Fascicule de TD -Fichier PDF du Powerpoint

Intervenants :
K. Mandon ([email protected])
E. Boncompagni (bonc[email protected])
L. Dupont ([email protected])
TD de Microbiologie Générale
(MBG)
Croissance, Transformation Bactérienne et
Analyse de mutants
Université de Nice Sophia-Antipolis, Faculté des Sciences, LSV2

Apporter du papier semi-log
Problème 1.
A partir d'une culture d'Escherichia coli de 24 h, on inocule, à 4%, deux erlens contenant, pour l'un 25 ml de
milieu LB stérile, et pour l'autre, 25 ml de milieu M63 glucose stérile. Les suspensions sont alors placées dans
une étuve à 37°C sous agitation constante. Le tableau résume l'évolution des densités optiques à 600 nm (DO
600
)
des suspensions en fonction du temps. Complétez-le.
Temps (h) 0 2 3 4 5 6 7 8 9 10
DO (LB)
log (DOx100)
0,02 0,04 0,28 0,6 0,75 0,85 0,9 1,0 1,0 1,0
DO (M63)
log (DOx100)
0,02 0,02 0,04 0,08 0,14 0,22 0,35 0,48 0,63 0,7
Q1. Tracez les courbes de croissance de chacune des suspensions en précisant le choix de vos ordonnées.
Q2. Décrivez-en les différentes phases et calculez les paramètres de la croissance. Commentez les résultats
obtenus.
Q3. Sachant que une unité de D.O. correspond à 100 µg de protéines/ml et que 1 mg de protéines correspond à
10
10
bactéries, calculez la concentration cellulaire des suspensions en phase stationnaire.
Problème 2.
Une souche bactérienne capable d’utiliser le xylose comme seule source de carbone a été isolée. Afin de
mieux comprendre le métabolisme de ce sucre, des cinétiques de croissance sont réalisées en suivant la Densité
Optique à 600 nm en fonction du temps. Pour cela, une culture de cette souche est réalisée en milieu minimum
(MM) additionné de glucose comme seule source de carbone. Lors de la phase exponentielle de croissance, cette
suspension bactérienne sert à ensemencer 3 erlens contenant le même milieu minimum avec comme seule source
de carbone :
1) soit le glucose
2) soit le xylose
3) soit un mélange de glucose + xylose
Les résultats de la (DO
600
x10) en fonction du temps sont représentés dans le tableau ci-dessous :
Temps (heure)
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5
MM+
glucose+xylose
0,16 0,4 0,96 2,1 2,3 2,3 2,3 2,3 2,7 3,5 5,8 9,6 16 27 33 33
MM+
glucose
0,14 0,33 0,8 1,7 1,9 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
MM+
xylose
0,14 0,14 0,14 0,16 0,2 0,3 0,52 0,86 1,4 1,6 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7
Q1/ Tracez les 3 courbes de croissance sur le papier semi-log, sachant que 2cm=1h.
Q2/ Définir les limites des différentes phases de croissance sur les courbes MM+glucose et MM+ xylose.
Q3/ Comparez et expliquez les différences entre ces 2 courbes (existence ou non de certaines phases de
croissance, etc…).
Q4/ Calculez g et µ en MM+glucose et MM+xylose. Représentez g graphiquement.
Qu’en concluez vous ?
Q5/ Décrivez l’allure de la courbe MM+glucose+xylose.
Calculez graphiquement les temps de génération dans les deux phases linéaires de croissance de cette courbe.
Que concluez-vous quant au métabolisme de ces deux sucres dans cette souche bactérienne ?
DO
600

