Effet des HDLs sur la balance Th1/Th2 au cours de diabète de type I
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TLEMCENN°D’ORDRE UNIVERSITE DE TLEMCEN-ABOUBEKR BELKAID FACULTE SNV/STU – DEPARTEMENT DE BIOLOGIE Laboratoire de Biologie Moléculaire Appliquée et Immunologie Mémoire Présenté pour obtenir le grade DE MASTER II EN IMMUNOLOGIE Par BELAMRI Ahmed Soutenu le 30/06/2016 Intitulé: Effet des HDLs sur la balance Th1/Th2 au cours de diabète de type I JURY: Pr. Mohammed chems-edine SMAHI Pr. Mourad ARIBI Dr. Sana BOUALI Dr. Nabila BRAHAMI Professeur professeur Maître-assistant B Maître-assistant B Président Encadreur Examinatrice Examinatrice 30 juin 2016 TLEMCENN°D’ORDRE UNIVERSITE DE TLEMCEN-ABOUBEKR BELKAID FACULTE SNV/STU – DEPARTEMENT DE BIOLOGIE Laboratoire de Biologie Moléculaire Appliquée et Immunologie Mémoire Présenté pour obtenir le grade DE MASTER II EN IMMUNOLOGIE Par BELAMRI Ahmed Soutenu le 30/06/2016 Intitulé: Effet des HDLs sur la balance Th1/Th2 au cours de diabète de type I JURY: Pr. Mohammed chems-edine SMAHI Pr. Mourad ARIBI Dr. Sana BOUALI Dr. Nabila BRAHAMI Professeur professeur Maître-assistant B Maître-assistant B Président Encadreur Examinatrice Examinatrice 30 juin 2016 Résumé II Résumé Introduction : Le diabète de type I (DT1), c’est une maladie auto-immune qui cause aujourd’hui un véritable problème sanitaire .cette maladie est caractérisée par la destruction auto-immune des cellules beta des ilots pancréatiques, impliquant les lymphocytes TCD4+ et TCD8+ auto réactivés ainsi les macrophages et les cellules dendritiques. Par ailleurs plusieurs recherches ont montré que les HDLs ont un rôle à jouer dans la pathogénie des maladies auto-immunes. Dans cette optique un essai ex-vivo a été réalisé au niveau de laboratoire de biologie moléculaire appliqué et immunologie faculté des sciences de la nature et de la vie et sciences de la terre et de l’univers département de biologie université Aboubaker Belkaid Tlemcen. Objectif : étudier l’effet des HDLs sur l’activité des macrophages/cellules T au début de DT1. But : montrer que les HDLs pourraient avoir un rôle à jouer sur l’activité des macrophage/cellules T au début de DT1. Matériels et méthodes : Deux type cellulaire : MDM (monocyte derived macrophage) et lymphocytes T CD4+ isolés a partir des PBMC (peripheral blood mononuclear cells) d’un sujet sain et d’un diabétique nouvellement diagnostiqué,ont été soumis à un ex-vivo. Résultats :la production d’IFN ᵧ et d’IL-2 est significativement diminuée (p=0.003) au niveau des co-cultures (macrophages/cellules T) de contrôle et de DT1 traitées par les HDLs à 50 µg/ml comparé aux contrôle et DT1 non traité par les HDLs. La production d’IL-4 et d’IL-10 est nettement élevée (p=0.003) et (p=0.001) respectivement au niveau des co-cultures (macrophages/cellules T) de contrôle et de DT1 traitées par les HDLs à 50 µg/ml comparé aux contrôles et DT1 non traité par les HDLs. Parallèlement les taux de phosphorylation des STAT4 sont significativement diminués (p=0.003) au niveau des co-cultures (macrophages/cellules T) de contrôle et de DT1 traitées par les HDLs à 50 µg/ml comparé aux contrôle et DT1 non traité par les HDLs et les taux de phosphorylation des STAT6 sont significativement élevés (p=0.003) au niveau des co-cultures (macrophages/cellules T) de contrôle et de DT1 traitées par les HDLs à 50 µg/ml comparé aux contrôle et DT1 non traité par les HDLs. Résumé II Conclusion et perspectives : les HDLs diminuent la production d’IFN ᵧ et d’IL-2 et faire augmentés la production d’IL-4 et d’IL-10 aussi diminuent les niveaux de la phosphorylation des STAT-4 et augmentent les niveaux de la phosphorylation des STAT-6. Les HDLs pourraient avoir un rôle a joué sur la balance TH1/TH2 et le devenir de macrophages en M2. Mots clés : diabète de type I , HDLs , Th1 , Th2 , Macrophage. Abstract III Abstract Introduction: Type I diabetes (DT1) is a major health problem today, it’s an autoimmune disease that result of the autoimmune destruction of beta cells of the pancreatic islets, involving the self reactivated TCD4+ and TCD8+ lymphocytes so the macrophages and the dendritic cells. Furthermore, several studies have shown that HDLs have a role in the pathogenesis of autoimmune diseases. In this context an ex-vivo test has conducted at the applied molecular biology and immunology laboratory, Faculty of the natural and life sciences and the earth and space sciences, biology department, University Abubaker Belkaid Tlemcen. Objectives: To study the effect of HDLs on the activity of macrophages / T cells at the beginning of T1D. Aim: to show that HDLs could play a role to exploit the activity of the macrophage /T cells at the begening of TD1. Materials and methods: Two cell types, MDM (monocyte derived macrophages) and TCD4+ cells have isolated from PBMC (peripheral blood mononuclear cells) of healthy subject and a newly diagnosed diabetic and have subjected to an ex-vivo. Results: The IFN ᵧ and IL-2 production was significantly reduced (p = 0.003) in co-cultures (macrophages / T-cells) of the control (DT1) treated with HDLs 50 μg / ml compared to the control (DT1) untreated by HDLs. whereas, the production of IL-4 