Muscle strié cardiaque (section longitudinale) Aspects métaboliques du fonctionnement du myocyte cardiaque Danielle Feuvray Université Paris XI UMR CNRS 8078 [email protected] (X 400) La cellule musculaire cardiaque qui est caractérisée par une activité contractile permanente requiert un apport énergétique ou, plus exactement, un flux d’énergie, élevé. Ce flux élevé et permanent d’énergie (assuré par la synthèse de molécules d’ATP) ne peut être entretenu que par un métabolisme de type oxydatif. Le caractère oxydatif du métabolisme du myocarde est illustré par l’abondance des mitochondries dans les cardiomyocytes (35 à 40% du volume cellulaire, 1 mitochondrie/sarcomère). mito 1 Transfert intracellulaire de l’énergie Cr CK PCr ATP ANTATP CK ATP ADP La production mitochondriale de l’ATP implique la notion de transfert de l’énergie vers le ou les lieu(x) d’utilisation, principalement les myofibrilles. Le système efficace qui intervient est celui qui met en jeu la phosphocréatine (PCr) et l’enzyme créatine kinase (CK). La CK catalyse une réaction entre la PCr (qui agit comme une "réserve" de groupements phosphates riches en énergie) et l’ADP, pour former de la Cr et de l’ATP. AG(NE) (en C16 et C18) GLUCOSE "The heart is a true metabolic omnivore", H. Taegtmeyer Substrats métaboliques en condition de normoxie 90 • 80 70 60 Ac. Gras 50 Glucose 40 Lactate 30 20 • 10 0 Normoxie Diabète L’utilisation des substrats est fonction des conditions nutritionnelles et hormonales Dans les conditions normales où un flux coronaire adéquat assure un approvisionnement optimal en substrats, l’oxydation des acides gras (à LC) représente au minimum 60 % de la consommation de O2, contre 16 à 18 % pour le lactate et le glucose, et environ 3% pour les corps cétoniques. Après un repas riche en lipides, en situation de jeûne ou chez le diabétique, les AGs représentent le substrat essentiel du myocarde. Glut-1 Ca2+ Glucose 6-P Na+ H+ Glycolyse Pi2-+ MgADP- Na+ Exercice physique: le lactate sanguin est utilisé. Sarcolemme AG(NE) TG FABPs Acyl-CoA ATP MgATP2- - Malonyl CoA CPT-1 Acyl carnitine LDH Acétyl CoA + CO2 Acyl carnitine MCT PDHa Lac- CPT-2 Acyl-CoA - Na+ PD active Acétyl CoA NBC HCO3- Cycle de Krebs O2 Membrane mitochondriale interne β-oxydation NADH & FADH2 PHOSPHORYLATION OXYDATIVE ADP + Pi • Glycogène PFK GAPDH Pyruvate H+ LACTATE FAT/CD36 Glucose NCX NHE Glut-4 H2O ATP Activité contractile Cardiomyocyte 2 AG(NE) GLUCOSE Glut-1 Sarcolemme C’est un cycle de réactionsGlut-4 mitochondriales dit cycle de l’acide citrique (ou encore cycle des acides tricarboxyliques, TCA, ou cycle de Krebs), Glucose NCX qui fournit, à partir de l’acétyl CoA produit par la dégradation des TG AGL substrats métaboliques, les6-Péquivalents réducteurs (NADH & FADH2) Glycogène Glucose Na+ qui vont alimenter, en présence d’O2, la phoshorylation oxydative. Glycolyse PFK Acyl-CoA GAPDH Ca2+ Celle - ci aboutit à la condensation d’ADP et de phosphate inorganique ATP MgATP MgADP H+pour Pi + régénérer l’ATP. 2- NHE Na+ 2- - Malonyl CoA CPT-1 Acyl carnitine H+ LACTATE - MCT Pyruvate Le cycle de l’acide citrique est la voie commune finale de LDH l’oxydation des substrats ou molécules énergétiques. Acétyl CoA + CO2 Comment les différentes voies d’utilisation de ces substrats sont- elles contrôlées et régulées ? Acyl carnitine PDHa Lac- CPT-2 Acyl-CoA - Na+ PD active NBC L’acétyl CoA fournit l’acétate qui se combine à l’acide oxaloacétique pour former le citrate, premier élément d’un cycle de réactions qui constitue le cycle des acides tricarboxyliques. Cycle de Krebs O2 Exemples : Membrane mitochondriale interne β-oxydation Acétyl CoA HCO3- NADH & FADH2 PHOSPHORYLATION OXYDATIVE H2O ¾ (charge) travail cardiaque contrôle la vitesse d’utilisation des substrats. ¾ des