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Muscle strié cardiaque (section longitudinale)
Aspects métaboliques du
fonctionnement du myocyte cardiaque
Danielle Feuvray
Université Paris XI
UMR CNRS 8078
[email protected]
(X 400)
La cellule musculaire cardiaque qui est caractérisée par une activité
contractile permanente requiert un apport énergétique ou, plus exactement,
un flux d’énergie, élevé.
Ce flux élevé et permanent d’énergie (assuré par la synthèse de molécules
d’ATP) ne peut être entretenu que par un métabolisme de type oxydatif.
Le caractère oxydatif du métabolisme du myocarde est illustré par
l’abondance des mitochondries dans les cardiomyocytes (35 à 40%
du volume cellulaire, 1 mitochondrie/sarcomère).
mito
1
Transfert intracellulaire de l’énergie
Cr
CK
PCr
ATP ANTATP
CK ATP
ADP
La production mitochondriale de l’ATP implique la notion de transfert de l’énergie vers le ou
les lieu(x) d’utilisation, principalement les myofibrilles.
Le système efficace qui intervient est celui qui met en jeu la phosphocréatine (PCr) et
l’enzyme créatine kinase (CK). La CK catalyse une réaction entre la PCr (qui agit comme
une "réserve" de groupements phosphates riches en énergie) et l’ADP, pour former de la Cr
et de l’ATP.
AG(NE) (en C16 et C18)
GLUCOSE
"The heart is a true metabolic omnivore", H. Taegtmeyer
Substrats métaboliques en condition de normoxie
90
•
80
70
60
Ac. Gras
50
Glucose
40
Lactate
30
20
•
10
0
Normoxie
Diabète
L’utilisation des substrats est fonction
des conditions nutritionnelles et hormonales
Dans les conditions normales
où un flux coronaire adéquat
assure un approvisionnement
optimal en substrats,
l’oxydation des acides gras (à
LC) représente au minimum
60 % de la consommation de
O2, contre 16 à 18 % pour le
lactate et le glucose, et
environ 3% pour les corps
cétoniques.
Après un repas riche en
lipides, en situation de jeûne
ou chez le diabétique, les AGs
représentent le substrat
essentiel du myocarde.
Glut-1
Ca2+
Glucose 6-P
Na+
H+
Glycolyse
Pi2-+ MgADP-
Na+
Exercice physique: le lactate
sanguin est utilisé.
Sarcolemme
AG(NE)
TG
FABPs
Acyl-CoA
ATP
MgATP2-
- Malonyl CoA
CPT-1
Acyl carnitine
LDH
Acétyl CoA + CO2
Acyl carnitine
MCT
PDHa
Lac-
CPT-2
Acyl-CoA
-
Na+
PD
active
Acétyl CoA
NBC
HCO3-
Cycle
de
Krebs
O2
Membrane
mitochondriale
interne
β-oxydation
NADH
&
FADH2
PHOSPHORYLATION OXYDATIVE
ADP + Pi
•
Glycogène
PFK
GAPDH
Pyruvate
H+
LACTATE
FAT/CD36
Glucose
NCX
NHE
Glut-4
H2O
ATP
Activité contractile
Cardiomyocyte
2
AG(NE)
GLUCOSE
Glut-1
Sarcolemme
C’est un cycle de
réactionsGlut-4
mitochondriales dit cycle de l’acide citrique
(ou encore cycle des acides tricarboxyliques, TCA, ou cycle de Krebs),
Glucose
NCX
qui fournit, à partir de
l’acétyl CoA produit par la dégradation
des
TG
AGL
substrats métaboliques,
les6-Péquivalents
réducteurs (NADH & FADH2)
Glycogène
Glucose
Na+ qui vont alimenter, en présence d’O2, la phoshorylation oxydative.
Glycolyse PFK
Acyl-CoA
GAPDH
Ca2+
Celle
- ci aboutit à la
condensation d’ADP et de phosphate inorganique
ATP
MgATP
MgADP
H+pour
Pi + régénérer
l’ATP.