and IL-10 was significantly high (p = 0.003) and (p = 0.001) respectively. In parallel, STAT4 phosphorylation levels were significantly reduced (p = 0.003) in co-cultures (macrophages / T-cells) of the control (DT1) treated by HDLs 50 μg/ml compared to the control DT1 untreated by HDLs. While, STAT6 phosphorylation levels were significantly high (p = 0.003). Conclusion: HDLs decrease the production of IFN ᵧ and il-2 and make increased the production of IL-4 and IL-10 also decrease the phosphorylation of STAT4 and increased the phosphorylation of STAT6 ; HDLs could have a role on balance TH1/TH2 and became too it macrophage in M2 Keywords: type 1 diabetes (TD1), HDLs, Th1, Th2, macrophage. Avant-propos IV Avant propos Je tiens à remercier tout particulièrement les nombres du jury pour leur ferveur et dévotion ; ainsi que leur honorable présence. Professeur Mourad ARIBI directeur de laboratoire de recherche BIOMOLIM, UABT. Professeur Mohammed chems-edine SMAHI, UABT. Monsieur Moustapha HADOUCHE, maitre assistant A, UABT. Madame Ibtisem TAHRAOUI, Phd, UABT. Docteur sanaa BOUALI, UABT. Madame Nabila BRAHAMI, maitre assistant B, UABT. Il me faut remercier aussi : Tout les membres de laboratoire de recherche biomolim. J’exprime aussi ma sincère gratitude à mes enseignants pour leur soutien et leurs conseils durant les cinq années universitaires. Ce travail a pour objectif d’étudier l'effet des HDLs sur la balance TH1/TH2 au cours de diabète de type I ; c’est pour cela un essai ex-vivo a été réalisé au niveau de laboratoire de biologie moléculaire appliqué et immunologie ; sous la direction de Professeur Mourad ARIBI ; qu’il soit persuadé de mes vives reconnaissances. Le présent mémoire est structuré en six chapitre : revue de la littérature, matériels et méthodes, résultats et interprétation, discussion, conclusion et perspectifs ; il s’inscrit dans le cadre de ma formation universitaire pour l’obtention du grade de Master II en Immunologie. Je dédie ce modeste travail à mes chers parents et à toutes les personnes que j’estime Liste des figures VI LISTE DES FIGURES Figure 1.1 pléiotropie d’HDL ………..…………………………………………………………………… 8 Figure1.2 les différents composants d’HDL et leur mode d’action…………................................... 10 Figure 1.3 synapse immunologique CPA/LT CD8+………………………………………………….. 11 Figure 1.4 dynamique de la réponse immunitaire LTCD4+ ……………..….………………………. 12 Figure 1.5 interactions de costimulation CPA/CD4+ et CPA/CD8+ ………..………………………. 13 Figure 1.6 structure des STATs…………………………………………………...……………………. 15 Figure 1.7 cascade de signalisation STAT4 ………………………..….……..………………………. 16 Figure 1.8 cascade de signalisation STAT 6 ……………………………….…..……………………. 18 Figure 2.1 récupération des PBMC …………………………………….………..……………………. 20 Figure 3.1 Effet des lipoprotéines de haute densité sur la production de l’IL-2au niveau des cocultures macrophages-lymphocytes T de cellules isolées au début du diabète de type 1……………….……………………………………………………………………………………….... 27 Figure 3.2 Effet des lipoprotéines de haute densité sur la production de l’IFN-γ au niveau des cocultures macrophages-lymphocytes T de cellules isolées au début du diabète de type 1.…………….….……………………………………………………………. 27 Figure 3.3 Effet des lipoprotéines de haute densité sur la production de l’IL-4 au niveau des cocultures macrophages-lymphocytes T de cellules isolées au début du diabète de type 1. …... Figure 3.4 .Effet des lipoprotéines de haute densité sur la production de l’IL-10 au niveau des cocultures macrophages-lymphocytesTde cellules isolées au début 28 du diabète de type 1……………………..…..…………………………………………………… 28 Figure 3.5 Effet des lipoprotéines de haute densité sur le taux de phosphorylation des STAT4 et STAT6 au niveau des cocultures macrophages-lymphocytes T de cellules isolées au début du diabète de type 1…..………………………………………………………………………………….. 29 Liste des abréviations LISTE DES ABREVIATIONS Apo-A: Apo lipoprotéines A. CMH: complexe majeur d’histocomptabilité. CPA: cellule présentatrice d’antigène. CD: classe de différentiation. DT1:diabète de type 1. DBD:DNA binding Domain. D.O: densité optique. EDTA: éthylène diamine tétra acétique acide. GSPX: selenoperoxidase de glutathionne. GAD 65: acide glutamique. HRP: horseradish peroxidase. HDL: high density lipoproteins. IL-4 : interleukine 4. IL-1 : interleukine 1 beta. IFN- : interféron gamma. IL-10 : interleukine 10. IL-2 : interleukine 2. Ig E : immunoglobuline E. Ig G1 : immunoglobuline G 1. IA-2 : phosphatase. Jak : Janus kinase. LCTA : acyl transférase de lécithine/cholestérol. LTCD4+ : lymphocytes T CD4+. LTCD8+ : lymphocytes T CD8+. LTC : Lymphocyte T cytotoxique. VII Liste des abréviations Micro RNs: micro ribonucleic acid. M1: macrophage 1 pro inflammatoire . M2: macrophage 2 anti inflammatoire. MDM: macrophage derived monocyte. NFƙB: nuclear factor kappa B. PGA: prostaglandine synthétase. PGE: prostaglandine. PRR: patterns recognition receptor. PAMPs: pathogen associated molecular patterns. PBS: phosphate buffered saline. PBMC: peripheral blood mononuclear cells. PHA: polyhydroxyalkanoates. PON1: paraoxanase. RPMI: Roswell park memorial institute medium. SH2: Src homology 2. STATs: signal transducer and activator