D1-UE7-Guiraud
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UE7 – Génétique Pr. Pascale GUIRAUD Date : 25/01/15 Promo : 2014/2015 Ronéistes : Plage horaire : 8h30-10h30 VENTURINI Yann LAVAUD Aurore Introduction à la génétique médicale et chromosomes humains I. Introduction 1. Généralités A. Importance de la génétique en médecine B. Lexique (Elle ne commente pas ces rappels de base.) 2. Maladies génétiques et mutations A. Incidence des maladies génétiques B. Exemples d’incidence de maladies génétiques les plus fréquentes C. Classification des maladies génétiques 3. Génétique médicale A. A quoi sert la génétique médicale ? B. Consultation génétique et conseil génétique 4. Rappels sur l’organisation de l’information génétique A. Que trouve-ton dans une cellule ? B. Organisation de l’information génétique II. Le caryotype 1. Généralités A. Définitions B. Les caractéristiques du caryotype C. Techniques d’études 2. Protocole A. 1ère étape : culture cellulaire B. 2ème étape : arrêt de la culture C. 3ème étape : choc hypotonique D. 4ème étape : fixation des préparations métaphasiques E. 5ème étape : étalement des préparations chromosomiques sur lame F. 6ème étape : coloration G. 7ème étape : analyse et traitement des images 3. Structure des chromosomes A. Constrictions B. Centromères C. ADN satellites D. Télomères 4. Critères d’identification des chromosomes A. Généralités B. Technique des bandes C. Nomenclature 5. Le caryotype humain A. Classification des chromosomes B. Techniques de coloration 6. Anomalies du caryotype 7. Indication de caryotype à basse et haute résolution A. Indication du caryotype (liste non exhaustive) : quand est-ce que l’on fera un caryotype ? B. Indication du caryotype à haute résolution I. Introduction 1. Généralités A. Importance de la génétique en médecine On considère qu’environ : 50% des fausses-couches du trimestre 1 (T1) sont dues à une ou plusieurs anomalies chromosomiques du fœtus. 2% des pathologies congénitales "majeures" ont des facteurs génétiques pour origine. Pathologie congénitale = toute anomalie constatée à la naissance, sans préjuger de son origine génétique. 98% des pathologies congénitales ne sont donc pas d’origine génétique. 50% de retard mental sévère, de surdité congénitale ou de cécité de l'enfant sont dus à une cause génétique. Le diabète, l’hypertension, les thromboses, l’obésité… sont dues à des facteurs génétiques. 10% des cancers fréquents (intestin, sein, ovaires) de l'adulte ont une origine génétique. B. Lexique (Elle ne commente pas ces rappels de base.) - Gène : segment d'ADN qui code pour une protéine. - Génome : ensemble des gènes contenus dans une cellule. - Génétique : tout ce qui est en lien avec la constitution génique. - Héréditaire : qui peut se transmettre de génération en génération. - Congénital : présent à la naissance mais n’est pas forcément lié à une anomalie génétique. - Sporadique/ de novo : caractérise en général une mutation et signifie « qui arrive pour la première fois ». - Homozygote/ hétérozygote : Le terme homozygote s’utilise lorsque qu’un individu possède deux mêmes allèles d’un même gène. En revanche un individu est hétérozygote lorsque celui- ci possède deux allèles différents pour un même gène. Ce nombre variable d’allèles pour un même gène dérive du polymorphisme. - Syndrome : ensemble de signes rattachés à une même cause, qu'elle soit connue ou suspectée. 2. Maladies génétiques et mutations A. Incidence des maladies génétiques A titre d’exemple, on sait que : Il existe plus de 7000 maladies génétiques connues. Toutefois, une majeure partie d’entre elles concerne des maladies rares. Les maladies génétiques peuvent apparaitre très tôt ou à l’âge adulte. Chaque être humain est porteur en moyenne de 5 à 10 anomalies génétiques asymptomatiques. Il existe un certain nombre de gènes qui sont mutés sans présenter pour autant de phénotype connu à l’état hétérozygote (parmi ces mutations on peut citer en exemple la mucoviscidose qui touche 1 individu sur 20). On considère que chaque humain porte au moins 1 à 3 