybrides (mulets et bardots), a montré que le génotype
fœtal est l’un des facteurs qui exerce un effet important et constant sur le développement des
cupules endométriales et la sécrétion de PMSG. (Allen, 1982b)
Le croisement entre une jument et un âne mâle aboutit à la naissance d’un mulet et
présente un taux de conception élevé. Par contre, le croisement réciproque entre une ânesse
est un étalon, donnant le bardot, est beaucoup moins fertile. Les mécanismes responsables de
ces différences importantes restent inconnus, bien que l’on suppose que le phénomène
d’empreinte génétique (imprinting), sur lequel nous reviendrons plus loin, joue un rôle. (Allen
et Short, 1997)
Les juments portant des conceptus de mules présentent des concentrations de PMSG
sériques ne s’élevant qu’à un sixième ou un dixième de ce qui est normalement retrouvé chez
la jument portant un conceptus de cheval. De plus la durée de la sécrétion est plus courte et
l’hormone a en général totalement disparu de la circulation sanguine à J80. Inversement, chez
l’ânesse portant un conceptus de bardot, les concentrations de PMSG sériques sont en général
cinq à huit fois plus hautes que chez une ânesse portant un conceptus d’âne. L’activité
gonadotrophique persiste alors jusqu’à environ J120.
69
La ceinture chorionique qui se développe chez le conceptus de mule est plus étroite et
plus fine que celle des conceptus de cheval. Il en résulte que beaucoup moins de cellules de la
ceinture sont disponibles pour envahir l’endomètre dans la gestation de mule et par
conséquent les cupules endométriales sont beaucoup plus petites et étroites que lors d’une
gestation classique de cheval.
La ceinture chorionique lors d’une gestation classique chez l’ânesse est semblable à la
structure qui se forme chez la mule puisqu’elle est plutôt mince et étroite. Elle donne ainsi
naissance à des cupules endométriales plus petites et plus étroites avec pour conséquence une
production de PMSG plus basse que chez le cheval. Chez le conceptus de bardot, par contre,
la ceinture se développe comme une structure large, épaisse et hyperactive. Un grand nombre
de cellules de la ceinture pénètrent dans l’endomètre durant le processus d’invasion. Les
cupules qui en résultent sont par conséquent plus larges et plus volumineuses que celles
classiquement retrouvées chez l’ânesse avec, en conséquence, une augmentation de la
production de PMSG. (Allen, 1982b)
Une autre caractéristique importante des cupules endométriales chez les deux types
d’hybrides est l’augmentation considérable du degré de la réponse leucocytaire maternelle
dirigée contre les cupules. Un nombre beaucoup plus élevé de lymphocytes, de cellules
plasmatiques et d’éosinophiles s’accumule dans le stroma endométrial et ceci beaucoup plus
rapidement que lors des gestations intraspécifiques. Lors de gestation de mule, les
lymphocytes ne restent pas groupés dans le stroma endométrial mais envahissent le tissu des
cupules en profondeur et attaquent les cellules des cupules. La totalité des cupules est déjà
détruite à J60, seulement 20 jours environ après leur formation. Dans le cas de la gestation de
bardot, les leucocytes en nombre augmenté ont tendance à rester rassemblés dans le stroma
endométrial de façon normale et semblent incapables de pénétrer en profondeur du tissu des
cupules. Ceci permet aux cupules une durée de vie normale de 80 à 100 jours chez le bardot.
(Figure 16) (Allen, 1982b)
70
Figure 16 : Comparaison de la taille et de l’apparence histologique des cupules
endométriales et des concentrations de PMSG sérique chez les juments et ânesses
portant respectivement des conceptus normaux de cheval et d’âne et des conceptus
hybrides
de
mule
et
de
bardot,
d’après
Allen
(1982b)
71
L’accumulation de leucocytes autour des cupules endométriales semble refléter une
réponse à médiation cellulaire maternelle classique suite à la reconnaissance d’antigènes
étrangers exprimés par les cellules des cupules endométriales. L’augmentation considérable
de la réponse leucocytaire dans les deux types de gestations d’hybrides est en faveur de cette
hypothèse, de même que le fait que les cellules de la ceinture chorionique restent viables et
continuent à sécréter de la PMSG durant plus de 200 jours lorsqu’elles sont cultivées in vitro.
Par contre la différence importante entre les deux types de gestations hybrides en ce qui
concerne la vigueur de l’attaque leucocytaire contre les cupules est difficilement explicable.
Elle pourrait simplement être liée à l’arrangement des cellules des cupules dans l’endomètre.
(Allen, 1982b)
Deux mécanismes semblent interagir pour aboutir aux différences importantes
observées en ce qui concerne la production de PMSG par les cupules endométriales dans les
différents types de gestation. Tout d’abord, la largeur, le développement général et les
capacités d’invasion de la ceinture chorionique sont largement influencés par le génome
paternel. (Allen, 1992) Ainsi, le développement des cupules endométriales et donc la
sécrétion de PMSG est élevée lorsque le père est un cheval, par contre la sécrétion est faible
lorsque le père est un âne. (Allen et al, 1993) Il semble donc que le développement du
trophoblaste équin, au moins en ce qui concerne la portion invasive de la ceinture
chorionique, soit contrôlé par des gènes empreintes paternels. (Allen, 1992)
L’autre facteur majeur gouvernant la sécrétion de PMSG chez les juments portant des
embryons de mulets est la durée de vie réduite des cupules endométriales qui sont déjà de
petite taille à l’origine. (Allen, 1992)
f) Influence
du
Complexe
Majeur
d’Histocompatibilité
(CMH) sur le développement des cupules endométriales
Des alloantigènes lymphocytaires existent chez le cheval : on parle des Equine
Lymphocytes Antigens (ELA) qui constituent le CMH chez les Equidés. Ceux exprimés par la
mère peuvent alors être compatibles ou non avec ceux exprimés par le père. (Allen, 1984) Il
semble que ces antigènes peuvent influencer le développement des cupules endométriales.
72
(1) Rappels sur la tolérance immunitaire du fœtus par la mère
chez les autres Mammifères
Les mécanismes généraux permettant la tolérance immunitaire du fœtus par sa mère
sont complexes. Le placenta joue un rôle essentiel, assurant au fœtus une défense efficace
contre le rejet.
(i) Les antigènes majeurs d’histocompatibilité
Les antigènes majeurs d’histocompatibilité sont réprimés dans la partie interne du
placenta chez l’Homme par contre leur présence est formellement démontrée sur la partie la
plus externe du placenta, celle qui envahit les tissus maternels. Les antigènes mineurs et les
antigènes liés au sexe sont également présents sur la partie externe du placenta. Pourtant la
mère ne développe pas de réaction immunitaire conduisant au rejet du fœtus. Le placenta peut
cependant bien être reconnu comme étranger par le système immunitaire maternel et quinze
pour cent des femmes développent des anticorps contre les antigènes majeurs du fœtus dès la
première grossesse, et cette proportion augmente avec le nombre de grossesses.
La reconnaissance des déterminants antigéniques paternels semble même bénéfique au
fœtus puisque chez des souris rendues tolérantes aux antigènes paternels de leur fœtus le
placenta était de taille anormalement petite.
Plusieurs phénomènes peuvent expliquer la tolérance immunitaire du fœtus. Certaines
hormones produites en abondance durant la grossesse (telles que la progestérone, la human
Chorionic Gonadotropin…) ainsi que certaines protéines caractéristiques de la grossesse ont
la capacité de réduire les réactions immunitaires. Cependant l’immunosuppression qui en
résulte est très limitée et elle est, de plus, généralisée et peu spécifique.
Il existe également des antigènes majeurs monomorphes à la surface du placenta,
ceux-ci ne varient pas d’un individu à l’autre. On leur attribue un rôle fonctionnel important
dans la tolérance du fœtus.
Le fœtus fait l’objet d’une acceptation spécifique puisque les antigènes hérités du père
sont tolérés, la mère conservant une réponse immunitaire normale vis-à-vis d’autres antigènes
étrangers.
Il existe des anticorps facilitants chez de nombreuses espèces, ils sont spécifiquement
dirigés contre les antigènes majeurs d’origine paternelle qu’ils “masquent”. Il existe
73
également des cellules suppressives (il s’agit de lymphocytes) qui pourraient supprimer ou
moduler les réactions immunitaires vis-à-vis des antigènes fœtaux d’origine paternelle. Ces
deux types de réactions sont produits par l’organisme maternel, en réponse à une
reconnaissance spécifique des antigènes fœtaux hérités du père. Enfin, les anticorps antiidiotypiques freinent l’activité des autres cellules du système immunitaires mais il est difficile
de leur attribuer un rôle précis dans la gestation puisque toute réponse à un antigène étranger
entraîne l’apparition d’anticorps anti-idiotypes. Quoi qu’il en soit, aucun de ces mécanismes
ne suffit à expliquer à lui seul le phénomène de tolérance. (Chaouat, 1986)
(ii) Rôle du placenta dans la défense du fœtus
Il existe au moins sept mécanismes permettant la défense active du fœtus contre sa
mère à l’interface foeto-maternelle.
1) Substances immunosuppressives non spécifiques concentrées localement au niveau du
placenta.
2) Facteurs placentaires bloquant la différenciation des cellules tueuses (compétition avec
l’interleukine 2), d’autres ayant un effet amplificateur sur les lymphocytes B qui
produisent les anticorps facilitants.
3) Cellules tueuses de type NK qui sont dirigées contre les lymphocytes.
4) Petites cellules granulées qui libèrent un facteur qui inhibe la prolifération des cellules
tueuses, celui-ci agit également en compétition avec l’interleukine 2. L’apparition de ces
cellules est sous la dépendance même du placenta et a lieu dans un environnement
imprégné de progestérone.
5) Sécrétion active par le placenta et la déciduale de substances capables d’inhiber l’activité
de destruction des cellules tueuses. Elles agissent après fixation de ces dernières sur leur
cible et elles sont, en partie du moins, caractéristiques d’espèce.
6) Capacité intrinsèque du placenta de résistance à la destruction par des cellules tueuses.
7) Substances libérées par le placenta ayant la capacité de transformer un anticorps dirigé
contre le placenta en anticorps “bloquant”, c’est à dire incapable d’agir.
Il y a donc mise en place d’un gradient immunosuppressif local capable d’empêcher
l’apparition de réactions immunitaires dirigées contre le fœtus.
74
De plus l’intérieur du placenta est une zone neutre sur le plan immunitaire (absence
d’antigènes du CMH). (Chaouat, 1986)
Tout ces mécanismes se complètent donc de façon à prévenir un avortement
immunitaire.
(2) Production d’anticorps cytotoxiques
Il a été mis en évidence chez l’homme et les rongeurs qu’une certaine proportion de
femelles gestantes présente une évidence de reconnaissance sérologique et histologique ainsi
qu’une réaction immunologique vis-à-vis des antigènes fœtaux. (Kydd et al, 1982) Ainsi des
anticorps humoraux qui sont spécifiquement cytotoxiques pour les lymphocytes paternels
apparaissent dans le sérum d’environ 15% des femmes durant la seconde moitié de leur
première grossesse. L’incidence, tout comme le titre de ces anticorps augmentent au cours des
grossesses suivantes. (Allen, 1982b) Une incidence beaucoup plus élevée de la production
d’anticorps cytotoxiques a été mise en évidence chez les chevaux, de plus ces anticorps
apparaissent plus tôt au cours de la gestation. (Kydd et al, 1982) Plus de 90% des juments
produisent de hauts taux d’anticorps humoraux au cours de leur première gestation. Ces
anticorps sont spécifiquement cytotoxiques pour les lymphocytes du père du poulain et leur
production débute peu après l’invasion de la ceinture chorionique à l’origine de la formation
des cupules. (Allen, 1982b)
Cependant, lorsque le CMH du fœtus est compatible avec celui de la mère, il n’y a
aucune production d’anticorps dans le sérum des juments. Par contre ces anticorps
apparaissent vers J50 chez la jument lors d’incompatibilité. (Allen, 1984) Les titres en
anticorps augmentent rapidement et restent élevés au cours de la gestation. (Allen, 1982b)
L’existence d’une réponse anamnestique a été mise en évidence concernant la
production d’anticorps cytotoxiques. En effet, lors d’une seconde gestation pour laquelle les
différences d’histocompatibilité entre la jument et le fœtus sont les mêmes que lors d’une
première gestation, la formation d’anticorps cytotoxiques est accélérée. Cependant les
anticorps n’apparaissent pas avant la formation des cupules endométriales. (Anderson, 1988)
Cependant, dans le cas de juments primipares gestantes de mulets, seule une petite
proportion va produire des anticorps spontanément durant la période du développement des
cupules endométriales. Cette production limitée d’anticorps chez les juments gestantes de
75
mulets est inattendue compte tenu de la réaction leucocytaire maternelle augmentée lors de ce
type de gestation. (Allen, 1982b)
Chez l’ânesse, seulement une faible proportion de femelles gestantes développe des
anticorps, ceux-ci apparaissant à la même période que chez la jument.(Kydd et al, 1982)
Peu d’ânesses gestantes de bardot ont été testées pour évaluer la présence d’anticorps
dans leur sérum mais les animaux testés ont tous présenté une production d’anticorps aux
environs de J45. (Allen, 1982b)
L’incidence plus faible de la production d’anticorps cytotoxiques chez l’ânesse ne peut
raisonnablement être attribuée à une augmentation de la probabilité d’obtenir des
homozygotes aux loci du CMH (accouplements histocompatibles) lors d’accouplement chez
l’âne (la population étant plus variable que chez le cheval). On peut alors supposer que la
jument ou l’ânesse reçoivent d’autres types de stimulations antigéniques qui interviennent et
sont différentes selon le type de gestation. (Allen, 1982b)
De plus, on a découvert récemment, en étudiant la réponse immunitaire cellulaire visà-vis des antigènes du CMH paternel, qu’il existe une diminution très importante, en ce qui
concerne les lymphocytes du sang périphérique, de l’activité des lymphocytes T cytotoxiques
(LTC) spécifique du CMH, contre les cellules paternelles allogéniques chez les juments et
ânesses présentant des gestations intraspécifiques. Il s’agit en fait d’une réorientation
généralisée et systémique de la réactivité immunitaire cellulaire au profit de l’immunité
humorale durant la gestation (passage d’une réponse immunitaire de type Th1 à une réponse
de type Th2). Cette réorientation est transitoire, l’activité des LTC revient à la normale après
la gestation et elle n’a pas lieu chez les juments gestantes de mulets. (Baker et al., 1999) Ceci
ne justifie pas les différences observées lors de gestations normales chez la jument et chez
l’ânesse mais cela explique la faible production d’anticorps chez les juments gestantes de
mulets.
(3) Morphologie des cupules endométriales
L’apparence des cupules est semblable, qu’il y ait compatibilité entre la jument et son
fœtus ou non. Les cupules sont viables, avec peu d’accumulation de sécrétions qui sont de
consistance fluide. Les variations observées correspondent à des différences dans la taille des
cupules. Il n’existe pas de distinction franche entre les gestations compatibles ou non
compatibles mais il semble cependant que l’accumulation de leucocytes tend à être plus
76
importante lors de gestation compatible. La différence est beaucoup plus nette chez la ponette.
Lors de gestation incompatible, les cupules sont semblables à celles observées chez la jument
alors qu’en cas de gestation compatible, on observe des cupules endométriales peu viables
avec une forte accumulation de leucocytes, ce qui se rapproche de ce que l’on observe lorsque
le fœtus est une mule. (Allen, 1984)
Les concentrations sériques en PMSG sont semblables entre les gestations compatibles
et non compatibles. (Anderson, 1988)
g) Expression des antigènes du CMH par les cupules
endométriales
Il existe une corrélation temporelle entre le développement des cupules, l’attraction
lymphocytaire vers le tissu des cupules et l’apparition d’anticorps anti-CMH dans le sérum
maternel. Les cupules seraient donc la source des antigènes du CMH paternels qui stimulent
le système immunitaire de la jument gestante. (Allen, 1984) La réaction lymphocytaire
représentant la réponse immunitaire maternelle à médiation cellulaire à ces antigènes
d’histocompatibilité et les anticorps cytotoxiques correspondant à la composante humorale de
cette réponse. (Kydd et al, 1982)
On peut remarquer que le fœtus n’exprime qu’un seul des deux antigènes du CMH du
père (dans le cas ou le père est hétérozygote pour ces antigènes) et donc la mère elle aussi ne
produira des anticorps que contre un seul de ces antigènes. (Allen, 1984)
Cependant, il n’a pas été possible de démontrer la présence d’antigènes du CMH de
classe I sur les cupules endométriales matures ou le trophoblaste non-invasif, grâce à
l’utilisation d’anticorps monoclonaux anti-CMH bien caractérisés. De plus, chez les juments
portant des fœtus dont le CMH de classe I est compatible, les concentrations en PMSG dans le
sérum maternel ne sont pas plus élevée que chez les juments portant des fœtus
histoincompatibles et l’activité de la PMSG ne persiste pas, plus longtemps au cours de la
gestation. Cependant le tissu d’origine des cupules, la ceinture chorionique réagit de façon
importante lors des tests avec les anticorps monoclonaux anti-CMH.
Bien qu’on ne parvienne pas à démontrer la présence d’antigènes du CMH de classe I
sur les cupules endométriales par méthode histochimique, la forte affinité des sérums antiCMH de classe I pour le tissu de la ceinture chorionique et l’association temporelle entre la
production d’anticorps cytotoxiques et la formation des cupules restent en faveur du rôle de
77
source d’alloantigènes joué par la composante invasive du trophoblaste lors de gestation
équine. (Allen et al., 1987)
En fait, on a démontré que les antigènes du CMH de classe I sont exprimés avec une
densité très importante à la surface des cellules trophoblastiques de la ceinture chorionique à
J32-36, juste avant qu’elles envahissent l’endomètre. Les cellules matures des cupules
endométriales sécrétant la PMSG, qui dérivent des cellules de la ceinture chorionique,
expriment les antigènes du CMH de classe I à des niveaux très réduits. Aucun antigène du
CMH de classe I n’est détectable dans les cellules du trophoblaste non invasif, excepté sous la
forme de petites zones isolées.
Les antigènes du CMH de classe II n’ont été détectés sur aucune cellule, bien qu’ils
soient exprimés à de hauts niveaux par l’épithélium endométrial glandulaire et luminal
bordant les cupules endométriales.
Les antigènes du CMH de classe I sont également exprimés à de hauts niveaux par les
tissus de l’endomètre au niveau des cupules. Le haut niveau d’expression des antigènes du
CMH de classe I par les glandes de l’endomètre bordant et entourant les cupules contraste
fortement avec l’expression réduite des antigènes de classe I par les cupules endométriales
matures elles-mêmes. (Donaldson et al., 1990)
Par contre, il est étonnant que la réponse à médiation cellulaire maternelle soit
augmentée (en particulier chez la ponette) en l’absence de production d’alloanticorps. La
relation, apparemment inverse à ce que l’on attendrait, qui existe entre la compatibilité du
CMH et l’intensité de la réaction leucocytaire suggère que la réponse à médiation cellulaire
pourrait être dirigée contre des antigènes autres que ceux du CMH tels que les antigènes
mineurs d’histocompatibilité ou des antigènes spécifiques du tissu du placenta. (Allen, 1984)
Chez l’âne, l’origine physiologique ou génétique du manque de réponse immunitaire à
médiation humorale lors de gestation n’a pas encore été établie. (Kydd et al, 1982)
Ce bilan concernant le cheval et l’âne nous permet d’aborder maintenant le premier
type de transfert d’embryons interspécifique réalisé chez les Equidés.
