sciences de la vie ue 3v513 travaux pratiques

2015-2016
LICENCE DE SCIENCES ET TECHNOLOGIES
MENTION : SCIENCES DE LA VIE
UE 3V513
TRAVAUX PRATIQUES :
ETUDE ENZYMATIQUE ET STRUCTURALE DE LA
LACTATE DESHYDROGENASE
Vous disposez d’une version du polycopié sur les sites de documents de cours de l’UPMC.
Une version papier vous sera distribuée le jour du TP ou pendant les cours.
Début des TP : 8h30.
APPORTER LE JOUR DU TP :
Une blouse en coton.
Un marqueur fin permanent ;
Une calculatrice
Une clé USB (utile pour sauvegarder vos courbes et vos données après traitement
informatique)
LIEU du TP de BIOCHIMIE :
Bâtiment B, 2ème étage
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Organisation des TP
Ces travaux pratiques sont organisés sur une journée de 8h30 à 18h:
- la journée se décomposant comme suit:
Matinée : Etude de l’activité enzymatique de la LDH (dosage de l’activité
enzymatique par chacun des étudiants puis étude de la fonction de
saturation).
Pause déjeuner de 1 heure
Après-midi : Traitement des données à l’aide du logiciel Kaleidagraph
Visualisation de la structure 3D de la LDH avec le logiciel PyMOL
Vous manipulerez dans la mesure du possible en binôme (exceptionnellement en
trinôme).
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Introduction et but des travaux pratiques.
1. Etude de l’activité enzymatique
Les lactates déshydrogénases (LDHs) sont des enzymes largement distribuées dans la plupart
des tissus animaux, des microorganismes et des plantes. Elles catalysent en anaérobiose la
dernière étape de la glycolyse : la réduction du pyruvate en lactate (fermentation lactique).
Pyruvate + NADH + H+
Lactate + NAD+
De nombreux microorganismes fermentent le glucose en acide lactique. Dans les tissus
animaux, lorsque l’apport d’oxygène est insuffisant pour assurer une oxydation aérobie du
NADH produit dans la glycolyse, le NAD+est régénéré à partir du NADH par la réduction du
pyruvate en lactate. Cependant certains tissus ou types cellulaires (rétine, cerveau, érythrocytes)
produisent du lactate à partir du glucose dans des conditions aérobies normales.
Le lactate produit par les tissus musculaires lors d’une activité intense (anaérobie) est excrété
dans le flux sanguin puis récupéré par le foie pour régénérer du glucose par gluconéogenèse. Le
cycle des réactions qui comprend la conversion du glucose en lactate dans le muscle et la
conversion du lactate en glucose dans le foie est appelé cycle de Cori.
Au cours de ces travaux pratiques, vous apprendrez à doser l’activité de la LDH dans le
sens de la production du lactate et vous étudierez la fonction de saturation de la LDH par
le pyruvate : Vi = f([Pyruvate])
2. Etude de la structure quaternaire de la LDH
Les LDHs de mammifères sont des protéines oligomériques qui existent sous plusieurs
formes moléculaires (isoenzymes), avec deux gènes de structure correspondant à deux types de
sous-unités appelées M (pour muscle) et H (pour cœur). En combinant une analyse des LDH
par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (ou SDS-PAGE) et par
chromatographie d’exclusion moléculaire, vous pourrez calculer la masse moléculaire d’une
sous-unité ainsi que celle de l’enzyme native. Vous déduirez le nombre de sous-unités
constituant la structure IVaire de la protéine.
3. Visualisation de la structure de la LDH à l’aide du logiciel PyMOL
Les structures tridimensionnelles des LDHs de plusieurs sources sont connues et déposées dans
une banque de donnée accessible à tous : la Protein Data Bank (ou PDB). Nous nous
intéresserons particulièrement à la structure de la LDH de muscle de lapin.