mutations récessives. Mais il y existe aussi d’autres remaniements comme des translocations équilibrées qui peuvent également passer inaperçu. Les translocations équilibrées concernent 1 individu sur 250. B. Exemples d’incidence de maladies génétiques les plus fréquentes Chez l’adulte Hypercholestérolémie familiale : 1/200 Cancer du sein d’origine génétique : 5 à 10% Cancer du côlon d’origine génétique : 5 à 8% Hémochromatose : 1/400. Chez l’enfant Trisomie 21 : 1/800 Mucoviscidose : 1/2500 Amyotrophie spinale : 1/3000 Surdités congénitales : 1/3000 C. Classification des maladies génétiques Anomalies chromosomiques (grossières) Anomalies géniques (ponctuelles) - Monogéniques (touchent un seul gène) - Polygéniques (touchent plusieurs gènes) - Multifactorielles (la maladie ne se déclenche qu’en cas de facteur(s) associé(s), environnementaux notamment) - Numériques - Structurelles 3. Génétique médicale A. A quoi sert la génétique médicale ? Tout d’abord, la génétique médicale comprend la génétique clinique, organisée autour de consultations de génétique. Ces consultations servent à : Etablir un diagnostic clinique avec l’aide des généticiens et de l’équipe soignante ; Informer le patient sur sa pathologie et assurer le soutien de celui-ci ainsi que de sa famille ; La participation des équipes médicales à une prise en charge médicale et socioéducative. Dans le cas des grossesses futures, l’inquiétude des familles nécessite l’apport de conseils et d’explications sur les risques de récurrences par exemple. Il est important d’informer les mamans sur les possibilités et les limites du diagnostic anténatal. Ainsi, on observe souvent une évolution vers un aspect de « conseil génétique » qui permet d’orienter les familles. Pour la famille, la génétique médicale permet d’organiser un dépistage des personnes à risque. Enfin, la génétique médicale est également caractérisée par la génétique biologique, dont le but est de poser un diagnostic. La génétique biologique met en œuvre : la cytogénétique (pour les anomalies chromosomiques), la biologie moléculaire (pour les mutations ponctuelles), la biochimie (pour les analyses fonctionnelles des protéines anormales). Suivant le diagnostic établi, on peut proposer des thérapeutiques spécifiques. B. Consultation génétique et conseil génétique La consultation génétique permet d’identifier une cause génétique potentielle. En parallèle, le conseil génétique, concernant les patients ou des apparentés à risque d’une maladie génétique, consiste à les informer sur : la nature, la cause, et les conséquences de la maladie ; la probabilité de la développer ou de la transmettre ; les moyens de la prévenir, dépister ou de l’améliorer ; les options pour la prise en charge ; les options pour un projet de conception futur. 4. Rappels sur l’organisation de l’information génétique A. Que trouve-ton dans une cellule ? Les anomalies conduisant à des maladies génétiques peuvent porter sur : L’ADN du noyau (hérédité conventionnelle) ou des mitochondries (hérédité non conventionnelle). L’ARN du noyau ou cytoplasme (issus de la transcription d’un ADN anormal). Les protéines (issues de la traduction d’un ARN anormal). Le caryotype humain comprend 46 chromosomes. L’ensemble de l’ADN d’une cellule humaine déroulé mesure jusqu’à 2 mètres et porte 30 000 gènes codant pour des protéines. B. Organisation de l’information génétique L’information génétique est répartie sur 46 chromosomes (soit 23 paires de chromosomes). Le nombre de bases de l’ADN est estimé à 3 000 Mb (3 milliards de bases). En moyenne, sur un chromosome, on peut retrouver 150 Mb (150 millions de bases) qui forment 250 à 2500 gènes. Dans une bande chromosomique, on dénombre 50 gènes. Une bande peut faire jusqu’à 5 Mb (5 millions des bases). Le génome mitochondrial porte également des gènes fondamentaux susceptibles d’être touchés par des mutations. II. Le caryotype 1. Généralités Les chromosomes sont des unités visibles au microscope optique au moment de la mitose (en raison de la forte condensation de la chromatine). Le