78
B. Les
transferts
d’embryons
interspécifiques
chez
les
équidés domestiques
Le genre des Equidés est l’un des seuls genres de Mammifères chez lequel le
croisement entre des espèces différentes, dont le nombre de chromosomes est très différent,
aboutit à la naissance d’une progéniture hybride viable. Ceci peut d’ailleurs paraître
surprenant compte tenu de l’importante réaction maternelle qui se produit chez ces espèces
lors de la formation des cupules endométriales. (Allen, 1982a)
Il semble que toutes les espèces d’Equidés croisées entre elles peuvent donner une
descendance viable si la femelle est inséminée avec de la semence fertile au moment
approprié de son cycle ovulatoire. Cependant, dans la plupart des cas, lors de croisements
avec Equus caballus la femelle doit être la jument pour que le croisement soit un succès.
(Allen et Short, 1997)
Ces hybrides ont été largement utilisés pour l’étude des mécanismes reproducteurs et
du développement embryonnaire. Cependant les combinaisons sont tout de même limitées.
Les procédures de transfert d’embryon permettent de réaliser de véritables gestations
interspécifiques lors desquelles le conceptus et la femelle gestante sont d’espèces différentes.
Les gestations interspécifiques sont largement utilisées pour étudier les mécanismes qui
permettent au fœtus de survivre et d’être accepté par le système immunitaire de sa mère.
Lors de ces transferts interspécifiques, le trophoblaste joue un rôle très important dans
la réussite de la gestation. Chez la plupart des espèces il est nécessaire que le trophoblaste soit
du même génotype, en ce qui concerne l’espèce, que l’utérus de la mère receveuse.
Cependant, chez les Equidés, le fœtus peut être transféré avec ses propres annexes fœtales.
Cette particularité est sans doute liée à la structure des annexes fœtales et à l’existence des
cupules endométriales chez les Equidés. (Anderson, 1988)
Dans cette partie, nous allons donc envisager les différents types de transferts
interspécifiques d’embryons chez les équidés domestiques. Nous allons tout d’abord étudier
les transferts interspécifiques d’embryons d’hybrides puis nous verrons les transferts
interspécifiques entre le cheval et l’âne. Nous aborderons ensuite des notions d’immunologie
avec l’expression d’antigènes par les cupules endométriales et par le trophoblaste normal. Les
effets du génotype fœtal et de l’environnement utérin sur le développement utérin seront
79
également explicités. Enfin, nous étudierons un dernier transfert interspécifique, celui
d’embryons d’âne et de cheval chez la mule.
1. Les transferts interspécifiques d’embryons d’hybrides
d’équidés
Le transfert d’embryons de mules à des ânesses, de même que celui d’embryons de
bardots à des juments ont tous deux été réalisés avec succès. (Allen, 1982a) Ces transferts ont
été entrepris afin d’étudier l’influence du génotype fœtal sur le développement des cupules
endométriales. (Allen, 1982b)
Lors de transfert d’embryons de mules à des ânesses, les cupules endométriales
(observées entre J60 et J70) sont très différentes, à la fois en ce qui concerne la taille et
l’apparence, de ce qui serait attendu à ce stade de gestation si l’embryon de mule avait été
laissé chez sa véritable mère, une jument. Au lieu des structures petites et étroites qui auraient
en principe été largement envahies par des lymphocytes et seraient donc à un stade final de
dégénérescence et de nécrose, les cupules présentent chez les ânesses receveuses sont de
grande taille et actives. Elles ressemblent fortement à celles observées lors d’une gestation
classique de bardot.
Cette ressemblance a été confirmée histologiquement. On observe les assemblages
typiques de cellules des cupules endométriales dans le stroma, la dilatation de type kystique
de nombreuses glandes endométriales à l’intérieur du tissu des cupules et une augmentation
marquée de la réaction leucocytaire maternelle par rapport à la gestation normale chez
l’ânesse. (Allen, 1982b)
Par contre, la plupart des cellules des cupules sécrétant la PMSG sont encore viables et
l’accumulation de leucocytes est moins importante que celle observée chez la jument lors de
gestation de mule. De plus ces leucocytes restent groupés dans le stroma environnant. (Allen
et al., 1993)
Il faut noter qu’au cours de ce type de gestation, comme lors de gestation
intraspécifique chez le cheval ou chez l’âne, la réaction cellulaire ne s’attaque pas à la couche
trophoblastique de l’allantochorion normal. (Allen et al., 1985)
Les ânesses présentent également de très hautes concentrations sériques en PMSG au
moment du retrait des fœtus (entre J60 et J70) ainsi que de très hautes concentrations
80
plasmatiques de progestérone après J50. (Allen, 1982b) Chez une autre ânesse, chez laquelle
l’embryon est laissé en place, la PMSG peut être détectée dans le sang jusqu’aux environs de
J150. (Allen et al., 1993)
Les résultats sont moins clairs lors du transfert d’embryons de bardots à des juments.
A J37 les lymphocytes sont déjà accumulés dans le stroma endométrial et semblent être en
train d’attaquer les cellules de la ceinture. A J45 le cercle typique de cupules endométriales de
taille moyenne est présent dans la corne gestante. Ces cupules sont d’apparence similaire aux
cupules de petite taille retrouvées lors de gestation intraspécifique chez le cheval au même
stade de gestation. Histologiquement cependant, ces cupules ressemblent davantage à celles
retrouvées classiquement chez la mule puisque les cellules des cupules sont assemblées de
façon plutôt lâche dans le stroma endométrial et qu’un nombre assez important de leucocytes
accumulés a commencé à envahir le tissu des cupules plutôt que de rester rassemblé autour de
ce dernier. (Allen, 1982b)
Les observations faites sur les conceptus de mules transférés, c’est à dire le
développement de cupules endométriales très larges et actives qui sécrètent de grandes
quantités de PMSG comme lors de gestation classique de bardot, sont explicites. (Allen,
1982b) Elles mettent clairement en évidence l’influence importante que l’environnement
utérin peut avoir sur le développement des membranes foetales (Allen, 1982b) contrairement
à l’idée selon laquelle l’empreinte du génome paternel détermine le devenir de la ceinture
chorionique (Allen et Short, 1997).
2. Les transferts interspécifiques d’embryons entre l’âne et le
cheval
Les transferts respectifs d’embryons de chevaux à des ânesses et d’ânes à des juments
ont également été réalisés avec succès. (Allen, 1982a) Ils ont donné lieu à des gestations
interspécifiques où le conceptus est à la fois xénogénique et extraspécifique pour la mère
receveuse. (Allen, 1982b) Nous verrons que ces caractéristiques influent sur la formation
d’anticorps cytotoxiques chez la mère et sur la placentation. Des tentatives d’immunisation de
la mère ont été menées afin d’aider au maintien de la gestation.
81
a) Le transfert d’embryons de cheval chez l’ânesse (♀
cheval × ♂ cheval → ♀ âne)
Six gestations interspécifiques d’âne chez le cheval ont été obtenues sur une période
de trois ans à partir de neuf transferts (67%) d’embryons de cheval récupérés à J7 ou J8 postovulation.
Sur ces six gestations, deux se sont poursuivies jusqu’au terme et des poulains en
bonne santé sont nés respectivement à 336 et 363 jours de gestation (Figure 17). Deux autres
conceptus ont été retirés par hystérotomie à J59 et J62 et enfin une ânesse portant à la fois son
propre conceptus d’âne et un conceptus de cheval a été tuée à J63 afin de récupérer l’utérus
gravide. (Allen, 1992)
Le conceptus de cheval transféré chez une ânesse aboutit à la formation de cupules
endométriales actives et de grande taille. (Allen, 1982a) Celles-ci se sont développées après
l’invasion de l’endomètre par une ceinture chorionique large et active. (Allen, 1982b) Il en
résulte de hautes concentrations de PMSG dans le sang de la mère. Ces embryons semblent
s’implanter facilement et continuent à se développer normalement jusqu’au terme. (Allen,
1982a)
Figure 17 : Anesse receveuse et son poulain issu de transfert d’embryon interspécifique
(photographie aimablement prêtée par le Dr W.R. Allen)
82
Le développement des cupules endométriales ainsi que la production d’hormones sont
similaires à ceux observés lors de gestation classique de bardot et lors du transfert d’embryons
de mules chez l’ânesse. (Allen, 1982b) Les cupules sont donc larges et actives et les
concentrations plasmatiques en PMSG sont élevées.
Un très grand nombre de lymphocytes s’accumule dans le stroma endométrial autour
de chaque cupule. Cependant, malgré l’intensité de cette attaque, les cupules persistent
jusqu’à après J100. (Allen et al., 1985)
Chez l’ânesse portant à la fois son propre conceptus âne et un conceptus transféré de
cheval les différences observées à J60 au niveau des cupules endométriales sont visibles
histologiquement. (Allen, 1982b) Les cupules endométriales associées au conceptus
intraspécifique d’âne sont typiquement plus étroites et plus petites que celles associées au
conceptus de cheval. (Allen, 1992) Alors que la réponse leucocytaire dirigée contre les
cupules d’âne était légèrement plus importante que celle attendue lors de la gestation
classique chez l’âne, elle est néanmoins beaucoup moins sévère et destructrice que l’attaque
contre les cupules extraspécifiques de l’embryon de cheval situé dans la corne controlatérale.
Un très grand nombre de leucocytes sont agrégés autour de chaque cupule et envahissent le
tissu des cupules en profondeur en détruisant les cellules des cupules. (Allen, 1982b)
L’examen histologique de l’interface allantochorion-endomètre chez les deux autres
ânesses, abattues autour de J60, montre que l’implantation se déroulait normalement chez les
deux animaux. Les villosités chorioniques primaires et secondaires s’engrènent exactement
dans les cryptes endométriales correspondantes. (Allen, 1982b) Il n’y a pas d’accumulation
leucocytaire visible à l’interface allantochorion-endomètre. (Allen et al., 1985)
Les cupules endométriales de cheval, plus grosses et actives, sont à l’origine d’une
élévation de la concentration sérique de PMSG chez la plupart des ânesses receveuses, ainsi
qu’une concentration de progestérone plasmatique augmentée chez l’ensemble de ces
dernières entre J50 et J90 par rapport à ce qui est observé lors de gestation intraspécifique
chez l’ânesse. (Allen, 1982b) La sécrétion excessive de progestérone est engendrée par le
développement d’un plus grand nombre de corps jaunes secondaires et de follicules lutéinisés
dans les ovaires maternels. Cette hyperstimulation ovarienne est, semble-t-il, due plutôt à un
ratio augmenté de l’activité biologique de l’hormone FSH-like vis-à-vis de l’hormone LH-like
chez le cheval par rapport à l’âne et non à une augmentation de la quantité totale de
83
gonadotrophine sécrétée. (Allen et al., 1985) Il n’y a pas d’évidence d’accumulation de
leucocytes chez l’ânesse lorsque la gestation peut être menée à terme. (Allen, 1982b)
b) Le transfert d’embryons d’âne chez la jument (♀ âne × ♂
âne → ♀ cheval)
Lors de ce transfert le taux de succès du transfert est élevé, il y a bien gestation mais le
taux de naissance d’un ânon vivant est très faible. Dans la majorité des cas il y a avortement
ou résorption du conceptus entre 47 et 105 jours de gestation. Dans les cas où le conceptus a
été retiré chirurgicalement entre J60 et J87, il y a avait alors évidence de lésions du fœtus et
du placenta, celles-ci résultant d’une réaction immunitaire à médiation cellulaire maternelle,
généralisée, contre le conceptus. Lors de ces gestations, aucun développement des cupules
endométriales n’a été mis en évidence en raison de l’incapacité complète de la ceinture
chorionique de l’embryon d’âne à envahir l’endomètre de la jument entre J35 et J40. (Allen,
1982a) Ainsi à J43, la ceinture chorionique typiquement petite et étroite chez l’âne mais qui
devrait, à ce stade, avoir envahit l’endomètre, est toujours visible attachée au chorion. (Allen,
1982b) Cependant, le fœtus d’âne semble grandir et se développer normalement jusqu’à
environ J70 et l’allantochorion reste sain et bien vascularisé à ce stade. (Allen et al., 1985)
Après J70, le fœtus dépérit et prend une apparence de plus en plus congestive. Les
fluides amniotiques deviennent progressivement de couleur rouge en raison de l’hémolyse des
globules rouges fœtaux. L’allantochorion est apposé de façon lâche plutôt qu’adhérant à
l’endomètre maternel. Il devient de plus en plus pale et flaccide entre J70 et J85 suite à l’arrêt
progressif de la circulation fœtale (Figure 18). Finalement le fœtus meurt entre J80 et J95 et le
conceptus en dégénérescence est expulsé avant que la mère ne revienne en oestrus. (Allen et
al., 1985)
84
Figure 18 : Conceptus interspécifique d’âne chez le cheval avorté à J87 de gestation,
d’après Allen et al. (1987) (avec permission).
Aucune production de PMSG n’est détectable dans le sang des juments à aucun des
stades de gestation, ceci suite à l’absence totale de formation des cupules endométriales. Dans
la grande majorité des cas, il n’y a pas de développement d’un second corps jaune. En ce qui
concerne la concentration en progestérone plasmatique, au lieu de l’augmentation soudaine
observée normalement autour de J40, celle-ci reste relativement constante jusqu’aux environs
de J50-J80 puis décline progressivement. Cette période semble correspondre avec le moment
de l’échec de la gestation. L’administration de progestagènes exogènes (allyl trembolone) ne
permet pas d’éviter la perte du fœtus (Tableau 4).
Il est intéressant de remarquer que lors de traitement à l’aide d’un progestagène, cela a
pour effet que le corps jaune primaire régresse plus précocement au cours de la gestation que
chez des juments non traitées. La concentration en progestérone plasmatique commence
également à diminuer peu après le début du traitement bien que le conceptus continue à se
développer normalement au cours de cette période.
L’administration de progestagènes
exogènes à des juments gestantes exerce donc un effet lutéolytique modéré ou en quelque
sorte un effet antilutéotrophique. Il semble donc inenvisageable d’administrer des
progestagènes aux juments gestantes en tant que thérapie de remplacement chez les juments
85
présentant un risque d’échec de gestation suite à une trop faible production de progestérone
endogène.
Le traitement avec de la PMSG semble inefficace également (Tableau 4). Dans
certains cas, une légère augmentation de la production de progestérone est observée, reflétant
soit la formation d’un corps jaune secondaire ou la stimulation de l’activité sécrétrice du corps
jaune primaire. Cependant, la réponse obtenue est très variable et dans l’ensemble elle est
considérée comme négative. (Allen, 1982b)
Tableau 4 : Traitements endocrinologiques administrés aux juments portant des
conceptus interspécifiques d’ânes, d’après Allen et al. (1987).
Traitement
Aucun
Allyl trenbolone orale (44mg
par jour)
PMSG partiellement purifiée
(20 000-30 000 U.I.)
Total
Nombre
de
gestations
Devenir des gestations
Avortée
Reste gestante
avant J110
après J150
Taux de
survie fœtale
(%)
15
4
12
4
3
0
20
0
7
6
1*
14
26
22
4
15
* Fœtus viable et allantochorion implanté normalement à J83.
On sait que l’embryon équin n’entre pas réellement en contact avec l’endomètre de la
jument avant J45. L’absence de nécessité d’un contact physique rapproché avec les tissus
maternels associée au taux de survie élevé de l’embryon xénogénique en début de gestation,
semble indiquer que le jeune conceptus d’équidé présente relativement peu d’exigences
spécifiques. C’est seulement à partir de J40, lorsque la réaction immunologique au niveau des
cupules endométriales débute, qu’une relation intime et stable avec l’organisme maternel
devient nécessaire à la survie de l’embryon. (Allen, 1982a)
Le transfert d’embryons d’ânes à des juments constitue donc un modèle d’échec de
gestation dans lequel plus de 70% des conceptus meurent et sont avortés entre J80 et J100.
(Allen et al., 1987)
Certaines gestations parviennent tout de même à terme, on peut alors remarquer que
l’ânon a largement bénéficié de la surface d’échange placentaire plus importante offerte par
l’utérus de jument qui est plus grand que celui d’ânesse (Figure 19). (Allen et Short, 1997)
86
Figure 19 : Jument receveuse et son ânon issu du transfert d’embryon interspécifique
(photographie aimablement prêtée par le Dr W.R. Allen)
Il existe en fait une gradation en terme de placentation et de survie fœtale lors de
gestation d’âne chez le cheval. On peut ainsi les classer. On parle alors de gestation normale
chez ces quelques juments qui donnent naissances à des ânons grands et robustes. Un autre
groupe correspond aux juments qui donnent naissance à des ânons petits et dysmatures après
terme. Puis un troisième groupe qui avorte des ânons sévèrement sous-développés dans les
semaines avant le terme. Enfin, le groupe le plus important correspond aux fœtus qui
subissent un échec typique de l’implantation combiné avec le rejet immunitaire maternel à
médiation cellulaire qui se terminent par un avortement avant J100. (Allen, 1992)
c) Production
d’anticorps
cytotoxiques
et
effet
de
l’immunisation contre les antigènes fœtaux
La présence d’anticorps humoraux maternels dirigés contre les antigènes du CMH des
parents génétiques du fœtus porté a été testée chez des juments et ânesses receveuses
d’embryons de l’autre espèce. Des échantillons de sérum étaient prélevés depuis J20 jusqu’à
10 à 14 jours après l’avortement, le retrait chirurgical du conceptus ou encore la naissance
d’un poulain vivant.
Au cours de cette étude seules trois ânesses avaient été testées pour les anticorps
cytotoxiques et leur présence a été démontrée chez deux d’entre elles. Cependant, cette
production d’anticorps est très différente de celle qui est observée lors de gestation classique
87
intraspécifique chez le cheval. En effet, dans le cas des ânesses, les anticorps contre les
antigènes du CMH du père du fœtus n’ont commencé à apparaître qu’après J300 chez les
deux animaux.
Chez les 22 juments portant des conceptus d’ânes qui ont été testées pour les anticorps
cytotoxiques contre les lymphocytes des parents la réponse était très variable. (Allen, 1982b)
Le sérum de la majorité des juments ne présentait pas d’activité cytotoxique. (Kydd et al,
1982) Huit juments ont montré une production d’anticorps détectable à n’importe quel
moment de la gestation. Parmi ces juments, trois avaient reçu des injections d’un mélange de
lymphocytes des parents aux environs de J40-J60. Chez les autres juments positives, le stade
de gestation auquel les anticorps devenaient détectables dans le sérum ainsi que la durée de
détection étaient très variables. Chez deux juments, les anticorps détectés n’étaient dirigés que
contre un seul des parents biologiques (la mère et le père respectivement). (Allen, 1982b)
Etant donné qu’il n’y a pas production de cupules endométriales lors de gestation de
conceptus d’âne chez le cheval, il existe donc une autre source d’antigènes constituant le
stimulus pour la production d’anticorps, comme cela a déjà été suggéré.
L’absence d’anticorps cytotoxiques dans de nombreuses gestations ayant échoué
montre que l’activité cytotoxique des anticorps ne peut être responsable de l’échec des
gestations. Les anticorps cytotoxiques ne semblent pas non plus augmenter les chances de
succès de la gestation puisque les animaux chez lesquels des anticorps sont apparus,
naturellement ou artificiellement, ont également avorté. (Kydd et al, 1982)
d) Placentation et changements histologiques
Chez les juments portant un embryon d’âne les structures observées après le retrait
chirurgical du conceptus après J60 donnent l’impression d’un manque d’attachement entre
l’allantochorion et l’endomètre. Une quantité variable d’une sécrétion brillante couleur miel
est visible à la surface de l’allantochorion. De plus, de nombreuses structures à paroi fine, de
type kystique contenant un liquide clair sont dispersées à la surface interne de
l’allantochorion. Ces structures sont facilement rompues durant la procédure chirurgicale.