Apres avoir effectué l’exercice proposé sous forme de tutoriel, vous aurez à répondre au
questionnaire présent en fin de polycopié
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1. Etude de l’activité enzymatique
PROTOCOLE DE DOSAGE DE L’ACTIVITE LDH
L’activité de la LDH est dosée dans le sens de la réduction du pyruvate en lactate par le NADH
+ H+ :
Pyruvate + NADH + H+
Lactate + NAD+
La réaction sera suivie par la modification d’absorbance due à l’oxydation du NADH. Le
substrat NADH absorbe à 340 nm avec un coefficient d’extinction molaire εM = 6220 M-1cm-1.
Le NAD+ n’absorbe pas à cette longueur d’onde.
MATERIEL :
-
-
Spectrophotomètre UV-visible.
Solutions mères :
Tampon phosphate de sodium 200 mM, pH 7
Pyruvate : 20 mM
NADH : 16 mM
Solution d’enzyme : concentration communiquée le jour des TP
Cuves en plastique de 1 cm de largeur
MODE OPERATOIRE
Dans une cuve de 1 mL, déposez:
500 µL de tampon phosphate de sodium 200 mM, pH 7
430 µL d’eau distillée (volume suffisant pour 1 mL)
50 µL de pyruvate à 20 mM
------------------------------------------------------------------------------Mélanger et régler le zéro du spectrophotomètre à 340 nm.
------------------------------------------------------------------------------Ajouter 10 µL de NADH à 16 mM
-------------------------------------------------------------------------------Mélanger et vérifier que l’absorbance lue soit proche de 0,9
-------------------------------------------------------------------------------Ajouter 10 µL de LDH
-------------------------------------------------------------------------------Mélanger et enregistrer la cinétique sur 2 minutes
Après 2 minutes, le spectrophotomètre donnera automatiquement la pente de la droite obtenue
(en ΔA.min-1) qui sera la vitesse initiale Vi de la réaction. Vous verrez avec les enseignants
comment extraire ces données du spectrophotomètre
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NB :
- Le NADH pouvant s’oxyder au cours de la journée, il sera conservé sur la glace.
- l’eau est ajoutée de façon à obtenir un volume final de 1 mL : le volume est donc
calculé en prenant en compte tous les autres volumes de réactifs ajoutés par la suite, notamment
les 10 µL de NADH et les 10 µL de LDH. Ici : Vol d’eau = 1000 -500 -50 -10 -10 = 430 µL.
- Il est important de bien mélanger les réactifs en inversant 3 ou 4 fois la cuve
préalablement bouchée avec du Parafilm
- Chaque étudiant devra faire 3 fois le dosage de façon à calculer la valeur moyenne de
la Vi ainsi que l’écart-type et consigner ses résultats dans la feuille se trouvant en fin de
polycopié qu’il devra rendre avec le compte-rendu.
FONCTION DE SATURATION DE LA LDH PAR LE PYRUVATE
Lors de cette expérience, le protocole de dosage de l’activité sera identique au précédent,
excepté que vous ferez varier la concentration de pyruvate (substrat) dans chacune des cuves
que vous préparerez.
Choix de la gamme de concentrations de pyruvate : Cette gamme comportera 18
concentrations (voir tableau ci-après). Le but de cette expérience est donc de mesurer la vitesse
initiale de la réaction pour chaque concentration de pyruvate testée afin de tracer la fonction de
saturation Vi = f([pyruvate])
Vous devrez compléter le tableau suivant en calculant les volumes de pyruvate et d’eau à
prélever et montrez vos valeurs à l’un de vos enseignants avant de commencer les dosages
d’activité.
Concentration
de pyruvate dans 0,02 0,04 0,06 0,08
l’essai (mM)
Volume de
Tampon (µL)
Volume d’H2O
479
(µL)
Volume de
NADH (µL)
Volume de
solution mère de
1
Pyruvate à
20mM (µL)
Volume
d’enzyme (µL)
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
1
1,5
2
4
6
500
10
10µl
Enregistrement des cinétiques pendant 30 s
Vi (ΔA.min-1)
Le traitement des résultats se fera en salle d’informatique en utilisant le logiciel Kaleidagraph.
