Stage - DLST
publicité
Université Joseph Fourier Département Sciences & Technologie RAPPORT DE STAGE “Études structurale et dynamique par RMN de la protéine chaperone TIM 9/10 avec ses substrats” Chavanne-Arod Alice Laboratoire d'accueil: Institut de Biologie Structurale Directeur du laboratoire: Weissenhorn Winfried Responsable du stage: Schanda Paul Licence STS- 1ère année-Parcours Biologie International Année Universitaire: 2014-2015 1 Remerciements Merci à Winfried Weissenhorn pour m'avoir permis d'effectuer ce stage dans son laboratoire. Je remercie Paul Schanda, mon maître de stage, pour sa supervision, sa diplomatie et son aide. Je remercie tout particulièrement Katharina Weinhaupl qui m'a encadrée tout au long de ce stage. C'est grâce à ses conseils, ses explications, ses remarques, ses réponses et sa pédagogie que j'ai pu apprendre, et je lui suis très reconnaissante de la confiance qu'elle m'a accordée. Je remercie également Vilius Kurauskas pour son encadrement et sa culture scientifique toujours prête à être partagée, ainsi que tout les membres du groupe RMN pour leur accueil, leur humour, et pour avoir toujours été disposés à répondre à mes questions. 2 Sommaire Introduction………………………………………………….…………..4-7 Personnelle………………………………………………………………...…………………....4 Laboratoire d'accueil………………………………………………………………….…..…...4 Contexte théorique…………………………………………...………………………………...4-6 Généralités……………...…………….……………………………………………….....4-5 Le complexe……………………………………………………………………………..6 Les substrats……………………………………………………………………………..6 Le projet de stage……………………………………………...…………………………….....6-7 Principes, Méthodes utilisées……………………………………….…...7-21 Culture bactérienne………………………………………………………………....……....….7-11 Préparation des milieux………………………………………………………...………...7 Transformation…………………………………………………………….……………..7-8 Croissance………………………………………………………….…………………….8-9 Récolte et lyse des cellules……………………...…………………………...…………...9 Purification des protéines……………………………………..………………………….9 Purification de l'ADN…………………………………………..………………………...10 Test d'expression………………………………………………..….…………………….11 Chromatographie par affinités (Ni-NTA, His Trap)………………………………………….11-12 Dialyse………………………………………………………………………..………………….13 Concentration…………………………………………………………………………………...13 Filtration gel (chromatographie exclusion de taille)………………………………………….14-15 SDS PAGE…………………...………………………………………………..………………...15-21 Préparation des gels……………………………………………………..……………….15-18 Préparation des échantillons……………………………………………………….……..18 Électrophorèse……………………………………………………………..……………..18-19 Révélation………………………………………………………………..……………….19 Western-blot………………………………………………………………..………...…..19-21 Protocoles et résultats…………………………………………...……..21-27 Conclusion…………………………………………………………..…..28-29 Annexes…………………………………………………………..……...29 3 Introduction Personnelle Je n'ai pas spécialement choisi ce stage pour son contenu, bien qu'il soit tout à fait intéressant : simplement, la plus grande partie des stages proposés cette année concernaient l'étude d'une protéine, c'est en cela qu'il ne se distinguait pas. En revanche, c'était le seul stage qui requérait explicitement un bon niveau d'anglais, et c'est ce qui a motivé ma décision : cela était le meilleur moyen de donner du sens à mon année de L1 en parcours Bio Int, en plus de me donner de meilleures chances de sélection et de suivre les conseils de Véronique Rossi, la responsable de mon parcours. Dans mon projet professionnel, je visais déjà la recherche, et la maîtrise de l'anglais s'avère en être une composante indispensable. En résumé, le stage me correspondait mieux et je correspondais mieux au stage. Laboratoire d'accueil Créé par le CEA et le CNRS en 1992, puis devenu unité mixte de recherche CEA-CNRS-Université Joseph Fourier en 1999, l'Institut de Biologie Structurale, à Grenoble, mêle biologie, physique et chimie dans son approche à la recherche fondamentale. Son objectif principal est l'étude structurale et fonctionnelle des protéines d'intérêt médical. Seize groupes, environ 270 personnes, y travaillent à différentes thématiques. Parmi ceux-ci, le groupe RMN biomoléculaire (Résonance Magnétique Nucléaire) se compose de quatre équipes, travaillant chacune à différentes applications biomoléculaires avec des approches RMN liquide et solide. L'équipe solid-state NMR and dynamics s'intéresse spécialement à la compréhension des mécanismes par lesquels les protéines membranaires transportent les métabolites à travers la bicouche phospholipidique, plus particulièrement le fonctionnement des chaperones interagissant avec des protéines membranaires. Elle s'attelle également à développer des approches RMN solide permettant d'étudier les détails des dynamiques biomoléculaires, s'intéressant surtout à celles qui permettent l'observation des états de conformation transitoires des protéines, souvent clés de leur fonction. Contexte théorique Généralités Les cellules eucaryotes sont composées de plusieurs organites, des compartiments délimités par une ou plusieurs membranes biologiques, c'est à dire bicouches lipidiques. La mitochondrie, possédant deux 4 membranes, en fait partie: sont rôle est, entre autres, d'assurer la conversion de l'énergie cellulaire. Toutefois, la majorité des protéines qu'elle utilise pour fonctionner est codée par les gènes du noyau, et ces dernières sont synthétisées sous forme de précurseurs par les ribosomes cytosoliques. Ces protéines sont reconnues par des récepteurs de la surface mitochondriale, puis importées dans l'espace intermembranaire par la porte d'entrée des mitochondries: le complexe TOM (Translocase of the Outer Membrane). À ce jour, au moins quatre catégories de précurseurs protéiques, porteurs des peptides signal menant à différents itinéraires d'import, ont été identifiées. Le complexe des petites protéines TIM (Translocase of the Inner Membrane), TIM9 et TIM10 (le complexe étant noté TIM9•10) est impliqué dans deux d'entre