La raison sous-jacente au manque d’attachement de l’allantochorion à l’endomètre est
facilement identifiable après l’examen au microscope de l’interface trophoblaste-endomètre.
Lors d’une gestation classique chez le cheval, une apposition intime des microvillosités du
trophoblaste avec l’épithélium luminal maternel et le développement d’interdigitations de
88
complexité croissante surviennent à partir de J45. Dans le cas de la gestation interspécifique
d’embryon d’âne chez la jument, l’allantochorion semble plutôt reposer simplement à la
surface de l’endomètre. Il y a très peu de signes de formation de villosités par le chorion et
encore moins d’évidence d’un développement des cryptes de l’endomètre. Il semble que les
surfaces épithéliales aient tendance à se repousser plutôt qu’à s’unir. Cette impression est
accrue par l’augmentation de la quantité des sécrétions exocrines au cours de la gestation. Ce
matériel est produit principalement par les cellules trophoblastiques et constitue une véritable
barrière physique entre les surfaces maternelles et fœtales. Cependant chez certains animaux
on peut observer une certaine apposition du trophoblaste et de l’épithélium utérin et quelques
aires semblent normales par rapport à ce qui est attendu lors de gestation normale chez le
cheval.
La caractéristique la plus frappante observée lors de cet examen est l’accumulation
très importante de leucocytes dans le stroma endométrial dans la plupart des endroits où
l’endomètre est en contact avec l’allantochorion (Figure 20). On retrouve là encore des
variations importantes, sur des coupes histologiques d’une même jument ou de juments
différentes, dans l’étendue et l’intensité de l’accumulation leucocytaire. Ces différences ne
sont pas corrélées directement au moment de la gestation, cependant, il est clair que
l’accumulation de leucocytes est progressive. Initialement les cellules restent dispersées dans
le stroma, sous l’épithélium luminal, puis elles s’agglutinent de plus en plus densément
jusqu’à finalement commencer à passer à travers l’épithélium et s’attaquer aux cellules
trophoblastiques. Ce stade final des modifications histologiques semble correspondre avec
une congestion, une hémolyse et la mort du fœtus ainsi qu’une dévascularisation de
l’allantochorion.
Chez une des juments dont le conceptus est retiré à J85, l’allantochorion est beaucoup
plus fermement attaché à l’endomètre que chez les autres animaux et, tout comme le fœtus, il
semble sain et bien vascularisé. Ce développement spectaculaire est aussi visible
histologiquement puisque l’implantation s’est déroulée correctement jusqu’à ce stade de
gestation. Comme lors de gestation intraspécifique, les villosités chorioniques allongées et
arborescentes se sont développées et sont déjà profondément enchâssées dans les cryptes
correspondantes de l’endomètre. On n’observe pas d’accumulation excessive de sécrétions
exocrines comme chez les autres juments. Néanmoins, malgré l’apparence normale des
surfaces maternelle et fœtale, il existe des zones de l’endomètre où l’accumulation de
lymphocytes est assez intense. Ces agrégats de lymphocytes semblent être confinés au stroma
89
et les cellules ne montrent aucun signe de migration à travers l’épithélium de l’endomètre
pour attaquer le trophoblaste. On en conclut que si cette jument avait été gardée gestante, elle
aurait probablement mené à terme avec succès son conceptus d’âne. (Allen, 1982b)
Figure 20 : Coupes histologiques de l’interface allantochorion-endomètre chez (a) une
jument portant un conceptus intraspécifique viable de cheval à J85, et (b) une jument
portant un conceptus interspécifique d’âne à J82, d’après Allen (1992) (avec permission)
e) Effets de l’immunisation et mémoire immunitaire
Devant l’inefficacité des traitements à l’aide de gonadotrophine exogène ou de
progestérone à maintenir la gestation d’un fœtus d’âne chez la jument, la mise en jeu de
facteurs immunologiques est l’hypothèse la plus probable. On a donc tenté de créer une
immunoprotection du fœtus d’âne à la fois par immunisation active et passive de la jument
receveuse. (Anderson, 1988)
Du sérum de jument gestante (gestation intraspécifique) est utilisé pour
l’immunisation passive et administré tous les quatre à cinq jours entre J40 et J85 à huit
juments. Trois autres juments reçoivent du sérum de jument non gestante. (Allen et al., 1987 ;
Allen et al., 1985)
90
Le conceptus est retiré chirurgicalement à J85 chez deux des juments traitées avec du
sérum de jument gestante. Dans les deux cas le fœtus est bien développé et l’allantochorion
est fermement attaché à l’endomètre. L’examen histologique confirme que l’implantation est
normale à ce stade. Bien que des leucocytes soient accumulés de façon sporadique dans le
stroma endométrial, ils ne semblent pas passer à travers le stroma de l’endomètre. On peut
donc en conclure que ces gestations auraient probablement été menées à terme si elles
n’avaient pas été interrompues. (Allen et al., 1985)
Trois des juments traitées avec du sérum de jument gestante et les trois juments
traitées à l’aide de sérum de jument non gestante avortent de leur conceptus d’âne durant la
période caractéristique (J84-110). Cependant les trois autres juments traitées avec du sérum de
jument gestante donnent naissance à des ânons vivants (Tableau 4). (Allen et al., 1987)
Pour l’immunisation active des juments portant des conceptus d’ânes, les lymphocytes
des parents biologiques sont utilisés comme substance immunogène. Au départ, seulement
deux injections de lymphocytes sont réalisées aux environs de J40 et J60. Les signes observés
chez les trois juments traitées lors du retrait chirurgical du conceptus entre J67 et J83
montrent un échec de la gestation. (Anderson, 1988)
Par la suite les immunisations sont réalisées chez six autres juments mais les injections
sont débutées plus tôt et quatre injections sont réalisées entre J25 et J54. Trois autres juments
reçoivent des lymphocytes d’ânes n’étant pas les parents du fœtus selon le même protocole.
La gestation échoue chez deux des juments immunisées avec les lymphocytes des parents
mais évolue normalement chez les quatre autres avec la naissance d’ânons vivants. La
gestation est également poursuivie jusqu’au terme chez deux des trois juments immunisées
avec des lymphocytes d’ânes non parents (Tableau 5).
Cependant, il n’est pas possible de prédire ou de déduire rétrospectivement, d’après les
dosages de progestérone plasmatique ou d’autres paramètres cliniques, la raison pour laquelle
les gestations ont échoué chez certaines juments immunisées avec les lymphocytes d’ânes.
Ces différences permettent envisager une origine partiellement génétique (associée
aux effets immunologiques) à l’échec de ce type de gestation.(Allen et Short, 1997)
Les taux de survie obtenus après immunisation sont largement supérieurs au taux de
20% obtenu chez les juments de contrôle non traitées. (Allen et al., 1987)
91
Par contre, l’utilisation de globules rouges ou de cellules des cupules endométriales se
montre inefficace pour améliorer le taux de réussite des gestations. (Anderson, 1988)
Tableau 5 : Traitements immunologiques administrés aux juments portant des
conceptus d’ânes et expression des aspects immunoprotecteur et cytotoxique (rejet) de la
mémoire immunitaire maternelle lors des gestations suivantes, d’après Allen et al. (1987)
Traitement
Traitements immunologiques
Immunisation passive
Sérum de jument gestante
Sérum de jument non gestante
Immunisation active
Lymphocytes des ânes parents
Lymphocytes des ânes non parents
Nombre
Taux de
Devenir des gestations
de
survie
Avortée Reste gestante
gestations avant J110 après J150
fœtale (%)
6
3
3
3
3
0
50
0
6
3
2
1
4
2
67
67
13
0
13
100
12
12
0
0
Mémoire immunitaire
Jument ayant préalablement porté
un fœtus d’âne à terme
Jument ayant préalablement avorté
d’un fœtus d’âne
L’amélioration considérable dans le maintien de la gestation obtenue à la fois par les
administrations de sérum de jument gestante et l’immunisation par les lymphocytes confirme
une origine immunologique pour l’échec de ce type de gestation. On peut supposer que le
sérum de jument gestante contient des facteurs protecteurs qui ont été produits par l’animal
donneur en réponse au stimulus antigénique de son propre fœtus. Ces facteurs sont à l’origine
d’une réaction croisée qui fournit une protection similaire au conceptus d’âne chez la jument
receveuse. Dans le cas des injections de lymphocytes parentaux, il semble probable qu’elles
stimulent activement le système immunitaire, engendrant ainsi une réponse protectrice vis-àvis du fœtus plutôt que la réaction de rejet typiquement observée. (Allen et al., 1985)
Les mécanismes mis en jeu dans l’immunoprotection fœtale induite par
l’immunisation par des lymphocytes sont donc encore mal compris mais l’immunisation par
des lymphocytes pour améliorer le taux de gestation est également efficace chez l’homme et
le rat. Un antigène à réaction croisée entre le trophoblaste et les lymphocytes a ainsi été mis
en évidence chez ces deux espèces. En raison de la similitude des effets bénéfiques obtenus
sur les modèles d’échec de la gestation chez l’homme, le rat et le cheval, il est possible qu’un
92
antigène du même type soit exprimé par les cellules des cupules endométriales chez la jument.
(Allen et al., 1987)
On peut en déduire que lors de gestation classique chez le cheval, l’invasion de
l’endomètre par les cellules de la ceinture chorionique pour former les cupules endométriales
constitue un stimulus antigénique important pour la mère. Ce stimulus aboutit en effet à la
tolérance de n’importe quel antigène fœtal pouvant par la suite être exprimé à l’interface
foeto-maternelle. (Allen et al., 1987)
Enfin, on peut noter qu’il semble exister une mémoire immunitaire. En effet, les
juments qui ont avorté d’un fœtus d’âne ont tendance à perdre la seconde gestation
interspécifique plus tôt. Au contraire, une jument qui a mené à terme la gestation d’un âne à
tendance à faire de même lors d’une seconde gestation interspécifique (Tableau 4).
(Anderson, 1988)
Ceci démontre clairement que les deux types de réponses maternelles vis-à-vis du
fœtus, le rejet (cytotoxique) et l’immunoprotection, sont rappelées lors d’une gestation
ultérieure. (Allen et al., 1987)
Suite à ces différentes observations, il semble donc fort probable que le maintien ou
l’échec de ce type de gestation fasse intervenir à la fois des facteurs génétiques et
immunitaires. (Allen, 1992)
3. Expression des antigènes du CMH par les cupules
endométriales
Si l’on considère les différents types de gestations étudiés, on constate donc des
différences importantes en ce qui concerne le nombre et la taille des cupules endométriales
prises individuellement. Il en résulte une grande variation dans la quantité ou le “volume”
total de tissu des cupules qui se développe.
On considère que le nombre d’antigènes du CMH paternel exprimés par les cellules
des cupules endométriales individuellement est faible et qu’il reste relativement constant quel
que soit le type de gestation. La quantité totale de stimulations antigéniques présentées au
système immunitaire maternel est sans doute liée au nombre total de cellules des cupules
présentes dans l’endomètre. Ainsi, si un certain degré de stimulations antigéniques est
nécessaire pour provoquer une production d’anticorps humoraux suffisante pour être
93
détectable dans le sérum, ce seuil ne pourrait être atteint que lors de gestations engendrant la
formation d’une certaine quantité de tissu des cupules.
Une relation de ce type pourrait expliquer l’incidence plus faible des anticorps
cytotoxiques chez l’âne (gestation intraspécifique) et chez la jument portant un conceptus de
mule. Cependant, il pourrait également exister un différentiel d’expression des antigènes du
CMH paternel. Ainsi, le fait qu’un cheval soit le père du fœtus (quel que soit le type de
gestation) pourrait conférer un taux d’expression relativement haut aux antigènes du CMH sur
les cupules. Par contre, le fait qu’un âne soit le père pourrait conduire à une réduction de
l’expression des alloantigènes par les cellules, ceci diminuerait la probabilité pour que la
stimulation soit suffisante pour engendrer une réponse humorale maternelle détectable.
Une autre explication possible à la divergence entre la réponse à médiation cellulaire
maternelle et la réponse immunitaire humorale dans les différents types de gestation équine,
est la possibilité que les cellules des cupules endométriales expriment également des
antigènes spécifiques d’espèce et/ou des antigènes spécifiques de tissus. Ces antigènes n’ont
pas de rapport avec les alloantigènes du CMH. Il a été démontré que des antigènes spécifiques
de tissus sont présents dans les placentas murin et humain, bien que l’expression d’antigènes
spécifiques d’espèce par le trophoblaste n’ait pas été clairement établie. Ainsi, la
reconnaissance maternelle des antigènes spécifiques d’espèce pourrait bien expliquer
l’augmentation marquée de la réponse leucocytaire contre les cupules qui survient lors des
gestations interspécifiques sans qu’il y ait d’augmentation équivalente de la production
d’anticorps cytotoxiques.
De la même manière, l’expression d’antigènes du trophoblaste par les cellules des
cupules endométriales pourrait stimuler au moins en partie la réponse maternelle à médiation
cellulaire, sans production équivalente d’anticorps cytotoxiques. Cependant il est peu
probable que ces antigènes spécifiques de tissus diffèrent suffisamment entre le cheval et
l’âne pour contribuer significativement à l’augmentation de la réponse leucocytaire observée
dans les gestations interspécifiques.
Les données obtenues concernant la gestation équine indiquent que les antigènes du
CMH d’origine paternelle font partie de ceux exprimés par les cellules des cupules
endométriales et reconnus par le système immunitaire de la mère. Cependant le taux réel
d’expression de ces antigènes peut varier considérablement entre les différents types de
gestations équines et peut être influencé par un certain nombre de facteurs physiques et/ou
94
génétiques. Il semble également probable que des antigènes spécifiques d’espèce soient
exprimés par les cellules des cupules endométriales. Ceci jouerait un rôle significatif dans
l’augmentation de la réponse maternelle à médiation cellulaire qui survient lors de gestations
interspécifiques. (Allen, 1982b)
4. Expression des antigènes par le trophoblaste normal
Le trophoblaste normal correspond aux tissus trophoblastiques qui ne constituent pas
les cupules endométriales.
Comme nous l’avons vu précédemment, dans la plupart des types de gestations la
réaction leucocytaire ne s'attaque pas au trophoblaste normal. Pourtant, les résultats obtenus
chez les juments portant des conceptus d’ânes laissent envisager que les cellules du
trophoblaste du chorion des Equidés expriment également des antigènes qui sont
potentiellement étrangers pour le système immunitaire maternel. Il s’agit donc de déterminer
si les cellules du trophoblaste normal expriment les mêmes antigènes fœtaux que les cellules
des cupules endométriales. Si tel est le cas il faudra envisager les mécanismes qui préviennent
l’allantochorion de la réaction à médiation cellulaire subie par les cupules endométriales lors
de la plupart des types de gestations. (Allen et al., 1985)
Chez la très grande majorité des juments portant des conceptus d’ânes il y a
avortement ou résorption du fœtus spontanément durant les 100 premiers jours de gestation ou
encore il est évident histologiquement que la gestation allait échouer au cours de cette
période. Le changement le plus frappant, et le plus constant, observé lorsque la gestation est
stoppée après J60 est l’accumulation progressive de cellules immunitaires partout où
l’endomètre est en contact avec l’allantochorion. Aucune de ces juments n’a été exposée
précédemment aux antigènes fœtaux par l’invasion habituelle des cellules spécialisées de la
ceinture chorionique formant les cupules endométriales. On en conclut donc que le stimulus
antigénique pour la réponse à médiation cellulaire généralisée provient des cellules du
trophoblaste normal de l’allantochorion.
On pourrait supposer que la réponse leucocytaire observée n’a débuté qu’après que
l’allantochorion ait déjà commencé à dégénérer et de ce fait expose des antigènes qui
n’auraient pas été exprimés si la couche trophoblastique était restée intacte. Ceci semble
cependant peu probable car le trophoblaste reste intact et sain jusqu’à un stade tardif du
processus d’invasion. De plus, on a pu observer chez une des jument dont le fœtus était déjà
95
mort et à un stade avancé de dégénérescence lorsqu’il a été retiré à J65, qu’il n’y avait pas
d’évidence d’accumulation de leucocytes dans l’endomètre de la corne utérine gestante. Ceci
suggère que le fœtus est mort de causes autres qu’un rejet immunologique. La présence de
tissus allantochorionique en dégénérescence ne constitue donc pas un stimulus antigénique
suffisant pour induire le type de réponse leucocytaire observée chez les autres juments.
Comme dans le cas des cellules des cupules endométriales, la question qui se pose est
de savoir quels types d’antigènes sont exposés par le trophoblaste normal. En raison de
l’infiltration leucocytaire généralisée observée chez les juments portant des conceptus d’ânes,
il est surprenant qu’un faible nombre seulement de ces animaux produise des anticorps
cytotoxiques contre les lymphocytes de l’un ou l’autre des parents génétiques du fœtus.
(Allen, 1982b) On peut associer cela au fait que les antigènes du CMH ne sont pas exprimés
par le trophoblaste non invasif (sauf aux niveaux de petites zones très limitées). (Donaldson et
al., 1990) Ainsi, on peut à nouveau supposer que la stimulation alloantigénique de la mère
hôte est insuffisante pour obtenir une réponse cytotoxique mesurable en raison d’une trop
faible expression d’antigènes du CMH à la surface exposée de chaque cellule trophoblastique.
Les cellules des cupules endométriales dans la gestation équine normale sont situées en
profondeur à l’intérieur du stroma endométrial et sont donc directement exposées à la partie
efférente du système immunitaire. Mais au contraire la couche trophoblastique du chorion
reste en dehors de l’épithélium de l’endomètre et à une certaine distance des cellules T et B.
L’espace est encore augmenté chez les juments gestantes d’un âne en raison de la sécrétion
exocrine qui s’accumule entre les surfaces fœtale et maternelle. Il en résulte que seule la
surface apicale de chaque cellule trophoblastique est exposée lorsque ces cellules sont situées
dans la couche serrée, de type pavimenteuse, du chorion. (Allen, 1982b)
Il semble donc que l’attaque leucocytaire marquée qui se produit chez le cheval contre
le conceptus interspécifique d’âne soit stimulée largement par l’expression par les cellules
trophoblastiques d’antigènes spécifiques d’espèce plutôt que d’antigènes du CMH. Cependant
les cas des juments chez lesquelles le conceptus d’âne a été mené à terme ou semblait devoir
l’être au moment de l’examen histologique constituent un obstacle à cette hypothèse. Comme
les autres juments, celles-ci n’ont pas présenté de développement des cupules endométriales
ni de sécrétion endogène de PMSG. Il n’est pas non plus possible d’attribuer le succès de
leurs gestations à une administration d’hormones exogènes. L’observation, sur les coupes
histologiques réalisées chez certaines des juments, de petites zones d’infiltration leucocytaire
intense de l’endomètre pourrait être significative. Cela indiquerait éventuellement qu’un
96
certain degré de reconnaissance maternelle d’antigènes étrangers était en train de se produire.