chromosome mitotique est formé de deux chromatides identiques appelées chromatides sœurs qui persistent jusqu’à la fin de la métaphase. On peut parler de chromosome tout au long du cycle cellulaire : le chromosome mitotique est la forme condensée du chromosome interphasique. Pour analyser les chromosomes et déterminer des anomalies chromosomiques, on procède au caryotype. Caryotype normal : Femme 46, XX Caryotype normal : Homme 46, XY On peut observer qu’il y a un classement des chromosomes par paires en fonction de leur taille, de la position du centromère… Les chromosomes présentés ici sont caractérisés par une coloration hétérogène due à des méthodes de coloration particulières. Les chromosomes sexuels sont toujours positionnés à la fin. A. Définitions Cytogénétique : spécialité médicale qui étudie la morphologie du matériel génétique se présentant sous forme de chromosomes compacts (chez la cellule eucaryote). Caryotype : consiste en un dénombrement et une identification de tous les chromosomes d’une cellule chez un individu. En général, l’analyse se déroule en métaphase (caryotype classique). On peut également réaliser le caryotype en pré-métaphase ou prophase pour augmenter la résolution et le niveau de détail (caryotype à haute résolution). A ce moment- là, les chromosomes sont moins compactés, on obtient donc plus de bandes. B. Les caractéristiques du caryotype Le caryotype correspond au nombre de chromosomes d’une cellule. Il présente un nombre de chromosomes identique pour toutes les cellules d’un même organisme (à l’exception des gamètes bien sûr !). Il est constant pour les individus d’une même espèce et est caractéristique de l’espèce. Il peut servir à mettre en évidence des anomalies de nombre ou de structure. Le caryotype ne permet pas de détecter des mutations ponctuelles, mises en évidence par des techniques de biologie moléculaire. Nombres chromosomiques diploïdes de quelques espèces (à titre indicatif !). C. Techniques d’études Pour étudier le caryotype, on utilise plutôt des chromosomes métaphasiques (mais il est aussi possible de réaliser un caryotype avec des chromosomes prémétaphasiques ou prophasiques). En biologie humaine, les échantillons sont le plus souvent : des fibroblastes (à partir de biopsies cutanées), des lymphocytes (à partir d’un prélèvement sanguin), des cellules buccales, des amniocytes (à partir d’un prélèvement de cordon ombilical) pour les dépistages pré-nataux, des cellules de moelle osseuse (a partir d’un myélogramme), des cellules tumorales ou ganglionnaires (pour les prélèvements d’oncologie). En général, le prélèvement sanguin est privilégié chez l’adulte. Une fois le sang prélevé, on met les lymphocytes en culture dans un milieu riche contenant de la phytohémagglutinine (permet l’agglutination des globules rouges qui ne nous intéressent pas). L’objectif de ce protocole est d’obtenir la division cellulaire des lymphocytes pour la bloquer en métaphase. Ce blocage nécessite l’emploi de différents produits tels que la colchicine (alcaloïde qui inhibe la polymérisation des microtubules). Etant donné que les chromosomes ne sont visibles que pendant une courte période du cycle cellulaire (la division), toutes les techniques visent à obtenir un maximum de cellules bloquées à ce stade. Le caryotype doit donc être réalisé sur une population cellulaire en division active. La multiplication est soit spontanée, soit obtenue artificiellement par une mise en culture. 