changements coordonnés d’activités enzymatiques régulent le métabolisme des substrats. ATP Activité contractile ADP + Pi ¾ autres … Insuline et métabolisme du glucose Insuline et transport du glucose Le récepteur de l’insuline est une enzyme allostérique transmembranaire. La liaison de l’insuline induit l’autophosphorylation et l’activation d’un domaine tyrosine kinase (sur la face cytoplasmique de la sous-unité β). Insuline Insuline Mb Glut-1 Glut-4 + Glucose Hexokinase, HK Glucose 6-P Glycogène Glut-1 intervient principalement dans le transport basal de glucose. La translocation de Glut-1 et de Glut-4 est stimulée par une ischémie modérée (Young et al., Circulation 1997). L’insuline secrétée lors d’une élévation de la glycémie accélère l’incorporation de glucose par Glut-4, et sa phosphorylation par HK. Glycolyse PFK GAPDH ATP ischémie Récepteur Membrane MAPK cascade? translocation (Insulin - receptor substrate) IRS P85r = P110c PI-3-KINASE (phosphatidylinositol-3kinase) Pyruvate PD active Acétyl CoA Cycle De l’acide citrique Mb Glut 1 Inhibition par wortmannin & LY294002 PI-3KINASE + PDHa - La "stimulation" de Glut- 4 dépend strictement de la PI- 3 - kinase. Insuline Mitochondrie La résistance sévère à l’insuline peut résulter de mutations du gène du récepteur, qui sont associées à la perte de l’activité kinase. CIBLES GLUT agit comme intermédiaire pour associer différentes protéines de la cascade de signalisation en aval. MgATP2- Kinase (tyrosine) Glut 4 PKB/Akt PKB/Akt GLUT translocation GLUT 4 phosphorylation directe? (conformation et/ou réarrangement du cytosquelette?) 3 Les signaux intracellulaires associés à la fixation d’insuline sur son récepteur dépendent de l’activité de l’enzyme PI3-kinase. Le mécanisme d’activation implique la mise en jeu d’une molécule intermédiaire, ou « adaptateur », appelée IRS (insulin receptor substrate). Insulin Ó Ð Phosphoinositide - dependent Ð protein kinase - 1(PDK - 1) Ô Décodage des signaux lipidiques par un « inté intégrateur » : la PKB (ou Akt) (PKB est une cible intracellulaire majeure) Ð PKB active [1ère mise en évidence du rôle de PKB dans la signalisation liée à l’insuline : Cross et al., Nature 378; 785-789, 1995] Ð Phosphorylation par PKB (sur résidus sérine/thréonine) de proté - cibles intracellulaires protéines Ó Inhibition de la glycogène synthase kinase (GSK3) Ð PFK2 Ð Glycolyse Ð Glycogène synthase active Ð Synthèse de glycogène Ô Stimulation du transport de glucose via translocation de GLUT - 4 Régulation intracellulaire de l’utilisation du glucose Cell membrane Glycogen PI3-K PtdInsP3 Glucose 6-P Glycolysis PFK2 Glycogen synthesis + GSK3 IRS P Ð P Glucose Ð La stimulation de la synthèse du glycogène met en jeu la phosphorylation, c’est- -à dire l’inactivation de la GSK3. C’est ce qui se passe dans le cœur normal en présence d’insuline. Glut-4 Ð Glut-1 Ð Activation de la PI3 - kinase Ð Production de seconds messagers lipidiques : PtdIns(3,4,5,P3)/ PtdIns(3,4,5,P2) IR Glucose GLUT PKB/Akt + Pyruvate - Others : pro-apoptotic Phosphorylation¾Nuclear export of NFAT and GATA-4, … thus preventing their effects on gene expression. 2 isoformes de GSK3, α et β, qui ont des fonctions différentes. C’est GSK3β, qui apparaît jouer le rôle majeur dans les myocytes cardiaques. Exerce un rôle régulateur négatif de l’hypertrophie cardiaque. La GSK3 s’oppose aux effets de l’insuline. Insulino-résistance Î le contrôle inhibiteur de la GSK3 est déficient = activité GSK3 trop élevée. Son contrôle régulateur négatif de l’hypertrophie est levé ¾ hypertrophie peut se développer. Les inhibiteurs de GSK3* augmentent les réponses à l’insuline dans différents systèmes in vitro. *ex: lithium, valproic acid, SB-216763, SB-415286, indirubin, … In vivo? Voie des pentoses phosphates