2-
NHE
Na+
2-
- Malonyl CoA
CPT-1
Acyl carnitine
H+
LACTATE
-
MCT
Pyruvate
Le cycle de l’acide citrique
est la voie commune finale de
LDH
l’oxydation
des substrats ou molécules énergétiques.
Acétyl CoA + CO2
Comment les différentes voies
d’utilisation de ces substrats sont- elles
contrôlées et régulées ?
Acyl carnitine
PDHa
Lac-
CPT-2
Acyl-CoA
-
Na+
PD
active
NBC
L’acétyl CoA fournit l’acétate
qui se combine à l’acide oxaloacétique
pour former le citrate, premier élément
d’un cycle de réactions qui constitue le
cycle des acides tricarboxyliques.
Cycle
de
Krebs
O2
Exemples :
Membrane
mitochondriale
interne
β-oxydation
Acétyl CoA
HCO3-
NADH
&
FADH2
PHOSPHORYLATION OXYDATIVE
H2O
¾ (charge) travail cardiaque contrôle la vitesse d’utilisation
des substrats.
¾ des changements coordonnés d’activités enzymatiques régulent le
métabolisme des substrats.
ATP
Activité contractile
ADP + Pi
¾ autres …
Insuline et métabolisme du glucose
Insuline et transport du glucose
Le récepteur de l’insuline est une
enzyme allostérique transmembranaire. La liaison de
l’insuline induit l’autophosphorylation et l’activation d’un
domaine tyrosine kinase (sur la face cytoplasmique de la
sous-unité β).
Insuline
Insuline
Mb
Glut-1
Glut-4
+
Glucose
Hexokinase, HK
Glucose 6-P
Glycogène
Glut-1 intervient principalement dans le
transport basal de glucose.
La translocation de Glut-1 et de Glut-4
est stimulée par une ischémie modérée
(Young et al., Circulation 1997).
L’insuline secrétée lors d’une élévation
de la glycémie accélère l’incorporation
de glucose par Glut-4, et sa
phosphorylation par HK.
Glycolyse
PFK
GAPDH
ATP
ischémie
Récepteur
Membrane
MAPK cascade?
translocation
(Insulin
- receptor substrate)
IRS
P85r =
P110c
PI-3-KINASE (phosphatidylinositol-3kinase)
Pyruvate
PD
active
Acétyl CoA
Cycle
De
l’acide citrique
Mb
Glut 1
Inhibition par
wortmannin & LY294002
PI-3KINASE
+
PDHa
-
La "stimulation" de Glut- 4
dépend strictement de la
PI- 3
- kinase.
Insuline
Mitochondrie
La résistance sévère à l’insuline peut
résulter de mutations du gène du
récepteur, qui sont associées à la perte
de l’activité kinase.
CIBLES
GLUT
agit comme intermédiaire
pour associer différentes protéines
de la cascade de signalisation en aval.
MgATP2-
Kinase
(tyrosine)
Glut 4
PKB/Akt
PKB/Akt
GLUT
translocation
GLUT 4
phosphorylation
directe?
(conformation et/ou
réarrangement
du cytosquelette?)
3
Les signaux intracellulaires associés à la fixation d’insuline sur son récepteur
dépendent de l’activité de l’enzyme PI3-kinase. Le mécanisme d’activation
implique la mise en jeu d’une molécule intermédiaire, ou « adaptateur »,
appelée IRS (insulin receptor substrate).
Insulin
Ó
Ð
Phosphoinositide
- dependent
Ð
protein kinase
- 1(PDK
- 1)
Ô
Décodage des signaux lipidiques par un « inté
intégrateur » : la PKB (ou Akt)
(PKB est une cible intracellulaire majeure)
Ð
PKB active
[1ère mise en évidence du rôle de PKB dans la signalisation liée à l’insuline :
Cross et al., Nature 378; 785-789, 1995]
Ð
Phosphorylation par PKB (sur résidus sérine/thréonine) de proté
- cibles intracellulaires
protéines
Ó
Inhibition de la
glycogène synthase kinase (GSK3)
Ð
PFK2
Ð
Glycolyse
Ð
Glycogène synthase active
Ð
Synthèse de glycogène
Ô
Stimulation
du transport
de glucose
via translocation
de GLUT
- 4
Régulation intracellulaire de l’utilisation du glucose
Cell membrane
Glycogen
PI3-K PtdInsP3
Glucose 6-P
Glycolysis
PFK2
Glycogen
synthesis
+
GSK3
IRS P
Ð
P
Glucose
Ð
La stimulation de la
synthèse du glycogène
met en jeu la
phosphorylation, c’est- -à
dire l’inactivation de la
GSK3. C’est ce qui se
passe dans le cœur
normal en présence
d’insuline.