of transcription. STAT 4: signal transducer and activator of transcription 4. STAT 6: signal transducer and activator of transcription 6. Src 2: steroid receptor co activator-2. SAA: amyloïde A sérum. SVF : sérum de veau fœtal Tpm: tour par minute. TLR: toll like receptor. TCR: T cells receptor . C: chaine commune gamma. VII Introduction.1 Introduction : Le diabète de type I (DT1) est une maladie auto-immune caractérisée par l’autodestruction des cellules bêta des ilots de Langerhans, la base de cette observation est la présence d’une inflammation chronique qui affecte les ilots pancréatiques au début symptomatique du DT1 (Sarah J. Richardson et al ., 2014). Des données récentes suggèrent que l’autodestruction des cellules bêta des ilots de Langerhans, pourrait être due à des toxines virales et environnementales et /ou une réaction auto-immune, contre les auto-antigènes des cellules bêta. Les lymphocytes T CD 4+ helper (LTh) sont activées par les cellules présentatrices d’antigène (macrophages, cellules dendritiques).les macrophages secrètent l’IL-12 qui stimule les TH1 pour secréter l’IFN gamma et l’IL-12 ; l’IFN gamma (IFN ) stimule d’autres macrophages pour secréter d’autres cytokines tels que l’IL-1 beta (IL-1 ) , TNF alpha (TNFɑ ) (Thomas A .Wynn et al ., 2013). Le DT1 est caractérisé par un déséquilibre de la balance TH1/TH2 en faveur des cytokines pro-inflammatoires TH1. Les lymphocytes B jouent un rôle dans la pathogénie du DT 1, en produisant des anticorps dirigés contre des antigènes libérés par les cellules bêta. Par ailleurs les LTCD8+ cytotoxiques (LTC) stimulé par l’IFN gamma provoquent la lyse directe des cellules bêta (cellules ) pancréatiques. (C-Gelbert et al. , 1994 ,Nmaclara et al. , 1999). Les HDL sont des complexes de protéines et de lipides secrétés au niveau du foie. Ces molécules sont connues pour leurs propriétés anti-inflammatoires, anti-oxydantes et anti-athérogènes. Les HDL interagissent avec les TLR 4 et inhibent la réponse antivirale induite par les LPS.Il a été montré que les HDL peuvent avoir un effet pléiotropique au cours des maladies auto-immunes sur différents type cellulaires (Sandra parra et al., 2014). Introduction.2 Des études récentes ont montré que l’HDL cholestérol peut inhiber la présentation antigénique aux lymphocytes T en réduisant les radeaux lipidiques, ce qui va bloquer l’expression des CMH II et la différenciation des macrophages et ainsi provoquer l’inactivation des LT CD4+ (Shu.huiwang et al ., 2012). Le processus du DT1 est induit par l’activation, des lymphocytes par les autoantigènes, qui vont détruire la cellule bêta pancréatique productrice d’insuline. Pour cela nous avons supposé que l’HDL peut avoir un effet inhibiteur sur la présentation antigénique Macrophage/Lymphocyte T CD4+ chez les diabétiques de type 1 nouvellement diagnostiqués (Giuseppe D.N et al ., 2011). Chapitre .1 revue de la littérature 3 1.1 Diabète de type 1 : 1.1.1Le processus diabétogène : Le diabète est un ensemble des maladies métaboliques caractérisées par une hyperglycémie résultant des défauts dans la sécrétion et/ou dans l’action d’insuline. L’hyperglycémie chronique du diabète est associée aux dommages et aux dysfonctionnements des différents organes ; particulièrement les yeux, les reins, les nerfs, le cœur, et les vaisseaux sanguins. Plusieurs processus pathogènes sont impliqués dans le développement du diabète, dont la destruction auto-immune des cellules bêta pancréatiques des ilots de Langerhans et l’insuffisance conséquente d’insuline (Genuth S et al ., 2003). Le déficit d’insuline sur des tissus cibles est la base des anomalies, dans les tissus adipeux, et dans le métabolisme des protéines au cours du diabète. Cette action déficiente d’insuline, résulte de la sécrétion insuffisante et/ou des réponses diminuées des tissus à l’insuline. L’affaiblissement de la sécrétion d’insuline et des défauts dans son action coexiste fréquemment chez le même patient. L’hypertension et les anomalies du métabolisme des lipoprotéines sont souvent trouvées chez les patients diabétiques (Edelnan D et al ., 2004). 1.1.2immunopathogénie du diabète de type 1 : La présence d’une insulino résistance suite à la détection des auto anticorps, et de lymphocytes T auto réactifs activés contre des antigènes exprimés par les cellules , et la survenue de la maladie chez des sujets exprimant des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH), font du diabète de type 1 une maladie auto-immune. Le diagnostic clinique est précédé d’une phase asymptomatique préclinique durant laquelle il y a une détection des auto-anticorps circulants dans le sang dirigés contre des antigènes intracellulaires des cellules . (jusola et al ; 2016). Malgré l’identification des trois principaux auto-antigènes du diabète de type 1 (insuline, décarboxylase de l’acide glutamique (GAD 65) et phosphatase IA-2) ; l’origine de ce processus auto-immunitaire demeure toujours inconnue (Gennen .V et al, 2005). HDL et activité macrophage/cellule T au début du DT1 4 1.1.3Paramètre de la réponse auto-immune diabétogène : L’activation des cellules T auto réactifs exige la présence des auto-antigènes exprimés par le CMH II. Cependant les