et stress oxydatif (ou oxydant) Concentrations plasmatiques élevées d’acides gras (c’est- à - dire supérieures à 0.8 mM) inhibition de l’utilisation du glucose, ainsi que du lactate. L’inhibition s’exerce au niveau de l’enzyme PFK; son activité est diminuée par l’élévation du taux de citrate et de l’ATP cytosolique, alors qu’elle est à l’inverse stimulée par la diminution de concentration d’ATP (plus précisément par ↑ rapport AMP/ATP). Toutefois, l’étape majeure de la régulation se situe au niveau du complexe enzymatique pyruvate déshydrogénase (PDH), sur la face interne de la mb. mitochondriale interne. En normoxie, la glycolyse anaérobie est couplée à l’oxydation du glucose: le pyruvate issu de la glycolyse est décarboxylé par la PDH. Ce complexe enzymatique constitue une plaque tournante au contrôle sophistiqué, dont l’activation conduit à l’oxydation du glucose, tandis que son inhibition, à l’inverse, prévient cette oxydation. kinase + PDH inactive Pyruvate PDH active phosphatase Acétyl CoA + CO2 β-oxydation Acides gras "pentose phosphate pathway" = glutathion réduit G6PDH = enzyme dont l’activité est régulée par le rapport NADPH/NADP+. La production de NADPH lors de la conversion de G6P catalysée par la G6PDH, maintient le glutathion dans son état réduit c’est-à-dire GSH. Parallèlement, GSH alimente, via l’activité de la glutathion peroxydase (GPX), la transformation de peroxyde d’hydrogène en H2O. H2O2 n’est pas une espèce radicalaire mais une espèce activée de O2 (= ROS: reactive oxygen species), et nombre de données expérimentales récentes ont montré que H2O2, à faibles [ ] physio-pathologiques (allant de nano- à µ-molaires), joue un rôle important dans la signalisation intracellulaire (“prolonged signaling effects“) 4 Régulation de l’utilisation des acides gras "libres" (AGNE) ou free fatty acids (= non estérifiés) anion superoxyde ONOO° Peroxynitrite NO° + O2° + O2°→ H2O2 → 2H2O + O2 AG(NE) SOD catalase Superoxyde dismutase très instable Mb extracellulaire FAT/CD36 intracellulaire “prolonged signaling effects“ Transport membranaire des AGs (ac. oléique, palmitique, …) fait intervenir une translocase FAT/CD36*. "Defect in human LCFA uptake is caused by FAT/CD36 mutations." J Lipid Res 2001. H2O2 → H2O GPX Glutathion peroxydase •GPX knockout (GPX -/-) mice are susceptible to acute oxidative damage. •Conversely, overexpression of GPX renders mice resistant Dans le cytoplasme, de petites protéines de liaison, ou FABPs (pour Fatty Acids Binding Proteins) assurent le « trafic » intracellulaire des AGs (Schaap et al. Circ Res 1999). AG H-FABP Triglycérides acyl CoA synthétases Malonyl CoA - ACC CO2 + Acétyl CoA Acyl- CoA à longue chaîne carnitine CPT-1 Acyl carnitine à LC translocase Acyl carnitine CoA CAT NB – Les moyennes et courtes chaînes d’acides gras (C2 à C12) ne représentent qu’une fraction infime des AG normalement oxydés par le myocarde. carnitine CPT-2 Acyl- Membrane mitochondriale interne CoA Matrice mitochondriale Acétyl CoA - PDHa *Malonyl CoA inhibe l’activité CPT - 1via une interaction allostérique. Dans le cœur normoxique, l’insuline diminue l’activité AMPK Autre acteur : l’AMPK (AMP-activated protein kinase). "L’AMPK is an energy sensor in tissues, and specifically in heart." (qui est sensible à la wortmannine) Quand la charge énergétique de la cellule diminue (↓ATP/AMP et PCr/Cr), l’AMPK est activée. Glycolyse AMPK phosphoryle et inactive des enzymes-clés, en particulier inactive l’ l’acé acétyl CoA carboxylase (ACC) ►entrée des AG dans la mitochondrie n’est plus freinée. AMPK Acétyl CoA + CO2 ACC ↓AMPK L’activation de l’AMPK par l’ischémie est aussi inhibée par l’insuline. Cytosol Le malonyl CoA est un inhibiteur physiologique de l’utilisation des acides gras via l’inhibition de l’enzyme CPT1. Malonyl CoA PI3K Acétyl CoA + CO2 ▲ACC ▲ Malonyl CoA Acyl CoA - Pyruvate carnitine CPT-1 Acyl carnitine Acyl CoA X CAT Cytosol Mb. mitochondriale interne CPT-1 Pyruvate Mb. mitochondriale interne CPT - 1catalyse une étape importante de l’oxydation mitochondriale des AGs. L’isoforme majeure dans le cœur adulte est le type musculaire -M CPT1. Matrice ▲ PDHa ÐAcétyl CoA Acyl CoA carnitine Matrice β-oxydation ª Par conséquent, l’insuline inhibe l’oxydation des acides gras et stimule l’oxydation du glucose. 