eux: le transport des protéines hydrophobes à insérer dans la membrane intérieure, du complexe TOM jusqu'au complexe TIM22, soit des protéines hydrophobe en tonneau β à insérer dans la membrane extérieure, du complexe TOM au complexe SAM (Sorting and Assembly Machinery). Figure 1: représentation schématique de la chaîne de transport inter-membranaire mitochondriale 5 Le complexe Ce complexe protéique est un oligomère, un hexamère plus précisément, dont la structure a été auparavant déterminée par cristallographie: Figure 2: TIM9•10 vu de dessus Il est composé de trois sous-unités TIM10 et de trois TIM9. Sur l'image, une portion rouge ou une portion bleue forment une sous-unité. Il a été prouvé que le rôle joué par ce complexe est vital pour les levures, mais il est bien sûr également présent chez l'humain, bien que sa structure soit légèrement différente. Les substrats AAC: ATP-ADP Carrier, translocase composée de 6 hélices α, membrane inférieure des mitochondries GGC: GTP-GDP Carrier, translocase composée de 6 hélices α, membrane inférieure des mitochondries TOM40: protéine translocase constituant le canal central du complexe TOM, en tonneau β, membrane extérieure des mitochondries POR1: porine VDAC (Voltage-Dependent Anion Channel) mitochondriale, en tonneau β, membrane extérieure des mitochondries Le projet de stage Il se concentre principalement sur l'étude de la protéine chaperone TIM 9•10, l'objectif étant de caractériser l'interaction du complexe TIM avec les protéines membranaires qu'il transporte. Les études et mesures effectuées précédemment à mon stage concernaient particulièrement l'interaction TIM/GGC et ont résulté en plusieurs hypothèses: lorsqu'il est lié au complexe TIM, GGC est en hélice α, et le ratio complexe/GGG est de 1:1 (spectres RMN, analyse d'acide aminés et mesure de dichroïsme circulaire). Le problème étant le suivant: on imagine facilement GGC se liant au centre du complexe, cependant l'espace disponible est inférieur au diamètre de GGC en hélice α... On met donc en place une étude plus poussée du TIM/GGC (avec marqueurs isotopiques pour les mesures IR et RMN), mais également avec 6 d'autres substrats: un deuxième MC (Mitochondrial Carrier), et deux protéines de la membrane extérieure, en tonneau β. Principes et méthodes utilisées Culture bactérienne [toutes les manipulations à faire en milieu stérile, avec bec Bunsen allumé] Préparation des milieux [c'est la seule opération pour laquelle les conditions stériles ne sont pas nécessaires étant donné que les solutions sont autoclavées] Si on souhaite des protéines non-marquées, classiques, on préparera du LB (Lysogeny Broth, milieu nutritif classique de culture d'Escherichia Coli). On pèse la quantité de poudre LB en fonction du volume de LB désiré, à savoir qu'il en faut 20 g/L. Selon l'utilisation qu'on lui destine, on rajoute également de la poudre d'agar (15 g/L). On remplit avec de l'eau distillée jusqu'à atteindre le volume désiré, et on autoclave la bouteille, après l'avoir légèrement dévissée, recouvert le couvercle d'aluminium et entouré de ruban adhésif autoclave (c'est lui qui indique que le contenu est bien autoclavé, auquel cas des hachures noires deviennent visibles sur le ruban). Cependant, si on veut utiliser un marqueur isotopique, comme du carbone 13 à la place du carbone 12 (utile pour les spectres RMN, de même que l'azote 15), il faut utiliser ce qu'on appelle un milieu minimal, qui contient tout juste de quoi maintenir la bactérie en vie: c'est parce que les isotopes sont moins “pratiques” pour la bactérie, et elle ne les utilisera (pour synthétiser ses protéines, par exemple) que s'il n'y a rien d'autre à disposition, ce qu'on la force à faire. Ici, le milieu utilisé s'appelle M9. Il est aussi sous forme de poudre, qui donne une solution tampon de phosphate et de sels nécessaires aux bactéries, et ne contient pas de source de carbone ni d'azote à la base, puisque c'est nous qui rajoutons celles de notre choix. On peut par exemple rajouter du glucose à base de carbone 13, pour que toutes les protéines produites par les cellules soient marquées au 13C (on marque le 15N avec du 15NH4Cl). Enfin, selon les bactéries que l'on manipule et ce qu'on veut en faire, on peut rajouter des additifs comme des vitamines… Transformation Les cellules sont conservées à -80°C, et préalablement rendues compétentes, ce qui signifie qu'elles sont capables d'absorber de l'ADN (il s'agit d'E. Coli, des bactéries à gram négatif: on leur a retiré leur membrane externe et au moins une partie du peptidoglycan). 7 Après le choix des cellules à utiliser, on les garde sur glace (0°C) pendant 15 minutes environ, ce qui va figer les membranes. On incorpore ensuite les plasmides (ADN circulaire non-chromosomique) choisis, qui vont se fixer à la membrane, puis on opère un choc thermique (cellules placées pendant 45s à 42°C) qui rend la membrane à nouveau fluide et incorpore les plasmides recombinants. Les gènes insérés dans ces plasmides peuvent être responsables de l'expression d'une protéine d'intérêt, ou d'une résistance à un antibiotique. On replace les cellules sur la glace pendant au moins 2 minutes, puis on opère une dilution 1:10 avec du milieu LB. On cultive ensuite ces bactéries à 37°C, dans un incubateur qui les agite pour optimiser la présence d'oxygène dans le milieu sans antibiotique, pendant une heure, pour permettre aux bactéries de se remettre des chocs thermiques. On place ensuite les cellules sur une boîte de LB (25 mL LB liquide + agar [15 g/L] + 25 μg d'ampicilline 1000x , 30-60 minutes pour solidifier, le LB agar nécessite d'être autoclavé par ailleurs) et on les laisse à l'envers pour garder la condensation, à grandir à 37°C pendant la nuit. La présence d'antibiotique permet de sélectionner uniquement les bactéries ayant intégré le plasmide contenant le gène codant une résistance à celui-ci (puisqu'elle seront