CAZAMEA Jérôme

T.P. ENZYMOLOGIE
MANIPULATION N°2 : CALCULS DES VM ET KM D’UNE ACTIVITE
ENZYMATIQUE. ETUDE DE L’EFFET D’UN INHIBITEUR
Au cours cette manipulation, nous allons dans un premier temps mesurer une activité
enzymatique, puis calculer la vitesse maximum d’une réaction enzymatique ainsi que sa
constante de Michaelis. Dans un second temps, nous étudierons l’effet d’un inhibiteur de
l’enzyme et calculerons sa constante d’inhibition.
Pour réaliser ces différentes expériences, nous utiliserons comme enzyme la déshydrogénase
lactique (LDH) de cœur de bœuf. Cette enzyme catalyse la réaction suivante :
LDH
Pyruvate + NADH + H+ L-Lactate + NAD+
Cette réaction peut être suivie par spectrophotométrie.
En effet, le NADH,H+ absorbe à 340 nm et à 280nm, et la densité optique dépend de la
concentration d’après la loi de Beer-Lambert :
∆DO/∆t0 = ∆C/ til
Nous pouvons donc suivre la disparition du NADH,H+ en fonction du temps grâce au
spectrophotomètre, en réglant la longueur d’onde sur 340nm (on ne choisit pas 280nm car le
NAD+ absorbe également à cette longueur d’onde).
Nous considérerons comme substrat de la réaction le pyruvate (bien que le NADH,H+ soit
également un substrat de la réaction). Le pyruvate sera utilisé sous forme de pyruvate de
sodium.A partir de cette réaction, il nous est possible d’étudier le comportement inhibiteur de
l’acide oxalique sur l’activité de la LDH.
Formule de l’acide oxalique
O O
C - C
OH OH

La réaction d’inhibition pourrait donc être la suivante :
O O LDH OH OH
C - C + NADH,H+ C - C + NAD+
OH OH OH OH
Il s’agirait dans ce cas d’une inhibition de type compétitive, l’inhibiteur entre en compétition
avec le pyruvate car ils réagissent tous deux sur le même site catalytique de NADH,H+. La
vitesse initiale sera donc modifiée ainsi que la constante de Michaelis (Km).
PREPARATION DES SOLUTIONS
Afin de réaliser les différentes expériences, nous devons préparer les solutions de pyruvate de
sodium, de NADH,H+ et d’oxalate de sodium. Le tampon phosphate nous servant de solvant a
été préparé préalablement.
Afin de réaliser les différentes réactions enzymatiques, il nous faut préparer les solutions
suivantes dans du tampon phosphate :
- Solution de pyruvate de sodium à 21mM
- Solution de NADH,H+ à 3mM
- Solution de LDH à 2 unités/mL
- Solution d’oxalate de sodium à 3mM
* Pour le pyruvate de sodium (21mM) :
Nous avons préparé 10 mL de solution comme suit :
m = c*V*M sachant que c est la concentration recherchée, V le volume total
de solution et M la masse molaire du pyruvate.
m = 21.10-3*10*111
m = 23,3 mg

Dans la pratique, nous avons pesé 23,7mg.
* Pour le NADH+H+ (3mM) :
Nous avons préparé 6mL de solution comme suit :
m = c*V*M
m = 3.10-3*6*709,4
m = 12,77mg
Le NADH,H+ n’est pas pur. En effet, le produit dont nous disposons est pur à 88,2%. Cela
signifie qu’un gramme de produit contient 0,882g de NADH,H+. Il nous faut donc pesé
14,5mg de poudre pour avoir 12,77mg de NADH,H+ au final.
* Pour la LDH à 2 unités/mL
Nous disposions d’une solution mère de LDH à 1000U/mL. Nous obtenons notre solution de
LDH à 2U/mL par des dilutions successives. Une dilution au 1/10 de la solution mère nous
permet d’obtenir une solution à 100U/mL. Une dilution au 1/10 de celle-ci porte la
concentration de la nouvelle solution à 10U/mL. La solution désirée (à 2U/mL) est préparée
par dilution au 1/5 de cette dernière.
* Pour l’oxalate de sodium (3mM) :
Nous avons préparé 100mL de solution comme suit :
m = c*V*M
m = 3.10-3*100*134
m = 40,2 mg.
Dans la pratique, nous avons pesé 40,5mg.EXPERIMENTATION
1. Calcul de l’activité exacte de la préparation enzymatique
Le but de cette partie est de tracer la cinétique de la réaction enzymatique. Nous en déduirons
son équation, afin de déterminer la vitesse initiale de la réaction, qui correspond à l’activité de
la préparation enzymatique.
Nous avons préparé trois cuves spectrophotométriques comme suit :
Cuve
1
2
3
Volume de pyruvate
(mL)
0,1
Volume de NADH,H+
0,1

(mL)
Volume de tampon
phosphate (mL)
0,1
Volume de solution
d’enzymes avec
déclenchement du
chronomètre.
0,1 à 1000U/mL
0,1 à 10U/mL
0,1 à 2U/mL
Nous avons observé la cinétique avec ces trois cuves, les deux premières sont inexploitables
car la réaction est trop rapide. Nous utiliserons donc pour nos manipulations une
concentration en enzymes de 2U/mL.A partir de cela, nous mesurons la cinétique de la
variation de la densité optique en fonction du temps pendant 5 minutes.
Nous obtenons les résultats suivants :
Temps (s)
DO
Temps
(min)
Concentration
du substrat
0
0,5104
0
0,08205788
15
0,435
0,25
0,06993569
30
0,363
0,5
0,05836013
45
0,316
0,75
0,05080386
60
0,282
1
0,04533762
75
0,244
1,25
0,0392283
90
0,208
1,5
0,03344051
105
0,185
1,75
0,02974277
120
0,17
2
0,02733119
135
0,145
2,25
0,0233119
150
0,121
2,5
0,01945338
165
0,097
2,75
0,01559486
180
0,076
3
0,01221865
195
0,061
3,25
0,00980707
210
0,052
3,5
0,00836013
225
0,045
3,75
0,00723473
240
0,039
4
0,0062701
255
0,033
4,25
0,00530547
270
0,027
4,5
0,00434084
285
0,022
4,75
0,00353698
300
0,019
5
0,00305466

Afin de calculer l’activité de l’enzyme, nous déterminons la concentration en substrat grâce à
la loi de Beer-Lambert :
C = DO /6,22
Cela correspond à la quatrième colonne du tableau. Nous pouvons, à partir de ce calcul, tracer
la courbe de la concentration en substrat en fonction du temps :
Cette courbe a une équation polynomiale d’ordre 4 que nous avons fait apparaître sur la
courbe.
Comme la vitesse correspond à la dérivée de la concentration par rapport au temps, il faut
dériver cette équation.
-dy/dx = -(0,0012x3-0.0096x²-0.0326x-0.0497)