molécules de CMH II ne sont pas exprimées normalement sur les cellules bêta in vivo. Il a été montré in vitro que l’expression des molécules de CMH II peut être induite sur la surface des cellules bêta par l’effet combiné de l’IFN ᵧ et de TNF ɑ (Pujol-borell R et al .,1987) ; cela cause par la suite, l’activation des T naïfs auto réactifs dans les ilots de Langerhans. Les auto antigènes sont présentés aux cellules T naïfs auto réactifs, par les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) exprimant principalement des molécules de CMH II ; la première rencontre des CPA et T auto réactif aura lieu dans les ganglions lymphatiques pancréatiques, les cellules T auto réactifs activées sont capable d’envahir les ilots de langerhans ou elles deviennent réactives en rencontrant les auto antigènes des cellules beta (Di Lorenzo TP et al ,. 2007). Les actions opposés des cellules T auto réactives et les cellules T régulateurs, sont réglées par la production respective des cytokines (Makoto M and Shimon S ., 2008). Plusieurs recherches, suggèrent que les cellules T CD 4+ auto réactifs principalement la sous population des TH1, activées par les CPA via le complexe antigène bêta-CMH II, sont la cause majeure de la destruction des cellules bêta sécrétrices d’insuline. Les cellules TH1 activées, produisent IL-β et l’IFN ᵧ, qui empêche la production d’IL-4 et IL-10 par les TH2. Par ailleurs l’IL-β et l’IFN ᵧ activent les macrophages et les LT CD 8+ cytotoxiques, responsables de la destruction des cellules bêta des ilots de langerhans, par les interactions directes avec les antigènes des cellules beta, présentés via les molécules de CMH I des cellules beta, impliquant des interactions Fas/FasL , perforines et granzymes provoquant la lyse les cellules beta productrices d’insuline (Alex Rabinovitch and Wilam L. Suarez- Pinzon .,1998). Chapitre .1 revue de la littérature 5 Plus de 90% des diabétiques récents possèdent des anticorps contre un ou plusieurs de ces auto-antigènes, leurs valeurs prédictive et aussi bien reconnue, car ils sont détectés plusieurs années avant l’apparition des signes cliniques liées à la carence en insuline, la présence d’auto-anticorps contre plusieurs antigènes a plus de valeur qu’un titre élevé d’anticorps contre un seul auto-antigène.(Gepts W .1965 ). 1.2 balance TH1/TH2 et l’immunopathogénie de diabète de type 1 : Les premiers modèles de la différenciation des lymphocytes T CD4+, ont été basées sur une dichotomie simple, entre l’IFN dominée dans la réponse TH1 et l’IL-4 dominée dans la réponse dite TH2 (L.S.K Walker and M. Von Herrath., 2015). Les lymphocytes TH1 peuvent être induites par l’IL-1β et sont importante pour l’activation des macrophages et l’élimination des pathogènes intracellulaires. Les lymphocytes TH2 rentrent dans l’hypersensibilité et la réponse anti parasitaire impliquant l’immunoglobuline IgE ; les mastocytes et les éosinophiles. Le diabète auto-immun semble tomber dans le biais TH1 (Katz JD et al ., 1995).Certains nombre d’études ont mis en évidence un rôle direct de la cytokine IFN ᵧ, considérée comme signature des lymphocytes TH1, dans la conduite du processus du DT1.l’expression d’IFN ᵧ sous le contrôle du promoteur de l’insuline humaine a été montré être suffisante pour provoquer le développement du diabète chez la souris (Servetnick N et al ., 1988) ; et inversement le blocage d’IFN ᵧ chez la souris NOD pourrait prévenir le diabète (Debray-sacks M et al ., 1991). En effet l’IFN a été impliquée dans le homing des lymphocytes T diabétogènes aux ilots pancréatiques chez la souris NOD (Savinov AY et al ., 2001), une importance recherche a mis en évidence l’implication de la voie de signalisation de l’IFN dans la mort des cellules bêta ; l’événement destructeur critique au cours de diabète auto-immune. (Chong MM et al 2001). HDL et activité macrophage/cellule T au début du DT1 6 1.3 Lipides, lipoprotéines et réponse immuno-inflammatoire : La réaction inflammatoire met en jeu différents types cellulaires dont les cellules du système immunitaire, les cellules épithéliales et endothéliales. La coordination entre ces phénomènes nécessitent un réseau de communication intercellulaire impliquant sur le plan biochimique des cytokines et certains médiateurs lipidiques (Sigal E ., 1991). Pour cela plusieurs mécanismes sont impliqués dans les relations cytokines et métabolismes lipidiques. Il a été démontré que les cytokines ont une action sur la synthèse des enzymes du métabolisme lipidique ; certains cytokines telles que l’IL-1 ne stimulent pas seulement la production d’acides aminés mais aussi stimulent la synthèse de prostaglandine synthétase (PGA) (Y.Pacheco et al ., 1992). 1.3.1Actions des cytokines sur la synthèse des enzymes du métabolisme lipidique : Il a été montré que les cytokines ont une action sur le métabolisme lipidique eu cours d’inflammation. 1.3.1.1 Au niveau des macrophages : Le système monocyte/macrophage représente la première ligne des cellules immunitaires produisant des prostaglandines (PGE) (Raz A et al ., 1988). une augmentation de l’expression de la PGH synthétase est provoquée au cours de la différenciation des monocytes, produites après stimulation par les diacylglycérols et les dicoters de phorbols (spotts G.D and Hann S.R ., 1982). 