les seules à survivre), nous assurant ainsi qu'elles peuvent également exprimer notre protéine. Figure 3: représentation schématique d'une transformation bactérienne Croissance de la culture Du bout de la pipette, on récupère une ou plusieurs colonies (selon ce qu'on veut en faire), qu'on met dans un petit volume (qui dépend de la taille de notre future culture, et également de si on se trouve en H2O ou en D2O) de LB + antibiotique. On cultive à nouveau les bactéries à 37°C dans l'incubateur, puis 8 on verse le contenu du tube dans un plus gros volume de LB + ampicilline (1000x, donc 1/1000 du volume de LB) : 50 mL, 500 mL, 1 L, 3 L... cela dépend de ce que l'on veut faire de notre culture, qu'on replace dans l'incubateur. On doit ensuite induire la sur-expression de la protéine d'intérêt. Pour savoir quand opérer, on mesure régulièrement l'OD600 (Optical Density, soit l'absorbance à 600 nm) de la culture (1 mL de culture dans une cuvette au spectrophotomètre). Habituellement, l'induction par ajout d'IPTG s'opère quand l'OD600 est entre 0,6 et 0,8. On cultive à nouveau après induction. Récolte et lyse des cellules On répartit la totalité de notre culture dans deux flacons de centrifugation, on centrifuge (il faut vérifier les caractéristiques de la centrifuge pour la vitesse de rotation max autorisée). On retire ensuite le surnageant, on re-suspend la pellet dans une solution tampon, et on centrifuge à nouveau. (Il est possible de stocker les pellets à -20°C après avoir à nouveau retiré le surnageant.) Pour briser les cellules, on utilise un sonicateur (lyse par ultra-sons pour rompre les membranes). Il faut disposer la pellet re-suspendue dans un tampon dans un récipient spécifique, qu'on place lui-même sur un bac de glace: la pointe du sonicateur dégageant une forte chaleur, celle-ci va peu à peu fondre, et il faut s'assurer que le récipient est toujours enfoncé et maintenu dans la glace, et que la pointe est dans le liquide, sans qu'elle touche le fond du récipient. Ici, on utilise 2 minutes de sonication au total, mais puisque le sonicateur doit alterner entre phase de vibration (2s) et phase de repos, pour refroidir (8s), c'est en fait 10 minutes que prend cette sonication. On centrifuge ensuite pour récolter le matériel de la cellule. Purification des protéines Selon le type de protéine et l'usage qu'on lui destine, on pourra utiliser différentes techniques de purification, détaillées plus loin. Après une étape de purification, on peut mesurer la concentration des protéines récupérées en connaissant leur coefficient d'extinction ε, grâce à un spectrophotomètre et la loi de Beer-Lambert. On utilise ici le Nanodrop, spectrophotomètre ne nécessitant qu'une goutte, soit 2 μL environ, pour faire la mesure de l'absorbance. Il est peu précis, mais il permet d'économiser beaucoup d'échantillon. 9 Purification de l'ADN Si on prépare une culture pour récupérer de l'ADN (par exemple pour l'envoyer au séquençage), on n'utilise pas la sonication. Les protocoles sont précisés sur les kits qu'on utilise pour la purification de l'ADN plasmidique, en voici un résumé : A1 : tampon de re-suspension A2 : tampon de lyse A3 : tampon de neutralisation AW : tampon de lavage (optionnel) A4 : tampon de lavage (avec éthanol à ajouter) AE : tampon d'élution Après avoir centrifugé notre culture bactérienne (environ 5 mL, donc petite pellet), on re-suspend la pellet avec 250 μL de A1 en s'assurant qu'il n'y a plus d’agrégat de cellules. On ajoute 250 μL de A2, en mélangeant doucement en retournant le tube 6-8 fois. On laisse incuber 5 minutes jusqu'à ce que le lysat apparaisse clairement. On ajoute 300 μL de A3, retournant le tube 6-8 fois, puis on centrifuge pendant 5 minutes à 11 000x g. On jette ce qui s'est écoulé du filtre. Il faut que le surnageant soit clair. Ensuite, on dépose le surnageant sur une mini-colonne de silice (750 μL à la fois maximum) Figure 4 : mini-colonne (gel de silice) et micro-tube en centrifugeant à chaque fois une minute à 11 000x g. On jette ce qui s'est écoulé du filtre. On lave ensuite la membrane avec 500 μL de AW (préchauffé à 50°C), puis centrifugation 1 minute à 11 000x g. On jette ce qui s'est écoulé du filtre. On ajoute 600 μL de A4, on centrifuge 1 minute à 11 000x g. On jette ce qui s'est écoulé du filtre. On centrifuge ensuite la colonne à 11 000x g sans rien ajouter, pour la sécher, puis on peut jeter le tube dans lequel repose la colonne. On la place dans un eppendorf, et on élue avec 50 μL de AE. On centrifuge pendant une minute à 11 000x g. On peut ensuite vérifier a concentration de l'ADN avec un Nanodrop . 10 Test d'expression C'est une opération à faire en parallèle de la culture bactérienne: on mesure l'OD600 au moment où on induit, puis 1h,2h,3h,5h après, et le lendemain matin, ce qui permet de faire un graphique de la concentration des cellules en fonction du temps. C'est par la suite utile pour prévoir le moment d'induction, par exemple. Chromatographie d'affinité (His-Trap, cation métallique-chélate) C'est une technique de séparation des molécules se basant sur l'affinité entre un ligand et son complexe. Mais ici, on s'intéresse particulièrement à l'interaction entre un His-tag (succession de 6 histidines à l'extrémité d'une protéine) et un ion Nickel Ni 2+ . En effet, les ions nickel se lient à la résine qu'on utilise dans les colonnes Ni-NTA (la résine comporte de l'acide nitrilotriacétique [NTA], un ligand chélatant tétradentate, dans une matrice à 6 % d'agarose, le NTA liant les Ni 2+ par quatre sites de coordination), et lui donnent par ailleurs une couleur bleutée. Figure 5: Le ligand Ni-NTA est fixé de manière covalente à la matrice d'agarose. Les résidus d'histidine peuvent se lier en remplaçant les molécules d'eau indiquées par une flèche rouge. Lors d'une telle chromatographie ; on utilise le CV en unité de volume. 