Applications de la spectroscopie et de l`imagerie tissulaire de
publicité
Geneviève Bourg-Heckly! Laboratoire ANBioPhy! FRE CNRS 3207, Université Pierre et Marie Curie,! Méthodes instrumentales! Développement de techniques innovantes! Compréhension des mécanismes, quantification! Etudes cellulaires et tissulaires, modèles animaux! Applications cliniques! Protocoles cliniques ! A. Contexte médical ! B. Diagnostic fondé sur les fluorophores exogènes! C. Diagnostic fondé sur les fluorophores endogènes! D. Mise en oeuvre clinique! ! •" biopsie optique! ! •" imagerie endoscopique! ! A. Contexte médical ! B. Diagnostic fondé sur les fluorophores exogènes! C. Diagnostic fondé sur les fluorophores endogènes! D. Mise en oeuvre clinique! ! •" biopsie optique! ! •" imagerie endoscopique! Majorité des cancers d’origine épithéliale# Cancérisation est un phénomène évolutif! Schéma simplifié de la cancérisation de l’oesophage! Majorité des cancers d’origine épithéliale# Cancérisation est un phénomène évolutif! Intérêt du diagnostic des lésions précancéreuses et cancéreuses précoces! ! •" augmentation des chances de guérison! ! •" traitements moins agressifs! Technique de diagnostic actuel! ! •" examen endoscopique en lumière blanche! ! •" biopsies sur zones suspectes! ! ! ! ! •" examen microscopique du prélèvement ! " " par anatomopathologiste! +! Nature# histologique# du tissu! Sensibilité clinique médiocre! • Tomographie Optique Cohérente (OCT) ! •" Spectroscopies optiques! ! ! spectroscopie de fluorescence! ! ! spectroscopie de diffusion élastique (ESS)! ! ! spectroscopie Raman! • Microscopie confocale fibrée! Caractéristiques! •" Non invasive! •" Sensible! •" Compatible avec l’exploration endoscopique! •" Radiation non ionisante! Fluorophores! Molécule susceptible, en réponse à une excitation lumineuse de longueur d’onde appropriée, d’émettre un rayonnement lumineux! Mécanisme de la fluorescence! Caractéristiques! •" Non invasive! •" Sensible! •" Compatible avec l’exploration endoscopique! •" Radiation non ionisante! S2 2 1 0 Conversion interne S1 2 1 0 Absorption Conversion intersystème 2 1 0 T1 Fluorescence Phosphorescence S0 2 1 0 A. Contexte médical ! ! B. Diagnostic fondé sur les fluorophores exogènes! C. Diagnostic fondé sur les fluorophores endogènes! D. Mise en oeuvre clinique! ! •" biopsie optique! ! •" imagerie endoscopique! Principe de détection! Affinité de certains fluorophores pour les tissus tumoraux! Concentration [F] plus importante dans la tumeur que dans tissu sain! Zones tumorales produisent une intensité de fluorescence plus élevée! contraste ! entre zone saine et zone tumorale! Fluorophores utilisés! Photosensibilisateurs (PS) utilisés en thérapie photodynamique! •" dérivés de la porphine (photofrin, m-THPC ...)! •" acide amino-lévulinique (ALA) et ses dérivés! •" hypéricine! avantages! •" rendement quantique de fluorescence élevé! •" un seul fluorophore! inconvénients! •" administration d’un produit chimique! •" photosensibilisation cutanée si injection systémique! A. Contexte médical ! B. Diagnostic fondé sur les fluorophores exogènes! ! C. Diagnostic fondé sur les fluorophores endogènes! D. Mise en oeuvre clinique! ! •" biopsie optique! ! •" imagerie endoscopique! Exploite les fluorophores naturellement présents dans le tissu! Principaux fluorophores endogènes! absorption max. (nm) émission max. (nm) origine tryptophane 275 350 protéines collagène 335 390 tissu conjonctif élastine 360 410 tissu conjonctif NADH 340 450 chaîne respiratoire flavines 450 530 chaîne respiratoire Caractéristiques spectrales des fluorophores endogènes! absorption max. (nm) émission max. (nm) origine tryptophane 275 350 protéines collagène 335 390 tissu conjonctif élastine 360 410 tissu conjonctif NADH 340 450 chaîne respiratoire flavines 450 530 chaîne respiratoire Paramètres déterminant l’autofluorescence tissulaire! Spectres tissus sain et tumoral diffèrent au niveau! • Métabolisme cellulaire ! • Morphologie tissulaire ! -" intensité globale! -" distribution spectrale ! • Vascularisation du tissu ! Exemple: Dysplasie de Haut Grade de l’oesophage! !ex = 330 nm" (a. u.) 100 normal mucosa HGD on BE 80 fluorescence intensity I390 nm ! 60 R=! 40 I450 nm ! 20 0 300 350 400 450 500 wavelength 550 600 650 Ratio d’intensité R = marqueur de la nature histologique du tissu! Bourg-Heckly G., Blais J. et al. Endoscopy. 