Glut-4
Ð
Glut-1
Ð
Activation de la PI3
- kinase
Ð
Production de seconds messagers lipidiques : PtdIns(3,4,5,P3)/ PtdIns(3,4,5,P2)
IR
Glucose
GLUT
PKB/Akt
+
Pyruvate
-
Others :
pro-apoptotic Phosphorylation¾Nuclear export of NFAT and GATA-4,
…
thus preventing their effects on gene expression.
2 isoformes de GSK3, α et β, qui ont des fonctions différentes. C’est GSK3β, qui apparaît
jouer le rôle majeur dans les myocytes cardiaques. Exerce un rôle régulateur négatif de
l’hypertrophie cardiaque. La GSK3 s’oppose aux effets de l’insuline.
Insulino-résistance Î le contrôle inhibiteur de la GSK3 est déficient = activité GSK3 trop
élevée. Son contrôle régulateur négatif de l’hypertrophie est levé ¾ hypertrophie peut se
développer.
Les inhibiteurs de GSK3* augmentent les réponses à l’insuline dans différents systèmes in vitro.
*ex: lithium, valproic acid, SB-216763, SB-415286, indirubin, … In vivo?
Voie des pentoses phosphates et
stress oxydatif (ou oxydant)
Concentrations plasmatiques élevées d’acides gras
(c’est- à
- dire supérieures à 0.8 mM)
inhibition de l’utilisation du glucose, ainsi que du
lactate.
L’inhibition s’exerce au niveau de l’enzyme PFK; son activité est diminuée par l’élévation du
taux de citrate et de l’ATP cytosolique, alors qu’elle est à l’inverse stimulée par la diminution
de concentration d’ATP (plus précisément par ↑ rapport AMP/ATP).
Toutefois, l’étape majeure de la régulation se situe au niveau du complexe enzymatique
pyruvate déshydrogénase (PDH), sur la face interne de la mb. mitochondriale interne. En
normoxie, la glycolyse anaérobie est couplée à l’oxydation du glucose: le pyruvate issu de la
glycolyse est décarboxylé par la PDH. Ce complexe enzymatique constitue une plaque
tournante au contrôle sophistiqué, dont l’activation conduit à l’oxydation du glucose,
tandis que son inhibition, à l’inverse, prévient cette oxydation.
kinase
+
PDH
inactive
Pyruvate
PDH
active
phosphatase
Acétyl CoA + CO2
β-oxydation
Acides gras
"pentose phosphate pathway"
= glutathion
réduit
G6PDH = enzyme dont l’activité est régulée par le rapport NADPH/NADP+.
La production de NADPH lors de la conversion de G6P catalysée par la G6PDH, maintient le
glutathion dans son état réduit c’est-à-dire GSH.
Parallèlement, GSH alimente, via l’activité de la glutathion peroxydase (GPX), la transformation
de peroxyde d’hydrogène en H2O.
H2O2 n’est pas une espèce radicalaire mais une espèce activée de O2 (= ROS: reactive oxygen
species), et nombre de données expérimentales récentes ont montré que H2O2, à faibles [ ]
physio-pathologiques (allant de nano- à µ-molaires), joue un rôle important dans la signalisation
intracellulaire (“prolonged signaling effects“)
4
Régulation de l’utilisation des acides gras "libres" (AGNE)
ou free fatty acids (= non estérifiés)
anion superoxyde
ONOO°
Peroxynitrite
NO° + O2° + O2°→ H2O2 → 2H2O + O2
AG(NE)
SOD
catalase
Superoxyde dismutase
très instable
Mb
extracellulaire
FAT/CD36
intracellulaire
“prolonged signaling effects“
Transport membranaire des AGs (ac.
oléique, palmitique, …) fait intervenir
une translocase FAT/CD36*.