1 CV (Column Volume) est simplement le volume de la résine utilisée dans la colonne. Si j'ai 5 mL de résine, alors 5 mL =1 CV. Les colonnes sont en général stockées à 4°C et remplies d'éthanol : pour en utiliser une, il faut d'abord laisser l'éthanol s'écouler, puis rincer avec de l'eau distillée (5 CV). Si on a déjà utilisé la résine plusieurs fois, ou si on n'utilise pas exactement les mêmes échantillons, il faut alors changer le nickel de la colonne : Figure 6 : photo d'une colonne Ni-NTA 11 On arrache l'ancien en versant 10 CV d'EDTA (50 mM) mais attention : les Ni 2+ sont très toxiques, il faut donc les collecter dans un bécher spécial, qu'on versera dans un récipient prévu à cet effet. On lave avec 5 CV d'eau. (Si le filtre au fond de la colonne est saturé d'impuretés précédentes, tout s'écoule très lentement. C'est pour cela qu'on peut utiliser de l'urée [urée 8 M, 20 mM MES] pour resuspendre la résine, et laisser reposer pendant une demi-heure). On lave avec 5 CV d'eau distillée, et on dépose 1 CV de Ni 2+ « neuf », du NiCl2 (en n'oubliant pas d'utiliser le bécher à déchets toxiques). On lave avec 5 CV d'eau distillée, puis on équilibre la colonne avec 5 CV de tampon (pour le pulldown TIM/GGC ou le TIM/TOM, il s'agit de : 6 M GnHCl, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4). Pour la chromatographie elle-même : On dépose 1/5 CV de substrat (GGC ou TOM, dans 6 M GnHCl) sur la colonne, on lave avec 5 CV de tampon (3 M GnHCl, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4), on ajoute ensuite 1/5 CV de TIM9•10 (dans Tris pH 7,4). On collecte ce qui s'est écoulé du filtre, et on dilue 1:1 avec du Tris 7,4 (composition exacte : Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4), avant de re-déposer le tout sur la colonne. On répète cette opération (dilution 1:1) jusqu'à ce que ce qui s'écoule du filtre atteigne 20 CV, c'est à dire que la concentration de GnHCl atteigne 0,05 M, ce qui était le but. En effet, cela va permettre au complexe se former lentement. On lave la colonne avec 5 CV de Tris pH 7,4, en n'oubliant de conserver ce qui s'est écoulé du filtre à chaque fois (surtout les flacons comportant du TIM, car il peut être recyclé par concentration, ce que j'évoquerais plus tard). On élue avec 5 CV de tampon (Tris 7,4 + 500 mM Imidazole). Pour analyser cette chromatographie, on peut prendre un échantillon de toutes les étapes pour faire une SDS-PAGE, sauf la phase de dépôt du substrat : en effet, elle contient du Guanidinium Hydrochloride (GnHCl) qui interagit avec le SDS des gels et rend le profil électrophorétique complètement illisible (même pour les échantillons voisins). (Si on souhaite faire migrer des échantillons de protéines contenant du GnHCl, il est possible d'opérer une précipitation à l'acétone, pendant une heure à -20°C) Il faudra par la suite éliminer l'Imidazole de notre élution, ce qu'on peut faire par exemple par dialyse. On a utilisé cette technique pour purifier nos protéines et pour former les complexes. 12 Dialyse C'est une technique permettant de séparer des molécules selon leur taille : on place l'échantillon dans une membrane poreuse en forme de sac. Les pores ont un certain diamètre : tout ce qui sera assez petit pour le traverser traversera par simple diffusion, puisqu'on place le sac dans un tampon : au début de la dialyse, la concentration des petites molécules sera grande à l'intérieur de la membrane et nulle à l'extérieur, c'est ce qui les fera passer à l'extérieur du sac. On place bien sûr l'ensemble sous agitateur, et il convient de changer plusieurs fois le tampon (pendant mon stage, on le changeait deux fois : une fois deux heures après, et une deuxième fois après toute la nuit) pour que la différence de concentration soit optimale. Figure7 : représentation schématique avant / après d'une dialyse On l'a utilisée surtout pour éliminer l'imidazole de notre élution de chromatographie d'affinité. Concentration C'est une technique très simple et très utilisée, pour concentrer une molécule ou en changer la solution tampon : on dépose l'échantillon dans la partie supérieure du flacon, et sous l'effet de la force centrifuge, les molécules assez petites pour traverser le filtre se retrouveront dans la partie inférieure (on pourra la plupart du temps jeter ce qui s'est écoulé du filtre). Figure 8: flacon de concentration 13 Filtration gel : chromatographie haute -performance par exclusion de taille C'est une technique consistant à séparer les protéines selon leur taille : une machine (d'où le hauteperformance) fait passer une solution contenant notre échantillon à travers une colonne remplie d'une résine fait de billes poreuses. On connaît le diamètre des pores. Toutes les molécules trop grosses pour rentrer dans les pores les plus larges sortiront en premier, et toutes celles qui sont trop petites et passeront donc par tous les pores vont sortir en dernier puisqu'elles seront les plus retardées. Figure 9 : Schéma d'une Chromatographie à haute performance La machine va donc fractionner le volume sortant (fractions de 1 mL par exemple), mais il reste encore à savoir dans quelles fractions se trouve notre échantillon de protéines : c'est là la fonction du détecteur UV (les acides aminés aromatiques absorbent à 280 nm). Figure 10 : représentation schématique d'un spectre UV par volume sortant 14 La machine nous fournit donc une courbe de l'A280 en fonction du volume sortant, ce qui nous permet de déterminer quelles fractions récupérer pour analyser l'échantillon. Les premières fractions ne contiendront pas d'échantillon, puisque le volume qui arrive n'est encore que du tampon de lavage, le volume mort (environ 1/3 du volume de la colonne). Cette dernière doit être lavée à l'éthanol, à l'eau, et au tampon de lavage, avant d'être utilisée, ce qui prend en général la nuit. On peut cependant écrire un programme pour qu'elle exécute seule le protocole. C'est une des méthodes de purification de