FLUORESCENCE ET TESTS FONCTIONNELS Association
publicité
FLUORESCENCE ET TESTS FONCTIONNELS Association Française de Cytométrie Journée Thématique 18 janvier 2007 Cécile COTTET Laboratoire de Bioénergétique Fondamentale et Appliquée - Inserm U884- Grenoble INTRODUCTION Plusieurs approches Cytométrie en Flux Cytométrie par analyse d’images (2D , 3D, 4D) Points communs : - fluorescence - applications en recherche et en clinique DETECTION DE LA FLUORESCENCE 4 éléments essentiels : - sources d’excitation - fluorochromes - filtres d’excitation et d’émission - photodétecteurs Instruments - Spectrofluorimètres (µl à ml) - Systèmes macroscopiques (microarrays, gels électrophorèse…) - Microscopes à épifluorescence/confocaux - Cytomètres à flux PROPRIÉTÉS DU SIGNAL DE FLUORESCENCE L’intensité de fluorescence est quantitativement dépendante de : • l’absorbance ou coefficient d’extinction molaire ε: plus ε est grand, plus la fluorescence sera élevée à intensité lumineuse incidente égale • le rendement quantique φ: φ = nombre total de photons émis dans tout le spectre d'émission de fluorescence / nombre de photons reçus et absorbés dans la zone spectrale d'excitation • durée de vie du singulet excité le plus bas τf = constante de temps de déclin de fluorescence CRITÈRES DE CHOIX D’UN FLUOROCHROME Le marquage des cellules par des fluorochromes permet d'accéder à des informations arbitrairement classées en deux catégories : - les paramètres fonctionnels - les paramètres structuraux Le choix du (des) fluorochrome (s) sera fonction de : - sa spécificité (ADN, protéines, organites…) - son accessibilité (échantillons vivants ou non, perméabilisation…) - sa toxicité - sa stabilité - des lasers et filtres disponibles - des chevauchements de spectres (multimarquages) FLUORESCENCE ET TESTS FONCTIONNELS Explorer une activité cellulaire ou une fonction biologique donnée In vitro : marquage fluorescent de composants ou structures de cellule en culture In vivo : photo-activation et expression de protéines/gènes imagerie du petit animal VIABILITÉ VS APOPTOSE/NÉCROSE Mayol JF & Ronot X., (2006). Dans: La cytométrie en Flux. Ronot X., Grunwald D., Mayol JF. Boutonnat J. (eds) Lavoisier, Paris, 2006, pp 307-328. VIABILITÉ VS APOPTOSE/NÉCROSE Mayol JF & Ronot X., (2006). Dans: La cytométrie en Flux. Ronot X., Grunwald D., Mayol JF. Boutonnat J. (eds) Lavoisier, Paris, 2006, pp 307-328. VIABILITÉ VS APOPTOSE/NÉCROSE VIABILITÉ VS APOPTOSE/NÉCROSE Lecoeur H., (2006). Dans: La cytométrie en Flux. Ronot X., Grunwald D., Mayol JF. Boutonnat J. (eds) Lavoisier, Paris, 2006, pp 329-376. VIABILITÉ VS APOPTOSE/NÉCROSE Effet du PACAP sur la toxicité de la β-amyloïde sur les CGC du cervelet de rat (calcéine/IP) Control Aß 25-35+ PACAP PACAP Aß 25-35 Vaudry D., Cottet-Rousselle C. et al.(2004).Regul Pept. Dec 15;123(1-3):43-9.4 ACTIVITÉ MITOCHONDRIALE Potentiel membranaire Le transfert des électrons le long des complexes de la chaîne respiratoire permet le pompage des protons de la matrice vers l’espace intermembranaire , induisant un potentiel de membrane ΔΨ. Toute fuite inverse de protons (par l’action de découplants par ex) provoque une dépolarisation. ACTIVITÉ MITOCHONDRIALE www.wako.chem.co.jp monomère J-aggrégats émission 520 nm émission 585 nm Brown S. Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif ACTIVITÉ MITOCHONDRIALE Mesure du potentiel membranaire de cellules U937 avec JC-1 +FCCP 25mM JC-1 monomères JC-1 monomères JC-1 agrégats Témoin www.cyto.purdue.edu ACTIVITÉ MITOCHONDRIALE Cellules 3T3 Témoin +H2O2 www.med.unipg.it ACTIVITÉ MITOCHONDRIALE TMRM : Tétraméthylrhodamine Méthyl Ester Sensible au potentiel membranaire : (extinction de la fluorescence lorsqu’il y a chute du ΔΨ) ACTIVITÉ MITOCHONDRIALE HMEC : Dépolarisation par DNP Témoin + DNP Laurent ARGAUD : LBFA, U884 Grenoble RELATION : ORGANISATION / FONCTION Organisation tissu-spécifique des mitochondries dans différents types de muscles Cardiomyocyte Cardiomyocyte + trypsine Muscle Squelettique L T L : 1,97 ± 0,43 µm L : 2,83 ± 0,65 µm T : 1,43 ± 0,43 µm T : 0,75 ± 0,22 µm Béraud N. et al. (2005). Am J Physiol Cell Physiol, 288: C757-C767 AU NIVEAU DE LA MEMBRANE Marqueur membranaire vital : PKH (Paul Karl Horan) Zyn-Linker - ancrage au niveau de la bicouche lipidique head group X Y chaque cellule fille - Fluorescent répartition équivalente de la fluorescence entre N+ N chromophore Lipid Bilayer Lipophilic tails Chaîne carbonée lipophile Cytoplasm Double couche lipidique cytoplasme PROLIFERATION CELLULAIRE 120 60 Témoin 0 30 30 60 nombre de cellules 90 Témoin 0 nombre de cellules 90 120 Suivi de la prolifération de cellules tumorales humaines de vessie traitées par un dérivé de flavonoïde fluorescence des PKH67 120 60 Témoin 0 30 30 60 nombre de cellules 90 Témoin 0 nombre de cellules 90 120 fluorescence des PKH67 fluorescence des PKH67 fluorescence des PKH67 Gerby B et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2006), doi:10.1016/J.bmcl.2006.09.057 RECYCLAGE MEMBRANAIRE Internalisation du PKH67 dans les cellules L929 Rousselle C. et al, In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. (2001) Nov-Dec;37(10):646-55. MIGRATION Dilinoleyl DiI : marqueur membranaire particulièrement adapté au suivi de la migration des neurones in situ MIGRATION Observation in vitro de l’émission d’un prolongement de neurone Vaudry D. et Cottet-Rousselle C. Plate-forme d’imagerie INSERM U413, IFR23. Mt St Aignan MIGRATION Migration cellulaire in situ au sein du cortex de cervelet de rat Injection de DiI à la surface de EGL : Cellules granulaires externes accrochées à la surface une cellule commence à migrer verticalement vers IGL Émission d’un prolongement Les cellules granulaires externes restent accrochées à la surface de EGL et émettent leurs prolongements à travers IGL Liesi et al. J Neurosci Res. 2003 May 1;72(3):290-302. ACTIVITÉ CALCIQUE Origines du Calcium dans la cellule : - extracellulaire via des canaux calciques - réticulum endoplasmique - autres compartiments intracellulaires (mitochondries, membrane nucléaire…) Rôle du calcium : - transduction intracellulaire d’un stimulus extracellulaire avec une dynamique spatio-temporelle complexe Signal calcique lié à : - expression de gènes précoces - différenciation et croissance cellulaires - contraction musculaire - endocytose et exocytose - chimiotactisme - régulation de protéines (kinases, phosphatases…) - apoptose (entrée massive dans mitochondries) ACTIVITÉ CALCIQUE Fluo-4 Indicateur de Calcium : fluorescent à 526 nm en présence de Calcium www.probes.invitrogen.com ACTIVITÉ CALCIQUE [Ca2+]free = Kd [ F-Fmin]/[ Fmax-F] F min : intensité Fluo en absence de Ca2+ F max : intensité de Fluo en Ca2+ saturé www.teflabs.com ACTIVITÉ CALCIQUE Propagation d’une onde calcique au sein de cellules astrocytaires marquées par Fluo4 et stimulées par le Cyclo-OP Leprince J. et al. Eur. J. Biochem. (2001) 268:6045-6057. ACTIVITÉ CALCIQUE Mesure du calcium dans le réticulum sarcoplasmique dans une fibre musculaire contraction relaxation 10µm Fluo-5N Contraction = sortie du calcium dans cytosol Récupération = rentrée du calcium dans RS Kabbara AA & Allen DG.