Problème 3.
Après 4 sous-cultures successives en milieu LB d’une souche d’E. coli, 4000 colonies ont été isolées.
Parmi ces colonies, 3895 réagissaient comme le clone A, et 1 comme le clone B, 1 comme le C et 1 comme le D.
Un représentant du clone A, ainsi que les clones B, C et D ont été mis en culture dans un milieu minimum M63
contenant du glucose. La croissance bactérienne est évaluée en mesurant à intervalles réguliers la densité optique
à 600 nm. Les résultats sont résumés dans le tableau ci-dessous :
Temps (h)
Souches 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0,15 0,16 0,17 0,20 0,28 0,40 0,56 0,80 1,00 1,10 1,20 1,20 1,20
B 0,15 0,15 0,16 0,16 0,14 0,14 0,17 0,15 0,14 0,15 0,15 0,16 0,15
C 0,15 0,14 0,15 0,14 0,16 0,15 0,14 0,15 0,17 0,17 0,15 0,14 0,14
D 0,15 0,17 0,15 0,14 0,16 0,16 0,15 0,17 0,16 0,16 0,15 0,16 0,17
- Tracez les courbes de croissance de chaque clone sur papier semi-log (1h=1 cm). Déterminez graphiquement le
temps de génération de la culture A et en déduire son taux de croissance.
- A 100 µl de la culture A prélevés à t=5 h, on ajoute 2,9 ml de M63. Cette suspension est diluée 10
5
fois par
dilution sérielle. 200 µl sont étalés, incubés 24h à 37°C et 18 colonies sont dénombrées.
Calculez le titre de la culture et le nombre de bactéries/ml pour une DO
600 nm
=1.
- Quel phénomène peut expliquer les résultats obtenus pour les clones B, C et D ?
- Les souches B, C et D sont repiquées sur milieu M63 glucose additionné de 3 des 4 acides aminés suivants :
thréonine, arginine, tyrosine ou méthionine. Les résultats des croissances obtenues après 24h d’incubation sont
les suivantes :
Souches milieu Thr
-
Milieu Arg
-
Milieu Tyr
-
Milieu Met
-
B + + - +
C + - + +
D - - + +
Donnez le phénotype de ces 3 souches.
- Une nouvelle culture de la souche C est effectuée dans un milieu M63 glucose additionné d’arginine. 30 ml de
cette culture C arrivée en phase stationnaire (DO
600 nm
=1,2) sont prélevés et centrifugés, puis le culot bactérien est
resuspendu dans 1 ml de M63. La totalité du culot est alors étalée sur milieu gélosé M63 glucose, sans arginine.
Après 48h d’incubation, on dénombre 7 colonies.
Quelle sélection a-t-on opérée ? Déterminez le taux correspondant à ce phénomène.
Problème 4 : (suite du problème 3) :
Le plasmide pBR322 porte 2 gènes qui confèrent la résistance à 2 antibiotiques: l'ampicilline et la
tétracycline. Il est introduit dans les bactéries de la culture A selon le protocole suivant:
1- On lave 20 ml de bactéries de la culture A (Tc
S
; Amp
S
) à DO 0,8 puis on les incube dans du CaCl
2
pour fragiliser les enveloppes, on centrifuge et on resuspend le culot dans 2 ml de CaCl
2
.
Q1. Calculer le titre de la suspension de cellules compétentes
2- A 0,1 ml de cette suspension de cellules compétentes, on ajoute 10 ng d'ADN de pBR322. Le mélange
est maintenu à 4°C pendant 1h puis la température est brutalement élevée pendant 2mn à 42°C pour favoriser
l'entrée du plasmide. Le volume est ensuite complété à 1 ml avec du milieu LB, puis la suspension est maintenue
à 37°C pendant 1h (réparation des enveloppes bactériennes, mise en route des gènes du plasmide) sans que les
bactéries se divisent.
3- Un témoin est constitué par l'application du même protocole à 0,1 ml de bactéries compétentes sans
ADN plasmidique.
Les bactéries des deux lots sont étalées sur un milieu nutritif LB gélosé contenant de la tétracycline.
Après incubation, les colonies bactériennes sont dénombrées et les résultats sont présentés ci-après.

Conditions d'étalement Bactéries compétentes SEULES Bactéries compétentes+ pBR322
Milieu LB + Tétracycline
0,1 ml de la dilution 10-1
1 190
Q2. Calculer le nombre total de bactéries transformées TcR
Q3. Calculer le % de bactéries compétentes transformées et déterminer le nombre de bactéries transformées par
µg d'ADN
Problème 5 : Etude du catabolisme de l’histidine
I. Les bactéries utilisent parfois certains acides aminés comme source de carbone et d’énergie. On
s’intéresse à la voie de dégradation de l’histidine chez Escherichia coli. Pour cela, on dispose d’une collection de
mutants incapables de croître sur milieu minimum (MM) additionné d’histidine comme seule source de carbone.
Chacun de ces mutants est cultivés sur MM additionné d’un des différents intermédiaires de la voie de
catabolisme de l’histidine. Les résultats des croissances sont résumés dans le tableau ci-dessous.
Souches Histidine (AFG) Acide formimino
glutamique
Acide
urocanique Acide glutamique (AIP) Acide imidazolone
propionique
Sauvage + + + + +
mutant 1 - - - + -
mutant 2 - + + + +
mutant 3 - + - + -
mutant 4 - + - + +
1/ Quel protocole utiliseriez-vous pour réaliser cette expérience?
2/ Déterminez l’ordre des composés de cette voie de catabolisme. Justifiez votre réponse en indiquant à
quelle étape chacun de ces mutants est bloqué.
II- Afin de préparer des cellules compétentes du mutant 1, 10 ml d’une culture en milieu riche LB est
réalisée jusqu’à atteindre une DO
600
= 0,5 puis centrifugée et resuspendue dans 2 ml de CaCl
2
.
Cette suspension de bactéries compétentes est diluée 10
5
fois et 150 µl sont étalés sur milieu gélosé. Après
incubation une nuit à 37°C, on dénombre 180 colonies.
1/ Calculez le titre de la suspension de cellules compétentes.
2/ Les cellules compétentes sont utilisées pour effectuer une transformation avec le plasmide pBSH10 qui
confère la résistance à l’ampicilline et porte le gène hutG.
- 30 ng d’ADN du pBSH10 sont ajoutés à 0,1 ml de bactéries compétentes. Après incubation dans la glace et choc
thermique, 1,9 ml de milieu riche LB sont ajoutés. Après 1 heure d’expression à 37°C, la suspension bactérienne
est lavée, resuspendue dans 2 ml de milieu minimum histidine (MMH) et diluée 10 fois avant étalement de 50 µl
sur milieu MMH gélosé. Le lendemain, 150 colonies sont dénombrées. Une seconde expérience réalisée sans
ajout d’ADN, n’a conduit à aucune colonie.
- Expliquez ces résultats. Quel pourrait être la fonction du gène hutG.
- Calculez le nombre de bactéries transformées par µg d’ADN
Problème 6.
Une mutagenèse EMS (Ethyl Méthane Sulfonate) est effectuée sur une souche d’Escherichia coli arginine
–
. Pour
cela, 10 ml d’une culture bactérienne réalisée en milieu minimum M63-glucose+arginine sont répartis dans 4
tubes. 30 µl de l’agent mutagène sont ajoutés dans les tubes 2, 3 et 4 pendant 5, 10 et 30 min., respectivement.
Les cellules de chaque tube sont alors lavées deux fois par centrifugation afin d’éliminer l’EMS et le dernier
culot est repris dans 1 ml de milieu M63-glucose.
1) Afin d’évaluer le taux de survie après traitement à l’EMS, 50 µl de chaque tube traité sont mélangés avec 1,95
ml de milieu riche. Après différentes dilutions sérielles précisées dans le tableau I, 50 µl de la dernière dilution
sont étalés sur milieu riche gélosé LB et les colonies dénombrées après incubation de 24 h à 37°C.