protéines. SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis) Préparation des gels On prend ici l'exemple de la préparation de 5 gels, puisque c'est ce que j'ai fait le plus souvent pendant mon stage. On doit tout d'abord placer les plaques: Figure 11 : Schéma du montage d'une préparation de gel 15 Toujours dans l'ordre: plastique, [petite plaque-grande plaque], plastique.... les [] représentant les “spacers” sur le schéma, nécessaires pour ménager un espace, mais suffisamment fin, pour le gel. On les dispose sur un support tel que celui ci-dessous : Figure 12 : supports de préparation de gels (gel casters) . On prépare ensuite les gels proprement dit: Le composant central du gel est le polyacrylamide: l'acrylamide, qu'on peut imaginer schématiquement comme de grands segments parallèles, et le bis-acrylamide, qui va lier les segments entre eux pour former un filet. En variant les pourcentage respectifs des deux composants, on obtient des mailles plus ou moins étroites. Le gel de concentration (stacking gel) est toujours à 5% d'acrylamide. En revanche, selon la taille des protéines étudiées (et donc leur masse molaire), on varie le pourcentage d'acrylamide du gel de séparation (running gel), comme expliqué plus haut : Acrylamide % M.W. Range 7% 50 kDa - 500 kDa 10% 20 kDa - 300 kDa 12% 10 kDa - 200 kDa 15% 3 kDa - 100 kDa 16 Ici, pour 5 gels à 15% d'acrylamide: Gel de concentration Gel de séparation (15%) Eau 13.2 mL 10.3 mL Tris (pH 6.8, 1M) 2.19 mL / Tris (pH 8.8, 2M) / 5.125 mL SDS 10% 165 μL 275 μL Glycérol 50% / 375.5 μL Acrylamide 40% (29/1) 2.478 mL 10.3 mL TEMED 30.9 μL 27.5 μL APS 10% 90 μL 200 μL On porte des gants en nitrile violets durant toute la manipulation (au moins jusqu'à la polymérisation complète), parce que l'acrylamide non polymérisé est très toxique. La polymérisation de l'acrylamide et du bis-acrylamide commence à partir de l'ajout de TEMED ou d'APS 10% (ammonium persulfate), ce qui signifie que l'on doit être rapide lors de ces étapes. Jusqu'à cet ajout, on peut préparer les deux phases du gel (stacking et running) en parallèle, mais ensuite il convient d'ajouter TEMED et APS dans le gel de séparation, d'agiter une fois le flacon, et de le verser entre les plaques du montage (laisser un peu plus d'un centimètre entre le niveau du gel de séparation et l'extrémité de la petite plaque, de façon à ce que le peigne que l'on va insérer dans le gel de concentration ne touche pas le gel de séparation). On rajoute environ 1 mL d'isopropanol au dessus du gel de séparation, pour rendre la surface de celuici lisse et homogène. Il faut essayer d'être fluide dans la répartition de l'isopropanol. On laisse ensuite le running gel polymériser pendant 20 minutes. On rajoute l'APS et le TEMED dans le gel de concentration, on agite une fois le flacon, et on le pipette individuellement au-dessus des plaques (environ 2 à 3 mL par plaque, pour atteindre le bord). On insère ensuite les peignes dans les plaques, entre la petite et la grande plaque: le gel de concentration déborde un peu en général, ce n'est pas grave. Encore une fois, il faut être rapide lors de ces étapes. On laisse polymériser pendant 20 minutes. Pour chaque polymérisation, le restant de gel dans les flacons est un bon indicateur: s'il est polymérisé, alors celui entre les plaques l'est normalement aussi (sauf erreur de manipulation). Quand le gel de concentration est lui aussi polymérisé, on retire les peignes avec beaucoup de délicatesse pour ne pas endommager les puits, on asperge ces derniers d'eau distillée, on emballe l'ensemble [petite plaque-gel-grande plaque] dans du papier humide, puis dans du papier d'alu, et on le 17 place au frigo en attendant de l'utiliser. Préparation des échantillons On utilise ici du tampon de Laemmli (c'est donc une SDS-PAGE Laemmli), qui comporte : (Laemmli 4x ; Tris-HCl (pH 6.8) : 250 mM, SDS : 8%, Glycérol : 40%, β-mercaptoéthanol : 8%, bleu de Bromophénol : 0.02%) - du SDS, un détergent qui servira à charger les protéines et les déplier (brisant les interactions faibles) - du β-mercaptoéthanol, un agent réducteur qui servira à casser les pont disulfure inter et intramoléculaires - du bleu de Bromophénol, qui sert à teinter l'échantillon pour mieux le voir, et qui, pendant l'électrophorèse, signalera la fin de la migration (une ligne bleue ayant parcouru tout le gel) On ajoute donc ce tampon dans notre échantillon de protéines (le volume à ajouter varie selon le volume de mon échantillon et la concentration du tampon disponible. Par exemple, si c'est du Laemmli 4x, il me faut trois fois plus de protéines que de tampon), et on chauffe ce dernier à 90°C pendant 2 à 5 minutes, pour favoriser la dénaturation des protéines. Ils sont ensuite prêts à être déposés dans les puits du gel. Électrophorèse (montage vertical) La SDS-PAGE, comme les autres techniques d'électrophorèse, vise à séparer les molécules, en l'occurrence des protéines, le plus souvent. Elle se base sur le déplacement de molécules chargées sous l'influence d'un champ électrique. L'ajout de Sodium Dodécyl Sulfate aux protéines leur confère une charge nette négative. De plus, on compte environ 1 molécule de SDS pour 2 acides aminés (elle se lie aux régions hydrophobes), ce qui fait que la charge de la protéine, donc sa distance de migration, dépend directement de sa taille (le nombre d'acides aminés qu 'elle comporte). Le montage d'électrophorèse SDS-PAGE se fait comme suit : - On fixe un ou deux gels sur la cuve d'électrophorèse : (l'anode est en bas, la cathode en haut, donc les protéines chargées négativement et déposées en haut migreront vers le bas) Figure 13 : photo d'une cuve d'électrophorèse verticale 18 - On remplis l'espace entre la cuve et le gel, ainsi que le fond de la cuve, avec du tampon de migration (pour un litre : 12,5 mL de Tris 25 mM ;14,4 g de glycine ; 977,5 mL d'eau distillée ; 10 mL SDS 10%) - On peut pipeter