1.3.1.2 Synergie d’action entre cytokines et ecosanoides : Le PGE seule n’est pas capable de stimuler la production d’immunoglobuline E (Ig E) ou Ig G1 à partir des lymphocytes B murins ; l’association de cette dernière avec IL-4 permet de potentialiser cette production alors que celles d’Ig M et Ig Gγ s’effondrent (Phipps R.P et al ., 1990). Chapitre .1 revue de la littérature 7 L’élévation des taux de PGE semble propice au Switch isotypique. Les effets des PGE sur les cellules T doivent être pris aussi en considération car les lymphokines provenant des lymphocytes T jouent un rôle très important dans le Switch (Betz M and Fox B.S ., 1991). Les PGE induisent une diminution de la production des IL-β et l’INF ᵧ par la sous population TH1 mais, n’ont pas d’effet sur la production d’IL-4 par la sous population TH2, qui potentialise la production Ig E et Ig G1 par les lymphocytes B ; par ailleurs les PGE augmentent la production de l’IL-5 qui potentialise la production Ig E par les lymphocytes B. (y.pacheco et al., 1993). 1.4Action anti-inflammatoire d’HDL : L’HDL pourrait atténuer l’accumulation de cholestérol cellulaire grâce au transport inverse de ce dernier et par l’action direct sur les actions de signalisation qui inhibent les voies inflammatoires. De multiples études ont démontrés que l’HDL empêche la transcription des gènes inflammatoires et inhibe l’activité des facteurs de transcription essentiel à la réponse inflammatoire (Nofer , J. R et al ., 2003). Les effets anti-inflammatoires De l’HDL sont bien élucidés sur les cellules immunitaires y compris les monocytes et les macrophages (Tomoyuki Y et al ., 2010); et aussi sur les cellules hématopoïétiques, les cellules souches et les cellules multipotentes pro génitrices (Murphy A.J et al ., 2008) . L’HDL a aussi une action dans les tissus métaboliques dont le foie, le pancréas et les muscles, ainsi que les niveaux bas d’HDL associés au syndrome métabolique, pourraient jouer un rôle permissif dans la promotion de l’accumulation des lipides cellulaires et l’inflammation dans de nombreux types cellulaires (figure1) (Yvan-charvet ,L et al ., 2010). HDL et activité macrophage/cellule T au début du DT1 8 Figure 1.1 : pléiotropie d’HDL (brianG.drew et al ., 2012) 1.5 Biologie moléculaire d’HDL : L’HDL plasmatique à une densité hydratée de (1.063-1.21 g/ml) est un groupe hétérogène de petites particules discoïdes et sphériques (7-12 nanomètre de diamètre) avec un contenu à haute valeur protéique (30-70 % du poids total) et il possède la plus petite dimension par rapport aux autres classes des lipoprotéines. Les protéines composantes d’HDL sont subdivisées en quatre groupes, les apolipoprotéines, les protéines transférantes des lipides, et autres petites protéines (avec un taux inférieur à 5 % des protéines total d’HDL) (Von Eckardestein et al ., 2001). Alors les apoprotéines et les enzymes ont maintenant été largement reconnus pour leurs fonctions clé dans le métabolisme et la fonctionnalité de l’HDL.L’apolipoprotéine ; est une protéine d’une masse moléculaire de β8 KDa qui contient 8 domaines alpha-hélicoïdaux amphipathiques de 22 acides aminés. Les apolipoprotéines sont subdivisées en deux classes Apo-A I qui joue un rôle très important dans la biogénèse, le métabolisme intra vasculaire et la fonction d’HDL, et l’Apo-A II qui représente environ 20 % des protéines Chapitre .1 revue de la littérature 9 totales d’HDL ; les autres petites apolipoprotéines d’HDL incluent l’Apo-IV, Apo-CI, ApoD, ApoE, ApoJ, Apo M et Apo L-I (nobecourt E et al ., 2005). L’HDL plasmatique porte des enzymes impliquées dans le métabolisme lipidiques, incluant l’acyltransférase de lécithine /cholestérol (LCTA), des enzymes avec activités anti oxydantes, telles que la paraoxonase 1 (PON 1) , PAF-AH également appelé phospholipase associé à la lipoprotéine Aβ’ , et selenoperoxidase de glutathion (GSPX) ainsi que d’autres protéines et peptides comme l’amyloïdes A de sérum (SAA) (fig2.1) (Hansel B et al ., 2004);alpha-1 antitrypsine , un inhibiteur efficace de sérine protéinase. Les phospholipides prédominants dans le lipidome d’HDL (principalement les espèces de phosphatidylcholine et de sphingomyélines rendent compte pour 40-60% des lipides totales ; avec peu de proportions de choléstéryl-esters (30-40%), triglycérides (5-12%) et du cholestérol libre (510 %) (Morgan J et al ., 2004). Des analyses lipidomiques récentes utilisant la spectrométrie de masse ont facilités l’identification de plus de 200 différentes molécules de lipide dans l’HDL, l’HDL porte plusieurs copies des micros RNs ; ce qui peut être livré aux cellules et aux tissus, cela prouve son rôle potentiel dans le règlement des gènes et son effet dans la communication cellulaire (Kontush et al ., 2003). HDL et activité macrophage/cellule T au début du DT1 10 Figure 1.2 : les différents composants d’HDL et leurs mode d’action (Kontush .A and Chapman M.J ., 2005 ). Chapitre .1 revue de la littérature 11 1.6 Macrophage et apprêtage de l’antigène aux cellules T : Les lymphocytes T expriment un récepteur de surface TCR ; qui se lie à un antigène simple, les TCR reconnaissent les peptides linéaires courts (de 8 à 12 acides aminés) qui sont dérivés des antigènes protéiques, les peptides antigéniques sont présentés aux lymphocytes T par des cellules exprimant des molécules de CMH (Ronsenthal .A.S and Shevahch E.M ., 1973). Les peptides produits par les cellules qui ont subi des transformations malignes ou infectés par des virus, s’associent aux molécules d’histocompatibilité de la classe I et sont reconnus par les lymphocytes TCD8+ (fig 3.1) (Engleman.E.G et al .,1981). Class I MHC/peptide DC B7, 4-IBBL Naïve + CD8 T cell CD28, 4IBB Figure 1.3 : synapse immunologique CPA/LT CD8+ (Abbas, Lichmab and Pillai. 