Q1. Complétez le tableau I pour chaque temps de traitement et expliquez vos calculs. Tracez le graphe du taux de
survie en fonction du temps de traitement à l’EMS et commentez.
Tableau I :
N° Tube Temps de traitement
EMS (mn) Dilutions Nombre de colonies dénombrées Titre (bact./ml) Taux de survie (%)
1 0 10
-
5
52
2 5 10
-
5
43
3 10 10
-
4
351
4 30 10
-
4
157
2) Pour chaque tube issu du traitement EMS, on réalise une culture de 16 h à 37°C en milieu M63-
glucose+arginine. Des dilutions sérielles sont alors réalisées et 200 µl de la dernière dilution sont étalés sur
milieu M63-glucose d’une part et milieu M63-glucose+arginine d’autre part. Après 24 h d’incubation, les
colonies sont dénombrées et les résultats reportés dans le tableau I.
Tableau II:
N° tube Colonies sur M63+arg
Dilutions Nombre Titre (MM + arg) Colonies sur MM Dilutions Nombre
Titre
(M63) Fréquence de mutation
1 10
-
7
168 10
0
171
2 10
-
6
395 10
-
3
83
3 10
-
6
368 10
-
3
166
4 10
-
6
186 10
-
3
153
Q2. Quelle sélection a-t-on réalisée ? Quel type de mutation a-t-on obtenu dans le tube 1 d’une part et dans les
autres tubes d’autre part ?
Q3. Calculez les titres bactériens obtenus pour les deux milieux et déterminez la fréquence de mutation pour
chaque temps de traitement à l’EMS. Sur le même papier semi-log (question 1), tracez le graphe de la fréquence
de mutation en fonction du temps de traitement à l’EMS et commentez.
3) A partir du tube n°3 issu du traitement EMS, on réalise une culture de 16 h à 37°C, cette fois en milieu riche
LB. 10
7
bactéries sont alors étalées sur différents milieux et le résultat des dénombrements des colonies obtenues
après 24 h d’incubation sont résumés ci-dessous :
M63-glucose : 1 M63-glucose + arginine : 45000 M63-glucose +arginine+thréonine : 46000
Ces résultats étaient-ils attendus ? Donnez les phénotypes bactériens sélectionnés sur chaque milieux, comparez
et expliquez les nombres de colonies obtenus dans chaque cas.
Problème 7.
Une souche sauvage d’E. coli est utilisée pour étudier le transport du lactate et du maltose. Les cellules
sont cultivées en milieu AM (phosphate de potassium 50 mM, sulfate d’ammonium 50 mM, glucose
10mM) jusqu’en milieu de phase exponentielle de croissance. Elles sont collectées par centrifugation,
lavées dans le milieu AG dépourvu de glucose et concentrées dans ce même milieu. Leurs réserves
énergétiques sont épuisées par un traitement de 10h en présence de 2,4-dinitrophénol (DNP), agent
découplant de la chaîne respiratoire qui dissipe le potentiel de membrane. Après ce traitement, elles sont
lavées dans le milieu AG dépourvu de glucose et traitées dans les conditions suivantes avant que leur
activité de transport vis-à-vis du
14
C-lactate et du
14
C-maltose soit mesurée :
- Addition de glucose : incubation de 10 min en milieu AG contenant 10 mM de glucose,