sur la largeur du gel quelques μL de Laemmli, ce qui colorera les puits pour mieux les voir - Dans un puits à une extrémité (voire aux deux), on dépose un marqueur de masse molaire (5 μL), qui une fois révélé fera apparaître des bandes dont on connaît exactement la masse molaire en Da - On peut ensuite déposer les échantillons (j'ai la plupart du temps déposé 10 μL, mais cela dépend aussi de la taille des puits) - On règle le générateur relié aux électrodes : j'ai utilisé 180V, 400 mA pendant 45 min - On lance la migration. Révélation Un fois la migration achevée, on démonte l'ensemble, on récupère le gel en décollant délicatement une des deux plaques (on peut éventuellement se servir de l'un des deux « spacers » en tant que levier). On peut éventuellement couper et jeter la part de gel de concentration, puisque aucune protéine ne s'y trouve. On place ensuite le gel dans une boîte, dans laquelle on ajoute du bleu de Coomassie, pour teinter les protéines. On place la boîte sur un mélangeur pendant une vingtaine de minutes, puis on retire le bleu de Coomassie (à recycler) pour le remplacer par du décolorant (acide acétique), qu'on va laisser pendant une demi-heure environ, toujours sur mélangeur. Les bandes sont ensuite observables à l’œil nu (on peut utiliser un support lumineux pour mieux voir toutefois). Western Blot (transfert) Cette technique n'est pas systématiquement utilisée après une migration SDS-PAGE, mais elle est parfois très utile et complémentaire. En revanche, si on destine un gel de SDS-PAGE à un WesternBlot, il faut utiliser un marqueur de taille coloré (et 3 μL au lieu de 5 parce qu'il est plus cher) au lieu de l'habituel, incolore (en dehors du bleu de bromophénol). Voir si le marqueur coloré s'est bien transféré constitue un premier indice que le Western Blot s'est correctement déroulé. Il s'agit ici de transférer les protéines du gel sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF. La PVDF doit être activée en la plongeant dans l'éthanol pendant 5-10 minutes avant le montage, mais la 19 nitrocellulose s'utilise dans certain cas, par exemple le transfert en extrémité N d'une protéine qu'on souhaite envoyer au séquençage. On ne doit toucher la membrane qu'avec des gants. Dans le montage, il faut respecter un ordre précis : (haut) cathode papier absorbant x 3 gel membrane papier absorbant x 3 (bas) anode Figure 14: assemblage Western-Blot, à utiliser sur un support. Avant de placer chaque papier absorbant (auparavant prédécoupé, idéalement légèrement plus grand que le gel), on l'imbibe du tampon de transfert (par litre : 700 mL d'eau distillée, 100 mL de tampon TG (Tris-glycine) concentré 10 fois, 200 mL d'éthanol, ou de méthanol, un assez bon substituant). Il en va de même pour la membrane, également à découper (et à toucher le moins possible). On doit faire attention au moment de déposer le gel sur la membrane : une fois qu'il s'y est collé, on ne doit pas le changer de place ou le décaler, sinon le transfert sera mauvais. On aplatit ensuite soigneusement l'assemblage pour se débarrasser des éventuelles bulles d'air, qui vont empêcher le transfert, et on ajoute encore un peu de tampon de transfert sur l'assemblage et autour. Pour le transfert Western-Blot, contrairement à une SDS-PAGE, ce n'est pas le voltage qui est constant, mais l'ampérage. Ce dernier, et le temps de transfert, dépendent respectivement du nombre de gels (on peut en transférer plusieurs en même temps selon le support utilisé) et de la taille des protéines transférées. Par exemple, le Western-Blot que nous avons fait concernait des protéines d'environ 30 kDa, et nous avons transféré pendant 45 minutes. Ce n'était qu'un seul gel, à 45 mA donc (pour deux gels : 90 mA, etc). Après le transfert Western-Blot, on lave la membrane avec du PBS (Phosphate Buffered Saline, dont la composition pour un litre est : 8,0 g/L de 137 mM NaCl ; 0,2 g/L de 2,7 mM Kcl ; 1,44 g/L de 10 mM Na2HPO4 ; 0,24 g/L de 1,76 mM KH2PO4 ) + 0,05 % de Tween 20, sur mélangeur pendant 5 min, trois fois. On doit ensuite bloquer le transfert, ce qu'on fait en laissant incuber la membrane dans du PBS + 20 5 % de poudre de lait pendant une heure. On lave ensuite trois fois 5 min avec PBS + 0,05 % Tween, puis on ajoute PBS + un anticorps spécifique au His-tag (polyhistidine). On laisse incuber pendant une heure. On lave encore trois fois avec du PBS, puis pour détecter les protéines transférées on utilise des tablettes de 3,3'-diaminobenzidine (deux tablettes dans 1 mL d'eau). Pour stopper la réaction (qui finit par teinter toute la membrane si on ne l'arrête pas), on place simplement la membrane dans de l'eau distillée. Résultats Première semaine (il y avait une infection de phages au laboratoire les deux premiers jours, l'accès aux salles de culture bactérienne nous était donc interdite, c'est pour cela que nous avons commencé les cultures seulement la semaine d'après). Dans un premier temps, on a fait une chromatographie d'affinité (pull-down) sur colonne Ni-NTA pour former le complexe TIM+GGC, puis après filtration (filtre 0,2 mm), une dialyse pour éliminer l'imidazole. On a ensuite concentré l'échantillon. On a ensuite utilisé ce dernier pour faire une filtration gel (chromatographie par exclusion de taille) sur une colonne S200 10/300 : il était important pour la préparation de futurs échantillons que l'on puisse faire une filtration gel avec ce complexe. Il avait déjà été tenté d'en faire une avant que j'arrive, mais GGC avait été perdu au cours de la chromatographie. Toutefois, c'était avant que le protocole de production du complexe soit optimisé, et il était donc temps de réessayer. Ci-dessous le gel comportant entre autre les fractions d'intérêt résultant de la chromatographie par exclusion de taille. MW GGC est à ce niveau TIM est là (deux bandes pour les deux sous-unités) 21 Conc.TIM/GGC 32 33 34 35 36 37 On peut voir sur le gel que, malheureusement et malgré l'amélioration du protocole, GGC a été perdu… Plusieurs hypothèses se proposent alors : GGC a été perdu soit en interagissant avec la résine de la colonne de la filtration gel, soit avec le filtre de cette dernière, soit avec le filtre 0,2 mm utilisé avant, soit on ne l'a pas vu parce qu'il était trop dilué. On testera ces hypothèses plus tard. Deuxième semaine On a ensuite pu débuter les cultures bactériennes : TOM dans des cellules BL21DE3, TIM dans des SHuffle, POR1 et AAC2 dans des RosplysS. En parallèle, on a commencé à tester nos hypothèses : peut-être GGC était-il en très faible concentration, aussi a-t-on chauffé les fractions, puis on les a centrifugées pour pouvoir voir une pellet… sans succès. On a re-suspendu les « pellets virtuelles » qu'on a fait migrer sur un gel, sans plus de résultats. 