Vous aurez donc à reporter dans un tableur les valeurs des vitesses initiales pour chaque
concentration de pyruvate testée puis représenter vos points expérimentaux Vi = f([pyruvate]).
Le logiciel se chargera d’ajuster automatiquement une courbe « idéale » passant par un
maximum de point expérimentaux et d’extraire les paramètres cinétique de la LDH (Vmax, KM,
etc.).
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2. Etude de la structure quaternaire de la LDH
ELECTROPHORESE EN CONDITIONS DENATURANTES
Le SDS (dodecyl sulfate de sodium) est un détergent anionique (figure ci-après) qui a la
particularité de dénaturer et charger négativement les protéines. Le 2-mercaptoéthanol (figure
ci-après) est un agent réducteur qui réduit les ponts disulfures présents dans les protéines. Par
conséquent, après traitement au SDS et au 2-mercaptoethanol les protéines se retrouvent à l’état
dénaturé et uniformément chargées négativement. Si des ponts disulfures reliaient des sousunités d’une protéine (ce qui n’est pas toujours le cas), ceux-ci sont réduits et la protéine perd
sa structure quaternaire. Après un tel traitement, la migration des protéines par électrophorèse
sur gel de polyacrylamide sera donc uniquement fonction de leur masse moléculaire
Molécule de 2-mercaptoéthanol
Molécule de SDS
La LDH de muscle de lapin et de cœur de bœuf ont donc été préalablement traitées au SDS et
au 2-mercaptoethanol puis soumise à une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide. La
figure ci-dessous représente une photographie du gel après coloration au bleu de coomassie.
!
1!
M!
2!
Dépôt!
Piste 1 : LDH de muscle
Piste 2 : LDH de cœur
Piste M : Marqueurs de
poids moléculaire (le poids
moléculaire est indiqué au
dessus
de
chaque
marqueur en kDa).
92,5!
68!
45!
29!
19,8!
Front!de!migration!
Dans une telle électrophorèse, on définit la mobilité relative des protéines en calculant le
facteur Rf comme étant le rapport de la distance parcourue par la protéine sur la distance
parcourue par le front de migration : Rf = (distance de migration)/(distance du front de
migration).
A partir de la photographie, calculez les Rf correspondant aux marqueurs de poids moléculaire
puis tracez sur papier millimétré la droite étalon : log (MM) = f (Rf). Apres avoir calculé le Rf
de la LDH, vous utiliserez la droite étalon pour déduire la masse moléculaire d’une de ses sousunités.
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CHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSION MOLECULAIRE EN CONDITIONS NATIVES
La chromatographie d’exclusion moléculaire (aussi appelée « tamis moléculaire » ou
« filtration sur gel ») est l’une des techniques utilisées pour déterminer le rayon de Stokes (Rs)
des protéine globulaires et par extension pour estimer leur masse moléculaire. En effet, le
volume d’élution d’une protéine dépendra non seulement de sa masse moléculaire mais aussi
de sa forme, de son hydratation préférentielle et de sa densité. Le rayon de Stokes tient compte
à la fois de tous ces paramètres. La colonne de chromatographie contient une phase stationnaire
constituée de billes poreuses dont les pores ont une taille définie. L’espace entre les billes est ce
qu’on appelle le volume mort (V0), l’espace à l’intérieur des billes est le volume interne (Vi) et
le volume non accessible au solvant (Vg) est le matériel constituant le gel. Le volume total Vt
sera égal à V0+Vi +Vg ~ V0+Vi car Vg est petit devant V0+Vi. La phase mobile remplit les
espaces entre les billes ainsi que ceux à l’intérieur des billes. Les compositions de la phase
stationnaire et de la phase mobile sont choisies pour minimiser les interactions entre les
protéines et les billes. : la chromatographie d’exclusion n’est donc pas une chromatographie
d’adsorption.
