CAZAMEA Jérôme

T.P. ENZYMOLOGIE
MANIPULATION N°2 : CALCULS DES VM ET KM D’UNE ACTIVITE
ENZYMATIQUE. ETUDE DE L’EFFET D’UN INHIBITEUR
Au cours cette manipulation, nous allons dans un premier temps mesurer une activité
enzymatique, puis calculer la vitesse maximum d’une réaction enzymatique ainsi que sa
constante de Michaelis. Dans un second temps, nous étudierons l’effet d’un inhibiteur de
l’enzyme et calculerons sa constante d’inhibition.
Pour réaliser ces différentes expériences, nous utiliserons comme enzyme la déshydrogénase
lactique (LDH) de cœur de bœuf. Cette enzyme catalyse la réaction suivante :
LDH
Pyruvate + NADH + H+
L-Lactate + NAD+
Cette réaction peut être suivie par spectrophotométrie.
En effet, le NADH,H+ absorbe à 340 nm et à 280nm, et la densité optique dépend de la
concentration d’après la loi de Beer-Lambert :
∆DO/∆t0 = ∆C/ til
Nous pouvons donc suivre la disparition du NADH,H+ en fonction du temps grâce au
spectrophotomètre, en réglant la longueur d’onde sur 340nm (on ne choisit pas 280nm car le
NAD+ absorbe également à cette longueur d’onde).
Nous considérerons comme substrat de la réaction le pyruvate (bien que le NADH,H+ soit
également un substrat de la réaction). Le pyruvate sera utilisé sous forme de pyruvate de
sodium.A partir de cette réaction, il nous est possible d’étudier le comportement inhibiteur de
l’acide oxalique sur l’activité de la LDH.
Formule de l’acide oxalique
O
O
C - C
OH
OH
La réaction d’inhibition pourrait donc être la suivante :
O
O
LDH
OH
C - C + NADH,H+
OH
OH
OH
C - C
OH
+ NAD+
OH
Il s’agirait dans ce cas d’une inhibition de type compétitive, l’inhibiteur entre en compétition
avec le pyruvate car ils réagissent tous deux sur le même site catalytique de NADH,H+. La
vitesse initiale sera donc modifiée ainsi que la constante de Michaelis (Km).
PREPARATION DES SOLUTIONS
Afin de réaliser les différentes expériences, nous devons préparer les solutions de pyruvate de
sodium, de NADH,H+ et d’oxalate de sodium. Le tampon phosphate nous servant de solvant a
été préparé préalablement.
Afin de réaliser les différentes réactions enzymatiques, il nous faut préparer les solutions
suivantes dans du tampon phosphate :
-
Solution de pyruvate de sodium à 21mM
-
Solution de NADH,H+ à 3mM
-
Solution de LDH à 2 unités/mL
-
Solution d’oxalate de sodium à 3mM
* Pour le pyruvate de sodium (21mM) :
Nous avons préparé 10 mL de solution comme suit :
m = c*V*M
sachant que c est la concentration recherchée, V le volume total
de solution et M la masse molaire du pyruvate.
m = 21.10-3*10*111
m = 23,3 mg
Dans la pratique, nous avons pesé 23,7mg.
* Pour le NADH+H+ (3mM) :
Nous avons préparé 6mL de solution comme suit :
m = c*V*M
m = 3.10-3*6*709,4
m = 12,77mg
Le NADH,H+ n’est pas pur. En effet, le produit dont nous disposons est pur à 88,2%. Cela
signifie qu’un gramme de produit contient 0,882g de NADH,H+. Il nous faut donc pesé
14,5mg de poudre pour avoir 12,77mg de NADH,H+ au final.
* Pour la LDH à 2 unités/mL
Nous disposions d’une solution mère de LDH à 1000U/mL. Nous obtenons notre solution de
LDH à 2U/mL par des dilutions successives. Une dilution au 1/10 de la solution mère nous
permet d’obtenir une solution à 100U/mL. Une dilution au 1/10 de celle-ci porte la
concentration de la nouvelle solution à 10U/mL. La solution désirée (à 2U/mL) est préparée
par dilution au 1/5 de cette dernière.