"Defect in human LCFA uptake is caused
by FAT/CD36 mutations." J Lipid Res 2001.
H2O2 → H2O
GPX
Glutathion peroxydase
•GPX knockout (GPX -/-) mice are susceptible to acute
oxidative damage.
•Conversely, overexpression of GPX renders mice
resistant
Dans le cytoplasme, de petites protéines
de liaison, ou FABPs (pour Fatty Acids
Binding Proteins) assurent le « trafic »
intracellulaire des AGs (Schaap et al.
Circ Res 1999).
AG
H-FABP
Triglycérides
acyl CoA synthétases
Malonyl CoA
-
ACC
CO2 +
Acétyl CoA
Acyl-
CoA à longue chaîne
carnitine
CPT-1
Acyl carnitine à LC
translocase
Acyl carnitine
CoA
CAT
NB – Les moyennes et courtes
chaînes d’acides gras (C2 à C12)
ne représentent qu’une fraction infime
des AG normalement oxydés par le myocarde.
carnitine
CPT-2
Acyl-
Membrane
mitochondriale
interne
CoA
Matrice mitochondriale
Acétyl CoA
-
PDHa
*Malonyl CoA inhibe l’activité CPT
- 1via une interaction allostérique.
Dans le cœur normoxique, l’insuline diminue l’activité AMPK
Autre acteur : l’AMPK (AMP-activated protein kinase).
"L’AMPK is an energy sensor in tissues, and specifically in heart."
(qui est sensible
à la wortmannine)
Quand la charge énergétique de la cellule diminue (↓ATP/AMP et PCr/Cr), l’AMPK est activée.
Glycolyse
AMPK phosphoryle et inactive des enzymes-clés,
en particulier inactive l’
l’acé
acétyl CoA carboxylase (ACC)
►entrée des AG dans la mitochondrie n’est plus freinée.
AMPK
Acétyl CoA + CO2
ACC
↓AMPK
L’activation de l’AMPK par l’ischémie
est aussi inhibée par l’insuline.
Cytosol
Le malonyl CoA est un inhibiteur physiologique de
l’utilisation des acides gras via l’inhibition
de l’enzyme CPT1.
Malonyl CoA
PI3K
Acétyl CoA + CO2
▲ACC
▲ Malonyl CoA
Acyl CoA
-
Pyruvate
carnitine
CPT-1
Acyl carnitine
Acyl CoA
X
CAT
Cytosol
Mb. mitochondriale
interne
CPT-1
Pyruvate
Mb. mitochondriale interne
CPT
- 1catalyse une étape importante de l’oxydation mitochondriale des AGs.
L’isoforme majeure dans le cœur adulte est le type musculaire -M CPT1.
Matrice
▲ PDHa
ÐAcétyl CoA
Acyl CoA
carnitine
Matrice
β-oxydation
ª Par conséquent, l’insuline inhibe l’oxydation des acides gras
et stimule l’oxydation du glucose.
5
Le catabolisme des AGs est aussi
finement régulé au niveau de la transcription des gènes.
L’expression cardiaque de la plupart des gènes impliqués dans l’oxydation
des AGs ▲après la naissance.
Potentiellement, les ligands endogènes de PPARα dans les
myocytes cardiaques sont les AGs à longue chaîne
et leurs métabolites.
Il a été montré in vitro que les AGs saturés et polyinsaturés lient et activent
PPARα.
Des changements aussi bien chroniques que aigus
(ex: jeûne, diabète) influencent l’expression de gènes-clés.
L’expression de la plupart des gènes associés au transport et à
l’oxydation des AGs est régulée
par le complexe de régulation transcriptionnelle PPARα
(pour peroxisome-proliferator activated receptor α).
Une fois engagé avec le ligand, PPAR recrute des
coactivateurs transcriptionnels (en particulier PGC-1)
nécessaires pour initier la transcription du gène-cible.