(2001) J.physiol. 534-1 : 87-97 LES PROTÉINES FLUORESCENTES Green Fluorescent Protein GFP Issue de la méduse Aequorea victoria, protéine intrinsèquement fluorescente isolée pour la 1ère fois en 1962 Le gène de la GFP peut être fusionné in vitro au gène d’une protéine que l’on souhaite étudier Le gène recombinant est ensuite réintroduit dans des cellules qui vont alors synthétiser la protéine chimérique fluorescente Permet d’étudier les protéines dans leur environnement naturel : la cellule vivante ! QUELQUES MUTANTS de la GFP… GFP et biologie végétale Localisation de la protéine TMM-GFP au niveau de l’épiderme d’Arabidospis Rôle de Too Many Mouths dans la différenciation de l’épiderme, la formation et l’organisation des stomates www.cas.ucf.edu GFP et petit animal Les facteurs de croissance confèrent l’immortalité des cellules souches spermatogoniales Restauration de la fertilité de mâles stériles après transplantation de SSC (spermatogonial stem cells) Progénitures de souris transgéniques C57GFP x ROSA: 50% expriment GFP car les cellules transplantées sont haploïdes pour le transgène GFP Kubota H. et al.(2004)Proc Natl Acad Sci U S A. Nov 23;101(47):16489-94. DAF-2DA : indicateur de monoxyde d’azote Principe de détection du NO par DAF-2DA http://www.emdbiosciences.com Monoxyde d’azote et Embryologie Rôle du NO au cours de la cardiogénèse d’embryon de poulet Stade 26 HH Stade 29 HH Stade 36 HH MF-20 : anticorps anti-laminine DAF-2DA : monoxyde d’azote tronc artériel Sac aortique Cloisonnement complet de l’aorte Grimes AC. et al.(2006) Developmental Biology 290 : 265-276 IMAGERIE PETIT ANIMAL Mise au point d’un vecteur moléculaire RAFT-Cy5 multifonctionnel pour l’imagerie de tumeurs Ciblage spécifique de RAFT-Cy5 au niveau des métastases après injection intraveineuse Garanger E. et al (2005). Molecular therapy. Vol12 n°6:1168-1175. QUANTUM DOTS plus brillants et plus stables que les sondes organiques traditionnelles QUANTUM DOTS Atom Sondes Protéines fluorescentes fluorescentes Or colloïdal Bactérie Cellule animale QUANTUM DOTS Les nanoparticules pour le diagnostic et la thérapie… Anticancéreux encapsulés dans des nanoparticules, libérés au niveau des tissus ou cellules cancéreuses cibles Rotomskis R. et al.(2006) Medicina (Kaunas);42(7): 542-58 TESTS FONCTIONNELS ET F-TECHNIQUES FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer www.erudit.org/revue/ms/2004/ ou Trugnan et al. M/S 2004 : de nouvelles techniques pour voir la vie en couleur TESTS FONCTIONNELS ET F-TECHNIQUES FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching www.erudit.org/revue/ms/2004/ ou Trugnan et al. M/S 2004 : de nouvelles techniques pour voir la vie en couleur Des tests fonctionnels à « l’art biologique » Alba, lapin transgénique fluorescent Eduardo Kac Telepresence & Bio Art Networking Humans, Rabbits and Robots Eduardo Kac. 2005 University of Michigan Press