* Pour l’oxalate de sodium (3mM) :
Nous avons préparé 100mL de solution comme suit :
m = c*V*M
m = 3.10-3*100*134
m = 40,2 mg.
Dans la pratique, nous avons pesé 40,5mg.EXPERIMENTATION
1. Calcul de l’activité exacte de la préparation enzymatique
Le but de cette partie est de tracer la cinétique de la réaction enzymatique. Nous en déduirons
son équation, afin de déterminer la vitesse initiale de la réaction, qui correspond à l’activité de
la préparation enzymatique.
Nous avons préparé trois cuves spectrophotométriques comme suit :
Cuve
1
2
Volume de pyruvate
(mL)
0,1
Volume de NADH,H+
0,1
3
(mL)
Volume de tampon
phosphate (mL)
Volume de solution
d’enzymes avec
déclenchement du
chronomètre.
0,1
0,1 à 1000U/mL
0,1 à 10U/mL
0,1 à 2U/mL
Nous avons observé la cinétique avec ces trois cuves, les deux premières sont inexploitables
car la réaction est trop rapide. Nous utiliserons donc pour nos manipulations une
concentration en enzymes de 2U/mL.A partir de cela, nous mesurons la cinétique de la
variation de la densité optique en fonction du temps pendant 5 minutes.
Nous obtenons les résultats suivants :
Temps (s)
DO
0
15
30
45
60
75
90
105
120
135
150
165
180
195
210
225
240
255
270
285
300
0,5104
0,435
0,363
0,316
0,282
0,244
0,208
0,185
0,17
0,145
0,121
0,097
0,076
0,061
0,052
0,045
0,039
0,033
0,027
0,022
0,019
Temps
(min)
0
0,25
0,5
0,75
1
1,25
1,5
1,75
2
2,25
2,5
2,75
3
3,25
3,5
3,75
4
4,25
4,5
4,75
5
Concentration
du substrat
0,08205788
0,06993569
0,05836013
0,05080386
0,04533762
0,0392283
0,03344051
0,02974277
0,02733119
0,0233119
0,01945338
0,01559486
0,01221865
0,00980707
0,00836013
0,00723473
0,0062701
0,00530547
0,00434084
0,00353698
0,00305466
Afin de calculer l’activité de l’enzyme, nous déterminons la concentration en substrat grâce à
la loi de Beer-Lambert :
C = DO /6,22
Cela correspond à la quatrième colonne du tableau. Nous pouvons, à partir de ce calcul, tracer
la courbe de la concentration en substrat en fonction du temps :
Cette courbe a une équation polynomiale d’ordre 4 que nous avons fait apparaître sur la
courbe.
Comme la vitesse correspond à la dérivée de la concentration par rapport au temps, il faut
dériver cette équation.
-dy/dx = -(0,0012x3-0.0096x²-0.0326x-0.0497)
Calcul de la vitesse initiale à t=0
Si x = 0, alors Vi =0.0497 mM.min-1
L’activité enzymatique est donc:
AE = (0,0497.10^3)x3/10^3
AE = 0,1491 U /mL
2. Déterminer la constante de Michaelis et la vitesse maximum
L’expérience précédente est réalisée de nouveau avec une solution de pyruvate au 1/10. Nous
préparons 10 cuves avec des concentrations croissantes de substrat. Nous pourrons ainsi
suivre la variation de DO dans le temps pour les différentes concentrations.