32 33 34 35 36 37 pas de GGC TIM On a également concentré puis purifié le contenu des flacons utilisés pour le pull-down qui contenaient du TIM, puisqu'il est recyclable : d'abord 20 min à 90°C (pour que les autres molécules précipitent), puis méthode de concentration décrite plus haut. La culture finale de TIM était de 1L, celle de TOM 1L également, celles de POR et AAC étaient de 50 22 mL chacune, puisque nous avons fait un test d'expression pour POR et AAC : On a induit à 12h00. Le graphe qui suit indique la Densité Optique de la culture en fonction de l'heure. 3 2,5 2 DO AAC2 DO POR1 1,5 1 0,5 0 11h00 11h45 12h00 13h00 14h00 15h00 17h00 Overnight On peut voir que la culture AAC n'a pas très bien poussé : on a fait l'hypothèse que la protéine produite est toxique pour la cellule. À chaque fois qu'on a mesuré la DO, on a également collecté un échantillon à déposer sur un gel (centrifugé et re-suspendu la pellet dans de l'urée) : on appelle respectivement 1, 2, 3 ,4 , 5 et 6 les échantillon à l'induction, 1h, 2h, 3h, 5h et une nuit après. MW 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 AAC devrait être là et POR ici AAC2 POR1 On devrait normalement voir apparaître une bande supplémentaire lorsque la protéine est sur-exprimée, ce qui n'est pas le cas… On veut vérifier avec un Western-Blot si les protéines n'ont vraiment pas été 23 exprimées. On récolte TIM et TOM, et on teste une seconde hypothèse : si GGC avait interagi avec la résine de la colonne, il est probable qu'elle interagisse avec celle d'une colonne NAP25, qui a une résine similaire. On fait donc un pull-down de TIM/GGC sur une NAP25, et on dépose les échantillons (avant, pendant, et après le pull-down) sur un gel : GGC TIM avant pendant après On voit que GGC est encore présente, on élimine donc cette hypothèse. On a également testé le filtre 0,2 mm qu'on utilise avant la filtration gel : GGC TIM filtre : avant après vieilles fractions de TIM filtration gel On peut ici voir que GGC est encore présente après être passée par le filtre 0.2 mm, cette hypothèse n'était donc pas la bonne. On pense donc que GGC s'accumule sur le filtre de la colonne de filtration, ou qu'elle était trop diluée... Troisième semaine On commence à purifier TIM et TOM : après avoir brisé les cellules au sonicateur, on les centrifuge et 24 on re-suspend les pellets dans un tampon. Pour TOM, on commence par faire une concentration. Pour TIM, puisque le complexe possède de base une polyhistidine (His-tag), on peut opérer une chromatographie d'affinités (His-Trap, pull-down) sur colonne Ni-NTA. On clive ensuite le His-tag de TIM (avec du TEV, DTT et EDTA), et on fait un second pull-down, qui va éliminer tous les TIM qui n'ont pas été clivés (ils se retrouveront dans l'élution, puisqu'ils se fixent à la colonne : les TIM clivés qui nous intéressent se trouvent cette fois dans le flow-through, ce qui s'écoule du filtre, et non dans l'élution, il est donc à conserver précieusement). On peut cette fois concentrer TIM, puis opérer une dialyse. On fait ensuite une filtration gel de TIM pour le purifier au maximum (sur colonne S200 16/60). On opère ensuite un pull-down de TOM qui possède également une polyhistidine : TIM recyclé fractions du pull-down de TOM TOM TIM On fait aussi un Western-Blot de AAC et de POR : aucune photo n'a été prise, étant donné qu'il n'y avait rien à voir : ni AAC ni POR n'ont été transférées, ce qui signifie qu'elles n'ont pas été exprimées par les cellules. On projette donc de faire une purification d'ADN plasmidique de POR et de AAC pour envoyer les plasmides au séquençage et vérifier que ce sont les bons. Quatrième semaine On recommence des cultures bactériennes avec GGC dans des BL21DE3, et TOM, AAC, POR dans des cellules DH5α, qui sont utilisées pour les extractions de plasmides. On destine les cultures de TOM, AAC et POR au séquençage, et celle de GGC à un marquage isotopique au cultiver les BL21 dans un milieu minimal M9, avec du glucose au 13C. 25 13 C. On va donc (La purification d'ADN s'est toutefois soldée par un échec dû à une erreur expérimentale, les cultures sont donc à recommencer la semaine prochaine). On tente également de former le complexe TIM/TOM : d'abord un pull-down classique, puis un pulldown sans TIM pour servir de contrôle négatif. On concentre ensuite l'élution TIM/TOM : MW TIM/TOM conc. TIM/TOM pull-down neg. control TOM TIM SN pellet (surnageant) wash wash elu (TIM)(buffer) wash elu (buffer) On constate plusieurs choses : le complexe, si complexe il y avait, s'est de toute façon dissocié pendant la concentration, puisqu'on retrouve TIM dans le surnageant et TOM dans la pellet. Dans l'élution du pull-down, on retrouve TIM et TOM, ce qui devrait être bon signe…malheureusement, on retrouve aussi TIM dans le lavage au tampon, ce qui semble suggérer que le TIM qu'on retrouve avec TOM est simplement du TIM résiduel, et que le complexe ne se forme pas. Le fait de retrouver TOM dans l'élution du contrôle négatif pose également question : TOM, en tant que protéine membranaire, est hydrophobe, donc