2001). Tandis que les peptides exprimés par les bactéries extracellulaires, les champignons et les protozoaires sont présentés via le CMH de classe II et sont reconnus par les lymphocytes TCD4+ (fig4.1) (Baroja .M.L et al 1989). HDL et activité macrophage/cellule T au début du DT1 12 Figure 1.4 : dynamique de la réponse immunitaire LTCD4+ (Abbas, Lichmab and Pillai. 2001). Les lymphocytes T comme les lymphocytes B exigent deux signaux pour être activés ; l’activation est lancée quand un lymphocyte T identifie et lie l’antigène par son TCR. Mais la liaison aux antigènes est insuffisante pour lancer la cascade de signalisation intracellulaire, un deuxième signal de co-stimulation fourni par l’interaction des molécules de surface des lymphocytes T et les CPA est requise pour la pleine activation. Une fois le lymphocyte T activé la production d’un clone spécifique à l’antigène déclencha. Par ailleurs les signaux fournis suite à la liaison de l’antigène et l’activation par les molécules de co-stimulations induisent la transcription des gènes qui mène à la synthèse et à la sécrétion des cytokines et chémokines (fig5.1) (Katz .D.H et al 1973). Chapitre .1 revue de la littérature 13 Figure 1.5 : interactions de costimulation CPA/CD4+ et CPA/CD8+ (Abbas, Lichmab and Pillai. 2001) 1.7 Macrophage et phagocytose : Les macrophages sont des composants essentiels d’immunité innée et jouent un rôle très important dans l’inflammation et la défense de l’hôte (Gordon .s and Martinez FO ., 2010).La lignée des monocytes-macrophages est caractérisée par une plasticité considérable, dans les tissus. Les phagocytes mononuclées répondent aux facteurs environnementaux avec l’acquisition des phénotypes fonctionnels distinctes (Biswas .SK and Mantovani .A ., 2010) les macrophages peuvent subir une activation vers M1 dite classique par des ligands ,IFN ᵧ et TLR, ou une activation vers Mβ dite alternative stimulée par l’IL4/IL13. Ces états reflètent la polarisation TH1/TH2 des lymphocytes T (Sica A and Bronte .V ., 2007). Le phénotype M1 est caractérisé par l’expression des niveaux élevés des cytokines pro-inflammatoires ; production élevée de monoxyde d’azote et une activité microbicide et anti tumorale forte. Par contre le phénotype M2 des macrophages est caractérisé par des niveaux élevés des cytokines anti-inflammatoires et est considéré être impliqué dans le HDL et activité macrophage/cellule T au début du DT1 14 retenue des parasites et la réparation tissulaire et aussi à avoir des fonctions immuno régulatrices (Mantovani A et al ., 2002). Le premier défi de l’immunité innée est la lutte contre un grand nombre des agents pathogènes potentiels de l’individu, utilisant un nombre restreint des récepteurs phagocytaires. ce défi a été révélé par l’évolution d’une variété des récepteurs qui reconnaissent des motifs conservés sur les agents pathogènes, qui ne sont pas trouvés chez les eucaryotes supérieurs ; ces motifs ont des rôles essentiels dans la biologie des agents d’envahissement .Januway a proposé d’appeler les récepteurs paterns recognation receptor (PRR) et les molécules cibles pathogen associated molecule paterns (PAMPs). Les motifs associés aux pathogènes incluent les mananes des paroies de levure, les peptides formylés des bactéries les lipopolysaccharides et les acides polyteichoic sur la surface des bactéries Gram négatif et Gram positif. Les récepteurs cellulaires qui identifient ces modèles incluent le récepteur des mananesaussi bien que les integrines (CD11b/CD18) et des récepteurs extracellulaires, qui identifient les composants des bactéries, comprenant les LPS des bactéries Gram positif (sastry K and Ezekowitz R.A ., 1993). L’HDL devient dysfonctionnel et pro-inflammatoire pendant les infections aigues, il ya un changement po-inflammatoire au niveau des HDL s qui mettent en parallèle une diminution de la capacité d’HDL de réguler le flux de cholestérol des macrophages ; HDL est converti d’une lipoprotéine anti-inflammatoire qui supprime l’adhérence des monocytes a l’endothélium à une forme po-inflammatoire qui ne supprime pas l’adhérence des monocytes pendant la réponse de la phase aigüe (Alan R.T and Laurant Y.C ., 2015) Chapitre .1 revue de la littérature 15 1.8 STAT 4/6 et le devenir de TH : Les STAT se sont des protéines de 750 à 850 acides aminés contient plusieurs domaines dont le domaine N terminal, bobine enroulé, SH2, éditeur de lien, site de liaison d’ADN (DBD), domaine de transcription (fig6.1) (John J et al. ,2002). Nous nous sommes intéressés dans cette étude sur les deux sous famille STAT4 et SATAT6. Figure 1.6 : structure des STATs (John J .O’shea et al ., 2002). 