Les protéines déposées sur une colonne de chromatographie d’exclusion entreront ou seront
exclues des pores des billes (constituant la phase stationnaire de la colonne) en fonction de leur
rayon de Stokes. Ainsi, les grosses protéines (ayant un rayon de Stokes élevé) n’entreront pas
dans les pores et seront éluées les premières alors que les petites protéines (ayant un faible
rayon de Stokes) seront retenues dans les pores et éluées tardivement.
Au cours de ces TP, nous avons utilisé une colonne de superdex S200 permettant de séparer les
protéines de poids moléculaires compris entre 10 000 et 600 000 Da. Celle-ci a été étalonnée en
utilisant le bleu dextran (grosse molécule de 2 MDa) permettant de mesurer le volume mort de
la colonne (V0) ; le bichromate de potassium (petite molécule) permettant de mesurer le volume
totale (Vt) de la colonne ; ainsi que les protéines standard de masse moléculaire et de Rayon de
Stokes connus suivantes :
Protéines
source
Ferritine
Catalase
Aldolase
Albumine (BSA)
Ovalbumine
Chymotrypsinogène A
Ribonucléase A
Rate de cheval
Foie de bœuf
Muscle de lapin
Sérum de bœuf
Œuf de poule
Pancréas de bœuf
Pancréas de bœuf
Masse Moléculaire
(kDa)
440
232
158
67
43
25
13,7
Rayon de Stokes
(Angström)
61
52,2
48,1
35,5
30,5
20,9
16,4
Pour chaque marqueur déposé sur la colonne, un chromatogramme vous sera fourni au cours
des TP vous permettant de connaître son volume d’élution (Ve). Vous calculerez donc le
coefficient de distribution Kav pour chaque marqueur selon la formule suivante :
K !" = puis vous tracerez le graphique suivant :
V! − V!
V! − V!
− 𝐥𝐨𝐠 𝐊 𝐚𝐯 = 𝐟 𝐑𝐬
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De ce graphique vous déduirez le Rayon de Stokes de la LDH puis vous calculerez sa masse
moléculaire en utilisant la formule ci-après, sachant qu’un coefficient de sédimentation S20,W
de 7,3 Svedberg a été mesuré pour la LDH :
MM = !.!.!.!! .!!",! .!
!!!.!
Avec : MM = masse moléculaire de la protéine en Daltons;
η : le coefficient de viscosité en poise (ou g.s-1.cm-1 ou dyne. cm-2s , la viscosité de
l’eau est de 0,01 poise);
Rs : le rayon de Stokes en cm (attention : vous avez obtenu une valeur en Angström et 1
-8
Å = 10 cm);
S20,w : le coefficient de sédimentation exprimé en seconde (1 S = 10 –13 secondes) ;
N : le nombre d’Avogadro : 6,022 1023 mol-1 ;
υ : le volume partiel spécifique (approximativement 0,73 cm3.g-1 pour la plupart des
protéines) ;
ρ : la densité de l’eau (1 g.ml-1).
Vous tracerez également le graphique : Kav = f(log MM) qui vous permettra de déduire
directement la masse moléculaire de la LDH.
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3. Visualisation de la structure de la LDH à l’aide du logiciel
PyMOL
Les coordonnées des atomes composant les protéines sont déposées dans une base de
données appelée "protein data bank " ou PBD. Chaque fichier est nommé par un code à 4
caractères, par exemple celui de la LDH de muscle de lapin est : "3h3f".
Les 3 sites principaux où ces fichiers sont disponibles sont :
-­‐
-­‐
-­‐
RCSB (research Collaboratory for Structural Bioinformatics) www.pdb.org/pdb : site historique
de consultation mais aussi de soumission des données structurales.
PDBe http://www.ebi.ac.uk/pdbe/ version européenne du site pdb.org géré par EBI (European
Bioinformatic Institute) avec interface différente.