Brian N. Finck & Daniel P. Kelly
"PPARα signaling in the gene regulatory control of energy
metabolism"
J Mol Cell Cardiol 34, 1249
- 1257 (2002)
PPARα a été le 1er membre identifié de
la famille de récepteurs hormonaux nucléaires.
Régulation de l’utilisation des acides gras "libres" (AGNE)
ou free fatty acids (= non estérifiés)
AG(NE)
extracellulaire
FATP
Mb
d’utilisation des acides gras
par les cardiomyocytes
intracellulaire
AGL
Malonyl CoA
ACC
CO2 +
Acétyl CoA
-
Triglycérides
acyl CoA synthétases
Acyl-
CoA
carnitine
CPT-1
Ð
Acyl carnitine
translocase
Protéines et
enzymes connues
pour être
régulées par
PPARα.
Acyl carnitine
CPT-2
acyl CoA
acétyl
CoA
cétoacyl CoA
thiolase
- cétoacyl CoA
3
Cycle
TCA
carnitine
3-hydroxyacyl CoA
déshydrogénase
Membrane
mitochondriale
interne
acyl-CoA
déshydrogénase
énoyl CoA
β -oxydation
Matrice
Mécanismes pouvant associer
perturbations métaboliques et
dysfonction ventriculaire?
Î Délétère, en particulier si l’entrée d’AG,
excède la capacité oxydative des cellules.
énoyl hydratase
- hydroxyacyl CoA
3
6
(1) Consommation d’oxygène du myocarde
*
----------------------------------------------------------------------------------------------------------Substrat
Rdt global en ATP
ATP formé/
Atomes d’O2
de l’oxydation d’une
atomes d’O2
consommés par
molécule de substrat
consommés
mol. de substrat
----------------------------------------------------------------------------------------------------------Glucose
36
3.0
12
Lactate
18
3.0
6
Acide gras
129
2.6
50
(ex. palmitate)
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------
*
*
*
*
1 µm
L’accumulation de triglycérides dans les cardiomyocytes (observée sous forme
de gouttelettes lipidiques) peut contribuer à la production
d’acyl-CoA à longue chaîne.
ªUtilisation pré
préférentielle des acides gras > augmentation de
consommation d’
d’oxygè
oxygène du myocarde
Amélioration du « couplage » entre glycolyse et oxydation
du glucose ► baisse de la production de protons issus du
métabolisme anaérobie du glucose, et réduction du
déséquilibre ionique
▼
Sources de formation des protons :
Mécanismes de régulation du pH intracellulaire
Hydrolyse de l’ATP formé au cours de la glycolyse
MgATP2-→ MgADP- + Pi2- → H+
glycolyse
Accumulation de CO2
Dégradation de l’ATP
…
Transporteurs membranaires
La glycolyse découplée de l’oxydation du glucose est une
source majeure de H+ dans le myocarde.
Chaque molécule de glucose via la glycolyse (seule) ► 2 H+
En revanche, 1 molécule de glucose ► glycolyse ► oxydation ► 0H+
7
NHE-1: Relation structure-fonction
Na+
Na+
NHE-1
(2) HCO3-
C
NB
NC
H+
INaL
X
T
MC
βi
Na+
K+
NH3+
pHe
AE
int
mb
cardiomyocyte
Structure de NHE1 – deux domaines fonctionnels
sites de
liaison à
l’amiloride
F
P
L
+
H+
COOMAPK p42/p44
PKC
ATP
CaM
PKII
Ca 2+
/CaM
Localisation de NHE1 dans les myocytes
cardiaques
disques intercalaires à proximité de la connexine 43 et à un moindre
degré dans les tubules transverses
ventricule
V
F
+
Pr
♦Le Prigent K, Lagadic
- Gossmann D, Feuvray D. Modulation by pHo and intracellular Ca2+ of
- 260.
Na+- H+exchange … Circ. Res. 1997; 80: 253
♦Karmazyn M et al. The myocardial Na+- H+exchange. Structure, regulation, and its role in heart
disease. Circ. Res. 1999; 85: 777
- 786 (review).