Ceci n’explique pas pour quelle raison cette réponse est restée localisée permettant une
implantation normale. (Allen, 1982b)
D’autre part, l’augmentation du taux de réussite de la gestation de conceptus d’âne
chez le cheval, lorsque la jument a été immunisée activement contre les lymphocytes des
parents, semble en faveur d’une implication des antigènes du CMH dans le rejet du conceptus
d’âne chez les juments non traitées. Cependant, des antigènes spécifiques d’espèce pourraient
également être mis en jeu dans ces réactions, avec le développement d’anticorps anti-âne
jouant un rôle essentiel dans la protection du fœtus âne chez les animaux immunisés. (Allen et
al., 1985)
Si les cellules du trophoblaste d’âne expriment des antigènes qui sont reconnus comme
étrangers par le cheval, on peut supposer que de tels antigènes seront également exprimés par
le trophoblaste des conceptus d’hybrides et sans doute aussi par le trophoblaste des conceptus
intraspécifiques. Si tel est le cas, l’existence d’une forme de mécanisme de protection doit être
envisagée, soit pour masquer les antigènes trophoblastiques évitant ainsi la reconnaissance
immunitaire maternelle, soit pour supprimer ou neutraliser la réaction maternelle, puisqu’il
n’y a pas de réaction contre le trophoblaste normal lors des autres types de gestations. Le fait
que la réaction des cupules endométriales soit justement absente dans le type de gestation qui
démontre l’existence des antigènes du trophoblaste, met en évidence la probabilité pour que
certains aspects de la formation des cupules endométriales fournissent la barrière
immunoprotective nécessaire entre le trophoblaste fœtal et l’épithélium de l’endomètre
maternel. La stimulation immunologique de la mère par les cellules de la ceinture chorionique
ou encore une action immunosuppressive de la PMSG peuvent être impliquées dans ce
processus.
Il a été démontré, comme nous l’avons vu précédemment, que le processus de
facilitation immunologique joue un rôle dans la protection du fœtus contre l’attaque
immunitaire maternelle. Chez l’Homme et la souris, de grandes quantités d’anticorps sont
produites dès les premiers stades de gestation. Ces anticorps sont spécifiques à la fois pour les
tissus et les antigènes allogéniques du fœtus et la majorité d’entre eux présente une action
bloquante ou facilitante. Ainsi, ils se combinent avec des antigènes spécifiques sur le
trophoblaste pour former des complexes antigène-anticorps qui par la suite masquent les
97
antigènes et empêchent une reconnaissance maternelle plus poussée. Ils bloquent également
toute attaque par des lymphocytes sensibilisés.
Les anticorps facilitants semblent être sécrétés préférentiellement aux anticorps
immunoréactifs lorsque le stimulus antigénique est reçu à faible dose sur une période
prolongée. C’est ce qui semble se produire pour les antigènes du trophoblaste lors de la
gestation.
Les anticorps facilitants jouant un rôle protecteur pour le trophoblaste chez l’Homme
et la souris, on peut supposer qu’ils jouent également un rôle important dans la protection du
fœtus chez les Equidés. L’invasion de l’endomètre par les cellules de la ceinture chorionique à
J36 puis l’expression d’antigènes du CMH, spécifiques d’espèces et/ou spécifiques de tissus
par les cellules des cupules endométriales pourraient constituer le stimulus de faible intensité
nécessaire. Cela engendrerait alors la production d’une réponse de type facilitante par le
système immunitaire maternel.
Dans le cas des juments portant les conceptus d’ânes, on peut supposer que l’absence
d’invasion par les cellules de la ceinture chorionique empêche l’apparition du stimulus
antigénique nécessaire pour la formation d’anticorps facilitants. Il en résulte que le
trophoblaste du fœtus d’âne ne possède pas de protection lorsque il entre en contact avec
l’endomètre maternel. Il se produit alors une réponse maternelle immunoréactive au lieu de la
réponse bloquante normale.
Enfin, en ce qui concerne l’accumulation leucocytaire autour des cupules
endométriales, il semblerait qu’une certaine proportion de ces leucocytes ont une activité
suppressive plutôt que cytotoxique. Il est donc tout à fait probable que la stimulation de
l’activité cellulaire suppressive spécifique de l’utérus soit une fonction majeure de la réaction
des cupules endométriales dans la gestation classique chez le Equidés. Ces cellules agiraient
ensuite en inhibant la réponse immunitaire potentiellement nuisible vis-à-vis des antigènes
étrangers qui peuvent s’exprimer à la surface du trophoblaste non invasif durant
l’implantation. (Allen et al., 1987)
Il existe un dernier moyen par lequel le développement des cupules endométriales
pourrait empêcher la réponse maternelle potentielle contre les antigènes exprimés par le
trophoblaste au cours de la placentation. Il s’agit de l’action du principal produit de sécrétion
des cupules, la PMSG. Ainsi, la fonction de facteur immunoprotecteur a été démontrée pour la
98
hCG lors de la gestation humaine. Cette substance, associée à d’autres, serait absorbée à la
surface des lymphocytes et augmenterait leur mobilité électrophorétique et donc, par
définition, leur charge électrostatique négative. Il en résulterait une répulsion électrostatique
entre les lymphocytes et les cellules trophoblastiques. La molécule de PMSG a une
composition plus riche en carbohydrate et acide sialique que la hCG et les autres
gonadotrophines pituitaires. Elle répondrait donc parfaitement à ce rôle de protection lors de
la gestation chez les Equidés.
Un tel mécanisme pourrait contribuer à expliquer l’échec de la majorité des gestations
interspécifiques d’âne chez le cheval, puisqu’il y a absence complète de production de PMSG.
Les autres types de gestation interspécifiques chez les Equidés présentent tous un
développement des cupules endométriales et une production de PMSG en quantité variable.
Cependant, les cupules endométriales disparaissent avant J100, il faut donc envisager que
d’autres hormones ou substances (œstrogènes, progestérone,…) relaieraient cette fonction
immunologique lorsque la PMSG cesse d’être produite. L’action de la PMSG agit
nécessairement en complément des autres mécanismes immunoprotecteurs. (Allen, 1982b)
5. Effets du génotype fœtal et de l’environnement utérin sur
le développement placentaire
L’existence du phénomène d’impriting est bien connue chez les Mammifères. Il
correspond au fait que la contribution relative des chromosomes homologues maternel et
paternel est inégale au cours du développement. Les hybrides d’Equidés, avec la particularité
du dimorphisme marqué entre la mule et le bardot, ainsi que ces différentes études de
transferts d’embryons, sont très utiles dans l’étude de ce phénomène. Les différences
observées chez la jument et l’ânesse lors de ces différents types de gestations présentent a
priori un bon exemple d’impriting en ce qui concerne les gènes contrôlant le développement
placentaire et la production d’hormones placentaires.
On remarque que lors de ces différentes expériences le développement de la ceinture
chorionique et des cupules endométriales est favorisé dans l’utérus d’ânesse par rapport à
celui de jument. Ceci concorde avec la gestation normale du bardot au cours de laquelle le
développement des cupules endométriales est largement augmenté. Cela s’accorde aussi avec
la gestation interspécifique d’âne chez la jument où le développement de la ceinture
chorionique est largement diminué. L’utérus de jument semble donc avoir une action
99
inhibitrice sur tout conceptus possédant des caractères d’âne. Au contraire, l’utérus d’ânesse a
un effet stimulant sur tout conceptus possédant des caractères de cheval. Ceci suggère que
l’utérus d’ânesse serait plus “tolérant” que l’utérus de jument pour ce qui est de l’acceptation
d’une gestation d’hybride ou d’une gestation interspécifique. Ainsi, lors de gestations
intraspécifiques chez le cheval et l’âne et lors de gestations d’hybrides (mule et bardot), l’effet
paternel apparent (gènes empreintes) sur les valeurs de PMSG obtenues, que nous avions
précédemment explicité, peut être largement modifié en transférant le conceptus dans le
“mauvais” utérus. Ceci ne remet, cependant, pas en cause le fait que des gènes empreintes
puissent influencer le développement placentaire chez les Equidés.
En prenant toutes les observations en compte, et en supposant que le phénomène
d’impriting mette en jeu un facteur de croissance et son récepteur à la fois pour les gènes
paternels et maternels, il est possible de créer un modèle pour expliquer les variations
marquées du développement des cupules endométriales lors des différents types de gestations.
Ce modèle est présenté dans le Tableau 6.
Tableau 6 : Modèle théorique du contrôle du développement endométrial lors des
gestations chez les Equidés d’après Allen et al. (1993)
Composantes
Valeur numérique
totale attribuée
Embryonnaire Utérine
Taille des cupules
endométriales
Gestations intraspécifiques
P C + MC
+UC
+18
Grosses
Cheval
A
A
A
+U
P +M
+14
Petites
Ane
Gestations d’hybrides
P A + MC
+UC
+14
Petites
Mule
C
A
P +M
+UA
+18
Grosses
Bardot
Gestations interspécifiques
Mule → Cheval
Petites
P A + MC
+UC
+14
A
C
Grosses
+18
P +M
+UA
Mule → Ane
Très grosses
+22
P C + MC
+UA
Cheval → Ane
A
A
C
Très petites
+10
P
+
M
+U
Ane → Cheval
On considère que le facteur de croissance embryonnaire, P, dérivant du gène paternel est stimulant et a
pour valeur numérique +14 pour le cheval et +10 pour l’âne (PC = +14, PA = +10).
On considère que le facteur de croissance embryonnaire, M, dérivant du gène maternel est stimulant et
a pour valeur numérique +12 pour le cheval et +8 pour l’âne (MC = +12, MA = +8).
On considère l’effet utérin, sous la forme d’un facteur inhibiteur, a pour valeur numérique -8 chez le
cheval et -4 chez l’âne (UC = -8, UA = -4).
On attribue une plus haute valeur numérique à l’effet stimulant de ce facteur de
croissance et du récepteur chez le cheval que chez l’âne, aussi bien en ce qui concerne le
100
facteur du gène paternel que celui du gène maternel. On envisage également un facteur utérin
ayant des effets inhibiteurs qui possède alors une valeur numérique négative supérieure chez
le cheval que chez l’âne. La somme des valeurs obtenues dans chaque type de gestation
reflète bien les différences observées en ce qui concerne le développement des cupules
endométriales et le taux de sécrétion de PMSG. Par exemple, l’addition des effets stimulants
des facteurs parentaux transmis au conceptus avec les effets négatifs du facteur utérin donne
le même total pour la gestation intraspécifique chez le cheval, la gestation de bardot et la
gestation interspécifique de mule chez l’ânesse. Ces trois types de gestations sont associés à
une ceinture chorionique large et active qui engendre la formation de grandes cupules
endométriales et des concentrations sériques en PMSG hautes. De la même manière,
l’addition des trois valeurs pour la gestation intraspécifique chez l’âne, la gestation de mule et
la gestation interspécifique de mule chez le cheval donne dans chaque cas le même total bas.
Ces trois types de gestations sont associés à une ceinture chorionique plus étroite et moins
active et donc des cupules endométriales de plus petite taille. Enfin, il est important
d’observer que la somme des valeurs numériques donne un total très bas pour le modèle de
gestation interspécifique d’âne chez le cheval et par contre un total très élevé pour la gestation
interspécifique de cheval chez l’âne, ce qui correspond bien à ce qui est observé dans la
réalité.
Il semble donc démontré que, chez les Equidés, le développement de la ceinture
chorionique et l’invasion de l’endomètre maternel pour former les cupules endométriales
sécrétant la PMSG puissent être affectés par le génotype fœtal mais aussi de façon assez
importante par l’environnement maternel utérin. (Allen et al., 1993) Cependant
l’identification des facteurs mis en jeu se révèle difficile.
On peut pourtant raisonnablement supposer que le stimulus pour la formation initiale
de la ceinture chorionique, ainsi que le contrôle au jour le jour de sa croissance, sa maturation
et ses propriétés invasives est induit localement par la production de facteurs de croissance
mitogéniques. En effet, des études récentes sur des utérus de juments durant le début de la
gestation ont révélé la présence de hautes concentrations d’ARNm et/ou de protéines. On a
également mis en évidence des récepteurs pour l’epidermal growth factor (EGF) et le
transforming growth factor-β1 (TGFβ1) dans l’endomètre ainsi que pour les insulin-like
growth factor II (IGF-II) et hepatocyte growth factor-scater factor (HGF-SF) dans les tissus
composant les membranes du conceptus. Enfin, il a été démontré qu’il existe une régulation
avec augmentation marquée de l’expression des ARNm codant pour EGF, TGF β1 et HGF-SF
101
durant la période du développement de la ceinture chorionique et l’invasion de l’endomètre
maternel qui s’en suit.
Concernant l’influence de l’utérus d’âne sur le développement de la ceinture
chorionique chez le conceptus de mulet, un mécanisme est envisagé. Il est possible qu’un
facteur de croissance, jouant un rôle clé dans le développement de la ceinture chorionique et
sécrété par l’endomètre sous contrôle génétique maternel, ne soit capable de se lier que
faiblement à son récepteur sur le placenta (qui est sous le contrôle du génome paternel) quand
le conceptus de mule est dans un utérus de cheval. Par contre, quand ce même conceptus de
mule est placé dans un utérus d’âne, le facteur de croissance produit par l’endomètre d’âne
peut alors se lier largement au récepteur placentaire dont le contrôle est paternel (âne) sur le
conceptus. Le développement d’une ceinture chorionique plus large et active est alors stimulé.
Ces hypothèses doivent cependant encore être testées expérimentalement. (Allen et Short,
1997)
6. Le transfert d’embryons de cheval et d’âne chez la mule
Le mulet (Equus mulus mulus, 2n = 63) qui résulte du croisement d’un âne mâle et
d’une jument est l’hybride d’Equidés le plus commun et est habituellement stérile dans les
deux sexes. (Anderson, 1988)
Malgré leur incapacité à produire des gamètes, des mules ont été utilisées avec succès
comme receveuses pour des embryons de cheval et d’âne, les gestations étant menées à terme
dans les deux cas (Figures 21 et 22). (Anderson, 1988) Le transfert d’embryons a été réalisé à
la fois par méthode chirurgicale et non chirurgicale (uniquement pour le transfert de fœtus de
cheval), les deux méthodes permettant d’obtenir des poulains vivants. Cependant, le passage
du pistolet utilisé pour le transfert à travers le col utérin est plus difficile chez la mule que
chez la jument. La principale difficulté rencontrée lors du transfert non chirurgical
d’embryons de cheval est la synchronisation entre les mules et les juments donneuses. Enfin,
la gestation n’est possible que si la mule est cyclée, les différents essais de transfert
d’embryons chez des mules non cyclées ayant échoué. (Camillo et al., 2003)
Les cellules de la ceinture chorionique du fœtus d’âne, comme du cheval sont capables
d’envahir l’endomètre et de former des cupules endométriales. Chez un conceptus de cheval
retiré en début de gestation (J73), une accumulation intense de leucocytes est observée autour
102
des cupules endométriales. Cette réponse est encore plus importante que celle observée chez
les juments portant un fœtus de mulet. (Anderson, 1988)
La production de PMSG est dépendante du génotype fœtal à la fois en ce qui concerne
sa concentration et sa durée de présence dans le sang maternel. Ainsi, la production est plus
faible et plus courte chez une mule portant un fœtus d’âne que chez une mule portant un fœtus
de cheval. (Anderson, 1988) Ainsi, lorsque la mule porte un fœtus de cheval, la sécrétion de
PMSG ressemble à celle observée lors de gestation intraspécifique chez le cheval alors que
lorsque la mule porte un fœtus d’âne cette sécrétion est semblable à celle observée lorsqu’une
jument porte un fœtus de mulet. (Allen, 1992) Cependant, nous verrons que des différences
importantes ont également été observées au sein des mules portant un fœtus de cheval.
(Camillo et al., 2003)
Figure 21 : Mule et son poulain né après transfert d’embryon (photographie aimablement
prêtée par le Dr Allen)
103
Figure 22 : Mule et son ânon né après transfert d’embryon (photographie aimablement
prêtée par le Dr Allen)
Les concentrations en progestérone augmentent rapidement après l’ovulation chez les
mules portant des embryons de cheval. Elles restent élevées après J40, ce qui signe le
développement d’un corps jaune secondaire. Les concentrations en œstrogènes conjugués
totaux sont mesurées à partir de J65. Elles augmentent régulièrement jusqu’à atteindre des
valeurs très élevées (800-1000 ng/mL) à J150. Ces caractéristiques sont semblables à celles
observées lors de gestation normale chez le cheval. (Camillo et al., 2003)
Des anticorps cytotoxiques contre les lymphocytes des parents sont observés avant J70
chez toutes les mules portant un fœtus dont le ELA est incompatible, y compris chez les
mules portant un fœtus d’âne. (Anderson, 1988)
Les images échographiques obtenues à différents stades de la gestation ne sont pas
différentes de celles observées chez des juments gestantes. La durée moyenne de la gestation
est de 348 jours. La parturition débute spontanément et il n’y a pas de complications
observées. Les mules porteuses présentent un comportement maternel normal et expulsent
correctement le placenta. La lactation est normale. De plus, les mules receveuses présentent
104
également des chaleurs de poulinage dans les 8 jours qui suivent la naissance et une ovulation
dans un délai de 13 jours.
Lors des différentes expériences, les mules non cyclées n’ont pu être rendues gestantes
malgré les essais d’utilisation d’oestrogènes et de progestagènes avant et après transfert. Les
changements cycliques dans la prolifération et la fonction des cellules endométriales sont
considérés comme étant contrôlés par la production de stéroïdes ovariens. Ainsi l’anœstrus
saisonnier engendre ainsi une atrophie relative de l’endomètre. Il a également été rapporté un
taux de gestation diminué et un taux de mort embryonnaire plus élevé chez les juments en
anoestrus transitionnel traitées avec un progestagène actif oral, l’altrenogest, par rapport aux
juments cyclées. Ces observations suggèrent donc que les Equidés en anœstrus ont un
potentiel plus limité que les Equidés cyclés comme receveurs d’embryons.
Il a été démontré, comme nous l’avons vu plus tôt, que le génotype fœtal exerce une
influence importante sur le développement des cupules endométriales et leur sécrétion de
PMSG. Cet effet est illustré ici par les différences observées suivant que le fœtus est un âne
ou un cheval. Néanmoins, l’environnement utérin maternel présente également un effet qui
peut totalement masquer les influences génétiques comme nous l’avons vu également.
Dans le cas des mules portant un fœtus de cheval, il existe cependant des différences
importantes concernant la sécrétion de PMSG qui ne peuvent être expliquées par ces effets.
Certains profils de sécrétions de PMSG sont similaires à ceux obtenus lors de gestations
intraspécifiques chez le cheval, alors que d’autres vont jusqu’à ressembler à ce qui est observé
lors de gestation normale de mule. Il semble donc possible que des facteurs autres que le
génome du conceptus et l’environnement maternel utérin puissent influencer la production de
PMSG. Les variations individuelles et celles liées à l’espèce semblent jouer un rôle majeur
lors de gestation intraspécifique chez le cheval, lors de laquelle la production de PMSG est
très variable à la fois en concentration et en durée de sécrétion. De plus, on ne peut exclure un
effet des administrations de progestérone exogène sur les profils endocrinologiques des mules
ayant reçu ce type de traitement. (Camillo et al., 2003)
Des recherches plus poussées seraient nécessaires en ce qui concerne le
développement des cupules endométriales lors des transferts d’embryons chez les mules afin
de vérifier et d’appliquer les hypothèses évoquées, en ce qui concerne les mécanismes
immunologiques, lors des autres types de transferts.
105
Les résultats globalement positifs obtenus lors de ces différents transferts chez les
équidés domestiques et les études immunologiques qui en découlent ont permis d’envisager
des applications plus pratiques à ces transferts ainsi que l’extrapolation de ces techniques à
d’autres espèces d’Equidés, ces dernières étant également capables de s’hybrider.
106
III. Les transferts d’embryons interspécifiques chez
les équidés sauvages
D’un point de vue pratique, il a été envisagé que les gestations interspécifiques soient
utilisées comme moyen de préservation des espèces menacées d’extinction. (Anderson, 1988)
Puisque les parcs zoologiques sont un lieu de choix pour la conservation des espèces
sévèrement menacées, ils pourraient permettre d’élever un nombre suffisant d’individus en
captivité pour espérer en relâcher certains afin de supplémenter les populations sauvages en
déclin. Cet objectif nécessite la mise en place et le maintien de troupeaux à haute fécondité.
