Caractrisation de la fonction des gnes d`avirulence de Magnaporthe

Sujet de stage, Unité mixte CNRS - Bayer CropScience, Lyon
Métabolisme secondaire du champignon pathogène du riz Magnaporthe grisea :
Analyse fonctionnelle des PKS-NRPS : rôles biologiques et métabolites synthétisés
Lieu du stage: Laboratoire de Physiologie des plantes et des champignons lors de l’infection
UMR2847 CNRS - Bayer CropScience, 14 rue Pierre Baizet, 69009 Lyon
tel. : 33 (0)4.72.85.29.12, fax : 33 (0)4.72.85.22.97
Direction scientifique: COLLEMARE Jérôme et LEBRUN Marc-Henri
e-mail: [email protected], [email protected]
Le métabolisme secondaire joue un rôle important aussi bien dans le développement des
champignons qu’au cours de leurs processus infectieux ou leur survie dans l’écosystème. Ainsi, le
métabolisme secondaire intervient par exemple dans la protection des cellules par la synthèse de pigments
(mélanine), dans leur pouvoir pathogène par la synthèse de toxines (HST de Cochliobolus) ou dans leur
compétition avec d’autres micro-organismes par la synthèse d’antibiotiques ou d’antifongiques (de
Trichoderma). Les enzymes clés de la biosynthèse de ces métabolites secondaires sont soit des polycétides
synthases (PKS), soit des peptides synthétases non ribosomales (NRPS). Une nouvelle famille d’enzymes
du métabolisme secondaire, récemment identifiée chez les champignons, correspond à une fusion entre une
PKS et une NRPS (Kroken et al., 2003 ; Böhnert et al., 2004, Song et al., 2004). Les seules PKS-NRPS
caractérisées aujourd’hui sont la LNKS impliquée dans la biosynthèse de la lovastatine chez Aspergillus
terreus (Kennedy et al., 1999), FusS de F. moniliforme impliquée dans la biosynthèse de la mycotoxine
Fusarin C (Song et al., 2004), et Ace1 de M. grisea nécessaire à la biosynthèse d’un signal d’avirulence
reconnu par les cultivars de riz portant le gène de résistance Pi33 (Böhnert et al., 2004).
M. grisea est l’agent responsable de la principale maladie du riz, la pyriculariose. L’analyse de son
génome a montré qu’il possède 8 PKS-NRPS. C’est le seul champignon à posséder un si grand nombre de
PKS-NRPS, suggérant que type de métabolites est important pour le cycle biologique ou infectieux de cet
organisme. L’étude de leur expression par RT-PCR quantitative a montré que 4 PKS-NRPS sont exprimées
au cours de l’infection de feuilles d’orge. ACE1, SYN2 et SYN8 présentent le même profil d’expression
spécifique des étapes précoces (17-32 h) de l’infection correspondant à la pénétration du champignon dans
la plante. Ce profil suggère que les métabolites secondaires correspondant ont un rôle dans cette étape du
processus infectieux. SYN6 n’est exprimé qu’après la pénétration du champignon dans la plante, lorsque le
champignon envahi les tissus infectés (24-72h), ainsi que dans le mycélium cultivé sur milieu riche. Les
quatre autres PKS-NRPS ne sont pas exprimées au cours de l’infection de feuilles d’orge, ni dans le
mycélium cultivé sur milieu riche. Seules les délétions des gènes ACE1 et SYN2 ont été réalisées. Le mutant
∆ace1 devient virulent vis-à-vis des cultivars de riz portant le gène de résistance Pi33, par contre aucun
phénotype n’a pu être obtenu pour le mutant ∆syn2. Ces deux gènes sont supposés intervenir dans la même
voie de biosynthèse, mais le métabolite produit n’a été encore identifié.
Le premier objectif du stage sera de mesurer par RT-PCR quantitative l’expression des PKS-NRPS
de M. grisea au cours du développement fongique (spores, appressoria), au cours de l’infection de feuilles
de riz et dans du mycélium cultivé en phase stationnaire, en excès ou en carence nutritionnels, sur
différentes sources de carbone et à différents pH, afin de trouver les conditions d’expression de ces 8 PKSNRPS. Cette connaissance permettra d’envisager la délétion des gènes exprimés dans une condition
particulière afin d’évaluer le rôle du métabolite secondaire synthétisé dans le cycle biologique et infectieux
de M. grisea. Le deuxième objectif du stage sera de poursuivre l’analyse fonctionnelle des PKS-NRPS de M.
grisea exprimées. Ainsi, nous envisageons de construire des mutants de délétion des gènes SYN6 et SYN8
par remplacement de gènes. Les vecteurs correspondants seront utilisés pour transformer la souche
Guy11∆ku80 qui présente un taux de remplacement de gènes par recombinaison homologue proche de
100%. Les mutants obtenus seront ensuite analysés pour leur caractéristiques biologiques (croissance,
sporulation, germination, pouvoir pathogène) et utilisés pour identifier par LC-MS-MS les métabolites
synthétisés (coll. Chimie analytique et structurale, Bayer Lyon). La surexpression de ces PKS-NRPS dans
différentes espèces fongiques pourra être envisagée afin de mieux caractériser les métabolites produits par
ces enzymes (Coll. R. Cox, Biochemistry Dpt, Bristol University, UK).
- Kennedy et al., 1999. Modulation of polyketide synthase activity by accessory proteins during lovastatin
biosynthesis. Science. 284:1368-1372.
- Kroken et al., 2003. Phylogenomic analysis of type I polyketide synthase genes in pathogenic ans saprobic
ascomycetes. PNAS. 100(26):15670-16675.
- Song et al., 2004. Fusarin C biosynthesis in Fusarium moniliforme and Fusarium venenatum.
ChemBioChem. 5 :1196-1203.
- Böhnert et al., 2004. A putative polyketide synthase/peptide synthetase from Magnaporthe grisea signals
pathogen attack to resistant rice. Plant Cell. 16:2499-2513.