1.8.1Stat4 : Le STAT4 est un composant essentiel de la voie de signalisation d’IL1β, il joue un rôle important dans la différenciation TH1. Cependant, les STAT4 semble être non essentiel pour l’expression d’IFN ᵧ par les TH 1, mais ils sont nécessaire pour augmenter le niveau de production d’IFN ᵧ produit à partir des différentes cellules (Mullen AC et al ., 2001). La manière selon laquelle STAT4 médiatise son effet est toujours incertaine ; bien que ce dernier peut agir par le biais de non consensus des sites de faible affinité, STAT non trouvés dans le promoteur et le premier intron du gène d’IFN g(Xu X et al 1996).Alors que plusieurs protéines STAT sont révélés interagir avec le grand co-activateur transcriptionnel P300/CBP. Les résultats de mulla et al ont suggéré qu’une interaction STAT4/CBP (Bhattachary S et al .,1996) peut être impliquée dans la médiation d’IFN ᵧ optimale produite par les TH1, parce que les cellules CBPL/Icd4 TH1 spécifiquement, perdent le haut niveau de production d’IFN gamma dans la culture au fil du temps (MULLEN A.C et al ., 2001) . Dans d’autres études, il a été révélé que le TCR active la production d’IFN ᵧ par les cellules TH1 effectrices, il semble être indépendant de STAT4, par ce que ces cellules HDL et activité macrophage/cellule T au début du DT1 16 étaient capables de produire de l’IFN ᵧ sans l’activation de STAT4 (Zhang JJ et al ., 1996).En revanche, la voie d’IL-12/IL-18 pour la production d’IFN gamma par les cellules TH1 effectrices, repose fortement sur STAT4. La synergie entre l’IL-12 et IL-18 pour augmenter la production d’IFN ᵧ, semble être médiée par l’intermédiaire des sites STAT et la liaison AP-1, situé au niveau du promoteur d’IFN gamma avec l’IL-18 induisent NFƙB et contribuent à l’augmentation d’expression d’IFNᵧ (Matsumoto S et al ., 1997) (fig 7.1). Figure 1. : Cascade de signalisation STAT4 (Abbas, Lichmab and Pillai. 2001) Chapitre .1 revue de la littérature 17 1.8.2Stat 6 : L’IL-4 c’est une lymphokine pleitropique qui joue un rôle important dans le système immunitaire. Elle active deux voies de signalisation à travers la phosphorylation des tyrosines de STAT 6 (fig : 8.1).Il a été démontré dans plusieurs études que trois résidus centraux de tyrosine dans la chaine d’IL-4Rɑ, sont important pour l’activation de STAT6 (Pernis .A et al ., 1995 ). Ces trois résidus Y575, Y603, Y631, deviennent phosphorylés par la stimulation du récepteur des peptides phosphorylés correspondant à ces phosphotyrosines et aux résidus voisins liant au STAT6 (Ryan J.J et al ., 1996 ). Les phosphotyrosines fournissent ainsi des sites d’amarrages pour les monomères STAT 6 , qui vont obtenir la tyrosine phosphorylé eux même par les récepteurs associés au JAK (Wang H.Y et al ., 1996).Le processus d’activation de STAT 6 est très rapide parce que la phosphorylation de STAT 6 atteint un plateau de stimulation par l’IL-4 dans un intervalle de temps moins de trois minutes (Gregory .G.D et al ., 2006).Par ailleurs la première voie décrite favorisant le destin TH2, est la cascade de signalisation impliquant le facteur de transcription STAT 6(Goenka .S and Kpla .M.H ., 2011 et Hebenstnet et al ., 2006. L ’IL-4 exerce sa fonction après sa liaison avec son récepteur apparenté, le récepteur de type 1 d’IL-4 (IL-4R alpha) et la chaine gamma commune (ᵧc) cette liaison nécessite la dimérisation des deux sous unités de récepteur et même la phosphorylation des résidus de tyrosine, dans IL-4R gamma par Janus kinase « JNK ». Après les monomères STAT 6 se lient par leurs homologie de domaine Src 2 aux résidus de phosphotyrosine dans la partie intracellulaire d’IL-4R alpha et deviennent phosphorylé par les JNK juxtaposés. Les monomères STAT6 phosphorylés vont se dimèriser par l’intermédiaire de leurs homologie des domaines Src 2 et puis transloquer dans le noyau ou ils règlent l’expression des gènes ciblés d’IL-4.Comme d’autres protéines de STAT, le STAT6 agit en tant qu’activateur transcriptionnel pour la grande majorité de sa cible, bien qu’il favorise principalement l’expression des gènes, plusieurs études suggèrent que STAT 6 ait des HDL et activité macrophage/cellule T au début du DT1 18 actions inhibitrices et joue un rôle très important dans l’engagement des sous familles de TH (Elo L.L et al ., 2010). Le STAT 6 se lie aux lieux génomiques des gènes associés à TH 1 et favorise des modifications d’histones liées à la chromatine plus condensée ; tandis que STAT 4 agit sur les lieux associés à TH β d’une manière semblable (Elisabeth .M et al ., 2012). Figure 8.1 : cascade de signalisation STAT 6 (Abbas, Lichmab and Pillai. 2001) Dans ce contexte, les HDLs pourraient-ils avoir un rôle à jouer sur l’activité des macrohages /cellules T CD 4+ au cours de diabète de type I ? On ne peut pas mettre les chapitres : matériels et méthodes, résultats et interprétations, discussion, conclusion et perspectives pour des raisons de confidentialité. Chapitre 6. Bibliographies 36 Chapitre.6 bibliographies A Alex .R and Wilma L.S-P. Cytokines and their roles in pancreatic islet B-cell destruction and insulin-dependent diabetes mellitus, biochemical pharmacology 1998 Avril; 8.55: 1139-1149. Alexei Y .savinov , F susan Wong and Alexander V.C. IFNᵧ Affect homing of diabetogenic T cells, American journal of physiology 1991 Février ; 260.2:13-28. A Raz ,A. Wyche et al. Regulation of fibroblast cyclooxygenase synthesis by interleukin-1, the journal of biological chemistry 1988 février ; 263 :3022-3028. Andrew J .Murphy , Kevin J et al. 