2. Protocole A. 1ère étape : culture cellulaire Il est obligatoire d’opérer avec des cultures stériles. Les milieux de cultures doivent être adaptés avec l’association d’antibiotiques et d’antifongiques. Les milieux de cultures sont généralement des milieux synthétiques enrichis en sels minéraux, glucose et acides aminés auxquels on ajoute du sérum animal (veau). Les laboratoires de cytogénétique sont équipés de matériels spéciaux tels que des hottes ou des récipients stériles en verre ou en plastique. Caryotype constitutionnel : à partir de SANG TOTAL On associe du sang total à un milieu de culture riche en phytohémagglutinine (stimules les lymphocytes T et élimine les hématies). La culture dure 72 heures à 37°, à l’étuve. Hémopathies malignes : à partir de SANG ET MOELLE Pour ce type de pathologie, le protocole de culture est différent. Tout d’abord, il faut rincer les cellules dans un milieu de culture puis effectuer une centrifugation. Ensuite, on récupère l’anneau de cellules mononuclées. Après avoir fait une numération cellulaire, on débute la mise en culture dans un flacon Falcon en présence ou non de mitogènes. Tissus solides La première étape consiste à dilacérer le fragment de tissu dans une boite stérile. On réalise alors un comptage des cellules libérées dans le surnageant, puis celles-ci sont disposées dans un milieu de culture. La mise en culture se fait dans un flacon Falcon sous surveillance quotidienne au microscope inversé (qui permet d’observer par dessous). Sur l’image au centre, on peut voir un microscope inversé (qui permet d’observer par en dessous), et sur celle de gauche une étuve. La culture se fait : à température stable : 37°C à pH compris entre 7.2 et 7.4 en air enrichi en CO2. Le temps de culture peut aller jusqu’à 72h (mais est variable en fonction du prélèvement). B. 2ème étape : arrêt de la culture Lorsque le nombre de cellules obtenues est suffisant, on ajoute au milieu un agent bloquant du fuseau mitotique (colchicine ou sulfate de vinblastine). Les cellules sont ainsi bloquées en métaphase. C. 3ème étape : choc hypotonique Après blocage des cellules en métaphase, un choc hypotonique est réalisé. Ce dernier est indispensable à l’obtention d’un étalement correct des chromosomes. Le choc hypotonique s’obtient en mettant les cellules en contact avec du KCl ou du MgCl2 : la pression osmotique varie et on assiste à un éclatement des membranes cellulaires avec dispersion des chromosomes. D. 4ème étape : fixation des préparations métaphasiques Cette fixation se fait avec un mélange d’éthanol et d’acide acétique. On obtient ainsi un culot de cellules fixées que l’on remettra en suspension pour l’étape suivante : l’étalement sur lame. E. 5ème étape : étalement des préparations chromosomiques sur lame L’étalement a pour but d’obtenir des métaphases avec des chromosomes bien séparés et non réfringents (faciles à observer). Pour cela, il suffit de faire tomber une ou deux gouttes de suspension cellulaire sur une lame. On obtient alors des spots, qui correspondent à des ensembles de chromosomes (1 spot = 1 cellule). L’analyse microscopique permet de repérer des groupes de chromosomes comme sur l’image ci-dessus. Il faut alors rassembler les paires de chromosomes puis les compter. Joie. F. 6ème étape : coloration A la suite de cette étape d’étalement, une nouvelle fixation est pratiquée, puis une coloration suivant différentes techniques (coloration uniforme ou à bandes). La fluorescence par exemple constitue une technique de coloration moderne qui n’est pas utilisée en routine. G. 7ème étape : analyse et traitement des images Après analyse microscopique, on peut obtenir des photos manuellement comme sur la photo de droite, ou directement à partir d’un logiciel comme sur la photo de gauche. Sur la photo de droite, on peut admirer l’atelier découpage du laboratoire. Schéma récapitulatif 3. Structure des chromosomes Un caryotype humain normal doit contenir 46 chromosomes. On doit donc pouvoir retrouver les 22 paires d’autosomes et la paire de gonosomes XX ou XY. Les chromosomes sont tous constitués d’une molécule d’ADN associée à de nombreuses protéines. Ils servent de support à l’information génétique. Les télomères correspondent aux extrémités des bras des chromosomes. Le centromère correspond à la partie centrale des chromosomes, région où les chromatides sont encore reliées. De part et d’autre du centromère se trouvent les bras, longs d’un côté et courts de l’autre. Les bras courts sont désignés par un p et les longs par un q. Ces caractéristiques participent à la classification des A. Constrictions Ce sont des étranglements de la molécule d’ADN. Constrictions