PDBsum http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/ : site géré par EBI. Moins complet que les sites
précédents pour la structure mais interface plus conviviale et lien avec d'autres bases de données
notamment Gene Ontology, Pfam. Propose en plus des diagrammes sur les réseaux
d’interactions avec d'autres protéines.
L'objectif de cette partie va consister à visualiser la structure de LDH de muscle de lapin avec
le logiciel PyMOL (libre de droit pour les utilisateurs académiques et étudiants ; téléchargeable
depuis le site : http://www.pymol.org/) : on vous demande de répondre aux questions posées en
vous aidant des instructions qui suivent.
Connectez-vous au site www.pdb.org/pdb. Dans l’onglet de recherche tapez le code
d’identification à 4 caractères 3H3F pour la LDH de muscle de lapin.
Faites dérouler la page d’accueil pour avoir accès au résumé des informations obtenues sur la
structure.
Q1 : Préciser par quelle méthode la structure a été résolue (RMN, radiocristallographie
aux Rayon X, microscopie électronique ou autre ?) ; à quelle résolution cette structure at-elle été obtenue ?
Q2 quels sont les 3 ligands co-cristallisés avec la structure ? Sont-ils des substrats de la
LDH ?
Télécharger ensuite le fichier pdb en le sauvegardant sur le bureau de l’ordinateur : pour se
faire, à droite du code d’identification 3H3F, cliquez sur “Download Files” (rouge ci-après)
puis sur “PDB File (Text)” (vert ci-après).
Le fichier est donc sauvegardé sous le nom de “3H3F.pdb”. Ce fichier contient les cordonnées
tridimensionnelles (x, y, z) de chaque atome contenus dans la protéine (à l’exception des
atomes d’hydrogène). Nous allons maintenant l’utiliser pour visualiser la structure de l’enzyme
à l’aide du logiciel PyMOL.
Ouvrez en double-cliquant le logiciel PyMol puis allez dans le menu “Fichier” puis “open” et
sélectionnez la structure 3H3F sauvegardée sur le bureau. (NB : dans cette structure, 2
molécules de LDH sont présentes)
Pour afficher la séquence des acides aminés (structure primaire), allez dans le menu “Display”
puis “Sequence On”
L’écran est séparé en 3 modules différents (ci-dessous) : le module A dédié aux lignes de
commandes ; le module B (principal) dédié à la visualisation de la structure et le module C
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dédié à la sélection/masquage et transformation de tout ou partie de la séquence. Dans ce
module C, le menu A est dédié aux “Actions” ; le menu S (‘show’) à “montrer” tout ou partie
de la séquence sélectionnée ; le menu H (‘hide’) à “cacher” tout ou partie de la séquence
sélectionnée ; le menu L (‘label’) à nommer tout ou partie des résidus de la séquence
sélectionnée et le menu C (‘color’) à colorer tout ou partie de la séquence sélectionnée.
A
B
C
La LDH de muscle de lapin s’affiche dans le module B par défaut, tous les atomes autres que
les hydrogènes sont représentés, y compris ceux des chaines latérales et les oxygènes des
molécules d’eau (points rouges).
Pour masquer les molécules d’eau, dans le module C, sélectionner le menu H de la molécule
3H3F et cliquez sur ‘waters’.
Pour masquer les atomes des chaines latérales, dans le module C, sélectionner le menu H de la
molécule 3H3F et cliquez sur ‘side chain’. La structure est maintenant simplifiée et ne fait
apparaître que le squelette de la chaine principale (Cα et liaisons peptidiques).
Afin de visualiser la structure avec son contenu de structures secondaires, dans le module C,
sélectionner le menu S de la molécule 3H3F et cliquez sur ‘cartoon’. Vous pouvez ensuite
masquer les atomes en allant dans le menu H de la molécule 3H3F et cliquez sur ‘lines’ puis
colorer la structure selon chaque sous-unité (menu C de la molécule 3H3F puis cliquez sur ‘by
chain’ puis encore sur ‘by chain’). Chaque sous-unité possède maintenant une couleur
differente.