Tableau de préparation des différentes cuves
Cuve
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Volume de
Pyruvate
(2,1mM) Vp
(mL)
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Volume de
solution
tampon (mL)
2,7
2,6
2,5
2,4
2,3
2,2
2,1
2,0
1,9
1,8
0,42
0,49
0,56
0,63
0,70
Volume de
NADH+H+ à
3mM (mL)
0,1
Volume de
solution
enzymatique
(mL)
0,1
Concentration
(mM)
0,07
0,14
0,21
0,28
0,35
Comme précédemment, nous traçons les courbes de l’évolution de la DO en fonction du
temps. Celles-ci nous permettront d’obtenir la vitesse initiale de chaque échantillon. Nous
réalisons ensuite les représentations de Lineweaver-Burk pour chacune des dix cuves. Cela
nous permettra d’en déduire les régressions linéaires indispensables à la détermination de la
constante de Michaelis ainsi que la vitesse maximale. (voir annexe 1)Tableau des résultats des
DO:
Temps
(s)
0
15
30
45
60
75
90
105
120
135
150
165
180
195
210
225
240
255
270
DO tube DO tube DO tube DO tube DO tube DO tube DO tube DO tube DO tube DO tube
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0,498
0,493
0,517
0,506
0,508
0,517
0,510
0,514
0,5177 0,5162
0,473
0,445
0,482
0,466
0,467
0,465
0,461
0,463
0,469
0,468
0,455
0,408
0,455
0,431
0,43
0,433
0,427
0,408
0,424
0,427
0,438
0,39
0,423
0,4
0,39
0,399
0,395
0,381
0,385
0,387
0,422
0,375
0,396
0,37
0,362
0,371
0,365
0,348
0,354
0,351
0,406
0,355
0,373
0,338
0,342
0,338
0,333
0,315
0,322
0,314
0,39
0,33
0,345
0,31
0,306
0,303
0,301
0,281
0,285
0,281
0,377
0,299
0,318
0,274
0,272
0,27
0,266
0,25
0,251
0,25
0,363
0,275
0,292
0,248
0,237
0,238
0,23
0,216
0,22
0,222
0,349
0,259
0,269
0,221
0,213
0,208
0,2
0,19
0,191
0,194
0,335
0,237
0,247
0,198
0,191
0,18
0,173
0,166
0,167
0,17
0,322
0,219
0,227
0,175
0,166
0,161
0,152
0,143
0,145
0,148
0,311
0,2
0,209
0,157
0,146
0,143
0,136
0,123
0,125
0,129
0,301
0,185
0,19
0,141
0,127
0,127
0,12
0,107
0,111
0,11
0,288
0,171
0,173
0,124
0,111
0,112
0,105
0,091
0,095
0,096
0,278
0,158
0,16
0,112
0,099
0,097
0,092
0,077
0,081
0,083
0,268
0,147
0,145
0,098
0,086
0,083
0,08
0,066
0,07
0,071
0,257
0,132
0,083
0,247
A partir de ces relevés, nous pouvons déterminer les vitesses initiales en calculant la dérivée
de chaque courbe en 0. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau suivant ainsi que
les valeurs nécessaires à la réalisation des représentations de Lineweaver-Burk.
Tube
Concentration
en pyruvate
(mM)
1
2
0,07
3
0,14
4
0,21
5
0,28
6
0,35
7
0,42
8
0,49
9
0,56
10
0,63
0,70
Vitesse
initiale
(mM/s)
0,0132 0,0191
0,02
0,0235 0,0234 0,0239 0,0229 0,0289
0,0283
0,0295
1/c
14,286
4,762
3,771
1,786
1,587
1,429
1/V
75,758 52,356 50,000 42,543 42,735 41,841 43,668 34,602
35,336
33,898
7,143
2,857
2,381
2,041
Représentation de Lineweaver-Burk
80,000
y = 3,0385x + 32,561
70,000
60,000
1/V
50,000
40,000
30,000
20,000
10,000
-20,000
-15,000
-10,000
0,000
-5,000
0,000
5,000
10,000
15,000
20,000
1/c
D’après ce graphique, nous déterminons 1/Vmax qui correspond à l’ordonnée à l’origine.
Cette valeur nous donnera la vitesse maximale.
1/Vmax = 32,561 soit Vmax = 0,031 mM/s
La constante de Michaelis est déterminée comme suit :
-1/Km est égal à x pour y = 0
-1/Km = -32,561 / 3,0385
-1/Km = -10,72
soit Km = 0,093
Effet de l’inhibiteur
Dans cette partie, nous allons recommencer l’expérience mais en ajoutant au mélange 0,1mL
de l’inhibiteur, l’oxalate.
