Stage - DLST

Université Joseph Fourier
Département Sciences & Technologie
RAPPORT DE STAGE
“Études structurale et dynamique par RMN de la protéine chaperone TIM 9/10
avec ses substrats”
Chavanne-Arod Alice
Laboratoire d'accueil: Institut de Biologie Structurale
Directeur du laboratoire: Weissenhorn Winfried
Responsable du stage: Schanda Paul
Licence STS- 1ère année-Parcours Biologie International
Année Universitaire: 2014-2015
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Remerciements
Merci à Winfried Weissenhorn pour m'avoir permis d'effectuer ce stage dans son laboratoire.
Je remercie Paul Schanda, mon maître de stage, pour sa supervision, sa diplomatie et son aide.
Je remercie tout particulièrement Katharina Weinhaupl qui m'a encadrée tout au long de ce stage.
C'est grâce à ses conseils, ses explications, ses remarques, ses réponses et sa pédagogie que j'ai pu
apprendre, et je lui suis très reconnaissante de la confiance qu'elle m'a accordée.
Je remercie également Vilius Kurauskas pour son encadrement et sa culture scientifique toujours prête
à être partagée, ainsi que tout les membres du groupe RMN pour leur accueil, leur humour, et pour
avoir toujours été disposés à répondre à mes questions.
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Sommaire
Introduction………………………………………………….…………..4-7
Personnelle………………………………………………………………...…………………....4
Laboratoire d'accueil………………………………………………………………….…..…...4
Contexte théorique…………………………………………...………………………………...4-6
Généralités……………...…………….……………………………………………….....4-5
Le complexe……………………………………………………………………………..6
Les substrats……………………………………………………………………………..6
Le projet de stage……………………………………………...…………………………….....6-7
Principes, Méthodes utilisées……………………………………….…...7-21
Culture bactérienne………………………………………………………………....……....….7-11
Préparation des milieux………………………………………………………...………...7
Transformation…………………………………………………………….……………..7-8
Croissance………………………………………………………….…………………….8-9
Récolte et lyse des cellules……………………...…………………………...…………...9
Purification des protéines……………………………………..………………………….9
Purification de l'ADN…………………………………………..………………………...10
Test d'expression………………………………………………..….…………………….11
Chromatographie par affinités (Ni-NTA, His Trap)………………………………………….11-12
Dialyse………………………………………………………………………..………………….13
Concentration…………………………………………………………………………………...13
Filtration gel (chromatographie exclusion de taille)………………………………………….14-15
SDS PAGE…………………...………………………………………………..………………...15-21
Préparation des gels……………………………………………………..……………….15-18
Préparation des échantillons……………………………………………………….……..18
Électrophorèse……………………………………………………………..……………..18-19
Révélation………………………………………………………………..……………….19
Western-blot………………………………………………………………..………...…..19-21
Protocoles et résultats…………………………………………...……..21-27
Conclusion…………………………………………………………..…..28-29
Annexes…………………………………………………………..……...29
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Introduction
Personnelle
Je n'ai pas spécialement choisi ce stage pour son contenu, bien qu'il soit tout à fait intéressant :
simplement, la plus grande partie des stages proposés cette année concernaient l'étude d'une protéine,
c'est en cela qu'il ne se distinguait pas. En revanche, c'était le seul stage qui requérait explicitement un
bon niveau d'anglais, et c'est ce qui a motivé ma décision : cela était le meilleur moyen de donner du
sens à mon année de L1 en parcours Bio Int, en plus de me donner de meilleures chances de sélection
et de suivre les conseils de Véronique Rossi, la responsable de mon parcours. Dans mon projet
professionnel, je visais déjà la recherche, et la maîtrise de l'anglais s'avère en être une composante
indispensable. En résumé, le stage me correspondait mieux et je correspondais mieux au stage.
Laboratoire d'accueil
Créé par le CEA et le CNRS en 1992, puis devenu unité mixte de recherche CEA-CNRS-Université
Joseph Fourier en 1999, l'Institut de Biologie Structurale, à Grenoble, mêle biologie, physique et
chimie dans son approche à la recherche fondamentale. Son objectif principal est l'étude structurale et
fonctionnelle des protéines d'intérêt médical.
Seize groupes, environ 270 personnes, y travaillent à différentes thématiques. Parmi ceux-ci, le groupe
RMN biomoléculaire (Résonance Magnétique Nucléaire) se compose de quatre équipes, travaillant
chacune à différentes applications biomoléculaires avec des approches RMN liquide et solide.
L'équipe solid-state NMR and dynamics s'intéresse spécialement à la compréhension des mécanismes
par lesquels les protéines membranaires transportent les métabolites à travers la bicouche
phospholipidique, plus particulièrement le fonctionnement des chaperones interagissant avec des
protéines membranaires. Elle s'attelle également à développer des approches RMN solide permettant
d'étudier les détails des dynamiques biomoléculaires, s'intéressant surtout à celles qui permettent
l'observation des états de conformation transitoires des protéines, souvent clés de leur fonction.
Contexte théorique
Généralités
Les cellules eucaryotes sont composées de plusieurs organites, des compartiments délimités par une ou
plusieurs membranes biologiques, c'est à dire bicouches lipidiques. La mitochondrie, possédant deux
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membranes, en fait partie: sont rôle est, entre autres, d'assurer la conversion de l'énergie cellulaire.
Toutefois, la majorité des protéines qu'elle utilise pour fonctionner est codée par les gènes du noyau, et
ces dernières sont synthétisées sous forme de précurseurs par les ribosomes cytosoliques. Ces protéines
sont reconnues par des récepteurs de la surface mitochondriale, puis importées dans l'espace inter-
membranaire par la porte d'entrée des mitochondries: le complexe TOM (Translocase of the Outer
Membrane). À ce jour, au moins quatre catégories de précurseurs protéiques, porteurs des peptides
signal menant à différents itinéraires d'import, ont été identifiées. Le complexe des petites protéines
TIM (Translocase of the Inner Membrane), TIM9 et TIM10 (le complexe étant noté TIM9•10) est
impliqué dans deux d'entre eux: le transport des protéines hydrophobes à insérer dans la membrane
intérieure, du complexe TOM jusqu'au complexe TIM22, soit des protéines hydrophobe en tonneau β à
insérer dans la membrane extérieure, du complexe TOM au complexe SAM (Sorting and Assembly
Machinery).
Figure 1: représentation schématique de la chaîne de transport inter-membranaire mitochondriale
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