normalement insoluble...si on a pu l'éluer, TOM a du être solubilisée d'une façon ou d'une autre, peut-être en se repliant d'une certaine façon sur la colonne. L'expérience est dans tous les cas à répéter. Cinquième semaine On répète le pull-down TIM/TOM dans les conditions exactes utilisées pour TIM/GGC (Ni-NTA 5 mL) en insistant sur le lavage au tampon pour éliminer toute ambiguïté. Cette fois, il n'y a quasiment pas de TIM dans l'élution : la conclusion, temporaire, est que le complexe TIM/TOM ne se forme pas avec ce protocole. On recycle le TIM utilisé pour les deux pull-down. 26 On tente également de former TIM/TOM en mettant les deux en présence dans du GnHCl 3 M, dans les mêmes concentrations que celles qu'on utilise pour le pull-down, dans une une dialyse (apparemment, une équipe avait réussi à former TIM/GGC de cette façon), mais la précipitation a été très rapide. Enfin, on recommence la culture de TOM, AAC et POR dans des DH5α et on fait la purification d'ADN. Sixième semaine À la suite d'une deuxième infection de phages, la salle de culture bactérienne est fermée pour la semaine, et la salle de biochimie n'est accessible qu'en début de semaine. On a tout de même pu préparer une future expérience nécessitant de savoir à quelle concentration d'imidazole le complexe TIM/GGC était élué pendant le pull-down. Pour cela, on a utilisé des fractions de tampon d'élution avec une concentration d'imidazole croissante : GGC TIM Concentration (en mM) 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 On peut voir que autour de 250 mM, le complexe est le plus élué. Le reste de la semaine a été principalement consacré à la rédaction de mon rapport de stage et à la découverte de la spectroscopie RMN. 27 Conclusion Ce stage fut une expérience très enrichissante, ainsi qu'une opportunité précieuse. En effet, pouvoir effectuer un stage en première année universitaire est rare, et devrait (vraiment!) motiver tout étudiant hésitant à fournir les meilleurs résultats possibles pour pouvoir y prétendre. C'est une véritable découverte du monde professionnel à travers un laboratoire de recherche. J'ai de plus eu la chance considérable d'obtenir une dérogation permettant un stage de six semaines alors que j'étais en première année... Bien sûr, au niveau d'étudiants en licence, les stages sont principalement expérimentaux, mais être entouré par des thésards, des post-doctorants et des chercheurs pendant la durée du stage renseigne vraiment sur les difficultés que l'on va rencontrer , tout en motivant considérablement. J'ai eu l'occasion d'assister à des séminaires, des réunions de groupe, des préparations de soutenances de fin de stage de master ou de concours d'école doctorale (pour décrocher des financements de thèse), tous en anglais. C'est en fait une véritable ouverture : mon stage s'est déroulé dans une équipe très internationale, d'où la nécessité de l'anglais. J'ai pu rentrer en contact avec plein d'horizons différents, entendre parler espagnol ou allemand au quotidien. J'ai également rencontré et échangé avec des stagiaires d'autres filières, ou d'autres années : une stagiaire de L3 de physique à l'ENS Cachan, une stagiaire de première année de BTS Bio-analyses, une stagiaire de fin de master de physique…(que je remercie d'ailleurs ici une seconde fois, parce qu'elles ont toutes les trois grandement participé à mon intégration dans l'équipe). Ce stage d'excellence a véritablement ancré les études que j'ai faites dans leur contexte concret et professionnel , qui, j'en ai l'impression, nous échappe trop souvent quand on étudie, et devrait pourtant participer à notre motivation. Je pense particulièrement aux cours et TP de biochimie, qui peuvent à certains sembler assez obscurs, mais qui ont fait partie du quotidien de mon stage. Ce qui m'a par ailleurs permis de beaucoup m'améliorer dans l'exercice des techniques de laboratoires telles que je les ai décrites plus haut. J'évoque également la démarche de trouver le stage d'excellence : le fait que les stages soient déjà proposés à l'université et que les étudiants n'aient plus qu'à les sélectionner est, bien sûr, infiniment appréciable. Toutefois, l'apparition de la mention « pourvu » n'est pas systématique devant les stages pris… peut être par des étudiants qui n'appartiennent pas à l'UJF ? On pourrait également souhaiter un petit peu plus de conseils dans la démarche de contact des professionnels et de sélection pour le stage, puisque certains d'entre nous n'ont jamais été en contact avec le monde professionnel, même pour 28 trouver un travail d'été (ne sachant donc pas vraiment rédiger ni CV, ni une lettre de motivation, et encore moins passer un entretien professionnel). Annexes Liens des images utilisées Figure 1 : http://jcb.rupress.org/content/179/4/585/F1.expansion.html Figure 2 : http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3DXR Figure 3 : http://www.odec.ca/projects/2006/sidh6h2/bg.html Figure 4 : http://fr.aliexpress.com/item/500pcs-2ml-Silica-Gel-membrane-column-for-plasmid-DNARNA-extraction/1896269196.html Figure 5 : http://www.labome.fr/method/Protein-Purification.html Figure 6 : https://www.iba-lifesciences.com/details/product/2-3202-051.html Figure 7 : https://www.sodipro.fr/catalogue/fiche-mat.php?refart=3103012 Figure 8 : http://www.capitolscientific.com/Millipore-UFC910024-Amicon-Ultra-15-Centifugal-FilterConcentrator-with-Ultracel-100-Regenerated Figure 9 : https://en.wikipedia.org/wiki/Chromatography#/media/File:Preparative_HPLC.svg Figure 10 : http://www.labome.fr/method/Protein-Purification.html Figure 11 : http://www.di.uq.edu.au/sparqsdspage Figure 12 : http://www.hoeferinc.com/index.php/four-gel-caster-for-10-x-8-cm-plates.html Figure 13 : http://www.dutscher.com/frontoffice/product?produitId=0B-42-02 Figure 14 : https://fr.wikipedia.org/wiki/Transfert_%28biologie_mol%C3%A9culaire %29#/media/File:Blot_biology.svg 29