Cuve
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Volume de
Pyruvate
(2,1mM) Vp
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
(mL)
Volume de
solution
tampon (mL)
2,6
2,5
2,4
2,3
2,2
Volume de
NADH+H+ à
3mM (mL)
0,1
Volume de
solution
enzymatique
(mL)
0,1
Volume
d’inhibiteur
(mL)
0,1
Concentration
(mM)
0,07
0,14
0,21
0,28
0,35
2,1
2,0
1,9
1,8
1,7
0,42
0,49
0,56
0,63
0,70
Comme précédemment, nous traçons les courbes de l’évolution de la DO en fonction du
temps. Celles-ci nous permettront d’obtenir la vitesse initiale de chaque échantillon. Nous
réalisons ensuite les représentations de Lineweaver-Burk pour chacune des dix cuves. Cela
nous permettra d’en déduire les régressions linéaires indispensables à la détermination de la
constante de Michaelis ainsi que la vitesse maximale.
Temps
(s)
DO
tube 1
DO tube DO tube DO tube DO tube DO tube DO tube DO tube DO
DO
2
3
4
5
6
7
8
tube 9 tube
10
0
0,505
0,504
0,502
0,502
0,503
0,502
0,505
0,5046
0,52 0,520
15
0,489
0,48
0,471
0,469
0,466
0,464
0,46
0,446 0,463
0,459
30
0,474
0,459
0,44
0,428
0,433
0,427
0,415
0,393 0,418
0,41
45
0,457
0,434
0,42
0,409
0,403
0,396
0,387
0,342 0,371
0,367
60
0,443
0,417
0,395
0,382
0,376
0,361
0,354
0,304
0,33
0,327
75
0,429
0,398
0,368
0,355
0,342
0,33
0,321
0,263 0,281
0,288
90
0,415
0,377
0,345
0,327
0,314
0,304
0,292
0,227
0,249
0,25
105
0,402
0,358
0,321
0,304
0,286
0,273
0,264
0,196 0,222
0,217
120
0,388
0,34
0,299
0,28
0,26
0,244
0,235
0,161
0,19
0,186
135
0,376
0,323
0,276
0,256
0,234
0,22
0,209
0,131 0,164
0,158
150
0,365
0,306
0,253
0,235
0,214
0,197
0,188
0,102 0,138
0,135
165
0,353
0,291
0,238
0,214
0,193
0,175
0,166
0,091 0,121
0,114
180
0,342
0,273
0,22
0,193
0,173
0,158
0,148
0,076 0,102
0,096
195
0,33
0,259
0,202
0,175
0,156
0,141
0,129
0,064 0,085
0,08
210
0,32
0,245
0,185
0,158
0,139
0,125
0,114
0,052 0,072
0,068
225
0,311
0,232
0,17
0,143
0,125
0,111
0,098
0,042
0,06
0,057
240
0,302
0,219
0,155
0,128
0,11
0,096
0,086
0,035
0,05
0,047
A partir de ces relevés, nous pouvons déterminer les vitesses initiales en calculant la dérivée
de chaque courbe en 0. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau suivant ainsi que
les valeurs nécessaires à la réalisation des représentations de Lineweaver-Burk.
Tube
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Concentration
en pyruvate
(mM)
0,07
0,14
0,21
0,28
0,35
0,42
0,49
0,56
0,63
0,70
0,011
0,015
0,019
0,021
0,023
0,025
0,028
0,039
0,038
0,037
14,286
7,143
4,762
3,771
2,857
2,381
2,041
1,786
1,587
1,429
90,909
66,667
52,632
47,619
43,478
40,000
35,714
25,641
26,316
27,027
Vitesse
initiale
(mM/s)
1/c
1/V
Représentation de Lineweaver-Burk
120,000
100,000
y = 5,0005x + 24,677
1/V
80,000
60,000
40,000
20,000
-20,000
-15,000
-10,000
-5,000
0,000
0,000
5,000
10,000
15,000
20,000
1/c
D’après ce graphique, nous déterminons 1/Vmax qui correspond à l’ordonnée à l’origine.
Cette valeur nous donnera la vitesse maximale.
1/Vmax = 24,677 soit Vmax = 0,04 mM/s
La constante de Michaelis est déterminée comme suit :
-1/Km est égal à x pour y = 0
-1/Km = -24,677 / 5,0005
-1/Km = -4,93
soit Km = 0,203