primaires : ce sont les centromères. Constrictions secondaires : retrouvées au niveau des bras de certains chromosomes. On les observe en particulier sur les chromosomes 1, 9, 16 et Y. Ces configurations sont constituées d’ADN hautement répétitifs (hétérochromatine constitutive). On retrouve ce type de particularité au niveau des bras courts des chromosomes acrocentriques. L’ADN contenu dans les constrictions primaires et secondaires représente 10% du génome humain. B. Centromères Il correspond à la constriction primaire de tous les chromosomes mitotiques. Il s’agit d’une structure complexe étroitement associée aux protéines et microtubules. En effet, le centromère est lié au kinétochore. Ce dernier émet des microtubules sur lequel s’insèrent les fibres du fuseau lors de la métaphase. Ce complexe joue un rôle essentiel dans la séparation des chromosomes. Le centromère sépare le chromosome en deux parties souvent inégales (bras court p et long q). Ce qui nous permet de définir l’index centromérique. Index centromérique = p/(p+q). C. ADN satellites Il existe plusieurs types d’ADN satellites : L’ADN α satellite est un motif répété de 170pb situé sur toutes les paires chromosomiques dans la région centromérique. L’ADN β satellite est un autre motif répété plus court localisé dans les régions péri-centromérique des chromosomes 1, 3, 9 et Y et sur les bras courts des chromosomes acrocentriques (13, 14, 15, 21 et 22). L’ADN sat 1 et 2 répartis sur de nombreux chromosomes. L’ADN sat 3, retrouvé sur les régions centromériques et hétérochromatiques des chromosomes 1, 9, 16 et Y. Le nombre de répétition de ces ADNs varie selon les individus. D. Télomères Les télomères correspondent aux extrémités des chromatides. Ils maintiennent l’intégrité des chromosomes et ont des propriétés répulsives. Ces régions sont constituées d’une séquence de 6pb « 5’ TTAGGG 3’ » répétée sur une longueur de 2 à 30 kb. Les télomères sont impliqués dans le vieillissement cellulaire : à chaque nouvelle division, les télomères se raccourcissent. La cellule cesse ses divisions et meurt lorsque ses télomères ont disparu. 4. Critères d’identification des chromosomes A. Généralités La longueur relative : on compare les chromosomes les uns par rapport aux autres. On remarque alors qu’ils sont de taille différente. L’indice centromérique : p/(p+q). Il permet de caractériser la place du centromère. Ainsi on parle de métacentrique lorsque le centromère est au milieu du chromosome, de submétacentrique lorsqu’il est moyennement décalé et acrocentrique lorsqu’il est complètement décalé. Métacentrique : le centromère est au milieu Subcentrique et acrocentrique : le centromère est décalé d'un côté. Les constrictions secondaires peuvent être unique ou à plusieurs par bras. Parmi ces constrictions, certaines correspondent à des organisateurs nucléolaires. Les satellites sont des éléments morphologiquement différenciés, retrouvés aux extrémités des bras. Ils sont reliés au reste du chromosome par des constrictions secondaires. B. Technique des bandes Les bandes chromosomiques sont des techniques de coloration qui améliorent soit l’observation, soit l’identification de certaines paires de chromosomes. La coloration se réalise après dénaturation partielle (enzymatique, physique ou chimique) du chromosome. Elle se présente alors sous forme de bandes transversales claires ou foncées. Les techniques de bandes vont en faire apparaitre un nombre plus ou moins important selon la taille du chromosome, la technique employée et le stade de réalisation du caryotype. A gauche : un chromosome métaphasique à 550 bandes A droite : un chromosome prophasique à 850 bandes. Ici l’analyse de chromosomes à différentes résolutions, en métaphase, pré-métaphase et prophase. C. Nomenclature Si l’on veut désigner une partie plus précise d’un chromosome (par exemple pour indiquer la position d’un gène ou la position d’une anomalie) on va utiliser cette méthode des bandes. Il y a une façon de désigner la position d’une bande sur un chromosome. Exemple : la bande 7 q 32. 