5 Le catabolisme des AGs est aussi finement régulé au niveau de la transcription des gènes. L’expression cardiaque de la plupart des gènes impliqués dans l’oxydation des AGs ▲après la naissance. Potentiellement, les ligands endogènes de PPARα dans les myocytes cardiaques sont les AGs à longue chaîne et leurs métabolites. Il a été montré in vitro que les AGs saturés et polyinsaturés lient et activent PPARα. Des changements aussi bien chroniques que aigus (ex: jeûne, diabète) influencent l’expression de gènes-clés. L’expression de la plupart des gènes associés au transport et à l’oxydation des AGs est régulée par le complexe de régulation transcriptionnelle PPARα (pour peroxisome-proliferator activated receptor α). Une fois engagé avec le ligand, PPAR recrute des coactivateurs transcriptionnels (en particulier PGC-1) nécessaires pour initier la transcription du gène-cible. Brian N. Finck & Daniel P. Kelly "PPARα signaling in the gene regulatory control of energy metabolism" J Mol Cell Cardiol 34, 1249 - 1257 (2002) PPARα a été le 1er membre identifié de la famille de récepteurs hormonaux nucléaires. Régulation de l’utilisation des acides gras "libres" (AGNE) ou free fatty acids (= non estérifiés) AG(NE) extracellulaire FATP Mb d’utilisation des acides gras par les cardiomyocytes intracellulaire AGL Malonyl CoA ACC CO2 + Acétyl CoA - Triglycérides acyl CoA synthétases Acyl- CoA carnitine CPT-1 Ð Acyl carnitine translocase Protéines et enzymes connues pour être régulées par PPARα. Acyl carnitine CPT-2 acyl CoA acétyl CoA cétoacyl CoA thiolase - cétoacyl CoA 3 Cycle TCA carnitine 3-hydroxyacyl CoA déshydrogénase Membrane mitochondriale interne acyl-CoA déshydrogénase énoyl CoA β -oxydation Matrice Mécanismes pouvant associer perturbations métaboliques et dysfonction ventriculaire? Î Délétère, en particulier si l’entrée d’AG, excède la capacité oxydative des cellules. énoyl hydratase - hydroxyacyl CoA 3 6 (1) Consommation d’oxygène du myocarde * ----------------------------------------------------------------------------------------------------------Substrat Rdt global en ATP ATP formé/ Atomes d’O2 de l’oxydation d’une atomes d’O2 consommés par molécule de substrat consommés mol. de substrat ----------------------------------------------------------------------------------------------------------Glucose 36 3.0 12 Lactate 18 3.0 6 Acide gras 129 2.6 50 (ex. palmitate) ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- * * * * 1 µm L’accumulation de triglycérides dans les cardiomyocytes (observée sous forme de gouttelettes lipidiques) peut contribuer à la production d’acyl-CoA à longue chaîne. ªUtilisation pré préférentielle des acides gras > augmentation de consommation d’ d’oxygè oxygène du myocarde Amélioration du « couplage » entre glycolyse et oxydation du glucose ► baisse de la production de protons issus du métabolisme anaérobie du glucose, et réduction du déséquilibre ionique ▼ Sources de formation des protons : Mécanismes de régulation du pH intracellulaire Hydrolyse de l’ATP formé au cours de la glycolyse MgATP2-→ MgADP- + Pi2- → H+ glycolyse Accumulation de CO2 Dégradation de l’ATP … Transporteurs membranaires La glycolyse découplée de l’oxydation du glucose est une source majeure de H+ dans le