Q3 Combien de sous-unité (au total) identifiez-vous ? Quelle est la structure quaternaire
de la LDH?
Afin de visualiser le site actif de l’enzyme, nous allons nous focaliser sur une sous-unité. Pour
cela, dans le module A de ligne de commande tapez la commande suivante (sans guillemets) :
“select chain_A, chain a”. Ceci crée une nouvelle molécule dans le module C nommée
<chain_A> et constitué de la sous-unité A de la LDH.
On peut maintenant masquer la structure d’origine : pour cela, dans le module C, sélectionner
le menu H de la molécule 3H3F et cliquez sur ‘everything’.
Puis dans le module C, sélectionner le menu S de la molécule <chain_A> et cliquez sur
‘cartoon’ : la sous-unité apparaît en vert. Vous pouvez la ré-orienter au milieu de l’écran : dans
le module C, sélectionner le menu A de la molécule <chain_A> et cliquez sur ‘orient’. Vous
pouvez déplacer la molécule en utilisant la commande ‘Alt + clic gauche + déplacement de la
souris’. Vous pouvez aussi zoomer dans la structure en faisant un clic droit puis déplacement de
la souris vert le bas (pour agrandir) ou vert le haut (pour rétrécir).
Q4 décrivez le contenu de structure secondaire de la sous-unité?
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Visualisation du site actif : dans la séquence figurant en haut du module principal B, faire
défiler la séquence et sélectionner les ligands NADH et oxamate (NAI et OXM). La sélection
s’affiche dans le module C sous le nom <sele>. Faire apparaître les deux molecules (module C,
onglet <sele>, clic sur S puis clic sur ‘sticks’) et les colorer en fonction des atomes (module C,
onglet <sele>, clic sur C puis clic sur ‘by element’ puis clic sur le premier choix de la liste
proposée c’est a dire que les Azotes sont en bleu, les oxygènes en rouge et les phosphores en
orange).
Q5 combien identifiez-vous d’atomes d’azote et de phosphore dans le NADH et dans la
molécule d’oxamate?
Identification des acides aminés au voisinage des ligands : sélectionnez la molécule d’oxamate
en cliquant dessus puis dans le module C, onglet <sele>, cliquez sur A > ‘modify’ > ‘around’ >
‘residues within 4 A’. Vous venez de sélectionner les atomes des acides aminés présent à moins
de 4 Å de l’oxamate.
Faire apparaître les chaines latérale des acides aminés sélectionnés (module C, onglet <sele>,
cliquez sur S > ‘side chain’ > ‘sticks’) et les colorer selon les atomes (module C, onglet <sele>,
clic sur C puis clic sur ‘by element’ puis clic sur le premier choix de la liste proposés).
Q6 quels sont les 5 acides aminés identifiés à moins de 4 Å de l’oxamate (donnez leur nom
et leur numéro dans la séquence)?
Visualisation des liaisons hydrogène entre l’oxamate et les acides aminés identifiés
précédemment : Dans la séquence située en haut du module B, sélectionner (en cliquant dessus)
les 5 acides aminés identifiés précédemment ainsi que la molécule d’oxamate (NB : faire
défiler la séquence vers la droite pour sélectionner la molécule d’oxamate notée OXM). Dans le
module C, onglet <sele>, cliquez sur A puis ‘find’ puis ‘polar contacts’ puis ‘within selection’.
Q7 combien de liaisons hydrogène identifiez-vous ? Pour chacune d’entre elles, dites avec
quel acide aminé elles sont engendrées.