7 pour le numéro du chromosome q pour le bras long 3 pour la région pour la 2e bande de la région 3. Une région regroupe plusieurs bandes. Ces régions sont numérotées à partir du centromère. Lorsque l’on décrit un chromosome, il faut préciser quelle méthode de coloration a été utilisée. En effet les alternances et le nombre de bandes dépendent de la technique utilisée. Pour chaque technique de bande, on sait comment se présente un chromosome normal; c’est- à-dire le nombre de bandes, éventuellement le nombre de sous-bandes. Le nombre de bandes dépend : de la technique utilisée du stade de condensation (métaphase, prémétaphase...). Le nombre de bandes augmente de façon inverse avec le stade de condensation. Que ce soit en bande G ou R, on aura environ 300-400 bandes par chromosome. Dans des caryotypes à haute résolution on aura des notions de sous-bandes (précision +++). Comparaison de méthode haute résolution (à gauche avec les sous bandes) et classique (à droite). Il existe une nomenclature internationale (ISCN) où l’on représente les chromosomes normaux humains. Ici, c’est par la technique des bandes G. On peut trouver la même chose avec tous les gènes identifiés sur chacun des chromosomes. 5. Le caryotype humain Il est réalisé dans 2 cas : anomalies diverses connues dans la famille, anomalies survenue de novo chez un enfant (malformations). Le caryotype ne permet de détecter que les anomalies « grossières » et aberrations chromosomiques. Il ne détecte pas les mutations ponctuelles (délétions etc...). L’objectif est de vérifier le nombre, la taille et la forme de chromosomes. A. Classification des chromosomes Les chromosomes sont classés en 7 groupes (de A à G) en fonction de leur taille et de la position du centromère. Les chromosomes du groupe A sont les plus grands, ceux du groupe G sont les plus petits. Le chromosome X fait partie des chromosomes de taille moyenne (groupe C) et le chromosome Y fait partie Groupe A = grands centromériques : 3 paires de plus grande taille avec un centromère proche de la partie médiane, on les classe ensuite suivant leur taille décroissante et la position des bandes. Groupe B = Submétacentrique : Groupe C = centromère quasi-médian : Groupe D = Acrocentriques « grands » : Groupe E = petit centromère quasi-médian : Groupe F = centromériques « petits » : Groupe G = acrocentriques «petits » : En résumé : B. Techniques de coloration 1. Giemsa Coloration de routine uniforme pour faire du dénombrement ou une analyse de rapide des cassures les plus grossières. Permet d'observer le caryotype, mais on n'a pas de différence entre les chromosomes du fait de l'uniformité de la coloration. Permet le classement par groupes, de faire un bilan global et un bilan des cassures. 2. Techniques de bandes (technique plus fine donnant plus d’informations) Succession de bandes longitudinales constantes et caractéristiques de chaque paire chromosomique. Nombre de bandes variable selon la condensation de la chromatine (300 par lot haploïde de chromosomes en métaphase). Marquage clair ou foncé selon la richesse en AT ou CG des régions chromosomiques. - Bandes G est la plus souvent utilisé (référence) = déprotéinisation enzymatique ou chimique + Giemsa. Extrémités ou télomères des chromosomes en clairs et les régions riches en A-T en foncées. - Bandes R est globalement inversées par rapport aux bandes G, dénaturation cette fois-ci par la chaleur + Giemsa, marquent mieux les télomères et les régions G-C. Donc si l’on veut étudier la région télomérique pour une cassure par ex, on prendra les bandes R. Bandes R Bandes G Coloration faible Coloration forte Riches en GC Riches en AT Sensibles à DNAse Insensibles à DNAse Condensation tardive Condensation précoce Réplication précoce Réplication tardive Riches en gènes Pauvres en gènes LINE - / ALU + LINE + / ALU - Dans les séquences d’ADN, il existe principalement deux types de séquences répétées : Séquences localisées répétées en tandem séquences microsatellites : 2-10 pb, très répétées. séquences minisatellites : 10-100 pb, très répétées. grands