Cl-
Domaine
transmembranaire
Ð
Transport des ions
cytosquelette
Intracellulaire
ATP
HCO3-
ext
Signaux extracellulaires
ex: AngII
-
Membrane
[Na+]i Ï
H+
Inhibiteurs
Extracellulaire
[Ca2+]i
pHiÐ
Lac-
-
Na+
+
+
Ca 2+
ventricule
F
L
P L
I
H
oreillette
oreillette
Wakabayashi et coll. J Biol Chem 2000; 275: 7942-9
+
Domaine
cytoplasmique:
Sites de liaison et
d’interaction des
protéines
régulatrices du
domaine Cter
PIP2
501
CHP
538
570
ERK
10 µm
p90RSK
CaM
638
NIK
700
815
domaine de phosphorylation
ERM
NIK
ROCK
PIP2 (phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate), ERM (ezrine, radixine et moesine), NIK (Nck-interacting
kinase), CHP (calcineurin B homologous protein), et CaM (calmoduline), ROCK (Rho Kinase), p90RSK
(ribosomal S6 kinase).
10 µm
10 µm
Comparison of NHE1 protein expression in ventricular and atrial
myocardium. A: immunofluorescence image of ventricular tissue
incubated in presence of anti-NHE1 antibody. B: high-magnification
image of A. C: immunofluorescence image of atrial tissue incubated in
presence of anti-NHE1 antibody. D: high-magnification image of C.
Colocalization of NHE1 and connexin 43 protein expression in
ventricular myocardium. NHE1 protein expression is visible as
red labeling; connexin 43 protein expression is visible as
green labeling.
10 µm.
Petrecca et coll., Am J Physiol; 1999.
8
Protéine NBC
Méthodologie
site de fixation du DIDS
Méthode du "pulse" à l’ammonium
CED 1401
Extracellulaire
NH4Cl
7.6
convertisseur
I-V
7.4
moniteur
lampe
Xénon
1
pHi
7.2
Membrane
7.0
2
3
6.8
6.6
tubes
photomultiplicateurs
(590 et 640 nm)
Intracellulaire
diaphragme
Microscope
6.4
filtre d’interférence (540 nm)
site consensus pour PKA
site consensus pour PKC
hhNBC
H2 N
Sonde fluorescente: Carboxy-SNARF1
H+
♦
Romero MF et al. Expression cloning and characterization of a renal electrogenic Na+/HCO3cotransporter.
Nature 1997; 387 : 409
- 413.
♦
Choi I et al. Cloning and characterization of human electrogenic Na+/HCO3- cotransporter isoform
(hhNBC)
Am. J. Physiol. 1999; 276 : C576
- C584.
NH3
NH3 H+
NH4+
HOOC
NH4+
ALCALINISATION
H+
NH3
NH3
NH4+
H+
NH4+
ACIDIFICATION
NHE
[H+]i
NBC
ßi
AngII
A l’heure actuelle il n’existe pas d’inhibiteur spécifique du transporteur NBC
Na+-HCO3-
Mise en evidence de l ’activité du transporteur
(NBC)
Microfluorimétrie sur cellule unique (cardiomyocytes isolés)
(2) HCO3-
Na+
NBC
Na+
AT1
récepteur
H+
7.6
NH4+
Conditions :
• enregistrement par
microfluorimétrie
utilisant la sonde
c-SNARF1
pHi
7.2
7.0
• méthode du “pulse”
à l’ammonium
6.8
lair
e
me
mb
ran
e
rac
ell
u
lai
re
PD98059
U0126
MEK 1/2
MAPK / Erk 1/2
• JH = βt X dpHi/dt
+ 1 µM cariporide (NBC)
6.6
5 min
6.4
int
Raf
Control (NBC + NHE)
7.4
ex
tra
ce
llu
NHE
G
ª Basal NBC activity requires activation of the ERK pathway
of the MAPK cascade.
ª Futhermore, activation of the ERK pathway of the MAPK cascade is involved
in stimulation of both NHE and NBC activity by angiotensin II.
9