Calcul de distances : identifiez tout d’abord les acides aminés au voisinage de la molécule de
NADH (sélectionnez la molécule NAI en cliquant dessus puis dans le module C, onglet <sele>,
cliquez sur A > ‘modify’ > ‘around’ > ‘residues within 4 A’) puis faire apparaître les chaines
latérales des acides aminés sélectionnés (module C, onglet <sele>, cliquez sur S > ‘side chain’
> ‘sticks’) puis les colorer (module C, onglet <sele>, clic sur C puis clic sur ‘by element’)
Q8 Visualisez l’atome de souffre au voisinage d’un des 2 riboses du NADH : de quel acide
aminé provient-il (donner son nom et son numéro dans la séquence)
Pour calculer la distance entre 2 atomes allez dans le menu
‘Wizard’ puis ‘Measurement’. Cliquez ensuite sur le premier
atome souhaité puis sur le second atome souhaité : la distance
s’affiche en Å à l’écran. Pour arrêter les mesures, cliquez sur la
ligne grisée ‘Done’ apparue dans le module C (figure ci-contre).
Q9 Calculez la distance entre l’atome de soufre identifié à la Q8
et l’atome d’oxygène porté par le carbone C2 du ribose portant l’adénine du NADH.
Q10 Calculez maintenant la distance entre l’atome d’azote de l’oxamate et l’atome
d’oxygène porté par le carbone C2 du ribose portant le groupement Nicotinamide du
NADH.
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Indications pour la rédaction du Compte Rendu
Il est demandé un compte-rendu par binôme (ou trinôme) en indiquant votre
section (A, B, C, D, ou E), le groupe de TP auquel vous appartenez, la date à
laquelle vous avez effectué le TP ainsi que les noms de vos enseignants.
Sauf avis contraire, vous aurez une semaine pour rédiger votre compte-rendu.
Devront figurer dans le compte rendu :
Une introduction générale présentant les différentes expériences que vous aurez
réalisées ainsi que leur but (sans entrer dans les détails et sans recopier le polycopié).
Un paragraphe décrivant l’étude de l’activité enzymatique qui comprendra :
-­‐ La page 13 remplie pour chaque étudiant et où devront figurer les détails des calculs.
-­‐ Une brève description de l’étude de la fonction de saturation de la LDH par le pyruvate.
(vous n’oublierez pas de faire figurer le tableau page 5 en l’ayant rempli).
-­‐ La courbe Vi=f([pyruvate]) avec les 18 points expérimentaux. Le cas échéant, une
deuxième courbe avec moins de points expérimentaux (voir avec les enseignants pour le
traitement des données)
-­‐ Les paramètres cinétiques de la LDH obtenus après traitement informatique (KM, Vmax
etc.)
-­‐ Les détails du calcul de l’activité spécifique de la LDH (en µmol.min-1.mg-1) à partir de la
valeur de la Vmax obtenue en ΔA.min-1.
-­‐ Le calcul détaillé de la constante catalytique kcat de la LDH (en min-1 et en s-1)
Un paragraphe consacré à l’étude de la structure IVaire de la LDH qui comprendra :
-­‐ Une brève description de la technique ainsi que le traitement des données issues de
l’électrophorèse en condition dénaturantes (p 6) avec la représentation graphique
demandée et le calcul de la masse molaire d’une sous-unité de LDH
-­‐ Une brève description de la technique ainsi que le traitement des données issues de la
chromatographie d’exclusion en condition natives (p 7) avec les deux représentations
graphiques demandées et le calcul de la masse moléculaire de LDH native.
-­‐ La déduction du nombre de sous-unités composant la LDH.
Un paragraphe consacré à la visualisation de la structure 3D de la LDH.
- vous répondrez pour cela au questionnaire p 9 et suivantes
Une brève conclusion générale.
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Résultats des 3 dosages de l’activité enzymatique de la
LDH.
Chaque étudiant devra rendre cette feuille avec le compte-rendu.
Nom et prénom de
l’étudiant
Absorbance
initiale du
NADH
Vitesse initiale
(ΔA.min-1)
Activité spécifique
(µmol.min-1.mg-1)
ou
(UI.mg-1)
Essai 1
Essai 2
Essai 3
Moyenne des 3 essais.
Ecart type
% d’erreur
Le protocole de dosage de l’activité est décrit page 4.
Rappel des unités enzymatiques :
1UI = 1µmole de substrat transformé par min.
Rappel formule de l’écart type :
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