blocs d’ADN satellite : 10% du génome humaine, une dizaine de Mb (méga bases), localisés très majoritairement au niveau des centromères et télomères. Séquences répétées dispersées (vertébrés), apparentées, réparties sur l’ensemble du génome dont un certain nombre est mobile : séquences SINE (Short Interspersed Elements) ou ALU : dont la taille varie entre 130-500 pb, les plus abondantes chez l'homme sont les séquences Alu. Merlefeu. séquences LINE (Long Interspersed Elements = longue séquence répétée intercalée) : leur taille est de quelques kb (5-7 kb), environ 100 000 copies dans le génome humain. séquences LTR (Long Terminal Repeat) : relativement petite taille mais en très grande quantité dans le génome (environs 400 000 copies) transposons d’ADN : très mobiles, de 300 – 300 000 copies, issus de la transposition de certains gènes d'une partie d'un chromosome vers une autre partie du génome. Séquences ALU : - Elles ont un intérêt particulier dans l’étude de l’évolution (séquence spécifique de l’Homme et de certains primates proches). - On va en trouver environ 500 000 copies dans le génome - Elément possiblement mobile. - L’insertion de ces séquences ALU est impliquée dans plusieurs maladies humaines héréditaires, dont plusieurs groupes de cancers. Elles peuvent faire l’objet dans certains cas d'études particulières. Elles sont étudiées aussi dans l'évolution des populations. Remarque : les séquences localisées répétées en tandem sont répétées sur la même portion d’ADN alors que les séquences répétées dispersées ne sont pas forcément répétées au même endroit. Différents caryotypes humains avec différentes techniques : Ici le caryotype féminin en bande G 46XX Ici en bande R où l’on voit globalement une inversion de coloration des bandes Ici, dans un caryotype masculin, pour chaque chromosome, on a fait une bande G et R. Il est possible d'appliquer du marquage en fluorescence pour regarder des bandes particulières. C'est une technique de bandes qui utilise les sondes fluorescentes couplées à des fluorochromes dirigées contre différentes portions des chromosomes (peu d'intérêt et très cher). Par contre, on peut utiliser des sondes dirigées contre une portion des chromosomes afin d’identifier une microdélétion). - Bandes Q : dérivés fluorescents de la quinacrine (examen sous lumière UV). Ces bandes fluorescentes sont comparables aux bandes G. Les bandes Q permettent l’étude du chromosome Y (bras long) (pour les autres chromosomes, ça n'a pas vraiment d'intérêt). 3. Autres colorations - Bandes C (traitement Ac/base + baryum + Giemsa) : coloration spécifique des centromères. - Bandes T Modification technique des bandes R. Permet d'améliorer le marquage des télomères. - Ag NOR (Argent Nucleolar Organizing Regions) Coloration à l’argent (Ag NO3 Nitrate d'argent) sur les bras courts des chromosomes acrocentriques 13, 14, 15, 21 et 22 pour les organisateurs nucléolaires. 4. Méthode à la Bromodéoxyuridine (BrdU) Analogue de la thymidine qui va pouvoir être utilisé lors d’un test ADN : on met les cellules en présence de ce composé et elles vont produire de l’ADN à la place de la thymidine, BrdU étant fluorescent on va pouvoir analyser l’ADN. Ajouter le composé en milieu de culture => incorporation préférentielle à la thymidine. Attendre 2 divisions (= mitoses) pour pouvoir comparer les 2 chromatides sœurs : La partie contenant la thymidine est plus foncée alors que la portion qui contient l'analogue (BrdU) apparaît plus claire. Utilisée dans des cas particuliers comme la mise en évidence de crossing-over (=échange anormaux entre chromatides sœurs) ou d'anomalies chromosomiques telles que les cassures et les échanges. Il faut donc 2 mitoses pour pouvoir faire l’observation. On part d'une cellule normale. On la met en contact avec de la BrdU. Le BrdU s’incorpore sur le chromatide néo synthétisé de la phase S. A l'issu de cette première mitose, on obtient des chromatides dont un brin contient de la BrdU et l'autre de la thymidine. A la 2eme mitose, se produit une 2eme phase S avec de la BrdU. Pour