2000;32(10)! Exemple: résultats d’une étude clinique sur l’oesophage! Variation relative du ratio R entre tissu sain et néoplasique ! 1,20 muqueuse malpighienne 1,00 R1 DHG et Kintramuqueux 0,80 0,60 0,40 Carcinome intramuqueux et DHG de l'oesophage 0,20 0,00 16 17 18 19 20 21 22 23 24 avantages! •" aucun produit à administrer au patient! •" très sensible! inconvénients! •" faible signal de fluorescence! •" information globale impliquant de nombreux paramètres! A. Contexte médical ! B. Diagnostic fondé sur les fluorophores exogènes! C. Diagnostic fondé sur les fluorophores endogènes! ! D. Mise en oeuvre clinique! ! •" biopsie optique! ! •" imagerie endoscopique! Deux techniques! Spectroscopie point par point! ou biopsie optique! Imagerie! Schéma de principe d’un spectrofluorimètre à fibres! dédié à la clinique! Fibres réception! fluorescence! Spectromètre (CCD)! Lampe Xénon! Endoscope! Canal opérateur! Fibre! Tissu ! excitation ! Filtre! 330 nm! Faisceau de fibres ! 1 fibre excitation! 9 fibres réception! Caractéristiques d’une biopsie optique! Dimensions of probed Dimensions du by! volume volume determined sondé déterminé par! Typical optical biopsy Volume typique d’une volume! biopsie optique! •" optical fiber core diameter! •" diamètre de cœur de la fibre! •" excitation wavelength! •" longueur d’onde d’excitation ! •" tissue optical properties! •" propriétés optiques du tissu ! •"•"area: 100 µm! surface: 100- -1000 1000 µm! profondeur: qqus 100 µm! µm! •"•"depth: a few hundreds mise en oeuvre clinique dans le cadre d’une procédure endoscopique conventionnelle! •" sonde optique insérée dans le canal opérateur! •" extrémité distale au contact du tissu! •" position de la sonde contrôlée sur moniteur vidéo! •" acquisition d’un spectre 1 seconde! Etat de l'art de la biopsie optique! •"" recherche active fondamentale et clinique ! ! ! compréhension des mécanismes à l’origine! de la modification du spectre tissulaire! ! ! ! quantification des spectres! ! détermination signatures spectrales! •"" tous organes accessibles par endoscopie:! " " bronches, côlon, col de l'utérus, œsophage, vessie ! Etat de l'art de la biopsie optique! •"" recherche active! •"" tous organes accessibles par endoscopie:! " " bronches, côlon, col de l'utérus, œsophage, vessie ! Offre industrielle! •"" marché principal visé: col utérin (colposcopie)! •"" plusieurs constructeurs, essentiellement aux USA ! LifeSpex, Mediscience Technology, MediSpectra, SpectRx ! Conditions! d’excitation! !,Irradiance,! Ø fibre! Propriétés optiques du tissu absorption, diffusion! Plusieurs! •" localisation tissulaire! fluorophores! •" fonctions biologiques! excités ! •" spectres d’émission ! Modification intensité et distribution spectrale ! Spectres observés! in vivo! CONTRADICTION ?! Cellules épithéliales oesophagiennes! en culture! NADH seul! Milieu optiquement mince! Interprétation! $! $! Muqueuse oesophagienne in vivo! Superposition collagène + NADH! Absorption et diffusion tissulaire! contribution collagène prépondérante# masque augmentation NADH ! prise en compte propriétés optiques tissu! Évolution vers l’imagerie! •" exploration de la totalité de la surface! •" information spectrale sous forme directement ! exploitable en temps réel par le praticien ! Objectif! Information contenue dans les spectres sous forme! d’une image! Image de fluorescence de même taille et résolution! spatiale que l’image endoscopique conventionnelle! Principe! Formation de 2 images d'autofluorescence dans deux bandes passantes différentes! Algorithme de traitement combinant I1 et I2! Affichage image en pseudo-couleurs! I1! (a. u.) 100 normal mucosa HGD on BE !1" !1" fluorescence intensity 80 I2! !2" 60 ! 2" 40 20 0 300 350 400 450 500 wavelength 550 600 650 I1 ! R=! I2! Schéma de principe! Axes de développement! •"" Bronches (autofluorescence)! •"" Vessie (ALA - PPIX, hypéricine)! •"" Voies digestives (oesophage et côlon)! Etat de l'art! •"" Recherche clinique active ! •"" Systèmes commercialement disponibles! " " pour les bronches et la vessie! •"" Majorité des travaux de recherche clinique! •"" Essais multicentriques randomisés WL vs WL + AF! •"" Gain en sensibilité de détection démontré! •"" Offre commerciale la plus importante! Principe! •" excitation: 390 - 460 nm! •" 2 BP de détection:! ! # vert 500 - 580 nm! ! # rouge > 630 nm ! Origines du contraste entre tissu sain et dysplasies - CIS! principales hypothèses! Epithelium Upper Submucosa Epithelium Lower Submucosa Upper Submucosa Lower Submucosa Cartilage Cartilage •" épaississement de l’épithélium! •" variation distribution et concentration fluorophores! •" variation métabolisme cellulaire et environnement! •" altération matrice extra-cellulaire (collagène - élastine)! •" absorption hémoglobine due à la micronéoangiogenèse! principe! XILLIX système LIFE! Dr Luc Thiberville, CHU Rouen, Pneumologie / Inserm U.295! Patient âgé de 50 ans, grand tabagique, présentant des bronchites à répétition.! La bronche LB3a apparaît normale en lumière blanche mais présente une interruption de fluorescence de classe II.! L'histologie confirmera l'existence d'une dysplasie mineure sans métaplasie.! Dr Luc Thiberville, CHU Rouen, Pneumologie / Inserm U.295! EPFL: Tanja Gabrecht, Georges Wagnières! Système d'imagerie de fluorescence pour la détection du cancer précoce dans les bronches par endoscopie Endoscope Fluorescence" 3 CCD Camera Head Bronchi Transmission [%] 80 60 Filtre d'excitation LP Filter Light Source Flip-Flop Filter 40 20 0 350 DV Recorder Camera Driver # Excitation Light 100 Monitor 450 550 650 Longueur d'onde [nm] 750 Footswitch DAFE – RICHARD WOLF! Images obtenues avec le DAFE au CHU Vaudois! Collaboration entre l'EPFL, le CHUV et la société Wolf Endoskope! Lumiére Blanche DAFE DAFE – RICHARD WOLF! Principe! Vidéobronchoscopie d’autofluorescence! Vidéobronchoscopie d’autofluorescence! Présentation des images! acide aminolévulinique 5-ALA ! •" molécule non fluorescente! •" précurseur de la PPIX dans la synthèse de l’hème! •" pénétration limitée à l’épithélium! administration de 5-ALA exogène! •"" stimulation de la formation de PPIX ! •"" accumulation préférentielle de PPIX dans les cellules! " " tumorales (facteur 10)! Protoporphyrine IX (PPIX) fluorescente! •"" Absorption dans le violet ! max = 410 nm! •"" Fluorescence dans le rouge I max = 635 nm! Application clinique principale! Détection des carcinomes urothéliaux superficiels! Carcinomes urothéliaux superficiels! •"" tumeurs plurifocales! •"" lésions planes difficiles à détecter! •" après résection endoscopique:! 50 - 70% récidives locales! 10 - 20% tumeurs infiltrantes! Instrumentation commercialement disponible! KARL STORZ «" D-Light system" »! •"" filtre bleu sur la source de lumière 375-440 nm! •"" filtre passe-haut de réception intégré ! >520 nm! •" commutation entre image blanche et image de fluorescence! •" observation : oeil ou CCD! KARL STORZ «" D-Light system" »! Procédure clinique! •" instillation intravésicale (1,5 g d’ALA)! •" durée d’incubation 2 - 3 heures! •" résection transuréthrale possible sous contôle fluorescence# durant la même séance! Résultats cliniques! •" plusieurs études cliniques depuis 1991! •" sensibilité: 87% à 96%! •" spécificité: 54% à 68%! •" gain d’environ un facteur 2 pour la sensibilité# de détection des CIS! Principales références! •" Kriegmair et al. 1994, 1995, 1996! •" d’Hallewin et al. 1998, 2002! •" König et al. 1999, 2001! •"Jichlinski et al. 1997, 2003! •"Filbeck et al. 1999, 2002! Exemples d’images obtenues avec le D-Light Karl Storz ! molécule fluorescente hydrophobe extraite du millepertuis! Intensité de fluorescence (u.a.)! 8000 8000! !! Cellules tumorales! !! 4000 4000! Cellules normales! !! 0! 557 607 657 707 ! Longueur d’onde (‘nm)! cellules d’un frottis du col de l’utérus incubées 1 heure! (hypéricine 2 µM)! HYPERICIN HYPERICIN HYPERICIN HYPERICIN CONCLUSIONS Sensitivity 95% Specificity 94% Photobleaching Clearance Clinical relevance of fluorescence endoscopy 20% increased detection 60% reduced recurrence 10% adapted therapy Sur le plan clinique! •"" Capacité diagnostique cliniquement démontrée pour les! " " bronches et la vessie! •"" Nécessité d’essais randomisés WL vs WL + Fluorescence! " " pour chaque organe, type de tissu et pathologie ! Sur le plan fondamental! •"" Compréhension des mécanismes à l’origine de la modification! " " spectrale lors de la cancérisation! •"" Optimisation des critères de discrimination! •"" Augmentation spécificité ! Sur le plan industriel! •" pas de verrou technologique majeur! •"" offre industrielle se diversifie! •"" présence accrue des leaders mondiaux de l’endoscopie !
![Télécharger le poster [PDF - 1 Mo ]](http://s1.studylibfr.com/store/data/000466182_1-6755f9747a8bc1be26949e77184b0a32-300x300.png)