Les équidés sauvages se reproduisent bien en captivité mais leur fécondité est largement
limitée par leur longue période de gestation et l’incapacité pour une femelle de porter plus
d’un seul fœtus à la fois. (Kydd et al., 1985)
Les transferts d’embryons sont utilisés chez les chevaux et les animaux de rente pour
augmenter les performances reproductrices de certaines femelles à haut potentiel génétique et
la même utilisation pourrait en être faite chez les espèces en voie d’extinction, en particulier si
les embryons peuvent être portés par des femelles d’une espèce proche, domestique ou
sauvage, qui n’est pas en danger. (Anderson, 1988) De plus, comme nous l’avons vu plus tôt,
le succès des gestations interspécifiques a été démontré chez les Equidés.
Deux expériences de transfert d’embryons d’équidés sauvages ont été menées. La
première a permis le transfert non chirurgical d’un embryon de zèbre à une jument
domestique. Lors de la seconde expérience, des embryons de zèbres et de chevaux de
Przewalski ont été transférés à des juments et ânesses domestiques.
Nous avons vu que le cheval de Przewalski est une espèce d’équidé qui a disparu de
son habitat d’origine en 1967. Cette espèce se reproduit bien en captivité et n’est pas
réellement menacée d’extinction. Cependant une gestion correcte de ces populations captives
doit être menée afin de maintenir la diversité génétique entre individus. (Durrant et al., 1986)
Le transfert interspécifique d’embryons serait donc un moyen d’augmenter le nombre
d’individus d’une population tout en maintenant la diversité génétique.
107
A. Transfert non chirurgical d’embryons de zèbres à des
juments domestiques
La première expérience de transfert d’embryons d’une femelle zèbre de Grant à des
juments domestiques a été menée par Bennet et Foster en 1984 au Zoo de Louisville,
Kentucky, U.S.A. Il s’agit du premier transfert interspécifique chez les équidés sauvages. Le
zèbre de Grant (Equus burchelli, 2n = 46) n’est pas une espèce menacée d’extinction. (Foster
et Bennett, 1984) Il s’agit du plus commun des zèbres, il est utilisé comme modèle pour
l’étude des espèces de zèbre menacées d’extinction. (Anderson, 1988) Ainsi, on suppose que
si un embryon de zèbre de Grant peut être transféré avec succès à une jument domestique et
que la mère hôte peut mener cet embryon à terme jusqu’à la naissance, cela signifie que la
même procédure pourra être menée avec un embryon d’une espèce de zèbre menacée. (Foster
et Bennett, 1984)
1. Animaux utilisés pour l’expérience
Une femelle zèbre de Grant multipare de six ans est utilisée comme donneuse
d’embryons et plusieurs juments Quarterhorse et croisées sont disponibles comme receveuses.
Les cycles œstraux de la donneuse et des receveuses sont synchronisés par l’administration à
chaque individu d’une injection intramusculaire unique de 250 µg de fluprostenol, un
analogue de la prostaglandine durant l’œstrus. Les receveuses sont traitées 36 heures après la
donneuse pour compenser les différences observées concernant la durée de l’œstrus chez les
deux espèces. Toutes les juments sont testées régulièrement pour détecter les signes d'œstrus
et la donneuse a la possibilité de s’accoupler naturellement avec un étalon zèbre de Grant une
ou plusieurs fois durant le comportement d’œstrus. (Bennett et Foster, 1985)
2. Récolte des embryons et transfert
Au jour estimé comme étant J7 après l’ovulation, la femelle zèbre est immobilisée en
décubitus sternal grâce à un mélange de 1,5 mg de chlorhydrate d’étorphine, 200 mg de
chlorhydrate de xylazine et 300 mg de kétamine administré grâce à une fléchette tirée à l’aide
d’un pistolet à air comprimé. L’aire périnéale est nettoyée et un cathéter trois voies muni d’un
ballonnet est passé à travers le col jusqu’à l’utérus. Le ballonnet est gonflé avec 15 mL de
solution saline stérile afin d’occlure l’anneau cervical interne et 500 mL de milieu de rinçage
c'est-à-dire de la saline tamponnée au phosphate de Dulbecco qui s’écoule dans l’utérus sous
108
l’effet de la gravité. Alors que le liquide arrive dans l’utérus, celui-ci est massé par voie
transrectale et l’arrière-train de la femelle est surélevé afin de faciliter la dispersion du milieu
partout dans l’utérus. On laisse ensuite le milieu de rinçage s’écouler sous l’effet de la gravité
dans un Erlenmeyer stérile. La femelle reçoit des antibiotiques et une antitoxine tétanique
comme traitements prophylactiques. La narcose est ensuite reversée en 90 secondes par une
injection intraveineuse de 4 mg de diprenorphine.
Les sept tentatives de récupération non chirurgicale d’embryons menées lors de cycles
consécutifs chez la femelle zèbre permettent de récupérer six embryons. Deux de ces
embryons sont transférés par méthode non chirurgicale, via le col utérin, dans la corne
ipsilatérale de juments synchronisées. Celles-ci sont traitées avec 2 g de phénylbutazone, 400
mg de flunixine méglumine et 1 g de progestérone le jour du transfert et le lendemain.
(Bennett et Foster, 1985)
3. Gestation et parturition
Chez une des juments receveuses, une Quarterhorse multipare de 26 ans, la palpation
transrectale de l’utérus à J10 après le transfert suggère la présence d’un conceptus. Compte
tenu de l’âge de la jument, il est décidé de continuer des injections hebdomadaires de 1 g de
progestérone jusqu’à J150. Les palpations transrectales suivantes, à J25, 45 et 60, sont
caractéristiques de la gestation et l’examen échographique à J71 montre un fœtus
normalement développé et viable.
La durée normale de la gestation chez le zèbre de Grant est de 340 à 345 jours. Dans
cette étude, la jument receveuse montre un développement mammaire correct et un léger
relâchement de la vulve et des ligaments sacro-sciatiques à J345 après transfert. Cependant, la
palpation transrectale indique que le fœtus, bien qu’actif, est positionné en profondeur de la
cavité abdominale. A J366, la jument est agitée, la région périnéale est très relâchée et du lait
s’écoule des mamelles. La palpation transrectale révèle que le poulain est relativement inactif
et n’est toujours pas positionné pour la naissance. Il est décidé d’induire la gestation.
La jument est tranquillisée par une injection intraveineuse de 200 mg de xylazine
hydrochloride et le col est dilaté manuellement afin de permettre le passage d’un bras.
L’allantochorion est rompu et le foal mâle de 28,6 kg est repositionné. Il est extrait à l’aide de
lacs sur les membres antérieurs. De l’oxygène intranasal est administré au foal de manière
préventive et on laisse s’écouler 4 minutes avant de clamper et couper le cordon ombilical. La
109
jument renifle et lèche le foal, elle exprime le comportement d’attachement maternel typique.
Le colostrum et le sérum de la jument ne présente aucune activité cytotoxique contre les
globules rouges du jeune zèbre. La jument continue par la suite à produire du lait et à allaiter
le poulain normalement. (Bennett et Foster, 1985)
4. Conclusion
Le succès de cette naissance montre que la récupération et le transfert d’embryons par
des méthodes non chirurgicales entre équidés sauvages et domestiques pourrait constituer une
méthode efficace de conservation des espèces menacées. En effet, par transfert d’embryons, il
est possible qu’une femelle adulte puisse produire jusqu’à six produits par an au lieu d’un
seul. (Bennett et Foster, 1985)
B. Transferts d’embryons d’équidés sauvages à des juments
et ânesses domestiques
La seconde étude de transfert d’embryons d’équidés sauvages a eu lieu d’avril à
septembre en 1983 et 1984. (Kydd et al., 1985)
Le but de cette étude est d’envisager la possibilité d’utiliser les transferts d’embryons
interspécifiques pour augmenter la production de poulains vivants chez deux espèces
d’équidés sauvages, le cheval de Przewalski (Equus przewalskii) et le zèbre de Grant (Equus
burchelli). (Kydd et al., 1985)
On suppose que le cheval de Przewalski est à l’origine des équidés actuels. Son
hybride avec le cheval domestique est le seul hybride d’équidé fertile. On suppose que les
différences chromosomiques entre les deux espèces sont liées à une simple translocation
Robertsonnienne, transformant quatre chromosomes acrocentriques de E. przewalskii (2n =
66) en deux chromosomes métacentriques chez E. caballus (2n = 64). La capacité à produire
des hybrides fertiles apporte sans doute une valeur prédictive positive au succès du transfert
interspécifique d’embryons entre ces deux espèces. (Anderson, 1988) De plus, la physiologie
de la reproduction chez le cheval de Przewalski est similaire à celle du cheval domestique.
(Durrant et al., 1986)
110
1. Matériel et méthode
a) Gestion des donneuses et receveuses
Les donneuses d’embryons sont deux zèbres de Grant femelles multipares (Figure 23)
âgées de 10 et 11 ans et accouplées à un étalon zèbre de Grant de 10 ans ainsi que deux
juments de Przewalski de 6 ans n’ayant jamais reproduit, accouplées à deux étalons de
Przewalski ayant respectivement 5 et 12 ans. (Figure 24) (Kydd et al., 1985)
Figure 23 : Une des femelles zèbre de Grant utilisée comme donneuse d’embryons,
d’après Kydd et al. (1985).
Figure 24 : L’étalon de Przewalski de 12 ans utilisé durant la seconde année de l’étude,
d’après Kydd et al. (1985).
111
Ces équidés sauvages sont hébergés dans des box ouverts sur des petits paddocks au
Regent’s Park Zoological Garden à Londres. Ils sont nourris avec du foin et des concentrés.
Durant la seconde année de l’étude, leur alimentation est supplémentée avec de l’orge germée
fraîche obtenue par culture hydroponique. (Kydd et al., 1985)
L’œstrus est détecté par l’observation des signes comportementaux puisque les
femelles sont placées dans un paddock avec leur mâle respectif au moins une heure par jour.
L’accouplement se fait de façon naturelle et le dernier jour du comportement d’œstrus est
considéré comme le jour de l’ovulation (J0).
Les ponettes de race Welsh et les juments croisées Welsh ainsi que les ânesse de type
anglais, utilisées comme receveuses, font partie d’un grand troupeau d’expérimentation élevé
au pré à Animal Research Station à Cambridge. Les juments sont âgées de 2 à 8 ans et les
ânesses de 2 à environ 15 ans. Les deux groupes contiennent à la fois des animaux ayant déjà
été gestants et d’autres ne l’ayant jamais été. L’œstrus est détecté en faisant souffler les
femelles tous les jours par un étalon ou un âne mâle. Le jour de l’ovulation est déterminé par
radioimmunodosages journaliers des concentrations en progestérone dans des échantillons de
plasma périphérique prélevés durant l’œstrus et les trois jours qui suivent. (Kydd et al., 1985)
Le jour où la concentration en progestérone plasmatique devient supérieure à 1ng/mL est
considéré comme étant le jour de l’ovulation. (Summers et al., 1987)
Etant donné que le cheval de Przewalski est une espèce menacée d’extinction et que ce
type de transfert d’embryons a pour but d’augmenter le nombre d’individus, le transfert
réciproque d’embryons de cheval domestique à des juments de Przewalski n’a pas été tenté.
(Anderson, 1988) Il en est de même pour le zèbre de Grant qui sert ici encore de modèle pour
des espèces menacées.
b) Récolte des embryons
Les embryons sont récupérés non chirurgicalement entre J6 et J10 (en général J7 ou
J8) après l’ovulation. (Hearn et Summers, 1986) Les femelles zèbres et les juments de
Przewalski sont tranquillisées par injection intramusculaire de 1,1 à 2,9 mg de chlorhydrate
d’étorphine et 4 à 12 mg de maléate d’acépromazine administrés grâce à un pistolet à air
comprimé. Alors que la sédation commence à faire effet, l’animal est amené dans un box où
on lui bande les yeux. Il est maintenu soit debout, soit en décubitus par des soigneurs. Le
rectum est vidé et l’aire périnéale est nettoyée avant d’introduire un cathéter flexible muni
112
d’un ballonnet (Franklin Medical, Bucks) à travers le col, jusqu’à l’utérus. Le ballonnet à
l’extrémité du cathéter est gonflé avec 40 mL d’air afin d’occlure l’anneau cervical interne.
L’utérus est ensuite rempli, suivant sa capacité, avec 700 à 1000 mL de saline tamponnée au
phosphate de Dulbecco, sous l’effet de la gravité. Une fois l’utérus complètement distendu, on
laisse le milieu s’écouler dans une éprouvette stérile de 250 mL, sous l’influence de la gravité
et des contractions du myomètre. La même procédure est répétée trois fois de suite et, durant
le lavage final, l’utérus est massé par voie transrectale pour agiter le contenu et aider à la
récupération complète du milieu. (Kydd et al., 1985)
Après la procédure de lavage, les juments reçoivent une injection intramusculaire de
pénicilline procaïne de routine. Dans la majorité des cas, il leur est également administré une
injection intramusculaire de 375 à 500 µg de cloprostenol afin d’induire la lutéolyse. (Kydd et
al., 1985) Les donneuses peuvent ainsi être utilisées de façon répétée au cours des deux
saisons de reproduction. (Hearn et Summers, 1986) Une récupération rapide de la narcose est
ensuite obtenue grâce à une injection intraveineuse de 1,5 à 4,2 mg de chlorhydrate de
diprénorphine. (Kydd et al., 1985)
Si l’embryon n’est pas visible à l’œil nu, les tubes contenant le milieu récupéré sont
conservés à température ambiante durant 20 à 30 minutes avant de retirer la majorité du
liquide de la surface de chaque contenant. Les 20 à 30 mL de liquide restants sont observés au
microscope. Une fois l’embryon localisé, il est transféré dans un tube à essai stérile avec 3 à 5
mL de milieu frais contenant 20% de sérum fœtal de veau. Le tube est ensuite transporté dans
la poche d’un vêtement jusqu’à Cambridge, un voyage de 1,5 à 2 heures. (Kydd et al., 1985)
L’intervalle entre la récolte et le transfert est ainsi compris entre 2,5 et 4,5 heures. (Summers
et al., 1987)
c) Transfert des embryons
La majorité des embryons (20) sont transférés chirurgicalement par laparotomie
ventrale sous anesthésie générale à des juments et ânesses receveuses qui ne se sont pas
accouplées. (Kydd et al., 1985) Ces receveuses ont ovulé 1 à 3 jours après leurs donneuses
respectives (Hearn et Summers, 1986) Deux embryons de cheval de Przewalski et un
embryon de zèbre sont transférés non chirurgicalement dans le corps de l’utérus chez des
ponettes grâce à une pipette d’insémination en plastique passée à travers le col. Un autre
embryon de cheval de Przewalski est transféré par laparotomie par le flanc sous anesthésie
locale. Chacune de ces receveuses reçoit une injection intraveineuse de 250 à 400 mg de
113
flunixine méglumine immédiatement après le transfert afin d’inhiber la sécrétion de
prostaglandines endogènes. (Kydd et al., 1985)
d) Diagnostic de gestation
La gestation est diagnostiquée et suivie par examen échographique de l’utérus
commençant entre J16 et J20 et se poursuivant ensuite à intervalles d’une semaine jusqu’à
J129. (Kydd et al., 1985) De plus, des échantillons de sang périphérique (25mL) sont prélevés
trois fois par semaine à la veine jugulaire de chaque receveuse entre J20 et J120. Ceci est
réalisé afin de pouvoir doser par la suite les concentrations en progestérone et en PMSG et
pour la détection des anticorps cytotoxiques contre les lymphocytes des parents biologiques
du conceptus. On permet également aux deux zèbres femelles de rester gestantes à la fin de la
saison de reproduction en 1984. Des échantillons de sang périphérique sont également
prélevés sur ces individus à intervalle de 8 à 10 jours entre J32 et J120, dans le but de doser
les concentrations en PMSG. (Summers et al., 1987)
e) Dosage de PMSG
Les concentrations sériques en PMSG sont mesurées par la méthode de l’inhibition de
l’hémaglutination décrite par Allen (1969), utilisant du sérum de lapin anti-PMSG (MSIIB)
dirigé contre de la PMSG hautement purifiée. Ces anticorps réagissent fortement de façon
croisée avec la PMSG purifiée d’ânesse. Les courbes obtenues concernant la réponse en
fonction de la dose sur le sérum de cheval, âne et zèbre sont parallèles à la fois avec la
méthode d’inhibition de l’hémaglutination et par radioimmunodosage à double anticorps pour
la LH de cheval. Le Second International Standard for Mare Serum Gonadotrophin (2nd IRPPMSG ; Bangham et Woodward, 1966) est utilisé comme standard et la limite de sensibilité
du test est 0,5 UI de PMSG/mL de sérum. (Summers et al., 1987)
f) Dosage de progestérone
Les concentrations plasmatiques de progestérone sont mesurées par une méthode
radioimmunologique, telle que décrite par Newcomb et al. (1977). Cette méthode utilise un
antisérum préparé chez une chèvre et de la [1,2,6,7,(n)-3H] progestérone (progestérone
marquée au tritium radioactif). Des aliquots de plasma (20µL) sont testés et la limite de
sensibilité du test est de 0,5 ng de progestérone/mL de plasma. (Summers et al., 1987)
114
g) Dosage des anticorps cytotoxiques
Le test standard NIH d’exclusion de coloration par réaction cytotoxique sur les
lymphocytes, modifié pour l’utilisation sur des lymphocytes de chevaux par Bright et al.
(1978) est utilisé pour rechercher, dans le sérum des receveuses, la présence d’anticorps
humoraux dirigés contre les antigènes du CMH des parents biologiques du conceptus. Des
lymphocytes du sang périphériques (PBL) sont isolés à partir d’échantillons de sang
périphérique prélevés chez trois zèbres et trois chevaux de Przewalski parents d’embryons
transférés. L’isolement se fait par centrifugation sur une interface à gradient de densité. Les
aliquots de sérum test (1 µL) et une suspension de 2 × 106 PBL/mL (1µL) sont incubés
pendant 30 minutes à température ambiante sous huile dans une plaque à micropuits avant
d’ajouter 5 µL de complément de lapin pour une heure de plus. Les cellules sont ensuite
teintées par ajout de 2 µL d’une solution d’éosine à 5% avant d’être fixées par 5 µL de formol
à 37%, pH 7.0. (Summers et al., 1987)
2. Résultats
a) Récolte des embryons
Les taux de récupération obtenus sur un total de 43 lavages utérins non chirurgicaux
réalisés sur les quatre donneuses sont présentés dans le Tableau 7. (Kydd et al., 1985)
Tableau 7 : Taux de récupération non-chirurgicale des embryons d’après Kydd et al.