un cas normal, on devrait obtenir une chromatide qui n'a que de la thymidine et l'autre chromatide que de la BrdU En principe, on a un aspect uniforme : une chromatide claire et une chromatide sœur plus foncée. S'il y a des cassures => aspect en mosaïque, c’est-à-dire des alternances de régions claires et foncées des 2 côtés. Cas normal 6. Anomalies du caryotype Anomalies chromosomiques constitutionnelles qui sont des anomalies chromosomiques survenues avant la fécondation, lors des premières divisions du zygote. Anomalies chromosomiques acquises qui vont apparaître chez l'individu au cours de sa vie et ne toucher qu'un seul organe (ne concernera pas la descendance). Anomalies chromosomiques homogènes quand toutes les cellules de l'individu présentent l'anomalie. Anomalies chromosomiques en mosaïque quand on a chez le même individu plusieurs populations de cellules (en général 2) avec des caryotypes différents. Anomalies chromosomiques héritées, dont on sait qu'elles ont déjà existé dans la famille et sont potentiellement transmissibles. Anomalies chromosomiques de novo quand on a le premier cas qui survient (sans antécédent connu). Anomalies du nombre de chromosomes (= aneuploïdie) : - Trisomie, - Monosomie, - Triploïdie. Altération de la structure des chromosomes : équilibrée quand il n'y a pas de perte de matériel, déséquilibrée quand il y a perte de matériel génétique : - Remaniement, - Cassure, - Duplication, - Délétion, - Translocation réciproque (échange de fragments), - Translocation robertsonnienne (fusion entre chromosomes acrocentriques : 13, 14, 15, 21, 22). 7. Indication de caryotype à basse et haute résolution A. Indication du caryotype (liste non exhaustive) : quand est-ce que l’on fera un caryotype ? Chez le nouveau-né - Cas de décès du nouveau-né (mort-né ou très rapidement après la naissance). - Tableau clinique évocateur d'une aberration chromosomique. - Tableau de malformations importantes ou de dysmorphies atypiques (non expliqué par d'autres facteurs). Chez l'enfant - Garçon : handicap mental moyen ou profond non expliqué par d'autres ATDC particuliers au moment de la naissance ou autres. - Fille : retard de croissance, hernie des gonades. Chez l'adolescent - Anomalies constatées au moment de la puberté. Chez l'adulte - Naissance d'un enfant présentant une anomalie chromosomique. - Fausse-couche spontanée à répétition sans autre explication. - Stérilité masculine. - Ménopause précoce. En hémato-cancérologie - Nombreux processus cancéreux sont très souvent associés à des remaniements chromosomiques et parfois peuvent être spécifique de certains types de tumeurs => pronostic, diagnostic, thérapeutique. B. Indication du caryotype à haute résolution C’est un examen de 2e intention, qui est réalisé après un caryotype classique qui n’aurait rien révélé de particulier. Le caryotype classique permettra de mettre en évidence des anomalies minimes du caryotype (anomalies invisibles sur un caryotype classique). Question : les anomalies chromosomiques ne gênent-elles pas l’identification des chromosomes ? En effet ça arrive, et ce n’est pas toujours évident d’identifier correctement des chromosomes anormaux... La solution consiste à faire plusieurs caryotypes, afin de confirmer et d’identifier plus précisément l’anomalie. Les manipulateurs chargés d’effectuer des caryotypes en routine ont toutefois l’habitude. Avec un peu d’expérience ils s’y retrouvent. Annexe : projet génome humain. Mme Guiraud rajoute en annexe un aperçu des résultats du projet international Génome Humain (1990) dont l’objectif était le séquençage et la cartographie de la totalité du génome humain. Chaque pays du projet a étudié un chromosome mitotique en détaillant : Sa longueur, La position et le nombre de ses gènes (estimation), Ses caractéristiques. Ce projet à l’échelle mondiale a mobilisé des centaines de chercheurs dans le monde (40 labos) entre 1990 et 2003. Pour les détails, voir les diapos : Guiraud a fait une diapo par chromosome, a fait une diapo par chromosome, mais n’a rien détaillé ou commenté.
