FLUORESCENCE ET TESTS FONCTIONNELS Association

FLUORESCENCE ET TESTS FONCTIONNELS
FLUORESCENCE ET TESTS FONCTIONNELS
Association Fran
Association Franç çaise de aise de Cytom Cytomé étrie trie
Journ
Journé ée Th e Thé ématique matique
18 janvier 2007
18 janvier 2007
Cécile COTTET
Laboratoire de Bio
Laboratoire de Bioé énerg nergé étique Fondamentale et Appliqu tique Fondamentale et Appliqué ée - Inserm U884- Grenoble e - Inserm U884- Grenoble

INTRODUCTION
INTRODUCTION
Plusieurs approches
Cytométrie en Flux Cytométrie
par analyse d’images
(2D , 3D, 4D)
Points communs :
- fluorescence
- applications en recherche et en clinique

DETECTION DE LA FLUORESCENCE
DETECTION DE LA FLUORESCENCE
4 éléments essentiels :
- sources d’excitation
- fluorochromes
- filtres d’excitation et d’émission
- photodétecteurs
Instruments
- Spectrofluorimètres (µl à ml)
- Systèmes macroscopiques (microarrays, gels électrophorèse…)
- Microscopes à épifluorescence/confocaux
- Cytomètres à flux

PROPRI
PROPRIÉ ÉT TÉ ÉS DU SIGNAL DE FLUORESCENCE S DU SIGNAL DE FLUORESCENCE
L’intensité de fluorescence est quantitativement dépendante de :
• l’absorbance ou coefficient d’extinction molaire ε:
plus ε est grand, plus la fluorescence sera élevée à intensité lumineuse incidente
égale
• le rendement quantique φ :
φ = nombre total de photons émis dans tout le spectre d'émission de fluorescence /
nombre de photons reçus et absorbés dans la zone spectrale d'excitation
• durée de vie du singulet excité le plus bas
τ
f = constante de temps de déclin de fluorescence

CRIT
CRITÈ ÈRES DE CHOIX D RES DE CHOIX D’ ’UN FLUOROCHROME UN FLUOROCHROME
Le marquage des cellules par des fluorochromes permet d'accéder
à des informations arbitrairement classées en deux catégories :
- les paramètres structuraux
- les paramètres fonctionnels
Le choix du (des) fluorochrome (s) sera fonction de :
- sa spécificité (ADN, protéines, organites…)
- son accessibilité (échantillons vivants ou non, perméabilisation…)
- sa toxicité
- sa stabilité
- des lasers et filtres disponibles
- des chevauchements de spectres (multimarquages)