(1985)
Génotype du
donneur
Nombre de récoltes
d’embryons
Nombre d’embryons
récoltés
Taux de
récupération (%)
E. przewalskii
E. burchelli
18
25
11
14
61
56
Total
43
25
58
Il y a 18 tentatives de collecte d’embryon chez les deux juments de Przewalski. Cellesci permettent de récupérer 11 embryons (61%) et les 25 tentatives de collecte d’embryon chez
les deux femelles zèbres ont permis de récupérer 14 embryons (56%). (Hearn et Summers,
1986) Les embryons de ces espèces sauvages ressemblent morphologiquement à ceux du
115
cheval domestique. Ils sont classés du stade jeune blastocyste (J6 et quelques J7) au stade
blastocyste mature (J8 à J10) (Tableau 8). (Summers et al., 1987)
Tableau 8 : Relation entre le stade de récolte et le diamètre des embryons de cheval de
Przewalski et de zèbre de Grant d’après Summers et al. (1987)
Jour de la Nombre d’embryons
collecte
Przewalski Zèbre
J6
Moyenne ± I.C. (variations) du diamètre des
embryons
Przewalski
Zèbre
1
0,184
J7
6
7
0,29 ± 0,05 (0,14-0,48)
0,26 ± 0,07 (0,17-0,70)
J8
4
6
0,58 ± 0,20 (0,23-1,16) 1,30 ± 0,391 (0,32-2,96)
J10
1
3,0
Tous les embryons sauf un semblent intacts et normaux immédiatement après la
collecte. Ils ne subissent aucun changement structural durant l’intervalle entre la récolte et le
transfert. Un blastocyste de zèbre à J8 est partiellement affaissé, sa zone pellucide présente de
nombreuses fissures et il semble contenir un grand nombre de cellules dégénérées. Aucune
gestation n’a résulté de ce transfert. La zone pellucide est toujours présente sur les embryons à
J6 et sur 4 des 13 embryons à J7 mais les embryons restants se sont extraits de la zone
pellucide et sont enveloppés par une fine capsule acellulaire comme cela a été décrit pour les
embryons de chevaux par Betteridge et al. (1982). (Summers et al., 1987)
Aucun problème majeur n’est rencontré avec la technique non chirurgicale de lavage
utérin chez ces équidés. La sédation et la narcose à l’aide du mélange étorphine et
acépromazine est un tel succès chez le zèbre que la majorité des lavages peuvent être réalisés
sur animal debout. Cependant, chez les juments de Przewalski, des doses plus élevées
d’étorphine et acépromazine sont nécessaires afin d’obtenir une narcose et une relaxation
adéquates. La plupart des lavages sont donc réalisés sur un animal maintenu en décubitus
latéral au sol. Cette procédure est plus difficile à réaliser mais elle est néanmoins efficace. Les
essais répétés de récupération d’embryon associés à l’induction prématurée de la lutéolyse ne
diminuent pas la fertilité chez aucune des quatre donneuses. En effet, le taux de récupération
d’embryons est légèrement plus élevé dans la seconde moitié de la saison lors des deux
années de l’étude. Le seul problème qui soit apparu correspond à des difficultés
d’accouplement chez les chevaux de Przewalski. L’étalon de 5 ans a commencé à brutaliser
116
les juments en œstrus plutôt qu’à s’accoupler avec elles à la fin de la saison en 1983 et au
début de la saison de 1984. Il a donc été remplacé par l’étalon âgé de 12 ans.
Ce manque d’accouplements à la fin de la première année et au début de la seconde a
diminué le nombre d’opportunités potentiellement exploitables pour la récupération des
embryons. (Kydd et al., 1985)
b) Transferts d’embryons
Huit des embryons de cheval de Przewalski sont transférés chirurgicalement par
laparotomie ventrale, un est transféré par laparotomie par le flanc et deux sont transférés non
chirurgicalement à des ponettes receveuses. Treize des embryons de zèbre sont transférés
chirurgicalement ou non à des ponettes et ânesses receveuses, l’embryon restant n’a pu être
transféré faute de receveuse synchronisée disponible. (Kydd et al., 1985)
Le devenir de ces transferts ainsi que les taux de gestations obtenus suite au transfert
des blastocystes de chevaux de Przewalski et de zèbres à des ponettes et ânesse domestiques
sont résumés dans le Tableau 9.
Tableau 9 : Taux de gestation après transfert d’embryons de cheval de Przewalski et de
zèbre de Grant à des juments et ânesses receveuses d’après Summers et al. (1987) et
Hearn et Summers (1986)
Type de transfert
E. przewalskii chez le cheval
Chirurgical
Cervical
E. burchelli chez le cheval
Chirurgical
E. burchelli chez l’âne
Chirurgical
Nombre
Gestations
d’embryons
établies*
transférés
9
7
(77,88%)
2
0
5
3
(60,0%)
Perte de la
gestation
(jours) (%)
Gestations
Poulains Poulains
menées à
morts
vivants
terme (%)
3 (20-26)
(34-40)
(85-101)
4
(44,4%)
1a
3
1 (61-70)
2
(40,0%)
1b
1
7
2
2 (51-78)
0
─
─
(28,6%)
(292) c
1
0
Cervical
* Les receveuses chez lesquelles un conceptus a pu être détecté à l’examen échographique entre J16 et J20 sont
considérées comme présentant une gestation établie.
a Non rupture de l’amnios
b Toxémie (J350)
c Toxémie (J292)
117
L’échec dans l’établissement d’une gestation ou sa perte ultérieure n’a pas pu être relié
au degré de synchronisation entre donneuses et receveuses, ni à l’âge de l’embryon ou
l’intervalle entre la collecte et le transfert. (Summers et al., 1987)
Le transfert chirurgical de neuf embryons de cheval de Przewalski, à J7 et J8, à des
ponettes permet initialement l’établissement de sept gestations interspécifiques (78%) (Kydd
et al., 1985) diagnostiquées par examen échographique entre J15 et J18 (Allen, 1992). Ces
gestations se poursuivent jusqu’au terme chez quatre des ponettes (Figure 25). (Anderson,
1988) Quatre poulains (un mâle et trois femelles) naissent donc après des gestations ayant
duré entre 322 et 334 jours. Une des juments met bas de façon inattendue au pré et la
pouliche, normalement développée, est étouffée par l’amnios qui ne s’est pas rompu. Les trois
autres poulains naissent de façon spontanée, sous surveillance. (Summers et al., 1987) Un
fœtus meurt et le conceptus est résorbé entre J85 et J101 et les deux autres conceptus sont
résorbés entre J20 et J26 et entre J34 et J40 respectivement. (Kydd et al., 1985)
Les naissances de poulains de Przewalski étaient les premières obtenues par
l’utilisation des techniques de transfert d’embryons. (Hearn et Summers, 1986)
Figure 25 : Pouliche de Przewalski née après transfert d’embryon à une jument
receveuse (photographie aimablement prêtée par le Dr W.R. Allen)
Les embryons de zèbre de Grant sont transférés à la fois à des juments domestiques et
à des ânesses. (Hearn et Summers, 1986) Des gestations s’établissent chez les receveuses des
118
deux espèces mais seules les juments mènent les embryons de zèbres à terme. (Anderson,
1988)
Ainsi, suite au transfert chirurgical de cinq blastocystes de zèbres à des ponettes
receveuses, trois gestations s’établissent (60%). (Kydd et al., 1985) Deux zèbres femelles
(dont un mort-né) naissent suite à ces gestations (Figure 26). (Hearn et Summers, 1986) Les
durées de gestation sont de 350 et 367 jours. La jument chez laquelle le zèbre, normalement
développé, est mort-né, présente un inconfort abdominal croissant ainsi qu’une polyarthrite
non infectieuse durant les trois semaines avant la mise bas. (Summers et al., 1987) Ceci,
associé à d’autres signes cliniques, est interprété comme une forme de syndrome toxémique
de gestation d’origine immunologique. (Anderson, 1988) Le foal meurt in utero durant le
premier stade du travail qui a été très long. Il est finalement sorti par césarienne. (Summers et
al., 1987) Les signes de polyarthrite disparaissent totalement dans les heures qui suivent le
retrait du fœtus. (Allen, 1992) Chez la troisième jument le fœtus meurt et le conceptus est
résorbé entre J59 et J66.
Figure 26 : Pouliche zèbre (a) née après le transfert d’un blastocyste mature à J8 (b) à
une ponette welsh receveuse, d’après Summers et al. (1987) (avec permission)
Le transfert chirurgical de sept blastocystes de zèbre à des ânesses permet
l’établissement de deux gestations interspécifiques (29%). Un fœtus meurt et le conceptus est
résorbé entre J53 et J64 et l’autre ânesse avorte d’un prématuré à J292. (Kydd et al., 1985)
Cette ânesse avait également présenté des signes de polyarthrite durant les 5 jours précédant
la naissance prématurée. (Allen, 1992) Le foal et le placenta sont d’apparence normale et bien
119
développés compte tenu du stade de gestation (Figure 27), le foal vit 3 heures avant de
succomber d’incompétence respiratoire. (Kydd et al., 1985)
Figure 27 : Foal zèbre de Grant né prématurément d’une ânesse à 292 jours de gestation
et son placenta, d’après Kydd et al. (1985)
Ni les embryons transférés par méthode non chirurgicale, ni ceux transférés par
laparotomie par le flanc n’ont abouti à des gestations. (Kydd et al., 1985)
Tous les poulains nés en vie sont pris en charge avec succès par leur mère hôte (Figure
28). (Hearn et Summers, 1986)
120
Figure 28 : Ponette et sa pouliche zèbre qui vient de naître (photographie aimablement
prêtée par le Dr Allen)
c) Production de PMSG
Comme cela est présenté dans le Tableau 10, une sécrétion de PMSG normale,
comparable à celle retrouvée lors de gestation intraspécifique chez le cheval, est observée
chez les juments portant des embryons de cheval de Przewalski. Ceci suggère que le
développement des cupules endométriales est également normal. (Anderson, 1988) Il existe
cependant des variations considérables entre les quatre animaux à la fois dans les
concentrations observées et dans le moment de disparition de l’activité de la PMSG dans le
sérum. Au contraire, de très faibles quantités de PMSG, à la limite de la sensibilité de la
méthode de dosage, sont détectées durant une période anormalement brève de la gestation
(J36-J56 ; Tableau 10 ) dans le sérum des trois juments portant des conceptus de zèbres.
(Summers et al., 1987) Cette production de PMSG faible et courte dans le temps lors des
gestations de zèbres chez le cheval suggère un faible développement endométrial. (Anderson,
1988)
La gestation normale chez le zèbre est caractérisée par un profil de sécrétion de PMSG
semblable à celui observé lors de gestation intraspécifique chez l’âne, c'est-à-dire une
sécrétion à faible concentration mais sur une longue durée (jusqu’à après J100). (Anderson,
1988) Ainsi, les deux zèbres portant des gestations intraspécifiques présentent des profils de
sécrétions de PMSG assez plats, avec des pics de concentrations sériques (9 et 28 UI/mL) et
une durée de sécrétion d’hormones (jusqu’à J108 et jusqu’à plus de J115 respectivement)
121
(Tableau 10) qui rappellent effectivement ce qui est observé lors de gestation intraspécifique
chez l’âne. Des pics similaires de concentrations en PMSG sérique sont mesurés chez les deux
ânesses portant des conceptus de zèbres (7 et 22 UI/mL respectivement). Cependant la PMSG
disparaît du sérum beaucoup plus tôt au cours de la gestation (J59 et J83 respectivement).
Tableau 10 : Profils de la sécrétion de PMSG chez les juments, ânesse et zèbres portant
des conceptus inter- et intraspécifiques, d’après Summers et al. (1987).
Type de
gestation
Pic de
Période de
concentration de
sécrétion de
Receveuse
PMSG mesurée
PMSG (jours
dans le sérum
après l’ovulation)
(U.I./mL)
Devenir de la
gestation
Cheval
de
Przewalski
chez le cheval
HP
KH
MQ
MN
TM
38-80
40-55
40-82
35-95
44-70
70
5
33
135
4
Poulain vivant, J329
Poulain vivant, J324
Résorbé J85-101
Poulain vivant, J322
Poulain vivant, J334
Zèbre chez le
cheval
KS
MG
MR
36-45
37
40-56
0,5
0,5
1,5
Résorbé, J61-70
Poulain vivant, J367
Poulain mort-né, J350
Zèbre
l’âne
UM
PF
39-83
40-59
22
7
Avorté, J292
Résorbé, J53-79
9
28
Poulain vivant, J364
Poulain vivant, J355
chez
Zèbre chez le
NJ
39-108
zèbre
J
38-115*
* Dernier jour où un échantillon de sang a été prélevé.
Il n’y a pas de corrélation entre le succès ou l’échec de ces gestations et le profil de
sécrétion de PMSG présenté par les mères hôtes. (Summers et al., 1987)
d) Anticorps cytotoxiques
Excepté lors d’une gestation de cheval de Przewaski chez le cheval (Jument HP), une
forte réponse cytotoxique dirigée contre les lymphocytes des parents biologiques est mesurée
dans le sérum périphérique des huit juments receveuses et d’une ânesse receveuse testée
(Tableau 11). Généralement les anticorps sont détectés pour la première fois peu après le
moment où le développement des cupules endométriales est censé commencer, à J36.
Cependant, chez une des receveuses (Jument KH) des anticorps contre les lymphocytes des
deux parents apparaissent à J33. Chez une autre receveuse (Jument TM), des anticorps contre
122
la mère de l’embryon, mais pas contre le père, sont déjà présents à J21, date à laquelle
l’animal est testé pour la première fois. (Summers et al., 1987)
Tableau 11 : Développement d’anticorps lymphocytotoxiques chez les ânesses et juments
receveuses portant des conceptus de cheval de Przewalski ou de zèbre, d’après Summers
et al. (1987).
Type de
gestation
Période de
test du sérum
Receveuse
pour les
anticorps*
Anticorps
présents
contre le
père*
Anticorps
présents
contre la
mère*
Devenir de la
gestation
Cheval
de
Przewalski
chez le cheval
HP
KH
MQ
MN
TM
18-194
14-134
20-128
19-68
21-70
─
33-134
41-128
40-68
56-70
─
33-134
34-128
40-68
21-70
Poulain vivant, J329
Poulain vivant, J324
Résorbé, J85-101
Poulain vivant, J322
Poulain vivant, J334
Zèbre chez le
cheval
KS
MG
MR
14-69
4-181
21-139
4-69
46-181
49-99
43-69
46-181
35-128
Résorbé, J61-70
Poulain vivant, J367
Poulain mort-né, J350
Zèbre
l’âne
UM
18-188
48-158
48-128
Avorté, J292
chez
* Jours après l’ovulation chez la receveuse.
3. Discussion
On constate grâce à cette étude que les techniques de collecte d’embryons, sous
sédation réversible et de courte durée, chez les chevaux de Przewalski et les zèbres ainsi que
le transfert interspécifique d’embryons à des juments domestiques pourraient être utilisés pour
améliorer la fertilité de ces espèces et des autres équidés sauvages. (Summers et al., 1987)
Les résultats montrent une fois de plus l’étonnante capacité des Equidés à porter à
terme des fœtus extraspécifiques de phénotype et caryotype très différents du leur (Figure 29).
(Kydd et al., 1985) Ainsi, le cheval domestique peut mener à terme des embryons de cheval
de Przewalski ou de zèbre. L’utilisation de l’âne comme receveur pour les embryons de zèbre
n’est pas un succès, bien que deux gestations se soient établies. Ceci est surprenant puisque
l’âne avait initialement été choisi car il est plus proche du zèbre d’un point de vue
taxinomique. (Hearn et Summers, 1986) L’âne semblait d’autant plus adapté que, comme
nous l’avons vu précédemment, le transfert d’embryons de cheval chez l’âne aboutit à un
développement normal des cupules endométriales et à la naissance d’une majorité de poulains
vivants. (Summers et al., 1987)
123
Figure 29 : Ponettes receveuses et leur petit (ânon, zèbre et poulain de Przewalski) issu
du transfert interspécifique (photographie aimablement prêtée par le Dr Allen)
Il apparaît évident, d’après les résultats de cette étude, qu’un certain nombre de
facteurs se combinent pour rendre le transfert d’embryon entre équidés sauvages et
domestiques possible d’un point de vue pratique : la capacité des Equidés à amener à terme
des conceptus extraspécifiques ; la facilité et la sécurité d’utilisation du mélange étorphine et
acépromazine ainsi que de la diprénorpine pour induire des narcoses répétées et des réveils
rapides chez les donneuses ; la relative simplicité et le succès des récoltes non chirurgicales
d’embryons chez ces donneuses sédatées ; et enfin l’utilisation d’analogues de la
prostaglandine pour induire une lutéolyse prématurée et un retour en œstrus rapide des
donneuses, augmentant ainsi les opportunités de récolte d’embryons dans une saison de
reproduction. (Kydd et al., 1985)
Les limites de la technique incluent les difficultés du diagnostic du moment de
l’ovulation chez les donneuses (la synchronisation de l’ovulation utilisée lors de la première
expérience et non lors de la deuxième, permet de résoudre en partie ce problème)et de
l’inefficacité des traitements à base de gonadotrophine exogène à stimuler une superovulation
chez les femelles d’équidés. Cependant, en dépit de ces inconvénients, les résultats de cette
expérience indiquent qu’il est possible de récupérer six à huit embryons par an d’une
124
donneuse fertile mise en présence d’un étalon actif et fertile. On peut alors espérer un taux de
gestation de 60% suite au transfert chirurgical chez une jument domestique synchronisée.
(Kydd et al., 1985) Ceci permettrait d’obtenir 2 à 4 naissances de poulains vivants par jument
lors d’une saison de reproduction. (Hearn et Summers, 1986)
Les taux de gestation initiaux sont très élevés aussi bien pour les embryons de cheval
de Przewalski que pour les embryons de zèbres transférés chez des juments domestiques. Ils
sont similaires à ceux obtenus lors des transferts interspécifiques réciproques entre âne et
cheval et lors de transferts intraspécifiques chez le cheval. (Summers et al., 1987)
Le taux assez élevé de perte de gestation précoce qui est observé à la fois chez les
ponettes et chez les ânesses est difficilement explicable. La présence d’embryons à l’examen
échographique n’a pas été observée avant leur disparition chez aucun des deux conceptus de
cheval de Przewalski qui ont été perdus avant J40. Il semble donc probable que ces deux
conceptus étaient en fait constitués uniquement d’une vésicule trophoblastique, des
dommages irréversibles ayant été causés à la masse cellulaire interne au moment de la récolte
et du transfert de l’embryon. (Kydd et al., 1985)
Le conceptus de cheval de Przewalski et les deux conceptus de zèbre perdus entre J53
et J101 pourraient ne pas avoir réussi à s’implanter correctement. Ces conceptus
xénogéniques pourraient également avoir provoqué une réponse de rejet immunitaire à
médiation cellulaire généralisée de la part de la mère.
L’ânesse et la jument receveuses qui ont avorté de foals zèbres bien développés et
proches du terme, ont montré toutes les deux des signes de polyarthrite avant l’avortement et
présentaient également de hautes concentrations de complexes antigène-anticorps dans le sang
périphérique à la même période. (Allen, 1992)
Il n’a pas été possible de déterminer exactement la réactivité croisée du sérum antiPMSG utilisé dans le test d’inhibition de l’hémagglutination contre les extraits purifiés de
PMSG de cheval de Przewalski et de zèbre. Cependant, tout porte à croire que la méthode de
dosage permet d’obtenir une image assez précise du taux de sécrétion de PMSG, et donc
également du niveau et de la durée du développement des cupules endométriales, dans les
différents types de gestations interspécifiques examinés au cours de l’étude. En effet, le sérum
de femelle zèbre gestante donne une courbe de la réponse en fonction de la dose parallèle à
celle obtenue avec du sérum de jument gestante lors de ce dosage. De plus, les juments
125
portant des conceptus de cheval de Przewalski présentent des profils de concentrations de
PMSG similaires à ceux des juments à gestation intraspécifique. Enfin, les ânesses portant des
conceptus de zèbre et les zèbres portant des gestations intraspécifiques présentent des pics de
concentrations sériques en PMSG semblables à ceux mesurés lors de gestation intraspécifique
chez l’âne.
On remarque que la période de la gestation (J36 à J53) au cours de laquelle la PMSG
est détectable dans le sérum des trois juments portant des conceptus de zèbre est très brève.