myocarde. Chaque molécule de glucose via la glycolyse (seule) ► 2 H+ En revanche, 1 molécule de glucose ► glycolyse ► oxydation ► 0H+ 7 NHE-1: Relation structure-fonction Na+ Na+ NHE-1 (2) HCO3- C NB NC H+ INaL X T MC βi Na+ K+ NH3+ pHe AE int mb cardiomyocyte Structure de NHE1 – deux domaines fonctionnels sites de liaison à l’amiloride F P L + H+ COOMAPK p42/p44 PKC ATP CaM PKII Ca 2+ /CaM Localisation de NHE1 dans les myocytes cardiaques disques intercalaires à proximité de la connexine 43 et à un moindre degré dans les tubules transverses ventricule V F + Pr ♦Le Prigent K, Lagadic - Gossmann D, Feuvray D. Modulation by pHo and intracellular Ca2+ of - 260. Na+- H+exchange … Circ. Res. 1997; 80: 253 ♦Karmazyn M et al. The myocardial Na+- H+exchange. Structure, regulation, and its role in heart disease. Circ. Res. 1999; 85: 777 - 786 (review). Cl- Domaine transmembranaire Ð Transport des ions cytosquelette Intracellulaire ATP HCO3- ext Signaux extracellulaires ex: AngII - Membrane [Na+]i Ï H+ Inhibiteurs Extracellulaire [Ca2+]i pHiÐ Lac- - Na+ + + Ca 2+ ventricule F L P L I H oreillette oreillette Wakabayashi et coll. J Biol Chem 2000; 275: 7942-9 + Domaine cytoplasmique: Sites de liaison et d’interaction des protéines régulatrices du domaine Cter PIP2 501 CHP 538 570 ERK 10 µm p90RSK CaM 638 NIK 700 815 domaine de phosphorylation ERM NIK ROCK PIP2 (phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate), ERM (ezrine, radixine et moesine), NIK (Nck-interacting kinase), CHP (calcineurin B homologous protein), et CaM (calmoduline), ROCK (Rho Kinase), p90RSK (ribosomal S6 kinase). 10 µm 10 µm Comparison of NHE1 protein expression in ventricular and atrial myocardium. A: immunofluorescence image of ventricular tissue incubated in presence of anti-NHE1 antibody. B: high-magnification image of A. C: immunofluorescence image of atrial tissue incubated in presence of anti-NHE1 antibody. D: high-magnification image of C. Colocalization of NHE1 and connexin 43 protein expression in ventricular myocardium. NHE1 protein expression is visible as red labeling; connexin 43 protein expression is visible as green labeling. 10 µm. Petrecca et coll., Am J Physiol; 1999. 8 Protéine NBC Méthodologie site de fixation du DIDS Méthode du "pulse" à l’ammonium CED 1401 Extracellulaire NH4Cl 7.6 convertisseur I-V 7.4 moniteur lampe Xénon 1 pHi 7.2 Membrane 7.0 2 3 6.8 6.6 tubes photomultiplicateurs (590 et 640 nm) Intracellulaire diaphragme Microscope 6.4 filtre d’interférence (540 nm) site consensus pour PKA site consensus pour PKC hhNBC H2 N Sonde fluorescente: Carboxy-SNARF1 H+ ♦ Romero MF et al. Expression cloning and characterization of a renal electrogenic Na+/HCO3cotransporter. Nature 1997; 387 : 409 - 413. ♦ Choi I et al. Cloning and characterization of human electrogenic Na+/HCO3- cotransporter isoform (hhNBC) Am. J. Physiol. 1999; 276 : C576 - C584. NH3 NH3 H+ NH4+ HOOC NH4+ ALCALINISATION H+ NH3 NH3 NH4+ H+ NH4+ ACIDIFICATION NHE [H+]i NBC ßi AngII A l’heure actuelle il n’existe pas d’inhibiteur spécifique du transporteur NBC Na+-HCO3- Mise en evidence de l ’activité du transporteur (NBC) Microfluorimétrie sur cellule unique (cardiomyocytes isolés) (2) HCO3- Na+ NBC Na+ AT1 récepteur H+ 7.6 NH4+ Conditions : • enregistrement par microfluorimétrie utilisant la sonde c-SNARF1 pHi 7.2 7.0 • méthode du “pulse” à l’ammonium 6.8 lair e me mb ran e rac ell u lai re PD98059 U0126 MEK 1/2 MAPK / Erk 1/2 • JH = βt X dpHi/dt + 1 µM cariporide (NBC) 6.6 5 min 6.4 int Raf Control (NBC + NHE) 7.4 ex tra ce llu NHE G ª Basal NBC activity requires activation of the ERK pathway of the MAPK cascade. ª Futhermore, activation of the ERK pathway of the MAPK cascade is involved in stimulation of both NHE and NBC activity by angiotensin II. 9