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Dans cette optique un essai ex-vivo a été réalisé au niveau de laboratoire de biologie moléculaire appliqué et immunologie faculté des sciences de la nature et de la vie et sciences de la terre et de l’univers département de biologie université Aboubaker Belkaid Tlemcen. Objectif : étudier l’effet des HDLs sur l’activité des macrophages/cellules T au début de DT1. But : montrer que les HDLs pourraient avoir un rôle à jouer sur l’activité des macrophage/cellules T au début de DT1. Matériels et méthodes : Deux type cellulaire : MDM (monocyte derived macrophage) et lymphocytes T CD4+ isolés a partir des PBMC (peripheral blood mononuclear cells) d’un sujet sain et d’un diabétique nouvellement diagnostiqué,ont été soumis à un ex-vivo. Résultats :la production d’IFN ᵧ et d’IL-2 est significativement diminuée (p=0.003) au niveau des co-cultures (macrophages/cellules T) de contrôle et de DT1 traitées par les HDLs à 50 µg/ml comparé aux contrôle et DT1 non traité par les HDLs. La production d’IL-4 et d’IL-10 est nettement élevée (p=0.003) et (p=0.001) respectivement au niveau des co-cultures (macrophages/cellules T) de contrôle et de DT1 traitées par les HDLs à 50 µg/ml comparé aux contrôles et DT1 non traité par les HDLs. Parallèlement les taux de phosphorylation des STAT4 sont significativement diminués (p=0.003) au niveau des co-cultures (macrophages/cellules T) de contrôle et de DT1 traitées par les HDLs à 50 µg/ml comparé aux contrôle et DT1 non traité par les HDLs et les taux de phosphorylation des STAT6 sont significativement élevés (p=0.003) au niveau des co-cultures (macrophages/cellules T) de contrôle et de DT1 traitées par les HDLs à 50 µg/ml comparé aux contrôle et DT1 non traité par les HDLs. Conclusion et perspectives : les HDLs diminuent la production d’IFN ᵧ et d’IL-2 et faire augmentés la production d’IL-4 et d’IL-10 aussi diminuent les niveaux de la phosphorylation des STAT-4 et augmentent les niveaux de la phosphorylation des STAT-6. Les HDLs pourraient avoir un rôle a joué sur la balance TH1/TH2 et le devenir de macrophages en M2. Mots clés : diabète de type I , HDLs , Th1 , Th2 , Macrophage. ABSTRACT Introduction:Type I diabetes (DT1) is a major health problem today, it’s an autoimmune disease that result of the autoimmune destruction of beta cells of the pancreatic islets, involving the self reactivated TCD4+ and TCD8+ lymphocytes so the macrophages and the dendritic cells. Furthermore, several studies have shown that HDLs have a role in the pathogenesis of autoimmune diseases. In this context an ex-vivo test has conducted at the applied molecular biology and immunology laboratory, Faculty of the natural and life sciences and the earth and space sciences, biology department, University Abubaker Belkaid Tlemcen. Objectives: To study the effect of HDLs on the activity of macrophages / T cells at the beginning of T1D. Aim: to show that HDLs could play a role to exploit the activity of the macrophage /T cells at the begening of TD1. Materials and methods: Two cell types, MDM (monocyte derived macrophages) and TCD4+ cells have isolated from PBMC (peripheral blood mononuclear cells) of healthy subject and a newly diagnosed diabetic and have subjected to an ex-vivo. Results: The IFN ᵧ and IL-2 production was significantly reduced (p = 0.003) in co-cultures (macrophages / T-cells) of the control (DT1) treated with HDLs 50 μg / ml compared to the control (DT1) untreated by HDLs. whereas, the production of IL-4 and IL-10 was significantly high (p = 0.003) and (p = 0.001) respectively. In parallel, STAT4 phosphorylation levels were significantly reduced (p = 0.003) in co-cultures (macrophages / T-cells) of the control (DT1) treated by HDLs 50 μg/ml compared to the control DT1 untreated by HDLs. While, STAT6 phosphorylation levels were significantly high (p = 0.003). Conclusion: HDLs decrease the production of IFN ᵧ and il-2 and make increased the production of IL-4 and IL-10 also decrease the phosphorylation of STAT4 and increased the phosphorylation of STAT6 ; HDLs could have a role on balance TH1/TH2 and became too it macrophage in M2 Keywords: type 1 diabetes (TD1), HDLs, Th1, Th2, macrophage. الملخص يتميز بتدمير المناع الذاتي ل خايا بتا،مرض السكر الن ع اأ ل؛ ه أحد أمراض المناع الذاتي الذ يشكل الي مشكل صحي مع د الخايا التائي٤ الخايا لمفا ي التائي، هنا مجم ع مينا الخايا المتسبب في تحطي الخايا بتا من بين هذه الخايا. المت اجدة في جزر ليرجان هانس البنكرياس كما أظ ر عدة دراسا عا تا ع ذل أن الده ن عالي الكثاف ل ا د ر في اأمراض المناع الذاتي. البالع الكبيرة أيضا الخايا الجذعي. النشيط ذاتيا٨ في هذا البيان ت إجراء اختبار تجريبي في مختبر البي ل جي الجزيئي التطبي ي ع المناع ك ي الع الطبيعي ع الحياة اأرض الك ن قس البالع الكبيرة البي ل جياجامع أب بكر ب ا يد ت مسان