De plus l’activité de la PMSG dans le sérum des deux ânesses portant des conceptus de zèbres
et dans celui de certaines juments portant des conceptus de cheval de Przewalski disparaît
prématurément. Tout ceci suggère le développement d’une réaction maternelle cytotoxique à
médiation cellulaire de forte intensité contre les cellules des cupules endométriales dans les
deux espèces de mères hôtes. En outre, les niveaux extrêmement bas d’activité de la PMSG
mesurés chez les juments portant des conceptus de zèbres laissent supposer que seulement une
très faible quantité du tissu de la ceinture chorionique de zèbre a envahi avec succès
l’endomètre de la jument hôte, dans le but de former les cupules endométriales sécrétant la
PMSG, aux alentours de J36. On peut s’attendre à une augmentation de la réponse à
médiation cellulaire contre les cupules endométriales aux vues de l’augmentation marquée de
cette réaction observée chez les juments portant des conceptus de mule. Le développement
minimal des cupules endométriales chez le cheval portant un conceptus de zèbre ressemble
également à la situation observée chez les chevaux portant des conceptus d’âne. Les cupules
endométriales sont alors absentes, comme nous l’avons vu, en raison de l’échec complet de la
ceinture chorionique de l’âne à envahir l’endomètre de la jument. On remarque à nouveau à
quel point l’environnement utérin exerce une grande influence, à la fois sur le développement
de la ceinture chorionique des Equidés et sur ses propriétés d’invasion. (Summers et al., 1987)
Ces données sont résumées dans le Tableau 12.
126
Tableau 12 : Développement des cupules endométriales et survie fœtale lors de
gestations intraspécifiques, hybrides et interspécifiques chez les Equidés, d’après Allen
et al. (1987)
Génotype foetal
Développement et
Caryotype fœtal :
durée de vie* des
Génotype de la
caryotype
cupules
mère
maternel (2n= )
endométriales
Devenir de la
gestation
Accouplement intraspécifique
Cheval
Ane
Zèbre de Grant
Cheval
Ane
Zèbre de Grant
64 : 64
62 : 62
46 : 46
+++
+
+
L
L
L
Terme
Terme
Terme
Cheval
Ane
63 : 64
63 : 62
+
++++
C
L
Terme
Terme
Accouplement hybride
Mule
Bardot
Transfert d’embryon interspécifique
Terme
Terme
Terme
Terme
Terme
Terme
80% d’avortement
─
à J80-J95
*Les cupules endométriales persistent pour : L > 60 jours ; C = 15 à 30 jours ; TC < 10 jours.
Cheval de Przewalski
Cheval
Cheval
Ane
Zèbre de Grant
Zèbre de Grant
Ane
Cheval
Ane
Mule
Mule
Ane
Cheval
Cheval
66 : 64
64 : 62
64 : 63
62 : 63
46 : 62
46 : 64
62 : 64
++
++++
+++
+
+
±
L
L
L
L
C
TC
Nous constatons à nouveau que les caractéristiques des cupules endométriales varient
largement selon les types de gestations. Cela concerne la quantité de tissu des cupules qui se
développe, comme cela est démontré par les concentrations sériques en PMSG qui reflètent la
largeur et le développement en général de la ceinture chorionique ainsi que sa capacité à
envahir l’endomètre. La durée de vie des cupules varie également, ceci est démontré par la
durée d’activité de la PMSG dans le sérum et pourrait refléter l’intensité et le succès de la
réaction leucocytaire maternelle dans l’accélération de la mort des cupules.
Il apparaît également que le génome paternel exerce une influence marquée sur la
croissance de la ceinture chorionique de la progéniture, et donc sur la quantité de tissu des
cupules endométriales qui se développe après l’invasion, comme nous l’avions déjà vu
précédemment. Quels que soient les changements de l’environnement utérin suite au transfert
d’embryon, la ceinture chorionique qui se développe sur le conceptus est plus large et plus
active lorsque le père est un cheval ou un cheval de Przewalski que lorsque le père est un âne
ou un zèbre de Grant.
127
Cependant, malgré ces variations importantes, tout conceptus qui engendre un
quelconque degré de développement des cupules endométriales dans l’utérus maternel semble
capable de s’implanter normalement et d’évoluer correctement jusqu’au terme. (Allen et al.,
1987)
Malgré le faible développement des cupules endométriales chez les juments portant
des conceptus de zèbres, une quantité suffisante de tissu envahit l’endomètre pour stimuler la
formation d’anticorps lymphocytotoxiques chez les trois animaux. (Summers et al., 1987) Or,
nous avons vu la fonction immunologique importante du développement endométrial dans le
maintien de la gestation chez les Equidés. Celui-ci fournirait le stimulus nécessaire à la mise
en place, par le système immunitaire de la mère, de différents mécanismes permettant
l’immunoprotection du fœtus comme nous l’avons montré plus tôt. (Allen, 1982b)
La gestation chez le zèbre est en général 25 à 40 jours plus longue que chez le cheval
domestique. Le fait que la gestation soit prolongée de cette même durée lors des deux
gestations de zèbre chez le cheval confirme l’hypothèse selon laquelle c’est le fœtus, suite au
développement de l’axe hypothalamo-adréno-pituitaire, qui contrôle le moment de la
parturition. Cette hypothèse est confortée par le fait que lors des gestations interspécifiques
réciproques entre Bos indicus et Bos taurus, deux espèces de bovins à durée de gestation
différentes, c’est également le génotype du fœtus et non de la receveuse qui influence la durée
de la gestation. (Summers et al., 1987)
Ces transferts interspécifiques d’embryons pourraient donc bien constituer une aide
pour l’élevage des équidés sauvages en captivité. (Hearn et Summers, 1986) Ils permettraient
d’augmenter le potentiel reproducteur de ces animaux dont le nombre d’individus est parfois
très faible. Le cheval de Przewalski est ainsi l’objet de programmes de réintroduction après
avoir vu le nombre d’individus en captivité diminuer à moins de 500. Chez les zèbres, nous
avons vu que plusieurs espèces sont menacées. Ces espèces pourraient largement bénéficier
de l’utilisation de ces techniques. (Kydd et al., 1985) On pourrait ainsi utiliser le transfert
d’embryon interspécifique pour augmenter la taille d’un troupeau d’équidés sauvages mais
surtout pour augmenter le nombre de descendants d’une lignée génétique rare. (Summers et
al., 1987)
128
Nous avons démontré que la plupart des transferts interspécifiques qui ont été tentés
chez les Equidés présentent un taux de réussite relativement élevé. L’exemple du transfert
d’embryon d’âne chez le cheval (caractérisé par une incapacité à former des cupules
endométriales et donc associé à un taux de gestation très faible) doit cependant être pris en
compte car le phénomène pourrait se reproduire lors de la mise en pratique des transferts
d’embryons interspécifiques chez les Equidés sauvages.
On peut ainsi supposer que le transfert d’embryons d’ânes sauvages chez le cheval
aboutirait à un faible taux de gestation.
Ceci ne remet cependant pas en cause la technique et démontre uniquement la
nécessité d’études plus poussées concernant la formation des cupules endométriales lors de
ces transferts interspécifiques.
129
IV. Difficultés
techniques
de
d’utilisation
et
reproduction
perspectives
assistée
chez
des
les
équidés sauvages
Après nous être intéressés aux divers intérêts et possibilités de mise en œuvre des
techniques de reproduction assistées chez les équidés sauvages nous allons envisager dans
cette dernière partie les facteurs limitant leur utilisation. Enfin, dans un deuxième temps, nous
aborderons des techniques nouvelles qui pourraient se révéler utiles dans le futur.
A. Facteurs limitants et inconvénients de ces techniques
A ce jour, un seul programme complet de reproduction assistée a été mis en place et
fonctionne. Il s’agit du plan de préservation du Mouflon européen débuté en 2000 en
Sardaigne. (Ptak et al., 2002) La plupart des gestations réussies grâce à la reproduction
assistée chez les différentes espèces ont été des événements uniques. (Wildt, 1991)
Ainsi l’utilisation de l’insémination artificielle ou du transfert d’embryons formés in
vivo ou par FIV pour augmenter une population est restée sporadique. De plus, les techniques
de manipulation embryonnaire, malgré une publicité considérable, n’ont eu d’impact
mesurable sur les efforts de conservation chez aucune espèce. (Loskutoff et Betteridge, 1992)
Ainsi, chez les Equidés, la technique du transfert d’embryon interspécifique n’a, à ce jour,
jamais été appliquée dans le cadre d’un programme de reproduction assistée chez des
individus sauvages.
Nous avons divisé ces facteurs limitants en quatre catégories. Tout d’abord, nous
étudierons ceux liés à la variabilité de la gestation entre les différentes espèces. Puis nous
verrons les différentes causes d’échec de la gestation. Nous aborderons ensuite les limites
liées au faible nombre d’individus disponibles et enfin celles n rapport avec les règlements et
supports institutionnels.
130
1. Variabilité
de
la
reproduction
d’un
point
de
vue
physiologique, anatomique et comportemental
Pour être un succès, la production de nouveaux individus grâce aux techniques de
reproduction assistée nécessite, dans un premier temps, une meilleure connaissance de base de
la biologie de la reproduction chez les différentes espèces car les données sont souvent
limitées. (Comizzoli et al., 2000) Dans le cas particulier des équidés sauvages il existe très
peu d’études concernant la physiologie de la reproduction, et bien que le cheval domestique
semble constituer un bon modèle, les connaissances nécessitent d’être approfondies dans ce
domaine. (Moehlman, 2002)
Des stratégies très variées sont utilisées chez les différentes espèces de Mammifères
pour le contrôle de l’ovulation et de la gestation, c’est le cas par exemple des corps jaunes
secondaires développés par les Equidés lors de la gestation. Des variations existent également
en ce qui concerne les processus de régulation au sein d’un même genre (durée du cycle
œstral par exemple). En plus de ces variations physiologiques, les ovocytes, les
spermatozoïdes, les embryons et les cellules des différentes espèces nécessitent
habituellement des milieux nutritifs différents pour la culture in vitro. Pour la plupart des
espèces menacées ces milieux n’ont pas encore été définis. (Comizzoli et al., 2000)
Chez les espèces sauvages les méthodes invasives ne peuvent être utilisées pour le
suivi du cycle œstral. L’existence de méthodes de suivi endocrinologique non-invasives
influence donc le succès des programmes d’élevage. (Comizzoli et al., 2000)
L’analyse des métabolites des stéroïdes dans les fèces a été utilisée pour estimer le
taux de gestation de troupeaux sauvages ou pour déterminer le statut reproducteur des mâles
et des femelles dans diverses espèces. (Comizzoli et al., 2000) Cette procédure a été
développée chez des juments sauvages pour le diagnostic de gestation mais aussi pour le
diagnostic de la cryptorchidie chez l’étalon. Chez la jument, la détection du pic d’œstrogènes
pré-ovulatoire est par contre plus difficile avec cette technique. (Schwarzenberger et al.,
1996) Le cycle ovarien peut également être suivi par analyse des stéroïdes et peptides dans
l’urine. (Comizzoli et al., 2000) Ce type de suivi hormonal par récolte d’échantillons d’urine
est utilisé chez le cheval de Przewalski. (Wildt, 1991) Le dosage des stéroïdes hormonaux
dans les fèces et l’urine a également été validé chez le zèbre de Grévy. (Moehlman, 2002)
Ces méthodes représentent un espoir considérable pour la gestion de la reproduction chez des
131
espèces sauvages qui sont trop indociles, nerveuses ou inaccessibles pour être étudiées grâce à
des échantillons sanguins. (Hearn, 1986)
L’échographie peut être utilisée chez certains animaux. (Comizzoli et al., 2000) Elle
est d’ailleurs utilisée par voie transrectale chez les équidés sauvages. Elle a notamment permis
l’étude du cycle œstral chez le cheval de Przewalski, bien qu’elle nécessite que les animaux
soient anesthésiés et placés en décubitus latéral. (Durrant et al., 1986) Elle est utilisée
également chez un grand nombre d’autres espèces et ses applications sont très variées
(détermination du statut reproducteur chez la femelle, collecte de semence chez le mâle, IA,
transfert d’embryons…). (Hildebrandt et al., 2000)
En ce qui concerne l’IA, il est important de connaître précisément le site approprié
pour déposer la semence ainsi que le moment idéal où elle doit être réalisée au cours de
l’œstrus. La solution la plus facile dans ce cas est de contrôler la fonction ovarienne,
malheureusement les préparations à base de gonadotrophine ne sont pas efficaces chez toutes
les espèces.
L’IA nécessite également la cryopréservation de la semence ; les techniques sont très
bien établies chez les ruminants domestiques mais moins bien chez les Equidés. Ces
techniques devront donc être adaptées aux différentes espèces sauvages, les exigences
physico-chimiques étant différentes d’une espèce à l’autre (tolérance différente à la
concentration de glycérol par exemple). (Comizzoli et al., 2000)
Pour le transfert d’embryons, il est également nécessaire d’utiliser la cryopréservation
afin de pouvoir stocker à long terme les embryons, les transporter et les conserver comme
banque de données génétiques. (Summers, 1986)
De même, en ce qui concerne la FIV, il existe deux facteurs limitants concernant la
semence qui sont la qualité du sperme (structure et motilité) (Wildt et al., 1992) et la méthode
de préparation du sperme pour la fécondation (Loskutoff et Betteridge, 1992). De plus, en ce
qui concerne la culture d’embryons, les conditions optimales devront sans doute être
développées espèce par espèce. (Loskutoff et Betteridge, 1992)
Pour toutes les espèces il existe également des contraintes liées à l’anatomie (petite
taille par exemple). (Comizzoli et al., 2000)
Chez les espèces sauvages, le comportement sexuel et social joue également un rôle
clé dans l’application des techniques de reproduction assistée (infertilité chez les animaux non
132
dominants par exemple). La captivité elle-même peut également induire des troubles
physiologiques ou comportementaux. La reproduction peut également être un échec en raison
d’une incompatibilité sexuelle entre les individus.(Comizzoli et al., 2000) Ce cas s’est produit
lors de l’expérience de transfert d’embryons de cheval de Przewalski puisque le premier
étalon utilisé s’est montré agressif envers les juments. (Kydd et al., 1985)
2. Echec de la mise en place de la gestation
Il est supposé que les gestations induites de manière artificielle échouent souvent en
raison d’un échec du signal entre l’embryon et la mère. Après une intervention sur la
reproduction, le développement respectif de l’utérus et du conceptus pourrait devenir
asynchrone. Ceci pourrait être lié soit à une synchronisation fœto-maternelle insuffisante au
moment du transfert de l’embryon, soit aux effets néfastes des procédures de manipulation du
conceptus.
On suppose que les manipulations artificielles de l’embryon pourraient réduire sa
capacité à sécréter les signaux de reconnaissance de la gestation. (Bainbridge et Jabbour,
1998) Ainsi, il a été mis en évidence chez les bovins domestiques et sauvages que le taux de
réussite de la gestation après transfert d’embryon (intra ou interspécifique) est nettement
diminué lorsque l’embryon a été produit par FIV. (Loskutoff, 1999)
Lors de transfert d’embryon interspécifique, la compatibilité biologique entre le
trophoblaste de l’embryon et l’endomètre utérin reste un facteur limitant de l’utilisation de
cette technique. (Wildt, 1991)
La supplémentation en interféron s’est montrée efficace pour empêcher la lutéolyse
chez les bovidés et les cervidés. L’utilisation des interférons pourrait donc permettre
d’améliorer les taux de gestation après IA, transfert d’embryon ou FIV chez les ruminants
non-domestiques. Cependant des recherches plus poussées sont nécessaires afin d’identifier
les facteurs de reconnaissance de la gestation dans les autres groupes de Mammifères, dont les
Equidés. (Bainbridge et Jabbour, 1998)
3. Faible nombre d’individus disponibles
Nous avons vu que lors de la mise en place d’un programme d’élevage, le nombre
d’animaux fondateurs devrait être aussi grand que possible pour augmenter la diversité
133
génétique. Les animaux chez lesquels la collecte est problématique ou dont les gamètes sont
difficiles à conserver ou à transférer, ou encore les individus dispersés géographiquement, ne
doivent pas être écartés de ces programmes. L’adaptation de moyens techniques tels qu’un
incubateur portable ou un laboratoire mobile pourrait permettre de résoudre le problème du
temps écoulé entre la récolte des gamètes et leur traitement. (Comizzoli et al., 2000)
La faible disponibilité en matériel génétique est un facteur limitant majeur dans l’étude
de la physiologie de la reproduction et la mise en place de techniques de reproduction assistée
adaptées chez les espèces menacées. (Comizzoli et al., 2000) Ce problème est d’autant plus
important que les espèces nécessitant le plus de recherches et le plus rapidement possible sont
en général celles représentées par un très faible nombre d’individus. (Wildt et al., 1986)
Les données rétrospectives sont souvent clairsemées et les opportunités de recherche
limitées. Un autre moyen de résoudre ce problème pourrait être l’utilisation d’une espèce très
proche non menacée comme modèle pour l’étude des paramètres physiologiques et
l’élaboration de techniques comme cela a été fait pour le transfert d’embryon interspécifique
chez les Equidés. (Comizzoli et al., 2000)
Le transfert d’embryon interspécifique est ainsi une technique clé dans la conservation
des espèces menacées. Cependant, même si le traitement à l’aide d’interféron peut réduire les
pertes dues à l’asynchronie entre l’embryon et la mère receveuse, la barrière immunologique
reste un obstacle majeur lors de gestation interspécifique. (Comizzoli et al., 2000) En dépit
des succès rapportés, un grand nombre d’échecs ont été relatés avec cette technique.
(Loskutoff, 1999)
De plus, des études plus poussées sont nécessaires afin d’analyser les préférences
sexuelles des animaux nés après transfert d’embryon interspécifique. (Comizzoli et al., 2000)
En effet, il n’existe quasiment aucune donnée concernant la croissance et le
développement des animaux sauvages produits par transfert d’embryon interspécifique. On
sait cependant que les jeunes mouflons élevés par des brebis se montrent dociles tant qu’ils
sont maintenus avec leur mère hôte mais que ce comportement est réversible. En effet, une
fois réintroduits parmi leurs congénères, ces jeunes assimilent la peur et le comportement
d’aversion lié à leur espèce.
Très peu d’attention a également été portée à la relation comportementale entre la
progéniture et sa mère hôte. Il a pourtant été démontré que la relation entre le jeune et sa mère
134
est déterminante chez la plupart des espèces de Mammifères, en particulier celles où le jeune
est mobile et où les individus sont organisés en groupes sociaux, ce qui est le cas des ongulés.
L’attachement mère-jeune va permettre à ce dernier de développer ses prédispositions à
devenir un adulte socialement et sexuellement adapté à son groupe social et à son espèce.
Cette relation nécessite pour se mettre en place que les deux individus soient réceptifs
d’un point de vue physiologique et comportemental au fait, respectivement, d’exprimer un
comportement maternel et de le recevoir.
Il a également été démontré qu’un jeune a tendance à s’identifier à l’espèce de
l’individu qui l’a pris en charge en premier. Dans le cas où l’identification se ferait envers
l’espèce de la mère hôte, cela pourrait sérieusement remettre en cause la formation de la
génération suivante.
Il est donc nécessaire que la mère hôte et le jeune soient tous deux réceptifs, au
moment adapté du développement ontogénétique, aux stimuli sensoriels et comportementaux
émis par l’autre individu. Ceci ne peut se faire que par l’étude de la mise en place des liens
d’attachements maternel et filial chez les différentes espèces. Cette concordance devra
également être prise en compte pour le choix de l’espèce hôte.
Il serait également très important de déterminer le moment idéal auquel le jeune doit
être réintroduit avec ses congénères afin de lui permettre de s’y intégrer et d’être accepté.
(Gibbons et Durrant, 1987)
4. Règlements et supports institutionnels
En plus des facteurs limitants pratiques et techniques, les contraintes institutionnelles
et économiques doivent également être considérées. Bien que la CITES joue un rôle
déterminant dans la conservation des espèces, les règlements créent parfois de nouveaux
problèmes aux défenseurs de l’environnement en limitant les possibilités d’acquisitions
d’animaux nécessaires pour maintenir les programmes traditionnels d’élevage en captivité.
(Comizzoli et al., 2000)
De plus, l’importation d’embryons et les stratégies de cryostockage ne sont
actuellement pas clairement définies pour les espèces sauvages. (Comizzoli et al., 2000) Les
règles définissant les déplacements d’embryons d’espèces non domestiques sont en train de se
mettre en place. Les embryons doivent être manipulés et lavés conformément aux standards
135
de l’IETS (International Embryo Transfer Society) existants. De plus, des critères stricts sont
mis en place en ce qui concerne le dépistage des maladies chez les animaux donneurs, avant,
pendant et après la récolte des embryons ou des gamètes. (Loskutoff et al., 1995) Ces
procédures doivent être supervisées par un vétérinaire officiel et complétées par un examen
physique des animaux donneurs. Les données existantes concernant les espèces domestiques
et certaines espèces sauvages seront utilisées de façon à réduire les études nécessaires à la
mise en place de ces directives. (Schiewe et al., 1995)
Les supports institutionnels sont importants, cependant il arrive que les espèces à
sauver soient choisies en fonction de divers intérêts (politiques, culturels, économiques)
parfois sans que le contrôle des biologistes puisse s’exercer. (Comizzoli et al., 2000) De plus,
un grand nombre de zoos sont financés de façon privée et les supports financiers
institutionnels pour la recherche zoologique sont bien souvent trop limités pour permettre des
avancées rapides de la recherche. Cependant, la popularité des programmes de préservation
des espèces menacées pour le grand public pourrait inciter des investissements privés. (Wildt
et al., 1986)
La stratégie la plus intéressante afin de limiter à la fois les coûts et la consanguinité est
celle qui associe à la fois la cryopréservation de semence et un troupeau d’élevage.
Les questions à se poser sont : quelles stratégies d’intervention auront les effets désirés
dans une situation précise, quel est le rapport coût/bénéfice ? Bien que le transfert d’embryon
ou l’IA ne soient pas les méthodes les plus efficaces pour propager rapidement une petite
population, elles peuvent parfois être plus appropriées que des techniques sophistiquées.
(Comizzoli et al., 2000)
Il est avant tout important de rappeler que les techniques de reproduction assistée et les
banques de données génétiques ne peuvent être réellement utiles à la conservation des espèces
que si des objectifs clairs avec un but précis sont préalablement définis. (Wildt, 1992)
Les techniques de reproduction assistée deviennent une méthode de gestion de plus en
plus importante pour la conservation des espèces sauvages. Cependant il apparaît évident que
les bénéfices les plus intéressants de ces techniques seront dans la gestion génétique des
populations stables plutôt que dans la propagation des espèces menacées. Le transfert
d’embryons interspécifique est un concept excitant et attractif, pourtant, historiquement, il a
abouti à davantage d’échecs que de succès. Cependant, en poursuivant les recherches et en
136
améliorant les connaissances dans le domaine de la physiologie de la reproduction chez les
différentes espèces, peut-être pouvons-nous espérer améliorer l’utilisation de cette technique
pour la sauvegarde des espèces rares ou menacées. (Loskutoff, 1999)
B. Applications futures
Le “assisted hatching” ou “éclosion assistée”, la bissection d’embryon, le sexage des
spermatozoïdes ou des embryons ne sont pas utilisés de routine chez les espèces domestiques.
Il n’existe actuellement aucune référence chez les espèces menacées. Cependant, la ICSI
pourrait être une alternative utile à la FIV chez les espèces menacées lorsque aucun
spermatozoïde mobile ne peut être obtenu sur des cadavres. Ce type de technique est
maintenant réalisé chez les Equidés. (Comizzoli et al., 2000)
La production de vrais jumeaux par micromanipulation d’embryons a également été
réalisée avec succès chez le cheval domestique, à titre expérimental mais il s’agit d’une
technique lourde dont le taux de réussite est tout de même limité. (Allen et Pashen, 1984)
La restauration des espèces par transfert d’un noyau de cellule somatique dans un
ovocyte receveur énucléé a déjà été envisagée. Le clonage pourrait également être utile chez
les espèces qui ne se sont jamais reproduites en captivité.
La préservation des lignées germinales (mâle et femelle) par transplantation chez une
souris SCID (immunodéficiente) pourrait également être une alternative intéressante lors de la
mort d’un animal de valeur. (Comizzoli et al., 2000)
Nous abordons ici deux techniques particulières qui seront peut-être utilisées plus
largement dans le futur : l’étude du contenu génétique des gamètes et embryons et l’utilisation
du clonage pour la conservation des espèces.
1. Etude du contenu génétique des gamètes et embryons
La gestion génétique des petites populations nécessite que les embryons soient
produits en fonction des décisions prises concernant le pedigree et la constitution génétique
qui est désirée pour les animaux d’origine. Ainsi, la constitution génétique d’un embryon de
mammifère au stade précoce peut être déterminée par amplification de l’ADN d’une seule
cellule en utilisant la Polymerase Chain Reaction (PCR) sans affecter la capacité de
137
l’embryon à se développer. Il pourrait donc être possible de sélectionner les embryons en
fonction d’un génotype recherché.
Cependant il pourrait se révéler très difficile de classer les génotypes comme
bénéfique ou délétère puisque la fonction de la majorité des allèles maintenus dans les
populations sauvages est inconnue. Ainsi il serait préférable de supposer qu’une espèce
captive porte les allèles nécessaires pour lui permettre de survivre à l’état sauvage et qu’une
sélection artificielle sur la base du génotype pourrait se montrer néfaste.
Une exception à cette règle est l’héritabilité du chromosome X ou Y. Nous avons
suggéré plus tôt que les fluctuations aléatoires du sex-ratio des portées pouvaient
compromettre sévèrement le succès des programmes d’élevage. Il pourrait donc être
intéressant de sélectionner les spermatozoïdes ou les embryons en fonction du chromosome
sexuel sans autre considération.
Une seconde exception à la non-sélection concerne les gènes du CMH. Il a été
démontré qu’un grand nombre d’allèles est maintenu pour chaque locus du CMH dans
beaucoup de populations d’animaux sauvages. Ceci pourrait constituer une forme de
protection contre l’exposition à de nouveau pathogènes. On peut donc penser qu’une certaine
vigilance doit être maintenue afin de s’assurer qu’aucun allèle du CMH ne soit perdu durant
les programmes de reproduction assistée. (Bainbridge et Jabbour, 1998)
2. Clonage et conservation des espèces
Le clonage est un des nombreux moyens d’augmenter le nombre d’individus d’une
population. (Holt et al., 2004) La technique consiste à fusionner des ovocytes receveurs
énucléés avec des cellules somatiques grâce à l’utilisation du virus Sendai, de l’électrofusion
ou en injectant directement le noyau de la cellule somatique dans le cytoplasme receveur.
(Squires et al., 2003)
Nous avons vu que l’un des principaux buts des techniques de reproduction assistée
est d’éviter l’apparition d’une dépression de consanguinité par la généralisation de certains
allèles délétères. (Holt et al., 2004)
Les populations représentées par un faible nombre d’individus possèdent une
variabilité génétique peu importante. Il est donc important dans ce cas d’éviter toute perte de
diversité, or cette perte survient à partir du moment où n’importe quel individu ne prend pas
138
part à la reproduction. Si le succès du clonage était garanti à 100%, une stratégie intéressante
pourrait être de cloner chaque individu (ce qui ne serait pas impossible dans de très petites
populations) et ensuite permettre à cette progéniture de s’accoupler naturellement. Le risque
de perte de la diversité génétique serait alors réduit, particulièrement s’il existe plus de 2
copies de chaque individu au départ.
Cependant, les taux de succès actuels du transfert nucléaire sont très bas (moins de 0,1
à 5% des embryons fabriqués aboutissent à la naissance d’un animal vivant).
Ceci montre combien l’idée d’appliquer les techniques du clonage aux espèces
menacées est utopique étant donné l’avancée actuelle des connaissances dans ce domaine.
Cependant, on ne peut négliger l’utilisation qui pourrait en être faite sur des populations plus
importantes, permettant ainsi d’obtenir davantage de naissances. Le meilleur moyen
d’optimiser le succès de cette technique serait d’utiliser des espèces à poly-ovulation avec des
portées nombreuses. Ceci assurerait qu’un minimum de conceptus soient viables afin
d’assurer la gestation jusqu’au terme. Ceci exclut de nombreux grands Mammifères, dont bien
sûr les Equidés.
Le faible taux de gestation actuellement associé au clonage ne peut pourtant pas
constituer une justification au fait de ne pas utiliser cette technique étant donné les progrès qui
ont déjà été faits dans ce domaine, en particulier chez les ongulés. Mais, étant donné que de
nombreux défenseurs de l’environnement sont encore réticents vis-à-vis des techniques de
reproduction assistée, il est peu probable que le clonage soit facilement accepté.
Une autre objection pratique à l’utilisation du clonage dans la conservation des
espèces, comme dans le cadre des autres techniques de reproduction assistée, est le manque
crucial d’informations concernant la physiologie de la reproduction chez les espèces
menacées. Dans la plupart des cas, il n’existe pas de protocole efficace d’induction du
recrutement des ovocytes, de leur développement et maturation. Lorsque des efforts ont été
faits pour développer de tels protocoles, il s’agit en général de projets beaucoup plus
complexes que ce qui avait été envisagé au départ. De plus les recherches sont engagées
lentement et à une échelle restreinte car, étant menacés, les animaux ne sont pas disponibles
pour ces recherches.
Les questions concernant la viabilité et la santé de la progéniture résultant du clonage
devront encore être explorées. Cependant, dans la plupart des cas ces projets sont difficiles à
139
mener à moins que l’espèce en question soit particulièrement inhabituelle et que son étude
puisse apporter de nouvelles connaissances scientifiques.
Actuellement, un des principaux défauts de la technique de transfert nucléaire est la
possibilité que la progéniture résultante présente un certain degré d’anormalité en ce qui
concerne le développement. Ceci inclut un allongement de la gestation, une augmentation du
poids à la naissance, une formation inadéquate du placenta et des anomalies histologiques de
la plupart des organes, y compris les reins, le cerveau, le système cardio-vasculaire et les
muscles. Ces effets sont attribués à un “reprogrammage” inefficace de l’ADN nucléaire, un
processus qui survient naturellement durant la gamétogenèse et le développement précoce et
qui détermine si certains gènes sont exprimés par les chromosomes maternels ou paternels.
Malgré tout, les arguments en faveur des programmes de clonages sont variés. Les partisans
de ces techniques citent souvent le déclin massif des espèces qui survient actuellement et
recommandent de mettre en œuvre n’importe quelle action qui pourrait inverser la tendance.
Dans la même logique que les banques de gamètes et d’embryons, de nombreux
groupes internationaux ont élaboré des banques de tissus et lignées cellulaires congelés. Une
attention considérable devrait cependant être portée à la contribution génétique directe que les
animaux produits grâce à ce matériel pourront apporter à une population. Le reprogrammage
inadéquat de l’ADN et les anomalies phénotypiques pourraient réduire, plutôt que supporter,
les aptitudes de l’ensemble de la population.
Cependant, chez certaines espèces, ces phénotypes anormaux ne sont pas transmis à la
génération suivante. Cette observation permet de défendre le clonage comme outil de
conservation.
Etant donné que le degré d’occurrence des anomalies à la première génération varie en
fonction des espèces, la valeur potentielle du clonage pour la conservation pourrait être
également spécifique d’espèce. Pour les espèces les plus menacées cet argument théorique est
insoutenable d’un point de vue pratique car les recherches initiales nécessaires pour établir
l’absence de ces anomalies de première génération ne pourraient être entreprises. Cependant,
cet argument n’empêche pas la création de banques de cellules et de tissus pour les espèces
sauvages, dans l’espoir que les techniques s’améliorent dans les années à venir.
Plusieurs tentatives de clonage d’espèces sauvages ou menacées ont été menées et ont
fait l’objet d’une large publicité (il s’agit du gaur, du banteng et du bouquetin des Pyrénées).
140
La caractéristique particulière de ces exemples est l’utilisation du clonage trans-spécifique.
Dans ces cas-là, le cytoplasme de l’ovocyte utilisé pour créer l’embryon provient d’une
espèce domestique proche. Les clones trans-spécifiques diffèrent inévitablement de chacune
des espèces parentales en ce qui concerne leurs caractéristiques nucléo-plasmiques. Ces
animaux ne seraient donc pas utiles directement pour la sauvegarde des espèces menacées.
Cependant, les clones mâles en âge de se reproduire ne transmettent pas leurs
mitochondries à la génération suivante. En théorie, il serait donc possible d’utiliser le clonage
trans-spécifique pour rétablir le génome d’une lignée génétique mâle de valeur particulière. Il
s’agirait là d’un usage très spécialisé et ciblé du clonage. (Holt et al., 2004)
En ce qui concerne les Equidés, il n’y a eu à ce jour aucune tentative de clonage chez
des espèces sauvages. Le clonage du cheval domestique est actuellement en développement.
Plusieurs laboratoires universitaires et commerciaux étudient activement l’utilisation des
techniques de transfert nucléaire pour la production de chevaux clonés. (Long et al., 2003) Le
premier représentant des Equidés à avoir été cloné était un mulet, en mai 2003. (Holden,
2003) La même année le laboratoire Cryozootech a cloné le premier cheval, Prométéa. En
février puis en mars 2005, deux autres clones ont été produits par ce même laboratoire, il
s’agit cette fois-ci du clone d’un hongre qui fut champion du monde d’endurance et de celui
d’un cheval de saut d’obstacle. (Cryozootech, 2005)
Comme chez les autres espèces, les problèmes de l’héritabilité des mitochondries et
des modifications épigénétiques se posent chez les Equidés. (Long et al., 2003)
Enfin, la presse a longuement évoqué l’intérêt que pourrait représenter le clonage pour
recréer des espèces éteintes. Bien que très attractive, l’idée que l’on pourrait cloner l’ADN
d’un mammouth laineux, d’un tigre de Tasmanie ou éventuellement d’un quagga relève à
l’heure actuelle de la science fiction. (Long et al., 2003)
Etant donné les progrès rapides des techniques de clonage, il semble essentiel
actuellement de se concentrer sur le développement de stratégies réalistes pour l’utilisation de
ces méthodes dans la conservation des espèces et de s’assurer que les ressources limitées sont
déployées là où elles seront le plus efficaces. (Holt et al., 2004)
La généralisation des programmes de reproduction assistée nécessite inévitablement
un support financier à long terme de la part des gouvernements et des institutions privées ainsi
141
qu’une poursuite des recherches fondamentales, comparatives et techniques de la part des
communautés scientifique et vétérinaire. (Bainbridge et Jabbour, 1998)
De plus, les espèces sauvages sont plus sensibles au stress que les espèces
domestiques, il est donc nécessaire de limiter la manipulation des individus. Les méthodes et
le matériel utilisés doivent être adaptés pour permettre de travailler dans des conditions
d’extérieur.
Partout dans le monde il existe des espèces menacées qui pourraient bénéficier de
programmes de conservation, cependant il est important de rappeler que les techniques de
reproduction assistée ne sont pas la seule solution pour la conservation des espèces.
L’éducation des populations et la préservation des habitats sont essentielles, et il est important
de se souvenir que toute espèce doit faire l’objet d’une action de conservation, même
lorsqu’elle n’est pas menacée. (Comizzoli et al., 2000)
142
CONCLUSION
Le zèbre est le seul Equidé sauvage bien connu et bénéficiant d'une image positive
auprès du grand public. La diversité des espèces de zèbre et jusqu'à l'existence des autres
espèces d'Equidés sauvages est en général méconnue. Pourtant, comme la plupart des genres
de Mammifères, celui des Equidés compte de nombreuses espèces menacées d'extinction si
des mesures de sauvegarde ne sont pas mises en place. Les techniques de reproduction
assistée sont assez largement utilisées chez les Equidés domestiques, leur adaptation aux
Equidés sauvages pourrait permettre d'établir des plans de reproduction plus efficaces.
Nous nous sommes intéressés à la technique de transfert d'embryons interspécifique et
à son intérêt dans le cadre d'un programme de reproduction assistée chez les Equidés
sauvages. Le transfert d'embryon est maintenant bien standardisé et utilisé chez le cheval
domestique. L'étude des différents transferts d'embryons interspécifiques réalisés chez les
Equidés domestiques a démontré le rôle fondamental des cupules endométriales dans la
réussite de la gestation. Le taux de réussite encourageant de ces transferts a permis
d'envisager l'utilisation de cette technique chez les Equidés sauvages. Le transfert d'embryons
de zèbre de Grant et de cheval de Przewalski chez le cheval domestique a abouti à la
naissance d'individus vivants chez les deux espèces. Malgré un taux de réussite assez faible et
la nécessité d'études plus poussées sur la formation des cupules endométriales, ces transferts
pourraient présenter un grand intérêt dans le cadre d'un programme de reproduction assistée.
Enfin, nous avons présenté les autres techniques de reproduction assistée et l'état
d'avancement de leur utilisation chez les Equidés sauvages.
Nous avons pu constater qu'en définitive aucun programme de reproduction assistée
n'a été développé chez les Equidés sauvages. En effet, les différentes techniques, bien que très
largement étudiées expérimentalement, ne sont actuellement pas étudiées sur le terrain et les
banques de données génétiques sont inexistantes. Le coût très élevé de ces techniques freine
notablement leur emploi. Nous ne pouvons qu'espérer que dans les années à venir des
supports financiers à long terme permettront de développer des programmes de reproduction
assistée, notamment pour des espèces peu médiatiques telles que les Equidés sauvages.
143
144
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APPORT DES TECHNIQUES DE REPRODUCTION ASSISTEE
DANS LE CADRE DE LA CONSERVATION DES EQUIDES
SAUVAGES : L’EXEMPLE DU TRANSFERT D’EMBRYONS
INTERSPECIFIQUE
Thèse Vétérinaire : Lyon, septembre 2005
RESUME :
Le processus actuel d’extinction des espèces animales nécessite désormais des
mesures de sauvegarde plus efficaces. Les équidés sauvages ne sont pas
épargnés par ce phénomène et l’utilisation des techniques de reproductions
assistée déjà développées chez leurs parents domestiques pourrait se révéler
utile à leur sauvegarde. Le transfert d’embryons interspécifique est une des
techniques utilisables dans le cadre d’un programme de reproduction assistée.
Les expériences réalisées chez les équidés domestiques puis sauvages montrent
un taux de réussite encourageant. Cependant de nombreux obstacles s’opposent
encore à l’utilisation de cette technique et des programmes de reproduction
assistée en général chez les équidés sauvages.
MOTS CLES :
- Equidés sauvages
- Transfert d’embryons
- Reproduction assistée
- Conservation d’espèces
JURY :
Président :
Monsieur le Professeur Jean-François GUERIN
1er Assesseur :
2ème Assesseur :
Monsieur le Professeur Stéphane MARTINOT
Madame le Professeur Mireille RACHAILBRETIN
DATE DE SOUTENANCE :
16 septembre 2005
ADRESSE DE L’AUTEUR :
9 Les Perles d’Azur
11 210 PORT la NOUVELLE
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